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Immunology and Infection

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा तीन डीएनए घावों का परिमाणीकरण और परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर के संपर्क में आने वाले चूहों के ऊतकों में उनके स्तरों का आकलन

Published: May 29, 2019 doi: 10.3791/59734
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 3,4, 5, 5, 1
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

हम यहाँ घावों के संवेदनशील और सटीक परिमाणन के लिए विधियां वर्णित करते हैं 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2'-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ), 1,एन6-एथनो-2'-डिऑक्सिडेनोसीन (1,एन6-दाडो) और 1,n2- एथिनो-2'-डीऑक्सीग्वानोसिन (1,N2-DGUO) डीएनए में । इन पद्धतियों को एक/J चूहों के ऊतकों (फेफड़ों, यकृत और गुर्दे) में परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर (पीएम२.५) के प्रभाव के आकलन के लिए लागू किया गया था ।

Abstract

डीएनए की अभिनलिकाएं और ऑक्सीकृत डीएनए आधार डीएनए के घावों के उदाहरण हैं जो इलेक्ट्रोफिलिक पदार्थों के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी बायोमार्कर हैं, बायोट्रांसफॉर्मेशन पर प्रतिक्रियाशील इलेक्ट्रोफिलिस उत्पन्न करते हैं, या ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा करते हैं । ऑक्सीकरण नाभिक के बीच, सबसे अधिक अध्ययन किया गया है 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रोग्वानिन (8-ऑक्सोगुआ) या 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2'-डिऑक्सीग्नॉसीन लिपिड परऑक्सीकरण प्रक्रिया के परिणामस्वरूप होने वाले ऐल्डिहाइडों और epoxyaldehydes हैं-इलेक्ट्रोफिलिक अणुओं के रूप में कर सकते हैं mutagenic exocyclic डीएनए adनलिकाओं, जैसे etheno adनलिकाएं 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) और 1,n6-etheno-2'-डिऑक्सिडेनोसिन (1,n6-εdado), जिसे प्रदाह के रोगपादाशय में संभावित बायोमार्कर के रूप में सुझाया गया है । डीएनए में उनकी मात्रा के लिए चयनात्मक और संवेदनशील तरीकों कोशिका उत्परिवर्तन दरों और जीर्ण रोग विकास (जैसे, कैंसर, न्यूरोडिजेनेरेटिव रोगों) को धीमा करने के लिए निवारक रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक हैं । उनके पता लगाने के लिए उपलब्ध संवेदनशील तरीकों में से (उच्च प्रदर्शन तरल वर्णलेखिकी इलेक्ट्रोकेमिकल या मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टरों करने के लिए युग्मित, धूमकेतु परख, immunoassays हैं, ३२पी-postlabeling), सबसे चयनात्मक उन आधारित हैं उच्च प्रदर्शन तरल वर्णलेखिकी पर मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस) को युग्मित । चयनात्मकता जटिल जैविक नमूनों और HPLC-ईएसआई-MS/MS का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक लाभ है, डीएनए, मूत्र, प्लाज्मा और लार जैसे जैविक matrices में संशोधित न्यूकोसाइड की मात्रा के लिए सोने के मानक के रूप में विकसित. Isotopically लेबल आंतरिक मानकों का उपयोग डीएनए हाइड्रोलिसिस और analyte संवर्धन कदम के दौरान अणु हानि के लिए सुधार का लाभ कहते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों के बीच analyte आयनन के मतभेदों के लिए । इसमें एक से अधिक चोटी मौजूद होने पर सही क्रोमेटोग्राफिक पीक की पहचान में भी एड्स होता है ।

हम यहां मौजूद संवेदनशील, सटीक और सटीक HPLC-ईएसआई-MS/MS तरीकों कि सफलतापूर्वक 8 की मात्रा के लिए आवेदन किया गया-oxodGuo, 1,n6-दाओ और 1,n2-फेफड़ों में dguo, जिगर और एक के गुर्दे डीएनए/ परिवेशी पीएम२.५ एक्सपोजर के प्रभावों का आकलन ।

Introduction

कुछ प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओज) डीएनए अड्डों के कार्बन डबल बांड और डीऑक्सीराइबोस मोइटी में कुछ कार्बनऑक्सिडाइज़ करने में सक्षम हैं, ऑक्सीकरण अड्डों और डीएनए कतरा को पैदा करते हैं1टूट जाता है । नाइट्रोजन और ऑक्सीजन परमाणुओं से समृद्ध एक नकारात्मक आवेशित अणु के रूप में, डीएनए भी इलेक्ट्रोफिलिक समूहों के लिए एक लक्ष्य है, जो नाभिकरागिता वाले स्थलों (नाइट्रोजन और ऑक्सीजन) के साथ सह प्रतिक्रिया करता है, जो उन उत्पादों को प्रदान करता है जिन्हें डीएनए adनलिकाओं2कहते हैं । तो, डीएनए adनलिकाएं और ऑक्सीकरण डीएनए ठिकानों डीएनए घावों है कि पदार्थों है कि electrophilic हैं के विषाक्तता आकलन के लिए उपयोगी biomarkers हैं, biotransformation पर प्रतिक्रियाशील electrophilic उत्पन्न, या ऑक्सीडेटिव तनाव1प्रेरित करने के उदाहरण हैं, २। हालांकि संशोधित डीएनए अड्डों को आधार या न्यूकोटाइड उच्छेदन (ईआर या एनईआर) द्वारा डीएनए से हटाया जा सकता है, लेकिन पूर्व के पक्ष में डीएनए घावों के उत्पादन और निष्कासन के बीच असंतुलन का प्रेरण डीएनए ओवरटाइम में उनके स्तर की एक शुद्ध वृद्धि करने के लिए होता है3 < /सी5 > । परिणाम डीएनए उत्परिवर्तन दरों की वृद्धि हुई है, कम जीन अभिव्यक्ति, और कम प्रोटीन गतिविधि2,4,5,6,7, प्रभाव है कि बारीकी से संबंधित है रोगों का विकास । डीएनए म्यूटेशन सेल सिग्नलिंग, कोशिका चक्र, जीनोम अखंडता, telomere स्थिरता, epigenome, क्रोमेटिन संरचना, आरएनए splicing, प्रोटीन homeostasis, चयापचय, apoptosis, और कोशिका विभेदन के रूप में विभिन्न सेलुलर कार्यों, प्रभावित हो सकता है8 ,9. सेल म्यूटेशन दरों को धीमा करने के लिए रणनीतियां और जीर्ण रोग विकास (उदा., कैंसर, न्यूरोडिजेनेरेटिव रोग), उनमें से, डीएनए घावों और उनके कारणों के बीच उत्परिवर्तन स्रोतों के ज्ञान के माध्यम से गुजरती हैं ।

अधिक में endogenously उत्पंन ROS, प्रदूषक जोखिम के कारण, लगातार सूजन, रोग रोगविज्ञान (जैसे, मधुमेह), आदि, डीएनए और लिपिड नुकसान1सहित biomolecule क्षति के महत्वपूर्ण कारण हैं । एक उदाहरण के रूप में, उच्च प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सिल रेडिकल (OH) संक्रमण धातु आयन (Fe2 +, Cu+) द्वारा एच2ओ2 की कमी से बना डीएनए कुर्सियां, डीएनए चीनी मोइटी और पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड पर प्रसार-नियंत्रित oxidizes 10दरें । ८० पहले से ही ऑक्सीकरण nucleobases3विशेषता में, सबसे अधिक अध्ययन किया गया है एक 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-ऑक्सीकरण) या 8-oxo-7, 8-diहाइड्रो-2'-deoxyguanosine (8-oxodguo, चित्रा 1), एक घाव है कि जीटी transversions में प्रेरित करने में सक्षम है स्तनधारी कोशिकाओं10,11। यह ग्वानिन के मोनो इलेक्ट्रॉनिक ऑक्सीकरण द्वारा, या डीएनए1में ग्वानीन के हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी या सिंगिंग ऑक्सीजन हमले के द्वारा बनाई गई है । पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेन्ट्स के अन्य महत्वपूर्ण लक्ष्य होते हैं, जैसे कि •ओह, जो लिपिड परऑक्सीकरण1,12की प्रक्रिया आरंभ करते हैं । यह फैटी एसिड hydroperoxides कि इलेक्ट्रोफिलिक aldehydes और epoxyaldehydes को विघटित कर सकते है वृद्धि देता है, जैसे मैलोन्डिहाइड, 4-हाइड्रोक्सी-2-नॉननेरल, 2, 4-डेकाडियोल, 4, 5-एपोक्सी-(2ई)-डेसीनल, हैक्सानियल, एक्रोलेइन, क्रॉटोनल्डिहाइड, जो 1,12,13या etheno adनलिकाओं-जैसे मैलोन्डिहाइड-, propano-, या एथेनो के रूप में उत्परिवर्तनिक exocyclic डीएनए adनलिकाओं, बनाने के लिए सक्षम. Etheno adनलिकाएं 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo, चित्रा 1) और 1,n6-Etheno-2'-deoxyguanosine (1,n6-εदाओ, चित्रा 1 ) सूजन14,15के pathophysiology में संभावित biomarkers के रूप में सुझाव दिया गया है.

