Summary
Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.
Abstract
Los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos a la biotransformación o inducen estrés oxidativo. Entre las nucleobasas oxidadas, la más estudiada es la 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN. Los aldehídos y los epoxialdehídos resultantes del proceso de peroxidación lipídica son moléculas electrofílicas capaces de formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como los aductos de etheno 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) y 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación. Los métodos selectivos y sensibles para su cuantificación en el ADN son necesarios para el desarrollo de estrategias preventivas que ralentizan las tasas de mutación celular y el desarrollo crónico de la enfermedad (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas). Entre los métodos sensibles disponibles para su detección (cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a detectores de espectrometría de masas en tándem o electroquímico, ensayo de cometas, inmunoensayos, 32P-etiquetado posterior), los más selectivos son los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas tándem (HPLC-ESI-MS/MS). La selectividad es una ventaja esencial al analizar muestras biológicas complejas y HPLC-ESI-MS/MS evolucionada como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente.
Presentamos aquí métodos validados, precisos y precisos de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo y 1,n2-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de los efectos de la exposición ambiental PM2,5 .
Introduction
Algunas especies reactivas de oxígeno (ROS) son capaces de oxidar enlaces dobles de carbono de bases de ADN y algunos carbonos en la fracción desoxirribosa, generando bases oxidadas y roturas de hebras de ADN1. Como una molécula cargada negativamente rica en átomos de nitrógeno y oxígeno, el ADN es también un objetivo para los grupos electrófilos que reaccionan covalentemente con los sitios nucleófilos (nitrógeno y oxígeno), dando productos que se denominan aductos de ADN2. Por lo tanto, los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos sobre la biotransformación, o inducen el estrés oxidativo1, 2. Aunque las bases de ADN modificadas se pueden eliminar del ADN por la reparación de la escisión de base o nucleótido (BER o NER), la inducción de un desequilibrio entre la generación y la eliminación de las lesiones de ADN en favor de la primera conduce a un aumento neto de sus niveles en el ADN horas extras3 < /C5 >. Los resultados son el aumento de las tasas de mutación del ADN, la reducción de la expresión génica y la disminución de la actividad proteica2,4,5,6,7, efectos estrechamente relacionados con el desarrollo de enfermedades. Las mutaciones de ADN pueden afectar diversas funciones celulares, como la señalización celular, el ciclo celular, la integridad del genoma, la estabilidad del telómero, el epigenoma, la estructura de la cromatina, el empalme de ARN, la homeostasis proteica, el metabolismo, la apoptosis y la diferenciación celular8 ,9. Las estrategias para ralentizar las tasas de mutación celular y el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas) pasan por el conocimiento de las fuentes de mutación, entre ellas, las lesiones de ADN y sus causas.
Los ROS generados endógenamente en exceso, debido a la exposición a los contaminantes, la inflamación persistente, la fisiopatología de la enfermedad (p. ej., diabetes), etc., son causas importantes del daño de la biomolécula, incluyendo el ADN y el daño lipídico1. Por ejemplo, el radical hidroxilo altamente reactivo (OH) formado a partir de la reducción de H2O2 por iones metálicos de transición (fe2 +, cu+) oxida las bases de ADN, la fracción de azúcar de ADN y los ácidos grasos poliinsaturados en la difusión controlada tarifas10. Entre las 80 nucleobasas oxidadas ya caracterizadas3, el más estudiado es 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-oxodGuo, figura 1), una lesión que es capaz de inducir transversiones gt en células de mamíferos10,11. Se forma por la oxidación electrónica mono de guanina, o por el ataque de oxígeno de la guanina a radical hidroxilo o singlete en el ADN1. Los ácidos grasos poliinsaturados son otros objetivos importantes de los oxidantes altamente reactivos, tales como •Oh, que inician el proceso de peroxidación lipídica1,12. Da lugar a hidroperóxidos de ácidos grasos que pueden descomponerse a aldehídos electrófilos y epoxialdehídos, tales como malondialdehído, 4-hidroxi-2-Nonenal, 2,4-Decadienal, 4, 5-epoxi-(2E)-decenal, hexenal, Acrolein, Crotonaldehído, que son puede formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como malondialdehído-, propano-, o los aductos de etheno1,12,13. Los aductos de etheno 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo , figura 1) y 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado, figura 1 ) se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación14,15.
Figura 1. Estructuras químicas de las lesiones de ADN cuantificadas en el presente estudio. dR = 2 ́-desoxiribosa. Esta cifra ha sido modificada de Oliveira et al.34. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los estudios realizados a comienzos de la década de 1980 permitieron la detección sensible de 8-oxodGuo por cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a la detección electroquímica (HPLC-ECD). La cuantificación de 8-oxodguo por HPLC-ECD en varios sistemas biológicos sometidos a condiciones oxidantes condujo al reconocimiento de 8-oxodguo como un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN1,16. Aunque son robustos y permiten la cuantificación de 8-oxodGuo en la gama baja de fmol17, las mediciones de HPLC-ECD se basan en la precisión del tiempo de retención del analito para la identificación del analito y en la resolución de la cromatografía para evitar interferencias de otros componentes de la muestra. Como la detección electroquímica requiere el uso de sal (por ejemplo, fosfato de potasio, acetato de sodio) en la fase móvil, el mantenimiento de condiciones analíticas adecuadas necesita tiempo de limpieza de columna y equipo de rutina.
Alternativamente, el uso de la enzima de reparación de ADN bacteriológico formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) y, después, 8-oxoguanina glucosilasa 1 (hOGG1), para la detección y eliminación de 8-oxogua de ADN, surgió como una manera de la inducción de ADN alcalino lábil Sitios. Los sitios del lábil alcalino se convierten en roturas de la hebra de ADN y permiten la cuantificación indirecta muy alta sensible de 8-oxogua por electroforesis de gel de una sola célula alcalina ("ensayo de cometa"). La alta sensibilidad y la realización de los análisis sin necesidad de extracción de ADN celular son las principales ventajas de este tipo de ensayo. Da los niveles de estado estacionario más bajos de 8-oxoGua en el ADN, típicamente 7-10 veces más bajo que los niveles obtenidos por métodos bioanalíticos basados en HPLC. Sin embargo, es una medida indirecta de 8-oxogua y algunos inconvenientes son la falta de especificidad o la eficiencia desconocida de las enzimas de reparación utilizadas1,16,18.
Los inmunoensayos son otro conjunto de métodos utilizados para la detección de aductos de ADN 8-oxoGua1 y exocíclico, tales como 1,n6-dado y 1,n2-dguo12. A pesar de la sensibilidad, una deficiencia del uso de anticuerpos para la detección de lesiones de ADN es la falta de especificidad debido a la reactividad cruzada a otros componentes de muestras biológicas, incluyendo las bases de ADN normales1,12. Los aductos de ADN exocíclico, incluyendo 1,n6-DAdo y 1,n2-dguo, también pueden ser detectados y cuantificados por los ensayos altamente sensibles de 32P-postetiquetado12. La alta sensibilidad de 32P-el etiquetado posterior permite el uso de cantidades muy pequeñas de ADN (por ejemplo, 10 μg) para la detección de aproximadamente 1 aducto por 1010 bases normales19. Sin embargo, el uso de radioquímicos, la falta de especificidad química y la baja precisión son algunas desventajas19,20.
Una limitación compartida de los métodos citados anteriormente es la baja selectividad o especificidad para la detección de las moléculas deseadas. En este escenario, la HPLC acoplada a la espectrometría de masas tándem de ionización electrospray (HPLC-ESI-MS/MS y HPLC-MS3) evolucionó como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva 1 , 19 , 20. las ventajas de los métodos HPLC-ESI-MS/MS son la sensibilidad (típicamente en la gama baja de fmol) y la alta especificidad proporcionada por i) la separación cromatográfica, II) el patrón característico y conocido de fragmentación molecular dentro de la masa cámara de colisión espectrómetro, y III) la medición precisa de la relación masa a carga seleccionada (m/z) en el modo de monitorización de reacción múltiple1,19. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente1,12,19,20.
Se han utilizado varios métodos basados en HPLC-ESI-MS/MS para la cuantificación de 8-oxodguo, 1, N6-dado y 1,n2-dguo en el ADN extraído de diferentes muestras biológicas12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Las partículas finas (PM2,5) transportan productos químicos orgánicos e inorgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), Nitro-PAHS, aldehídos, cetonas, ácidos Carboxilicos, quinolinas, metales y iones solubles en agua, que pueden inducir inflamación y estrés oxidativo, condiciones que favorecen la ocurrencia de daño biomolecular y enfermedad30,31,32,33. Aquí presentamos métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo y 1,N2-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de la efectos de la exposición ambiental PM2,5 34.
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Protocol
Ratones a/J masculinos de cuatro semanas de edad, libres de patógenos específicos, se obtuvieron del centro de cría de animales de laboratorio de la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Río de Janeiro, Brasil, y fueron tratados en consecuencia al Comité ético de la Facultad de medicina, Universidad de São Paulo (Protocolo no 1310/09).
1. recolección de los tejidos de ratones
- Anestesiar el animal con xilazina y ketamina. Para un ratón con 30 g de peso corporal, inyectar una solución (no más de 2 mL) que contenga 2,63 mg de ketamina y 0,38 mg de xilazina, intraperitonealmente.
- Recolectar sangre (0,5-1,5 mL) para análisis complementarios (p. ej., actividad enzimática antioxidante, niveles de malondialdehído).
- Afeita el vello abdominal de la pelvis al proceso Apéndice xifoides. Haga una incisión en una línea media vertical en el área sin pelo. Hacer incisiones en líneas laterales horizontales para exponer los órganos abdominales.
- Cortar la aorta abdominal para promover la desangramiento y la eutanasia del animal.
- Eliminar los tejidos de interés (en este caso, hígado, riñones y pulmones).
- Para extirpar el hígado, corte la vena de cava inferior y la vena hepática porta.
- Para extirpar los riñones, sección de las venas y arterias renales.
- Para extirpar los pulmones, haga una incisión en las extremidades del diafragma y la circunferencia cerca de la pared torácica. Rompe las clavículas abriendo una tijera en el interior de la cavidad torácica. Cortar el hueso externo del proceso Apéndice xifoides hacia la tráquea, con el fin de exponer los pulmones y el corazón.
- Sostenga el pulmón con un fórceps, sección de la tráquea y los ligamentos alrededor de los pulmones. Retire cuidadosamente los pulmones del bloque más el corazón. Para extraer los pulmones del bloque, sostenga el corazón con un fórceps y corte todos los vasos en su base.
- Lavar los tejidos aislados inmediatamente en solución salina fría (0,9% NaCl), transferir a tubos criogénicos, e inmediatamente sumergir los tubos en nitrógeno líquido. Después de completar el trabajo, almacene los tubos a-80 ° c.
PRECAUCIÓN: el nitrógeno líquido en contacto directo con la piel, la mucosa o los ojos provoca quemaduras. Utilice una protección individual adecuada para evitar el contacto. Trabaje en un laboratorio ventilado para evitar asfixia debido al vapor de nitrógeno líquido.
2. extracción de ADN
Nota: el método de extracción de ADN fue modificado de Loureiro et al. (2009)35 para permitir el análisis de las lesiones estudiadas aquí.