Figure 1
चित्रा 1 । वर्तमान अध्ययन में डीएनए के घावों की रासायनिक संरचनाओं का परिमाण निर्धारित है । डॉ = 2 ́-डीऑक्सीराइबोस । यह आंकड़ा Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

1980 के दशक के आरंभ में किए गए अध्ययनों में उच्च निष्पादन वाले द्रव क्रोमेटोग्राफी के द्वारा 8-ऑक्सोडगूओ को वैद्युत-रासायनिक संसूचन (एचपीएलसी-ईसीडी) से संयोजित करने की अनुमति दी गई थी । एचपीएलसी द्वारा 8 ऑक्सोडगुओ का परिमाणीकरण-ecd कई जैविक प्रणालियों में ऑक्सीकरण की स्थिति के अधीन 8-oxodguo की मांयता के लिए नेतृत्व में oxidatively प्रेरित आधार नुकसान के एक biomarker के रूप में डीएनए1,16। हालांकि मजबूत और 8-oxodGuo की मात्रा कम fmol रेंज17में, HPLC-ecd मापन की अनुमति के विश्लेषण के लिए analyte प्रतिधारण समय की सटीकता पर भरोसा करते है और क्रोमेटोग्राफी संकल्प पर interferences से बचने के लिए अंय नमूना घटक है । चूंकि इलेक्ट्रोकेमिकल डिटेक्शन के लिए मोबाइल फेज में सॉल्ट (मसलन, पोटैशियम फॉस्फेट, सोडियम एसीटेट) के इस्तेमाल की जरूरत होती है, इसलिए पर्याप्त विश्लेषणात्मक स्थितियों के रखरखाव के लिए रूटीन कॉलम और उपकरणों की सफाई का समय चाहिए होता है ।

वैकल्पिक रूप से, डीएनए से 8-oxoगुआ का पता लगाने और हटाने के लिए बैक्टीरिया डीएनए मरंमत एंजाइम formamidopyrimidine डीएनए glycosylase (fpg) का उपयोग करें और, बाद में, मानव 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), डीएनए क्षार अस्थिर के प्रेरण के लिए एक रास्ते के रूप में उभरा साइटों. क्षार अस्थिर साइटों डीएनए भूग्रस्त टूट जाता है और क्षारीय एकल कोशिका जेल वैद्युतकणसंचलन ("धूमकेतु परख") से 8-oxogua की बहुत उच्च संवेदनशील अप्रत्यक्ष प्रमात्रीकरण की अनुमति देते हैं । उच्च संवेदनशीलता और सेलुलर डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकता के बिना विश्लेषण की सिद्धि परख के इस प्रकार के मुख्य लाभ हैं । यह डीएनए में 8-oxoGua के सबसे कम स्थिर राज्य स्तर देता है, आमतौर पर 7-10 बार एचपीएलसी पर आधारित bioanalytical तरीकों से प्राप्त स्तरों से कम है । हालांकि, यह 8-oxogua की एक अप्रत्यक्ष माप है और कुछ कमियां विशिष्टता की कमी या मरंमत एंजाइमों की अज्ञात दक्षता1,16,18इस्तेमाल कर रहे हैं ।

इम्यूनोएसकहते हैं, 8-oxoGua1 और exocyclic डीएनए adनलिकाओं, जैसे 1,n6-दाओ और 1,n2-dguo12का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के अन्य सेट कर रहे हैं । संवेदनशीलता के बावजूद, डीएनए घावों का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की कमी, सामान्य डीएनए आधारों1,12सहित जैविक नमूनों के अन्य घटकों को क्रॉस-रीएक्टिविटी के कारण विशिष्टता का अभाव है । 1, छ-दाडो तथा 1 एएन2-डगूओ सहित बहिर्चक्रीय डीएनए अभिनलिकाओं का भी पता लगाया जा सकता है और अत्यधिक संवेदनशील ३२पी-पोस्टलेबलिंग द्वारा मात्रा का निर्धारण किया जाता है । ३२पी-पोस्टलेबलिंग की उच्च संवेदनशीलता की अनुमति देता है डीएनए की बहुत छोटी मात्रा का उपयोग (जैसे, 10 μg) के बारे में पता लगाने के लिए 1 योगोत्पाद प्रति 1010 सामांय कुर्सियां19। हालांकि, रेडियो रसायनों का उपयोग, रासायनिक विशिष्टता और कम सटीकता की कमी कुछ नुकसान कर रहे है19,20।

ऊपर उद्धृत तरीकों की एक साझा सीमा वांछित अणुओं की खोज के लिए कम चयनशीलता या विशिष्टता है । इस परिदृश्य में, hplc इलेक्ट्रोस्प्रे आयनन मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (hplc-ईएसआई-एमएस/एमएस और hplc-ms3) के लिए युग्मित डीएनए, मूत्र, प्लाज्मा और लार के रूप में जैविक matrices में संशोधित न्यूकोसाइड्स की मात्रा का निर्धारण करने के लिए सोने के मानक के रूप में विकसित 1 । , 19 , hplc के लाभ-ईएसआई-MS/ms तरीकों संवेदनशीलता (आम तौर पर कम fmol रेंज में हैं) और उच्च विशिष्टता मैं द्वारा प्रदान की) वर्णलेखी जुदाई, द्वितीय) द्रव्यमान के अंदर अणु विखंडन की विशेषता और ज्ञात पैटर्न स्पेक्ट्रोमीटर संघट्ट कक्ष, और iii) कई प्रतिक्रिया निगरानी मोड1,19में चार्ज अनुपात (एम/जेड) के लिए चयनित द्रव्यमान का सही माप । Isotopically लेबल आंतरिक मानकों का उपयोग डीएनए हाइड्रोलिसिस और analyte संवर्धन कदम के दौरान अणु हानि के लिए सुधार का लाभ कहते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों के बीच analyte आयनन के मतभेदों के लिए । यह भी सही क्रोमेटोग्राफिक चोटी की पहचान में एड्स जब एक से अधिक चोटी मौजूद है1,12,19,20।

एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस पर आधारित अनेक तरीकों का उपयोग विभिन्न जैविक नमूनों से निकाले गए डीएनए में 8-ऑक्सोडगुओ, 1,एन6-दाडो और 1,एन2-डगूओ के परिमाणके लिए किया गया है । ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . महीन कणों (पीएम२.५) में जैविक और अकार्बनिक रसायन होते हैं, जैसे कि पॉलीसाइक्लिक एरोमैटिक हाइड्रोकार्बन (pahs), नाइट्रो-pahs, एल्डिहाइड्स, कीटोन्स, कार्बोक्सिलिक एसिड, क्विनोलाइंस, मेटल, और पानी में घुलनशील आयन, जो सूजन को प्रेरित कर सकते हैं और ऑक्सीडेटिव तनाव, स्थितियों है कि biomolecule क्षति और रोग की घटना एहसान30,31,३२,३३. हम यहां मौजूद HPLC-ईएसआई-MS/MS तरीकों कि सफलतापूर्वक 8 की मात्रा-oxodGuo, 1,n6-दासो और 1,n2-Dguo फेफड़ों में, जिगर और एक के मूल्यांकन के लिए/ परिवेशी प्रधानमंत्री२.५ एक्सपोजर३४के प्रभाव ।

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Protocol

चार सप्ताह पुराने पुरुष ए/J चूहों, विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त, Fundação ओस्वाल्डो क्रूज़ (FIOCRUZ), रियो डी जनेरियो, ब्राजील, के प्रयोगशाला जानवरों के प्रजनन केंद्र से प्राप्त किया गया और चिकित्सा, विश्वविद्यालय के संकाय की नैतिकता समिति के लिए तदनुसार इलाज किया गया साओ पाउलो के (प्रोटोकॉल एनओ 1310/09) ।

1. चूहों के ऊतकों का संग्रह

  1. Xylazine और ketamine के साथ जानवर anesthetize । शरीर के वजन के 30 ग्राम के साथ एक माउस के लिए, एक समाधान इंजेक्ट (कोई अधिक से अधिक 2 मिलीलीटर) जिसमें २.६३ मिलीग्राम केटामाइन की और ०.३८ मिलीग्राम की xylazine, intraperitoneally ।
  2. पूरक विश्लेषण के लिए रक्त (०.५-१.५ मिलीलीटर) लीजिए (जैसे, एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधि, malondialdehyde स्तर) ।
  3. पेट के बालों को पेल्विस से लेकर असिरूप प्रोसेस में शेव करें । गंजा क्षेत्र में एक ऊर्ध्वाधर मध्य रेखा में एक चीरा बनाओ । उदर अंगों को बेनकाब करने के लिए क्षैतिज पार्श्व लाइनों में चीरों बनाओ ।
  4. एक्सरसाइज़ को बढ़ावा देने और जानवर को euthanize करने के लिए उदर महाधमनी को काटें ।
  5. (इस मामले में, जिगर, गुर्दे और फेफड़ों) ब्याज के ऊतकों को हटा दें ।
    1. जिगर को हटाने के लिए, अवर कावा नस और पोर्टल यकृत शिरा में कटौती ।
    2. गुर्दे, खंड गुर्दे की नसों और धमनियों को हटाने के लिए ।
    3. फेफड़ों को दूर करने के लिए, डायाफ्राम हाथ पैरों और परिधि वक्ष दीवार के करीब में एक चीरा बनाते हैं । वक्ष गुहा के इंटीरियर में एक कैंची खोलकर हंसटिकाओं को तोड़ने । ट्रेकिआ की ओर असिरूप प्रक्रिया से extern हड्डी कट, क्रम में फेफड़ों और दिल को बेनकाब करने के लिए ।
      1. फेफड़ों को संदंश से पकड़ें, परिच्छेद श्वासनली और फेफड़ों के चारों ओर स्नायुबंधन करें । ध्यान से ब्लॉक फेफड़ों से अधिक दिल निकालें । ब्लॉक से बाहर फेफड़ों को हटाने के लिए, एक संदंश के साथ दिल पकड़ और उसके आधार में सभी जहाजों में कटौती ।
  6. ठंडा खारा घोल (०.९% NaCl), क्रायोजेनिक ट्यूबों के हस्तांतरण में तुरंत अलग ऊतकों को धोने, और तुरंत तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों डुबकी । काम पूरा करने के बाद-८० डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों स्टोर ।
    सावधानी: त्वचा, श्लेष्म या आंखों के साथ सीधे संपर्क में तरल नाइट्रोजन जलता का कारण बनता है । संपर्क से बचने के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा का उपयोग करें । तरल नाइट्रोजन वाष्प के कारण श्वासावरोध से बचने के लिए हवादार प्रयोगशाला में काम करते हैं ।

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: डीएनए निष्कर्षण विधि Loureiro एट अल से संशोधित किया गया था (२००९)३५ घावों के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए यहां अध्ययन ।

  1. सूखी बर्फ के ऊतकों युक्त ट्यूबों स्थानांतरण ।
  2. एक आधार के रूप में बर्फ पर रखा संस्कृति प्लेट का उपयोग करें एक स्केलपेल के साथ ऊतक के एक टुकड़े में कटौती करने के लिए । तत्काल उपयोग के लिए वजन 1 जी । शेष ऊतक सूखी बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब तक यह-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए रिटर्न ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि शेष ऊतक के विगलन से बचने के लिए कलाकृतियों के गठन को रोकने के लिए अगर विश्लेषण के repetitions की जरूरत है ।
  3. ५० मिलीलीटर छाया ट्यूबों में ऊतक के प्रत्येक 1 जी के लिए, जोड़ने के वाणिज्यिक सेल lysis समाधान के 10 मिलीलीटर ०.५ मिमी deferoxamine युक्त और बर्फ पर रखें ।
    नोट: तत्काल उपयोग के लिए समाधान की मात्रा के लिए deferoxamine जोड़ें । समाधान के प्रत्येक १०० मिलीलीटर के लिए, deferoxamine mesylate नमक के ०.०३२८ ग्राम जोड़ें ।
  4. एक ऊतक homogenize का उपयोग ऊतकों जब तक ऊतक के टुकड़े के बिना एक सजातीय समाधान प्राप्त है homogenize । होमोनेटाइजेशन के दौरान ट्यूब कोल्ड (बर्फ पर) रखें । हीटिंग से बचने के लिए कम स्पीड का इस्तेमाल करें ।
  5. प्रत्येक homogenized नमूना करने के लिए proteinase K समाधान (20 मिलीग्राम/एमएल) के १५० μL जोड़ें । इनवर्ज़न द्वारा ट्यूबों हिला और उंहें कमरे के तापमान पर रात भर रखो ।
  6. Ribonuclease एक समाधान (15 मिलीग्राम/एमएल) के ४० μL जोड़ें, inversion द्वारा हिला, और 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों रखो ।
    नोट: ribonuclease तैयार सोडियम एसीटेट बफर में एक समाधान 10 मिमी, पीएच ५.२ वर्षा से बचने के लिए । 15 मिनट के लिए १०० डिग्री सेल्सियस पर समाधान गर्मी से पहले का उपयोग करें deoxyribonuclease से मुक्त समाधान प्राप्त करने के लिए ।
  7. 10 मिनट के लिए वाणिज्यिक प्रोटीन अवक्षेपण समाधान, भंवर जोरदार, और २,००० x जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. Supernatants ५० मिलीलीटर ठंड isopropanol के 10 मिलीलीटर से ढकी ट्यूबों के लिए स्थानांतरण । नलिकाओं धीरे से उपजी डीएनए की टिप्पणी तक कई बार पलटी ।
    नोट:-20 ° c पर ट्यूबों रखते हुए प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
  9. अंत में बंद एक पाश्र पिपेट का उपयोग उपजी डीएनए लीजिए । यह 10 मिमी Tris बफर, 1 मिमी deferoxamine, पीएच ७.० के 4 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों के लिए स्थानांतरण ।
  10. डीएनए पूरी तरह से ऊपर समाधान (मत भंवर) में भंग हो जाने के बाद, isoamyl शराब का 4% युक्त एक क्लोरोफॉर्म समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. नलियों को उलटनें homogenization के लिए 10 बार, २,००० x जीपर अपकेंद्रित्र, 4 ° c, 10 मिनट के लिए दो चरणों को अलग करने के लिए, और एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण हस्तांतरण ।
  12. दोहराएं कदम २.१० और २.११ दो और बार ।
  13. डीएनए को अवक्षेप करने के लिए 8 मिलिलीटर निरपेक्ष एथेनॉल तथा 5 उ छंल विलयन का ०.४ उ2 डालिए ।
  14. फिर से उपजी डीएनए ले लीजिए और यह ७०% इथेनॉल के 3 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण । इस चरण को एक बार दोहराएं ।
  15. सावधानी के साथ इथेनॉल समाधान त्यागने और अवशोषक कागज पर उपजी डीएनए युक्त ट्यूबों पलटे समाधान के अतिरिक्त हटाने के लिए ।
  16. डीएनए भंग करने के लिए ०.१ मिमी deferoxamine समाधान के २०० μL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को बनाए रखने जब तक डीएनए पूरी तरह से rehydrated है (रातोंरात) ।
  17. २६० एनएम पर अवशोषणांश और इसकी शुद्धता को 260/280 एनएम अवशोषण अनुपात द्वारा मापने के द्वारा डीएनए सांद्रण का निर्धारण करें ।
    नोट: डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, डीएनए समाधान के 10 μL के एक aliquot ९९० μL ultrapure पानी (100x कमजोर पड़ने) के लिए स्थानांतरण । अवशोषन को २६० एनएम पर गुणा करें (यह 1 से नीचे होना चाहिए) ५० द्वारा (५० μg/एमएल डबल फंसे डीएनए की एकाग्रता है जब २६० एनएम पर 1 सेमी पथ लंबाई समाधान का अवशोषण 1 है) और (100x) इस्तेमाल किया कमजोर पड़ने के द्वारा μg/एमएल में डीएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । यदि २६० एनएम पर अवशोषक 1 से अधिक है, तो अतिरिक्त dilutions आवश्यक हैं । 260/280 एनएम अवशोषण अनुपात वांछित डीएनए शुद्धता के लिए १.८ के बराबर या ऊपर होना चाहिए, लेकिन १.६ के आसपास अनुपात स्वीकार्य हैं ।