- Transfiera los tubos que contienen los tejidos al hielo seco.
- Utilice una placa de cultivo colocada sobre hielo como base para cortar un trozo de tejido con un bisturí. Peso 1 g para uso inmediato. El tejido restante debe conservarse en hielo seco hasta que regrese al almacenamiento a-80 ° c.
Nota: es importante evitar la descongelación del tejido restante para evitar la formación de artefactos si se necesitan repeticiones de los análisis. - A cada 1 g de tejido en tubos tapados de 50 mL, añadir 10 mL de la solución de lisis celular comercial que contiene 0,5 mM deferoxamina y mantener en hielo.
Nota: Añadir deferoxamina al volumen de la solución para su uso inmediato. Para cada 100 mL de solución, Añadir 0,0328 g de la sal de mesylato deferoxamina. - Homogeneizar los tejidos utilizando un homogeneizador de tejido hasta obtener una solución homogénea sin fragmentos de tejido. Mantenga el tubo frío (sobre hielo) durante la homogeneización. Utilice una velocidad baja para evitar el calentamiento.
- Añadir 150 μL de solución de proteinasa K (20 mg/mL) a cada muestra homogeneizada. Agitar los tubos por inversión y mantenerlos a temperatura ambiente durante la noche.
- Añadir 40 μl de ribonucleasa A solución (15 mg/ml), agitar por inversión, y mantener los tubos A temperatura ambiente durante 2 h.
Nota: preparar ribonucleasa una solución en tampón de acetato de sodio 10 mm, pH 5,2 para evitar la precipitación. Calentar la solución a 100 ° c durante 15 min antes de utilizarla para obtener una solución libre de desoxiribonuclease. - Añadir 5 mL de la solución comercial de precipitación proteica, vórtice vigorosamente y centrifugar a 2.000 x g, 4 ° c, durante 10 minutos.
- Transfiera los sobrenadantes a 50 mL de tubos tapados que contengan 10 mL de isopropanol frío. Invierta los tubos suavemente varias veces hasta la observación del ADN precipitado.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí, manteniendo los tubos a-20 ° c. - Recoja el ADN precipitado usando una Piera Pasteur cerrada al final. Transferirlo a tubos que contengan 4 mL de tampón Tris de 10 mM, deferoxamina de 1 mM, pH 7,0.
- Después de que el ADN se disuelva por completo en la solución anterior (no se torbellino), añadir 4 mL de una solución de cloroformo que contiene 4% de alcohol isoamílico.
- Invierta los tubos 10 veces para homogeneización, Centrifugue a 2.000 x g, 4 ° c, durante 10 minutos para separar las dos fases, y transfiera la fase superior a un nuevo tubo.
- Repite los pasos 2,10 y 2,11 dos veces más.
- Añadir 8 mL de etanol absoluto y 0,4 mL de una solución NaCl de 5 M para precipitar el ADN.
- Recoger de nuevo el ADN precipitado y transferirlo a 3 mL de etanol al 70%. Repite este paso una vez más.
- Deseche la solución de etanol con precaución e invierta los tubos que contienen el ADN precipitado en papel absorbente para eliminar el exceso de la solución.
- Añadir 200 μL de solución deferoxamina de 0,1 mM para disolver el ADN. Mantener los tubos a 4 ° c hasta que el ADN esté completamente rehidratado (durante la noche).
- Determinar la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm y su pureza por la relación de absorbancia de 260/280 nm.
Nota: para determinar la concentración de ADN, transferir una alícuota de 10 μL de la solución de ADN a 990 μL de agua ultrapura (dilución 100x). Multiplicar la absorbancia a 260 Nm (debe ser inferior a 1) por 50 (50 μg/mL es la concentración de ADN de doble cadena cuando la absorbancia de una solución de 1 cm de longitud de trayecto a 260 nm es 1) y por la dilución utilizada (100x) para obtener la concentración de ADN en μg/mL. Si la absorbancia a 260 nm es superior a 1, son necesarias diluciones adicionales. La relación de absorbancia de 260/280 nm debe ser igual o superior a 1,8 para la pureza de ADN deseada, pero las proporciones alrededor de 1,6 son aceptables.
3. la hidrólisis enzimática del ADN
- Receta de análisis
- Análisis 1, n6-εdado y 1,n2-εdguo: a una ALÍCUOTA que contiene 150 μg de ADN, añadir 7,5 μl de 200 mm Tris/mgcl2 buffer (pH 7,4), 1,4 μL de la solución estándar interna que contiene 250 fmol/μl de [15N5 ] 1,n6-εdado y [15N5] 1,n2-εdguo, y 15 unidades de desoxirribonucleasa I. Ajuste el volumen final a 200 μL con agua ultrapura, restando los volúmenes de enzimas que se utilizarán en el paso 3.2.1.
- 8-análisis de oxodGuo: a una alícuota que contiene 80 μg de ADN, añadir 3,8 μL de 200 mM Tris/MgCl2 buffer (pH 7,4), 2 μl de la solución estándar interna que contiene 1.000 fmol/μl de [15N5] 8-oxodguo, y 8 unidades de desoxiribonuclease I. Ajustar el volumen final a 100 μL con agua ultrapura, restando los volúmenes de enzimas que se utilizarán en el paso 3.2.2.
Nota: las normas internas [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,N2-εdguo y [15n5] 8-oxodguo pueden ser sintetizadas y caracterizadas como descrito35,36,37. Las cantidades de las normas internas en los volúmenes de muestras inyectadas deben ser las mismas que las de los volúmenes de la curva de calibración inyectada.
- Incubar las muestras a 37 ° c durante 1 hora.
- Muestras del paso 3,1: Añadir 0,006 unidades de fosfodiesterasa I de Crotalus Atrox y 15 unidades de fosfatasa alcalina de la mucosa intestinal bovina.