3. डीएनए एन्ज़ामैटिक हाइड्रोलिसिस

  1. विश्लेषण नुस्खा
    1. 1 ए6-εडाडो तथा 1 एएन2-Εडगुओ विश्लेषणों में १५०-ग्राम डीएनए युक्त एक aliquot करने के लिए, २०० मिमी Tris/Mgcl2 बफर की ७.५ μL जोड़ें (पीएच ७.४), आंतरिक मानक समाधान के १.४ μl युक्त ] 1,n6-εदाडो और [15n5] 1,n2-εdguo, और डिऑक्सीराइबोन्यूक्लिड की 15 इकाइयां I. अंतिम मात्रा को ultrapure पानी के साथ २०० μl समायोजित करें, चरण 3.2.1 पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों की मात्रा को घटाकर ।
    2. 8-oxodguo विश्लेषण: डीएनए के ८० माइक्रोग्राम युक्त aliquot करने के लिए, २०० mM Tris/mgcl2 बफर के ३.८ μl जोड़ें (पीएच ७.४), आंतरिक मानक समाधान के 2 μl [15N5] 8-oxodguo के १,००० fmol/ १०० μl ultrapure पानी के साथ करने के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें, कदम 3.2.2 पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए एंजाइमों की मात्रा घटाकर ।
      नोट: आंतरिक मानक [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo और [15n5] 8-oxodguo synthetized किया जा सकता है और के रूप में विशेषता ३५,३६,३७बताया । अंतःक्षिप्त नमूना मात्रा में आंतरिक मानकों की मात्रा इंजेक्शन अंशांकन वक्र मात्रा में उन लोगों के रूप में ही होना चाहिए.
  2. 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेते हैं ।
    1. चरण ३.१ से नमूने: मैं क्रोटालस अट्रोक्ष और 15 इकाइयों से बोवाइन आंत्र mucosa से फोस्फोडाईस्टेरेज के ०.००६ इकाइयों जोड़ें ।
    2. चरण ३.२ से नमूने: मैं crotalus अट्रोक्ष और 8 alkaline फॉस्फेट से गोजातीय आंत्र mucosa से फोस्फोडाईस्टेरेज के ०.००३२ इकाइयों जोड़ें ।
  3. 1 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेते हैं ।
  4. 10 मिनट के लिए १४,००० एक्स जी पर नमूनों केंद्राge ।
  5. कदम 3.2.1 से नमूने: अलग deoxynucleosides की मात्रा के लिए प्रत्येक नमूने के 10 μL (दाओ, dGuo) एचपीएलसी द्वारा (चरण 9) । विषय ठोस चरण निष्कर्षण करने के लिए अवशिष्ट मात्रा (चरण 4) ।
  6. चरण 3.2.2 से नमूने: स्थानांतरण ८० μL supernatant के इंजेक्शन के लिए शीशियों के लिए ५० μL (१,००० fmol के [15एन5] 8-oxodguo) में एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस प्रणाली । एचपीएलसी/डैड (स्टेप 9) द्वारा dGuo की क्वांटिफिकेशन के लिए शेष 20 μL आरक्षित रखें ।

4. ठोस चरण निष्कर्षण के विश्लेषण के लिए 1, n6-εdado और 1, n2-εdguo

  1. लोड कारतूस (spe-C18, 30 मिलीग्राम/एमएल, ३३ μm, 1 मिलीलीटर) समाधान के निम्नलिखित अनुक्रम के 1 मिलीलीटर के साथ: १००% मेथनॉल, विआयनीकृत पानी, hydrolyzed डीएनए नमूना, विआयनीकृत पानी, 10% मेथनॉल, 15% मेथनॉल, और १००% मेथनॉल (एकत्र करने के लिए) ।
    नोट: विभिंन समाधानों के अनुप्रयोगों के बीच कारतूस सूखी मत छोड़ो । पिछले समाधान के तुरंत बाद अगले समाधान जोड़ें कारतूस पूरी तरह से प्रवेश करती है ।
  2. वैक्यूम अंतिम क्षालन अंश (१००% मेथनॉल) को शुष्क करते हैं जिसमें adनलिकाएं शामिल हैं ।
  3. तुरंत HPLC-ईएसआई एमएस/एमएस विश्लेषण करने से पहले ultrapure पानी के ८३.१ μL में सूखे नमूनों को फिर से निलंबित प्रत्येक नमूने के ५० μL में प्रत्येक आंतरिक मानक के २०० fmol प्राप्त करने के लिए ।

5. अंशांकन curves की तैयारी

  1. ३०० से ६,००० एफएमओएल के अंतराल में 8-ऑक्सोडगुओ मानक के अनुसार न्यूनतम पांच अंक तैयार करें, जिसमें प्रत्येक बिंदु में [15छ5] 8-ऑक्सोडगुओ की १,००० एफएमओएल की निश्चित राशि होती है । इंजेक्शन मात्रा में इन राशियों पर विचार करें ।
  2. 1 से ४०फमोल के अंतराल में न्यूनतम पाँच अंक तैयार कीजिए 1 ए6-εडाडो तथा 1 एएन2-εडगूओ, जिसकी नियत मात्रा २०० एफमोल [15छ5] 1 ए छ6-εदाडो तथा [15छ5] 1, एसएन 2ण्प्रत्येक बिदु पर εदगुओ । इंजेक्शन मात्रा में इन राशियों पर विचार करें ।
  3. ०.०५-1 नामोल के डगूओ और दाड़ो के अंतराल में कम से पांच अंक तैयार करें । इंजेक्शन मात्रा में इन राशियों पर विचार करें ।

6. विधि सत्यापन के लिए डीएनए नमूने की तैयारी

  1. 1ए ढ6-εदाडो तथा 1 ए ढ2-εडगुओ विश्लेषण: 1 ए6-εदाडो तथा 1 ए2-εडगूओ (उदाहरणार्थ, १.७५, ८.७५, १७.५ तथा ३५ एफएमओएल) तथा नियत मात्रा में [15छ5] 1, द6-εदाडो तथा [15छ5] 1 ए2-εडगुओ (३५० फमोल) से १००-ग्राम तक के दो भिन्न दिनों में चार प्रतियों में नमूनों की प्रक्रिया । विधि सटीकता और सटीक मूल्यांकन के लिए नमूनों का उपयोग करें ।
    नोट: डीएनए hydrolysates के अंतिम मात्रा २०० μL (चरण 3), जिसमें से 10 μL HPLC द्वारा deoxynucleosides की मात्रा के लिए अलग हो जाएगा (चरण 9) । शेष समाधान (१९० μL) ठोस चरण निष्कर्षण के अधीन किया जाएगा (चरण 4), सूखे अंश ८३.१ μL (चरण ४.३), जिसमें से ५० μL में HPLC-ईएसआई-MS/MS प्रणाली में इंजेक्ट किया जाएगा resuspended किया जाएगा । 1 ए6-εदाडो तथा 1 एढ2-εडगुओ के अंतःक्षिप्त 1, 5, 10 तथा 20 फमोल होंगे, जिनमें से २०० फमोल [15छ5] 1 ए छ6-εदाडो तथा [15छ5] 1 एछ प्रत्येक नमूने में 2-εdguo ।
  2. 8-oxodguo विश्लेषण: 8-oxodguo (जैसे, ७३४, १,४६८, २,९३८, और ४,४०८ fmol) की एक निश्चित राशि और [15N5] 8-oxodguo (२,००० fmol) की एक निर्धारित मात्रा से १०० माइक्रोग्राम बछड़ा थाइमस डीएनए के लिए और के रूप में एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के बाहर ले जोड़ें चरण 3 में वर्णित है । दो भिन्न दिनों में चार प्रतियों में नमूनों की प्रक्रिया । विधि सटीकता और सटीक मूल्यांकन के लिए नमूनों का उपयोग करें ।
    नोट: डीएनए hydrolysates के अंतिम मात्रा १०० μL होगा (चरण 3), जिसमें से ५० μL HPLC-ईएसआई-एमएस/एमएस प्रणाली में इंजेक्ट किया जाएगा । की मात्रा 8-oxodGuo इंजेक्शन ३६७, ७३४, १४६९, और २२०४ fmol होगा, के साथ १,००० fmol के [15N5] 8-oxodguo प्रत्येक नमूने में ।
  3. जोड़ें १३.१२५ fmol के 1,n6-εdado (इंजेक्शन मात्रा में ७.५ fmol प्राप्त करने के लिए) और ३५ fmol के 1,n2-εdguo (इंजेक्शन मात्रा में 20 fmol प्राप्त करने के लिए) के आठ नमूनों के लिए बछड़ा थाइमस डीएनए के १०० माइक्रोग्राम ।
    1. आंतरिक मानक [15n5] 1,n6-εdado और [15n5] 1,n2-εdguo (२०० fmol) से चार नमूने जोड़ें । डीएनए हाइड्रोलिसिस और सभी नमूनों की ठोस चरण निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें ।
    2. आंतरिक मानक [15n5] 1,n6-εdado और [15n5] 1,n2-εdguo (२०० fmol) अंय चार नमूनों में जोड़ें ।
    3. ठोस चरण निष्कर्षण से adनलिकाओं की वसूली की गणना करने के लिए नमूनों का उपयोग करें.