- Muestras del paso 3,2: Añadir 0,0032 unidades de fosfodiesterasa I de Crotalus Atrox y 8 unidades de fosfatasa alcalina de la mucosa intestinal bovina.
- Incubar las muestras a 37 ° c durante 1 hora.
- Centrifugar las muestras a 14.000 x g durante 10 minutos.
- Muestras del paso 3.2.1: separar 10 μL de cada muestra para la cuantificación de los desoxinucleósidos (dAdo, dGuo) por HPLC/DAD (paso 9). Someter el volumen residual a la extracción de fase sólida (paso 4).
- Muestras del paso 3.2.2: transferir 80 μL del sobrenadante a viales para preparaciones inyectables de 50 μL (1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo) en el sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reserve los 20 μL restantes para la cuantificación de dGuo por HPLC/DAD (paso 9).
4. extracción de fase sólida para análisis de 1, n6-Εdado y 1, n2-εdguo
- Cargar los cartuchos (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) con 1 mL de la siguiente secuencia de soluciones: 100% de metanol, agua desionizada, muestra de ADN hidrolizado, agua desionizada, 10% de metanol, 15% de metanol y 100% de metanol (a recoger).
Nota: no deje los cartuchos secos entre las aplicaciones de las diferentes soluciones. Agregue la siguiente solución inmediatamente después de que la solución anterior penetre completamente en el cartucho. - Secar al vacío la última fracción de elución (100% de metanol) que contiene los aductos.
- Resuspende las muestras secas en 83,1 μL de agua ultrapura inmediatamente antes del análisis de HPLC-ESI-MS/MS, para obtener 200 fmol de cada norma interna en 50 μL de cada muestra.
5. preparación de las curvas de calibración
- Preparar al menos cinco puntos en el intervalo de 300 a 6.000 fmol de 8-oxodGuo estándar, con la cantidad fija de 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo en cada punto. Considere estas cantidades en el volumen inyectado.
- Preparar al menos cinco puntos en el intervalo de 1 a 40 fmol de 1,n6-Εdado y 1,n2-εdguo, con cantidades fijas de 200 fmol de [15n5] 1,n6-εdado y [15n5] 1, N 2-εdguo en cada punto. Considere estas cantidades en el volumen inyectado.
- Preparar al menos cinco puntos en el intervalo de 0,05-1 nmol de dGuo y dAdo. Considere estas cantidades en el volumen inyectado.
6. preparación de muestras de ADN para la validación del método
- Análisis 1, n6-εdado y 1,n2-Εdguo: añadir cantidades variables de 1,N6-εdado y 1,n2-εdguo (p. ej., 1,75, 8,75, 17,5 y 35 fmol) y cantidades fijas de [15N5] 1, N6-εdado y [15N5] 1,N2-εdguo (350 fmol) a 100 μg de ADN de timo de becerro y llevar a cabo la hidrólisis enzimática como se describe en el paso 3. Procese las muestras en cuadruplicado en dos días diferentes. Utilice las muestras para la precisión del método y la evaluación de precisión.
Nota: el volumen final de los hidrolizados de ADN será de 200 μL (paso 3), de los cuales se separarán 10 μL para la cuantificación de desoxinucleósidos por HPLC/DAD (paso 9). La solución restante (190 μL) se someterá a una extracción de fase sólida (paso 4), la fracción seca se resuspendará en 83,1 μL (paso 4,3), de los cuales se inyectarán 50 μL en el sistema HPLC-ESI-MS/MS. Las cantidades de 1,n6-Εdado y 1,n2-εdguo inyectado serán 1, 5, 10 y 20 fmol, con 200 fmol de [15n5] 1,N6-εdado y [15n5] 1,n 2-εdguo en cada muestra. - 8-análisis de oxodGuo: añadir cantidades variables de 8-oxodGuo (p. ej., 734, 1.468, 2.938 y 4.408 fmol) y una cantidad fija de [15N5] 8-oxodguo (2.000 fmol) a 100 μg de ADN del timo de becerro y llevar a cabo la hidrólisis enzimática como se describe en el paso 3. Procese las muestras en cuadruplicado en dos días diferentes. Utilice las muestras para la precisión del método y la evaluación de precisión.
Nota: el volumen final de los hidrolizados de ADN será de 100 μL (paso 3), de los cuales se inyectarán 50 μL en el sistema HPLC-ESI-MS/MS. Las cantidades de 8-oxodGuo inyectados serán 367, 734, 1469 y 2204 fmol, con 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo en cada muestra. - Añadir 13,125 fmol de 1,N6-εdado (para obtener 7,5 fmol en el volumen de inyección) y 35 fmol de 1,n2-εdguo (para obtener 20 fmol en el volumen de inyección) a ocho muestras de 100 μg de ADN de timo de becerro.
- Añadir las normas internas [15n5] 1,n6-εdado y [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) a cuatro de las muestras. Proceda con la hidrólisis del ADN y la extracción de fase sólida de todas las muestras.
- Añadir las normas internas [15n5] 1,n6-εdado y [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) a las otras cuatro muestras.
- Utilice las muestras para calcular la recuperación de los aductos a partir de la extracción de fase sólida.
7. Análisis de HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxodGuo
- Al infunar el estándar 8-oxodGuo en el equipo, establezca los parámetros ESI-MS/MS para la mejor detección de su patrón de fragmentación mediante el control de reacción múltiple (MRM): m/z 284 [m + h] + → m/z 168 [m-2 '-Desoxyribose + h]+.
- Utilice los mismos parámetros para la detección de[15N5] 8-oxodguo : m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-Desoxyribose + h]+.
Nota: utilice un equipo equivalente o mejor que el equipo utilizado en este trabajo (consulte la tabla de materiales). Los parámetros ESI-MS/MS se configuraron como se describe en la tabla 1.
- Utilice los mismos parámetros para la detección de[15N5] 8-oxodguo : m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-Desoxyribose + h]+.
- Filtro (usando membranas porosas de 0,22 μm) y degasificar (usando un sonicador) todos los solventes de HPLC a base de agua.
- Utilice las siguientes condiciones de cromatografía para los análisis, montando el sistema como se muestra en la figura 2.
Nota: la columna a está conectada a la bomba binaria. Su eluyente se dirige a la detección UV y los desechos en los primeros 16 minutos y de 32 a 46 min de la cromatografía, como se muestra en la figura 2A. Esta es la columna a través de la cual la muestra se elude inmediatamente después de la inyección. La columna B está conectada a la bomba isocrática y al espectrómetro de masas. Recibe el eluyente de la columna a sólo en el intervalo de 16-32 min, cuando la válvula se cambia a la posición mostrada en la figura 2B. La conmutación de la válvula permite la conexión entre las dos columnas, que se eluye por el gradiente de la bomba binaria. La configuración mostrada en la figura 2B permite una mayor separación y estrechamiento de picos. Además, sólo la fracción cromatográfica de interés alcanza el espectrómetro de masas, mejorando la sensibilidad y la selectividad.- Elute una identificación de 50 x 2,0 mm, 2,5 μm, columna C18 (columna A de la figura 2) acoplada a un cartucho de protección de seguridad C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) con un degradado de 0,1% ácido fórmico (disolvente a) y metanol que contiene 0,1% ácido fórmico (disolvente B) a un caudal de 150 μL/min y 25 ° c.
- Utilice el siguiente programa de gradiente para la bomba binaria: de 0 a 25 min, 0-15% del disolvente B; 25 a 28 min, 15-80% del disolvente B; 28 a 31 min, 80% del disolvente B; 31 a 33 min, 80-0% del disolvente B; 33 a 46 min, 0% del disolvente B.
- Utilice la válvula de conmutación para dirigir los primeros 16 minutos de eluyente a los desechos y la fracción de 16-32 min a una segunda columna (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, C18, columna B de la figura 2) conectada a la fuente ESI y condicionada por la bomba isocrática con una solución de 15% me thanol en agua que contiene 0,1% de ácido fórmico (150 μL/min).
Nota: antes de utilizar el programa de válvula de conmutación del paso 7.3.1.2, compruebe si el estándar 8-oxodGuo eluta de la primera columna después de 16 min. Es importante cerrar la válvula a 32 min para utilizar el gradiente de la bomba binaria para eluir 8-oxodGuo de la segunda columna y obtener un pico cromatográfico agudo. La lesión 8-oxodGuo eluta de la segunda columna a aproximadamente 36 min. las variaciones del tiempo de retención del analito pueden ocurrir dependiendo de la columna y el equipo utilizado. Pueden ser necesarias adaptaciones del programa de gradiente de disolvente para HPLC.
- Elute una identificación de 50 x 2,0 mm, 2,5 μm, columna C18 (columna A de la figura 2) acoplada a un cartucho de protección de seguridad C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) con un degradado de 0,1% ácido fórmico (disolvente a) y metanol que contiene 0,1% ácido fórmico (disolvente B) a un caudal de 150 μL/min y 25 ° c.
Figura 2. Sistema de dos columnas utilizado para análisis de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxiguanosina (8-oxodGuo). A) configuración utilizada en los primeros 16 min y de 32 a 46 min de la cromatografía; B) configuración utilizada en el intervalo 16-32 min, permitiendo una mayor separación y estrechamiento de picos en la columna B antes de la elución a la fuente ESI del espectrómetro de masas. Esta cifra ha sido reeditada de Oliveira et al.34. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
8. Análisis de HPLC-ESI-MS/MS de 1, n 6 -Εdado y 1, n 2 -εdguo
- La infusión de los estándares 1,n6-Εdado y 1,n2-εdguo en el equipo, establece los parámetros ESI-MS/MS para la mejor detección de sus patrones de fragmentación mediante la monitorización de múltiples reacciones (MRM): m/z 276 [m + H]+ → M/z 160 [m 2 '-Desoxyribose + h]+ para detección de 1,N6-εdado y M/z 292 [m + H]+ → M/z 176 [m-2 '-Desoxyribose + h ]+ para la detección de 1,N2-εdguo.
- Utilice los mismos parámetros para la detección de [15n5] 1, N6-εdado (m/z 281 [m + h]+m/z → 165 [m-2 '-Desoxyribose + h]+) y [15N 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + H]+ → m/z 181 [m-2 '-Desoxyribose + H]+). Defina los parámetros ESI-MS/MS como se describe en la tabla 1.
| Los parámetros ESI-MS/MS | 8-oxodGuo | Los aductos de etheno |
| Gas cortina | 20 psi | 20 psi |
| El gas nebulizante | 55 | 50 |
| Ion Source gas | 50 psi | 40 psi |
| El gas de disociación inducido por colisión | Medio | Medio |
| Ion spray Voltage | 5000 | 4500 |
| ESI sonda de temperatura | 450 | 450 |
| Potencial de decluación | 31 V, 8-oxodGuo | 41 V, 1, N6-εdado |
| 31 V, [15N5] 8-oxodguo | 41 V, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 45 V, 1, N2-εdguo | ||
| 45V, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Energía de colisión | 23 eV, 8-oxodGuo | 25 eV, 1, N6-εdado |
| 23 eV, [15N5] 8-oxodguo | 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 27 eV, 1, N2-εdguo | ||
| 27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Potencial de salida de célula de colisión | 16 V, 8-oxodGuo, | 8 V, 1, N6-εdado |
| 16 V, [15N5] 8-oxodguo | 8 V, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 16 V, 1, N2-εdguo | ||
| 16 V, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Potencial de entrada | 10 V | 10 V |
Tabla 1. Parámetros utilizados en el equipo ESI-MS/MS para la detección de las lesiones de ADN. Esta tabla ha sido modificada de Oliveira et al.34.