7. एचपीएलसी-ईएसआई-MS/एमएस विश्लेषण 8-oxodGuo

  1. उपकरण में 8-oxodGuo मानक infusing, कई प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) द्वारा अपने विखंडन पैटर्न का सबसे अच्छा पता लगाने के लिए ईएसआई-MS/MS पैरामीटर सेट: m/z २८४ [m + H] + → m/z १६८ [m-2 '-Deoxyribose + H]+।
    1. का पता लगाने के लिए एक ही पैरामीटर का उपयोग करें [15N5] 8-oxodguo: m/z २८९ [m + H]+m/z → १७३ [एम-2 '-deoxyribose + H]+।
      नोट: इस कार्य में प्रयुक्त उपकरण के समतुल्य या बेहतर उपकरण का उपयोग करें ( सामग्रियों की तालिकादेखें) । ईएसआई-MS/MS पैरामीटर्स को तालिका 1में वर्णित के रूप में सेट किया गया था ।
  2. फ़िल्टर (०.२२ μm सरंध्र झिल्ली का उपयोग करके) और degasify (एक sonicator का उपयोग करके) सभी पानी आधारित HPLC सॉल्वैंट्स ।
  3. विश्लेषण के लिए निंनलिखित क्रोमेटोग्राफी शर्तों का प्रयोग करें, प्रणाली बढ़ते के रूप में चित्र 2में दिखाया गया है ।
    नोट: स्तंभ A बाइनरी पंप से कनेक्टेड है । इसके eluent यूवी का पता लगाने और कचरे को पहले 16 मिनट में और ३२ से ४६ मिनट वर्णलेखिकी के लिए निर्देशित किया गया है, के रूप में चित्र 2aमें दिखाया गया है । यह वह स्तंभ है जिसके माध्यम से इंजेक्शन के तुरंत बाद नमूने को ठीक किया जाता है । स्तंभ B isocratic पंप और मास स्पेक्ट्रोमीटर से जुड़ा है । वाल्व चित्र 2bमें दिखाया गया स्थिति के लिए बंद कर दिया जाता है, जब यह स्तंभ A केवल 16-32 ंयूनतम अंतराल में, eluent प्राप्त करता है । वाल्व स्विचन दो कॉलम, जो द्विआधारी पंप ढाल द्वारा eluted है के बीच कनेक्शन की अनुमति देता है । चित्र 2b में दिखाया गया कॉन्फ़िगरेशन आगे पीक जुदाई और संकुचन की अनुमति देता है । इसके अतिरिक्त, केवल ब्याज का वर्णलेखी अंश मास स्पेक्ट्रोमीटर तक पहुँचता है, संवेदनशीलता और चयनात्मकता में सुधार.
    1. Elute a ५० x २.० mm आईडी, २.५ μm, C18 कॉलम ( चित्रा 2के स्तंभ a) एक C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस (४.० x ३.० mm आईडी) के साथ युग्मित ०.१% फॉर्मिक एसिड (विलायक a) और ०.१% फॉर्मिक एसिड युक्त मेथनॉल की एक प्रवाह दर पर १५० μl/ 25 ° c ।
      1. बाइनरी पम्प के लिए निम्न ग्रैडिएंट प्रोग्राम का उपयोग करें: 0 से 25 मिनट, विलायक B का 0-15%; 25 से 28 मिनट, विलायक बी का 15-80%; 28 से 31 मिनट, विलायक बी का ८०%; 31 to ३३ मिनट, ८०-विलायक B का 0%; ३३ से ४६ मिनट, विलायक बी का 0%
      2. स्विचन वाल्व का उपयोग करने के लिए बेकार है और एक दूसरे स्तंभ के लिए 16-32 मिनट (१५० x २.० mm आईडी, ३.० μm, C18, 2 चित्राके स्तंभ बी) को eluent के पहले 16 मिनट सीधे ईएसआई स्रोत से जुड़े और 15% me के समाधान के साथ isocratic पंप द्वारा वातानुकूलित थनोल% फॉर्मिक एसिड ०.१ युक्त पानी में (१५० μL/
        नोट: चरण 7.3.1.2 के स्विचन वाल्व प्रोग्राम का उपयोग करने से पहले, जांच करें 8-oxodGuo मानक elutes पहले स्तंभ से 16 मिनट के बाद । दूसरे कॉलम से 8-oxodGuo के लिए बाइनरी पंप के ढाल का उपयोग करने के लिए ३२ मिनट पर वाल्व को बंद करने और एक तेज क्रोमेटोग्राफिक चोटी पाने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरे स्तंभ से लगभग ३६ मिनट पर घाव 8-oxodGuo elutes । analyte के अवधारण समय की भिन्नता स्तंभ और उपयोग किए गए उपकरणों के आधार पर हो सकता है । HPLC विलायक ढाल कार्यक्रम के रूपांतरों आवश्यक हो सकता है ।

Figure 2
चित्रा 2 । 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2'-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ) विश्लेषण के लिए प्रयुक्त दो स्तंभों की प्रणाली । क) पहले 16 मिनट में इस्तेमाल किया विंयास और ३२ से ४६ मिनट के वर्णलेखिकी; ख) विंयास के अंतराल 16-32 मिनट में इस्तेमाल किया, आगे जुदाई और शिखर के पहले कॉलम बी में संकुचन की अनुमति मास स्पेक्ट्रोमीटर के ईएसआई स्रोत के लिए । यह आंकड़ा Oliveira एट अल.३४से पुनर्प्रकाशित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

8. एचपीएलसी-ईएसआई-MS/MS विश्लेषण 1, n 6 -εदासो और 1, n 2 -εdguo

  1. 1,n6-Εदाको और 1,n2-εdguo मानक उपकरण में infusing, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (mrm) द्वारा उनके विखंडन पैटर्न का सबसे अच्छा पता लगाने के लिए ईएसआई-ms/ms पैरामीटर्स सेट करें: m/z २७६ [m + h]+ → m/z १६० [m 2 '-deoxyribose + h]+ का पता लगाने के लिए 1,N6-εdado और m/z २९२ [m + h]+ → m/z १७६ [m-2 '-deoxyribose + h ]+ 1,N2-εdguo का पता लगाने के लिए ।
    1. [15n5] 1,N6-εdado (m/z २८१ [m + H]+m/z → १६५ [m-2 "-deoxyribose + H]+) और [15n 5] 1,N2-εdguo (m/z २९७ [m + H]+ → m/z १८१ [m-2 "-deoxyribose + H]+) । ईएसआई-MS/MS पैरामीटर्स को तालिका 1में वर्णित के रूप में सेट करें ।
ईएसआई-MS/MS पैरामीटर्स 8-oxodGuo एथिनो एड्रीडक्ट
पर्दा गैस 20 पीएसआई 20 पीएसआई
छिटकना गैस ५५ ५०
आयन स्रोत गैस ५० साई ४० साई
संघट्ट प्रेरित वियोजन गैस मध्यम मध्यम
आयन फुहार वोल्टता ५००० ४५००
ईएसआई जांच तापमान ४५० ४५०
Declustering विभव 31 वी, 8-oxodGuo ४१ V, 1, N6-εदाडो
31 V, [15N5] 8-oxodguo ४१ V, [15N5] 1, n6-εdado
४५ V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, n2-εdguo
संघट्टन ऊर्जा 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εदासो
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εदाडो
27 eV, 1, N2-εdguo
27 मट, [15N5] 1, n2-εdguo
संघट्टन कक्ष निकास विभव 16 वी, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εदासो
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, n2-εdguo
प्रवेश क्षमता 10 वी 10 वी

तालिका 1. डीएनए घावों का पता लगाने के लिए ईएसआई-MS/MS उपकरण में प्रयुक्त पैरामीटर । इस तालिका Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है ।