- Filtro (usando membranas porosas de 0,22 μm) y degasificar (usando un sonicador) todos los solventes de HPLC a base de agua.
- Utilice las siguientes condiciones de cromatografía para los análisis.
- Elute un 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, columna C18 acoplada a un cartucho de seguridad C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) con un gradiente de 5 mM de acetato de amonio, pH 6,6 (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) a un caudal de 130 μL/min y 25 ° c.
- Utilice el siguiente programa de gradiente para la bomba binaria: de 0 a 10 min, 0% del disolvente B; 10 a 39 min, 0-20% del disolvente B; 39 a 41 min, 20-75% del disolvente B; 41 a 46 min, 75% del disolvente B; 46 a 47 min, 75-0% del disolvente B; 47 a 60 min, 0% del disolvente B.
- Utilice la válvula de conmutación para dirigir los primeros 35 min de eluyente a los desechos y la fracción 35-42 min a la fuente ESI. Asegúrese de que las normas del aducto eluen de la columna en el intervalo establecido (35-42 min). Haga ajustes si es necesario.
- Elute un 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, columna C18 acoplada a un cartucho de seguridad C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) con un gradiente de 5 mM de acetato de amonio, pH 6,6 (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) a un caudal de 130 μL/min y 25 ° c.
9. cuantificación de 2 '-desoxirribonucleósidos normales por HPLC-UV
- Utilice un equipo similar al del equipo utilizado en este trabajo (consulte la tabla de materiales).
- Elute un 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, columna C18 unida a un cartucho de seguridad C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) con un degradado de 0,1% ácido fórmico y metanol.
- Utilice el siguiente programa de gradiente: de 0 a 25 min, de 0 a 18% de metanol; de 25 a 27 min, 18 a 0% de metanol; de 27 a 37 min, 0% de metanol) a un caudal de 1 mL/min y 30 ° c.
- Inyectar 5 μL de cada muestra reservada para la cuantificación de 2 '-desoxynucleosides.
- Fije el detector DAD a 260 nm para la integración de los picos dGuo y dAdo.
10. cuantificación de las lesiones de ADN
- Integrar los picos de 8-oxodGuo, [15n5] 8-Oxodguo, 1,N6-εdado, [15n5] 1,N6-εdado, 1,n2-εdguo, y [15n5] 1,n2 -εdguo de los análisis de HPLC-ESI-MS/MS.
- Calcular las relaciones de área de 8-oxodGuo/[15n5] 8-oxodguo, 1, n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado, y 1,n2-εdguo/[15n5 ] 1,N2-εdguo para las curvas de calibración y las muestras.
- Trace las curvas de calibración utilizando las relaciones de área obtenidas en el paso 10.1.1 en el eje y y las cantidades de analitos presentes en cada punto del eje x.
- Calcule las cantidades (fmol) de las lesiones en cada muestra inyectada utilizando las proporciones calculadas en el paso 10.1.1 y las curvas de calibración del paso 10.1.2.
- Integre los picos de dGuo y dAdo a partir de los análisis de HPLC-UV.
- Graficar las curvas de calibración utilizando las áreas obtenidas en el paso 10,2 en el eje y y las cantidades de analitos presentes en cada punto en el eje x.
- Calcular las cantidades (nmol) de dGuo y dAdo en cada muestra inyectada utilizando las áreas obtenidas en el paso 10,2 y las curvas de calibración del paso 10.2.1.
- Calcular los importes (nmol) de dGuo y dAdo presentes en cada muestra inyectada en el sistema HPLC-ESI-MS/MS, teniendo en cuenta que las cantidades calculadas en el paso 10.2.2 están presentes en el volumen de muestra de 5 μL, mientras que 50 μL se inyectaron en el sistema HPLC-ESI-MS/MS.
Nota: para calcular la cantidad de dGuo en las muestras utilizadas para el análisis de 8-oxodGuo, simplemente multiplique la cantidad (nmol/μL) obtenida en el paso 10.2.2 por 50. Para calcular las cantidades de dAdo y dGuo en las muestras utilizadas para análisis de 1,n6-Εdado y 1,n2-εdguo, considere el paso de concentración después de la extracción de fase sólida. El volumen de 50 μL inyectado en el sistema HPLC-ESI-MS/MS corresponde a 114,32 μL de la muestra original. Los importes (nmol/μL) obtenidos en el paso 10.2.2 deben multiplicarse por 114,32 para obtener los valores correctos. - Calcular las fracciones molares 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdado/DAdo, 1,n2-εdguo/dguo. Las proporciones (lesión de fmol/desoxinucleósido normal de nmol) dan el número de lesiones por cada 106 dguo o dado normal.
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Representative Results
Las concentraciones medias de ADN (± SD) obtenidas a partir de ratones hígado (~ 1 g de tejido), pulmón (~ 0,2 g de tejido) y riñón (~ 0,4 g de tejido) fueron, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 y 3.223 ± 723 μg/mL en el volumen final de 200 μL. En la figura 3se muestra un cromatograma representativo obtenido por HPLC-DAD del ADN purificado. La presencia de los cuatro 2 '-desoxinucleósidos, libre del ARN ribonucleósidos, que eluye inmediatamente antes de los 2 '-desoxynucleósidos correspondientes, demuestra la pureza del ADN.