  1. फ़िल्टर (०.२२ μm सरंध्र झिल्ली का उपयोग करके) और degasify (एक sonicator का उपयोग करके) सभी पानी आधारित HPLC सॉल्वैंट्स ।
  2. विश्लेषण के लिए निंन क्रोमेटोग्राफी शर्तों का उपयोग करें ।
    1. Elute a १५० x २.० mm आईडी, ३.० μm, C18 कॉलम एक C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस (४.० x ३.० mm आईडी) के साथ युग्मित 5 मिमी अमोनियम एसीटेट की एक ढाल के साथ, पीएच ६.६ (विलायक A) और acetonitrile (विलायक बी) के प्रवाह की दर पर १३० μL/
      1. बाइनरी पंप के लिए निंनलिखित ढाल कार्यक्रम का प्रयोग करें: 0 से 10 मिनट, विलायक बी का 0% से; 10 से ३९ मिनट, विलायक बी का 0-20%; ३९ से ४१ मिनट, विलायक बी का 20-75%; ४१ से ४६ मिनट, विलायक बी का ७५%; ४६ से ४७ मिनट, ७५-विलायक बी का 0%; ४७ से ६० मिनट, विलायक बी का 0%
      2. स्विचन वाल्व का उपयोग करने के लिए eluent के पहले ३५ मिनट के लिए बेकार और ३५-४२ ंयूनतम अंश ईएसआई स्रोत है । सुनिश्चित करें कि योगोत्पाद मानक सेट अंतराल में स्तंभ से elute (३५-४२ मिनट) । यदि आवश्यक हो तो समायोजन करें ।

9. सामान्य 2 का परिमाणीकरण-HPLC द्वारा deoxyribonucleosides-यूवी

  1. इस कार्य में उपयोग किए जाने वाले उपकरण के समान किसी उपकरण का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. Elute एक २५० मिमी x ४.६ मिमी आईडी, 5 μm, C18 एक C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस (४.० x ३.० mm आईडी) से जुड़ी ०.१% फॉर्मिक एसिड और मेथनॉल की एक ढाल के साथ कॉलम ।
    1. निंन ग्रैडिएंट प्रोग्राम का उपयोग करें: 0 से 25 मिनट, 0 से 18% मेथनॉल; 25 से 27 मिनट, 18 से 0% मेथनॉल; 27 से ३७ मिनट, 0% मेथनॉल) 1 मिलीलीटर/न्यूनतम और 30 डिग्री सेल्सियस की प्रवाह दर पर ।
    2. 2 ' के लिए आरक्षित प्रत्येक नमूने के 5 μL इंजेक्ट-deoxynucleosides परिमाणीकरण ।
    3. DGuo और dAdo चोटियों के एकीकरण के लिए २६० एनएम पर पिताजी डिटेक्टर सेट करें ।

10. डीएनए घावों का परिमाणीकरण

  1. 8-oxodGuo की चोटियों को एकीकृत, [15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εदासो, [15n5] 1,n6-εदासो, 1,n2-εdguo, और [15n5] 1,n2 -एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस एनालिसिस से εdguo ।
    1. 8-ऑक्सोडगुओ/[15छ5] 8-ऑक्सोडगुओ, 1,ढ6-εदाडो/ ] 1,N2-εdguo अंशांकन घटता है और नमूनों के लिए ।
    2. Y अक्ष में चरण 10.1.1 में प्राप्त किए गए क्षेत्र अनुपात और x अक्ष में प्रत्येक बिंदु में मौजूद analytes की मात्रा का उपयोग करके अंशांकन वक्र प्लॉट करें ।
    3. कदम 10.1.1 में गणना अनुपात और चरण 10.1.2 के अंशांकन घटता का उपयोग कर प्रत्येक अंतःक्षिप्त नमूने में घावों की मात्रा (fmol) की गणना.
  2. HPLC-यूवी विश्लेषण से dGuo और dAdo की चोटियों को एकीकृत ।
    1. Y अक्ष में चरण १०.२ में प्राप्त किए गए क्षेत्रों और x अक्ष में प्रत्येक बिंदु में मौजूद analytes की मात्रा का उपयोग करके अंशांकन वक्र प्लॉट करें ।
    2. चरण १०.२ में प्राप्त क्षेत्रों और चरण 10.2.1 के अंशांकन घटता का उपयोग कर प्रत्येक अंतःक्षिप्त नमूना में dGuo और dAdo की मात्रा (nmol) की गणना ।
  3. इस बात पर विचार ५० करते हुए कि चरण 10.2.2 में परिकलित मात्रा 5 μl के नमूना आयतन में मौजूद है, जबकि एचपीएलसी-ईएसआई-ms/ms प्रणाली में इंजेक्शन लगाए गए थे ।
    नोट: 8-oxodGuo विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नमूनों में dGuo की राशि की गणना करने के लिए, बस ५० द्वारा चरण 10.2.2 में प्राप्त राशि (nmol/μL) गुणा । 1,n6-εदासो और 1,n2-εdguo के विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए नमूनों में दासो और डगूओ की मात्रा की गणना करने के लिए, ठोस चरण निष्कर्षण के बाद एकाग्रता चरण पर विचार करें । एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस प्रणाली में ५० μL अंतःक्षिप्त की मात्रा मूल नमूने के ११४.३२ μL से मेल खाती है । मात्रा (nmol/μL) चरण 10.2.2 में प्राप्त सही मान प्राप्त करने के लिए ११४.३२ से गुणा करना चाहिए ।
  4. मोलर भिन्नों की गणना कीजिए 8-ऑक्सोडगूओ/डगूओ, 1,ढ6-εदाडो/दगुओ, 1,ढ2-εदगुो/दगुओ । अनुपात (fmol घावों/nmol सामांय deoxynucleoside) प्रति 106 घावों की संख्या दे सामांय dguo या दासो ।

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Representative Results

औसत डीएनए सांद्रता (± SD) चूहों जिगर (~ 1 जी ऊतक), फेफड़ों (~ ०.२ जी ऊतक) और गुर्दे (~ ०.४ जी ऊतक) से प्राप्त किया गया, क्रमशः, ५,०६८ ± २,६१५, ४,३६९ ± १,०२१, और ३,२२३ ± ७२३ μg/एमएल के अंतिम मात्रा में २०० μL । एचपीएलसी द्वारा प्राप्त प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम-शुद्घ डीएनए के पिता को चित्र 3में दर्शाया गया है । आरएनए राइबोन्यूक्लियोसाइड्स से मुक्त चार 2 '-डिऑक्सीन्यूक्लिओसाइड ' की उपस्थिति, जो इसी 2 '-डीऑक्सीन्यूक्लिओसाइड से तुरंत पहले उट जाती है, डीएनए शुद्धता को प्रदर्शित करता है ।

एचपीएलसी से प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम्स-ईएसआई-एमएस/एमएस का विश्लेषण 8-oxodGuo, 1,एन6-Εदाओ और 1,n2-εdguo का आकलन एमआईसीई ऊतक में डीएनए नमूनों को 4 से 6 के आंकड़ेमें दर्शाया गया है । चित्र 4 में यूवी का पता लगाने के साथ प्राप्त किए गए वर्णलेख से पता चलता है कि चार 2 '-deoxynucleosides पहले स्तंभ से ~ 10 मिनट तक eluting, 8 से एक अच्छा जुदाई-oxodGuo, अवांछित interferences को नष्ट करने के साथ । सामांय 2 '-deoxynucleosides के विश्लेषण में मौजूद नहीं थे 1,n6-εdado और 1,n2-εdguo, के रूप में वे ठोस चरण निष्कर्षण प्रक्रिया में समाप्त हो गया । इस कार्य में प्रयुक्त मानकों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रा को चित्र 7में दर्शाया गया है ।

8-oxodGuo, 1,n6-εदावो और 1,n2-εdguo के परिमाण के लिए ठेठ रैखिक अंशांकन वक्र चित्र 8३४में दर्शाए गए हैं । तरीके सटीक और सटीक थे, के रूप में तालिका 2३४में प्रस्तुत किया । डीएनए aliquots ३६७ fmol 8-oxodGuo के साथ पूरक के लिए गणना की अंतर-दिवसीय शुद्धता १६.९७% था, 1 के 10 fmol के साथ पूरक,n2-εdguo १४.०१% था, और 1 के fmol के साथ पूरक,n6-εदासो १६.६६% था । स् तंभ के लिए निर्धारित मानकों के लिए मात्रा (S/N = 10) की सीमाएं 8-oxodGuo के लिए 25 एफएमओएल, ०.३ एफएमओएल के लिए1, एन6-εदासो, और 1,एन2-εdguo३४के लिए एक एफएमओएल थे ।