Los cromatogramas representativos de los análisis de HPLC-ESI-MS/MS para la cuantificación de muestras de ADN del tejido de 8-oxodGuo, 1,N6-Εdado y 1,N2-εdguo en ratones se muestran en las figuras 4 a 6. El cromatograma obtenido con detección UV en la figura 4 muestra los cuatro 2 '-desoxynucleósidos eluyendo desde la primera columna hasta ~ 10 min, con una buena separación de 8-oxodGuo, eliminando interferencias no deseadas. Los 2 '-desoxynucleósidos normales no estaban presentes en los análisis de 1,N6-Εdado y 1,n2-εdguo, ya que fueron eliminados en el procedimiento de extracción de fase sólida. Los espectros de masas de los estándares utilizados en este trabajo se muestran en la figura 7.
Las curvas de calibración lineales típicas para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,n6-Εdado y 1,N2-εdguo se muestran en la figura 834. Los métodos eran precisos y precisos, tal como se presenta en el cuadro 234. La precisión inter-día calculada para las alícuas de ADN suplementadas con 367 fmol de 8-oxodGuo fue del 16,97%, complementada con 10 fmol de 1,n2-εdguo fue del 14,01%, y complementada con 1 fmol de 1,n6-εdado fue del 16,66%. Los límites de cuantificación (S/N = 10) para las normas inyectadas en la columna fueron 25 fmol para 8-oxodGuo, 0,3 fmol para 1,n6-εdado, y 1 fmol para 1,n2-εdguo34.
Los métodos se aplicaron a la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,n2-εdguo y 1,N6-εdado en las muestras de ADN pulmonar, hepática y renal de los tejidos de ratones a/J expuestos cuerpo entero al aire ambiente enriquecido en PM2,5, en comparación con los expuestos al aire ambiente in situ como el control de estudio34. Los niveles encontrados se muestran en la tabla 3, e indican la inducción de lesiones de ADN en pulmón, hígado y riñón por PM2,5 exposición34.
Figura 3 . Cromatograma del hidrolizado de una muestra de ADN extraída del pulmón del ratón. El cromatograma se obtuvo a 260 nm del sistema HPLC-DAD. Los cuatro 2 '-desoxynucleósidos están indicados: dC, 2 '-desoxycytidine; dA, 2 '-desoxiadenosina; dG, 2 '-desoxiguanosina; dT, 2 '-desoxitimidina. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Cromatogramas representativos que muestran la detección de 8-oxo-7,8-dihydro-2 ́-desoxiguanosina (8-oxodguo) y el estándar interno [15N5] 8-oxodguo por HPLC-ESI-MS/MS, así como los normales 2 '-desoxynucleósidos eluyendo de la primera columna y desviada a la detección de DAD (λ = 260 nm) y residuos. La muestra de ADN se extrajo del pulmón del ratón. Los análisis por HPLC-ESI-MS/MS se realizaron con control de reacción múltiple (MRM) utilizando las fragmentaciones especificadas en las imágenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Cromatogramas representativos que muestran la detección de 1, N 6 -etheno-2 ́-desoxiadenosina (1,N6-εdado) y el estándar interno [15N5] 1, N 6 -εdado por HPLC-ESI-MS/MS. La muestra de ADN se extrajo del riñón del ratón. Los análisis se realizaron con la monitorización de múltiples reacciones (MRM) utilizando las fragmentaciones especificadas en las imágenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Cromatogramas representativos que muestran la detección de 1, N 2 -etheno-2 ́-desoxiguanosina (1,N2-εdguo) y el estándar interno [15N5] 1, N 2 -εdguo por HPLC-ESI-MS/MS. La muestra de ADN se extrajo del hígado del ratón. Los análisis se realizaron con la monitorización de múltiples reacciones (MRM) utilizando las fragmentaciones especificadas en las imágenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Espectros de masas de los estándares utilizados en esta obra. Los espectros se obtuvieron en MS2 utilizando la energía de colisión de 20 eV para fragmentar los iones [M + H]+ . Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 . Curvas de calibración obtenidas por HPLC-ESI-MS/MS para la cuantificación de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodguo), 1,n2-etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) y 1, N6-etheno-2́-desoxiadenosina (1,N6-εdado). Área relativa significa las proporciones de área entre la lesión y su respectivo [15N5] estándar interno. Esta cifra ha sido modificada de Oliveira et al.34. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Los parámetros ESI-MS/MS | 8-oxodGuo | Los aductos de etheno |
| Gas cortina | 20 psi | 20 psi |
| El gas nebulizante | 55 | 50 |
| Ion Source gas | 50 psi | 40 psi |
| El gas de disociación inducido por colisión | Medio | Medio |
| Ion spray Voltage | 5000 | 4500 |
| ESI sonda de temperatura | 450 | 450 |
| Potencial de decluación | 31 V, 8-oxodGuo | 41 V, 1, N6-εdado |
| 31 V, [15N5] 8-oxodguo | 41 V, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 45 V, 1, N2-εdguo | ||
| 45V, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Energía de colisión | 23 eV, 8-oxodGuo | 25 eV, 1, N6-εdado |
| 23 eV, [15N5] 8-oxodguo | 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 27 eV, 1, N2-εdguo | ||
| 27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Potencial de salida de célula de colisión | 16 V, 8-oxodGuo, | 8 V, 1, N6-εdado |
| 16 V, [15N5] 8-oxodguo | 8 V, [15N5] 1, N6-εdado | |
| 16 V, 1, N2-εdguo | ||
| 16 V, [15N5] 1, N2-εdguo | ||
| Potencial de entrada | 10 V | 10 V |
Tabla 1. Parámetros utilizados en el equipo ESI-MS/MS para la detección de las lesiones de ADN. Esta tabla ha sido modificada de Oliveira et al.34.