इन पद्धतियों में फेफड़ों, यकृत और ए/जे२.५चूहों के डीएनए नमूनों में 8-ऑक्सोडगुओ, 1,एन2-εडगूओ और 1,एन6-εदाओ के परिमाणीकरण के लिए आवेदन किए गए थे । अध्ययन नियंत्रण३४के रूप में स्वस्थानी परिवेशी वायु में उजागर उन । पाया स्तर तालिका 3में दिखाया गया है, और पीएम२.५ जोखिम३४द्वारा फेफड़ों, जिगर और गुर्दे में डीएनए घावों के प्रेरण से संकेत मिलता है ।

Figure 3
चित्रा 3 . माउस फेफड़े से निकाले गए डीएनए नमूने के हाइड्रोलाइटेट का वर्णलेख । क्रोमेटोग्राम को एचपीएलसी-डैड सिस्टम से २६० एनएम पर प्राप्त किया गया था । चार 2 '-deoxynucleosides संकेत कर रहे हैं: डीसी, 2 '-deoxynucleosides; डी, 2 '-deoxyadenosine; डीजी, 2 '-deoxyguanosine; डीटी, 2 '-डिऑक्सीथाइमिडीन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . प्रतिनिधि क्रोमेटोग्राम्स 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2 ́-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ) और आंतरिक मानक [15एन5] 8-ऑक्सोडगुओ को एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस, साथ ही सामान्य 2 '-डीऑक्सीन्यूक्लोसाइड्स का पता दिखा पहले स्तंभ से बाहर निकलकर पिताजी का पता लगाने (λ = २६० एनएम) और कचरे को डायवर्ट कर दिया गया । डीएनए का नमूना माउस फेफड़े से निकाला गया । एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस द्वारा किए गए विश्लेषणों को प्रतिबिंबों में विनिदष्ट विखंडनों का उपयोग करते हुए मल्टीपल रिएक्शन मॉनीटरिंग (एमआरएम) के साथ निष्पादित किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 . प्रतिनिधि chromatograms 1 का पता दिखा रहा है, एसएन 6 । -etheno-2 ́-deoxyadenosine (1,n6-εदासो) और आंतरिक मानक [15N5] 1, एसएन 6 । -εदाओ एचपीएलसी द्वारा-ईएसआई-एमएस/एमएस । चूहे के गुर्दे से डीएनए का नमूना निकाला गया । विश्लेषण एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) छवियों में निर्दिष्ट fragmentations का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 6
चित्रा 6 . प्रतिनिधि chromatograms 1 का पता दिखा रहा है, एसएन 2 । -etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) और आंतरिक मानक [15N5] 1, एसएन 2 । -एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस द्वारा εdguo । डीएनए का नमूना माउस लिवर से निकाला गया । विश्लेषण एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी (MRM) छवियों में निर्दिष्ट fragmentations का उपयोग कर के साथ प्रदर्शन किया गया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 7
चित्रा 7 . इस कार्य में प्रयुक्त मानकों का द्रव्यमान स्पेक्ट्रा । स्पेक्ट्रा MS2 में प्राप्त किया गया था 20 eV की टक्कर ऊर्जा का उपयोग करने के लिए टुकड़ा [M + H]+ आयनों । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 8
अंक 8 . 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2'-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ), 1,एन2-एथनो-2 ́-डिऑक्सीग्वानोसिन (1,एन2-εडगूओ) और 1, के परिमाणीकरण के लिए एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस द्वारा प्राप्त अंशांकन वक्र द6-एथिनो-2́-डिऑक्याडेनोसीन (1,एन6-εदाडो) । सापेक्ष क्षेत्र का अर्थ होता है, घाव और उसके संबंधित [15N5] आंतरिक मानक के बीच का क्षेत्र अनुपात । यह आंकड़ा Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

ईएसआई-MS/MS पैरामीटर्स 8-oxodGuo एथिनो एड्रीडक्ट
पर्दा गैस 20 पीएसआई 20 पीएसआई
छिटकना गैस ५५ ५०
आयन स्रोत गैस ५० साई ४० साई
संघट्ट प्रेरित वियोजन गैस मध्यम मध्यम
आयन फुहार वोल्टता ५००० ४५००
ईएसआई जांच तापमान ४५० ४५०
Declustering विभव 31 वी, 8-oxodGuo ४१ V, 1, N6-εदाडो
31 V, [15N5] 8-oxodguo ४१ V, [15N5] 1, n6-εdado
४५ V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, n2-εdguo
संघट्टन ऊर्जा 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εदासो
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εदाडो
27 eV, 1, N2-εdguo
27 मट, [15N5] 1, n2-εdguo
संघट्टन कक्ष निकास विभव 16 वी, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εदासो
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, n2-εdguo
प्रवेश क्षमता 10 वी 10 वी

तालिका 1. डीएनए घावों का पता लगाने के लिए ईएसआई-MS/MS उपकरण में प्रयुक्त पैरामीटर । इस तालिका Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है ।

आधारिक स्तर जोड़ा पाया पता लगाया (-) बेसल सटीकता Cv
औसत ± एसडी (fmol) fmol औसत ± एसडी (fmol) औसत (एफएमओएल) % %
8-oxodGuo
३७३.०० ± २.७१ 0 ३७२.७९ ± ५०.६ - - १३.५७
३७३.९८ ± ४.८६ ३६७ ७५५.४१ ± १०७.९२ ३८१ १०३.९३ १४.२९
३७४.८४ ± ५.१९ ७३४ १०६९.५७ ± १०८.५१ ६९५ ९४.६५ १०.१४
३५७.९४ ± १५.०५ १४६९ १६७१.६७ ± ४४.२७ १३१४ ८९.४३ २.६५
३७१.०७ ± २.४३ २२०४ २२७२.०१ ± ४०.२ १९०१ ८६.२५ १.७७
1, N2-εdguo
०.५४ ± ०.०१ 0 ०.५४ ± ०.०९ - - १६.८८
०.५४ ± ०.०१ 1 १.४७ ± ०.१६ ०.९३ ९३.३९ ११.१७
०.५५ ± ०.०१ 5 ५.३० ± ०.७२ ४.७६ ९५.११ १३.५०
०.५३ ± ०.०१ 10 १०.६० ± ०.३९ १०.०६ १००.६३ ३.६७
०.५४ ± ०.०१ 20 २०.२० ± ०.९३ १९.६६ ९८.२९ ४.६०
1, N6-εदासो
२.०८ ± ०.१० 0 २.२९ ± ०.३९ - - १७.०५
२.०५ ± ०.०४ 1 ३.०६ ± ०.४७ १.०१ १००.८९ १५.३१
१.९९ ± ०.०६ 5 ७.८७ ± १.६६ ५.८८ ११७.६० २१.१०
२.०३ ± ०.०७ 10 १२.४३ ± १.२५ १०.४१ १०४.०६ १०.०६
१.९७ ± ०.०३ 20 २२.४२ ± ३.८९ २०.४६ १०२.२९ १७.३४

तालिका 2 । विधि सटीकता और भिंनता गुणांक (CV) 8-oxodGuo, 1, के परिमाण के लिए एसएन 2 । - Εdguo और 1, एसएन 6 । -εदाड़ो डीएनए में । इस तालिका Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है ।

परिवेशी वायु PM२.५             एन P मान
औसत ± SEM औसत ± SEM   
फेफड़ा
8-oxodGuo/108 dguo २१२४ ± ५६.९६ २४६६ ± ९३.१० 6 ०.०१
1, N2-εdguo/108 dguo एन डी एन डी - -
1, N6-εdado/108 दासो १.४१ ± ०.२३ १.४४ ± ०.१३ 7 एन एस
जिगर
8-oxodGuo/108 dguo २८४८ ± १८३.५ २९४९ ± २२३.८ 6 5 एन एस
1, N2-εdguo/108 dguo ७.७९ ± २.४९ २४.९४ ± ५.२१ 4 ०.०२
1, N6-εdado/108 दासो २.८२ ± ०.३० २.१८ ± ०.२५ 6 एन एस
गुर्दे
8-oxodGuo/108 dguo १८५४ ± ८७.१३ २३६३ ± १५७.० 6 ०.०२
1, N2-εdguo/108 dguo एन डी एन डी - -
1, N6-εdado/108 दासो १.०९ ± ०.१५ १.५२ ± ०.१२ 7 ०.०४
(एन एस, महत्वपूर्ण नहीं; ND, पता नहीं)

तालिका 3. ए/जे चूहों ऊतक नमूनों में डीएनए घावों के स्तर । चूहों को परिवेशी वायु और परिवेशी वायु के संपर्क में२.५ (पीएम२.५ केंद्रित 30 बार) में समृद्ध किया गया । दो समूहों के बीच का मतलब है (परिवेशी वायु और पीएम२.५) टी परीक्षण का उपयोग कर की तुलना में थे । P मान ०.०५ से कम था, जब परिणाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था । इस तालिका Oliveira एट अल.३४से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

एचपीएलसी विधियों द्वारा 8-oxodguo विश्लेषण में पाया एक प्रमुख समस्या डीएनए निष्कर्षण, डीएनए hydrolysis के workup प्रक्रियाओं के दौरान इसके गठन के संभावित शामिल है, और डीएनए hydrolysis की एकाग्रता22,३८। 8-oxodguo विरूपण तथ्यात्मक गठन की समस्या को कम करने के लिए, यह सभी डीएनए निष्कर्षण, भंडारण और हाइड्रोलिसिस समाधान के लिए deferoxamine के अलावा सिफारिश की है, सोडियम आयोडाइड chaotropic विधि के उपयोग और डीएनए निष्कर्षण में phenol के परिहार, के रूप में साथ ही अंतिम परिणाम३९के लिए नकली ऑक्सीकरण के योगदान को कम करने के लिए हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया में १०० माइक्रोग्राम के करीब डीएनए की मात्रा का उपयोग करें । हमने ऊपर उद्धृत सिफारिशों को ध्यान में रखा, सिवाय डीएनए निष्कर्षण के लिए सोडियम आयोडाइड चायोट्रॉपिक विधि के उपयोग को छोड़कर । इसके बजाय, सादगी के लिए, हम उपयोग करने से पहले उन्हें deferoxamine जोड़ने, डीएनए निष्कर्षण के लिए वाणिज्यिक समाधान का इस्तेमाल किया । इसके अलावा, प्राप्त डीएनए hydrolysates सीधे HPLC की एक पहले कॉलम में इंजेक्शन थे-ईएसआई-एमएस सिस्टम 8-oxodGuo के एक पिछले जुदाई के लिए सामांय nucleosides से । 8-oxodguo के क्षालन के तुरंत पहले, एक स्विचन वाल्व एक दूसरे स्तंभ जहां आगे जुदाई और चोटी संकुचन हासिल किया गया करने के लिए पहले स्तंभ eluent हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह दृष्टिकोण 8-oxodGuo हस्तक्षेप से मुक्त परिमाणीकरण के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता की अनुमति दी । डीएनए में 8-oxodguo की मात्रा के लिए सबसे समान दृष्टिकोण chao और सहकर्मियों द्वारा वर्णित किया गया था22, जो नमूना सफाई के लिए एक जाल स्तंभ का इस्तेमाल किया और 8-oxodguo प्रतिधारण से पहले नमूना क्षालन विश्लेषणात्मक स्तंभ में, के बीच एक स्विचन वाल्व का उपयोग स्तंभ । वैकल्पिक रूप से, 8-oxodGuo के एक एकाग्रता कदम डीएनए hydrolysates HPLC से पहले एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/

Hplc विश्लेषण के आधार पर रोडेंट फेफड़ों केऊतकों में 8-oxodguo के बेसल स्तर की सूचना, १८० से सीमा-450/108 dguo23,३९,४१,४२,४३, १,३४०-2120/108 dguo४४, या लगभग 3000/10 dguo४५,४६, सोडियम आयोडाइड का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण तरीकों से प्राप्त ंयूनतम मूल्यों के साथ । मतलब 8-oxodGuo स्तर यहां परिवेशी वायु के संपर्क में चूहों के फेफड़ों में पाया 2124/ पीएम२.५ (सारणी 3)३४में समृद्ध परिवेशी वायु के संपर्क में आने वाले पशुओं में यह स्तर 2466/108 डगुओ तक बढ़ गया है । यह संभव है कि सोडियम आयोडाइड चैट्रॉपिक विधि से डीएनए को निकालते हुए समूहों के बीच मतभेदों का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता को सुधारा जा सके । वर्तमान अध्ययन में, औसत 8-oxodGuo स्तर नियंत्रण में पाया चूहों फेफड़ों, गुर्दे, और जिगर डीएनए क्रमशः, २.०, १.८, और २.७ बार मध्यम बेसल स्तर (1047/108 dguo) ऑक्सीडेटिव पर यूरोपीय मानक समिति द्वारा प्राप्त से अधिक डीएनए में 8-oxodGuo के एक अंतर प्रयोगशाला मूल्यांकन में (ESCODD) सुअर जिगर के मानक नमूनों से निकाले३८।

डीएनए में 1,छ-Εदाडो तथा 1,ढ2-εडगुओ का पता लगाने के लिए मुख्य सीमा विधि संवेदनशीलता है, क्योंकि ये घाव बहुत निम्न स्तर पर होते हैं । डीएनए में 1,एन2-डगूओ का निम्नतम स्तर एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस द्वारा परिमाणित किया गया, ०.८७-4 घावों की रेंज में थे प्रति 108 dguo एक मानव कोशिका रेखा और चूहे के ऊतकों में25,४७। एक तरह से संवेदनशीलता और उनकी मात्रा के लिए चयनशीलता में सुधार करने के लिए उंहें डीएनए hydrolysates के बड़े नमूनों से ध्यान केंद्रित है, ठोस चरण निष्कर्षण का उपयोग कर । इस सफाई कदम hplc विश्लेषणात्मक स्तंभों में अधिक से अधिक १०० माइक्रोग्राम डीएनए hydrolysates के इंजेक्शन से पैदा कर सकता है कि वर्णलेखी मुसीबतों को हल करती है । हम इस दृष्टिकोण मांय विधि यहां प्रस्तुत में इस्तेमाल किया । इस अध्ययन में पाया गया 1,एन6-εdado के स्तर३४ अल्ट्रासेन्सिव इम्यूनोएफ़िनिटी/३२पी-पोस्टलेबलिंग४८,४९, को नियोजित अध्ययनों में प्राप्त रेंज के भीतर आते हैं । ५० , ५१ और अंय hplc रोजगार समूहों द्वारा वर्णित से कम हैं-ईएसआई-ms/ इसी प्रकार, यहां निर्धारित किए गए 1,एन2-εdguo का स्तर३४ हैपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस का उपयोग करके गार्सिया25 और अंगली26 द्वारा सूचित निम्नतम स्तरों के अनुरूप है ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त उपकरणों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता के साथ एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस प्रणालियां उपलब्ध हैं । इस तरह के सिस्टम के उपयोग की अनुमति देता है डीएनए की छोटी मात्रा है, जो स्थितियों में ऊतक उपलब्धता एक सीमा है के लिए यहां प्रस्तुत तरीकों के अनुप्रयोगों broadens के विश्लेषण । यहां प्रस्तुत तरीके उनके मानकों और समस्थानिक मानकों की उपलब्धता के आधार पर अन्य संशोधित डीऑक्सीन्यूकोसाइड की मात्रा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । विश्लेषण में शामिल सभी अणुओं की तेज चोटियों को प्राप्त करने के लिए क्रोमेटोग्राफिक स्थितियों का समायोजन आवश्यक होगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

FAPESP (Fundação डे Amparo à Pesquisa क्या Estado de साओ पाउलो, Proc. 2012/22190-3 और 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 और 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-रिटोरिया डी Pesquisa डा Universidade de साओ पाउलो), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FAPESP/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), झपकी Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) और CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8) । टी एफ Oliveira और ए एफ Oliveira FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) और CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento डे Pessoal डी Nível बेहतर) से छात्रवृत्ति प्राप्त की । एम. एच. जी. मेडेरोस, पी. डी. Mascio, पी. एच. एन. साल्दिवा और ए. पी. एम. लोरेरो ने CNPq से फैलोशिप प्राप्त की |

कुछ आंकड़े और इस काम में मौजूद तालिकाओं मूलतः Oliveira A.A.F. एट अल. Genotoxic और epigenotoxic प्रभाव में प्रकाशित किया गया चूहों में केंद्रित परिवेश ठीक पार्टिकुलेट मैटर (पीएम२.५) साओ पाउलो शहर, ब्राज़िल से अवगत कराया । कण और फाइबर विष विज्ञान । 15, ४० (२०१८) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४७ मास स्पेक्ट्रोमेट्री डीएनए adनलिकाएं डीएनए ऑक्सीकरण जीनोविषाक्तता ऑक्सीडेटिव तनाव ठीक कण पदार्थ
मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा तीन डीएनए घावों का परिमाणीकरण और परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर के संपर्क में आने वाले चूहों के ऊतकों में उनके स्तरों का आकलन
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Franco de Oliveira, T., Falcão… More

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H. N., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

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