| El nivel basal | Añadido | Detectado | Detectado (-) basal | Precisión | Cv | ||||
| Promedio ± SD (fmol) | Fmol | Promedio ± SD (fmol) | Promedio (fmol) | % | % | ||||
| 8-oxodGuo | |||||||||
| 373,00 | ± | 2,71 | 0 | 372,79 | ± | 50,6 | - | - | 13,57 |
| 373,98 | ± | 4,86 | 367 | 755,41 | ± | 107,92 | 381 | 103,93 | 14,29 |
| 374,84 | ± | 5,19 | 734 | 1069,57 | ± | 108,51 | 695 | 94,65 | 10,14 |
| 357,94 | ± | 15,05 | 1469 | 1671,67 | ± | 44,27 | 1314 | 89,43 | 2,65 |
| 371,07 | ± | 2,43 | 2204 | 2272,01 | ± | 40,2 | 1901 | 86,25 | 1,77 |
| 1, N2-εdguo | |||||||||
| 0,54 | ± | 0,01 | 0 | 0,54 | ± | 0,09 | - | - | 16,88 |
| 0,54 | ± | 0,01 | 1 | 1,47 | ± | 0,16 | 0,93 | 93,39 | 11,17 |
| 0,55 | ± | 0,01 | 5 | 5,30 | ± | 0,72 | 4,76 | 95,11 | 13,50 |
| 0,53 | ± | 0,01 | 10 | 10,60 | ± | 0,39 | 10,06 | 100,63 | 3,67 |
| 0,54 | ± | 0,01 | 20 | 20,20 | ± | 0,93 | 19,66 | 98,29 | 4,60 |
| 1, N6-εdado | |||||||||
| 2,08 | ± | 0,10 | 0 | 2,29 | ± | 0,39 | - | - | 17,05 |
| 2,05 | ± | 0,04 | 1 | 3,06 | ± | 0,47 | 1,01 | 100,89 | 15,31 |
| 1,99 | ± | 0,06 | 5 | 7,87 | ± | 1,66 | 5,88 | 117,60 | 21,10 |
| 2,03 | ± | 0,07 | 10 | 12,43 | ± | 1,25 | 10,41 | 104,06 | 10,06 |
| 1,97 | ± | 0,03 | 20 | 22,42 | ± | 3,89 | 20,46 | 102,29 | 17,34 |
Tabla 2. Precisión del método y coeficiente de variación (CV) para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1, N 2 - Εdguo y 1, N 6 -εdado en DNA. Esta tabla ha sido modificada de Oliveira et al.34.
| Ambiente aire | PM2,5 | N | Valor P | |||||
| Promedio ± SEM | Promedio ± SEM | |||||||
| Pulmón | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 2124 | ± | 56,96 | 2466 | ± | 93,10 | 6 | 0,01 |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | Nd | Nd | - | - | ||||
| 1, N6-εdado/108 dado | 1,41 | ± | 0,23 | 1,44 | ± | 0,13 | 7 | Ns |
| Hígado | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 2848 | ± | 183,5 | 2949 | ± | 223,8 | 6 5 | Ns |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | 7,79 | ± | 2,49 | 24,94 | ± | 5,21 | 4 | 0,02 |
| 1, N6-εdado/108 dado | 2,82 | ± | 0,30 | 2,18 | ± | 0,25 | 6 | Ns |
| Riñón | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 1854 | ± | 87,13 | 2363 | ± | 157,0 | 6 | 0,02 |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | Nd | Nd | - | - | ||||
| 1, N6-εdado/108 dado | 1,09 | ± | 0,15 | 1,52 | ± | 0,12 | 7 | 0,04 |
| (NS, no significativo; ND, no detectado) | ||||||||
Tabla 3. Niveles de las lesiones de ADN en muestras de tejido de ratones A/J. Los ratones fueron expuestos al aire ambiente y al aire ambiente enriquecido en PM2,5 (PM2,5 concentrado 30 veces). Los medios entre los dos grupos (aire ambiente y PM2,5) se compararon usando t test. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor P era menor que 0,05. Esta tabla ha sido modificada de Oliveira et al.34.
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Discussion
Un problema importante que se encuentra en los análisis de 8-oxodguo por métodos de HPLC es la posible inducción de su formación durante los procedimientos de trabajo de extracción de ADN, hidrólisis de ADN, y la concentración de ADN hidrolizados22,38. Con el fin de minimizar el problema de la formación artística de 8-oxodGuo, se recomienda la adición de deferoxamina a todas las soluciones de extracción de ADN, almacenamiento e hidrólisis, el uso del método chaotrópico de yoduro sódico y la evitación de fenol en la extracción de ADN, como así como el uso de cantidades de ADN cercanas a 100 μg en el procedimiento de hidrólisis para minimizar la contribución de la oxidación espuria al resultado final39. Tomamos en cuenta las recomendaciones citadas anteriormente, excepto el uso del método chaotrópico de yoduro sódico para la extracción de ADN. En cambio, para simplificar, usamos soluciones comerciales para la extracción de ADN, añadiendo deferoxamina a ellos antes de su uso. Además, los hidrolizados de ADN obtenidos se inyectaron directamente en una primera columna del sistema HPLC-ESI-MS/MS para una separación previa de 8-oxodGuo de los nucleósidos normales. Inmediatamente antes de la elución de 8-oxodGuo, se usó una válvula de conmutación para desviar la primera columna eluyente a una segunda columna donde se lograron una mayor separación y estrechamiento de picos. Este enfoque permitía una sensibilidad adecuada para la cuantificación de 8 oxodGuo libre de interferencias. El enfoque más similar para la cuantificación de 8-oxodGuo en el ADN fue descrito por Chao y sus compañeros de trabajo22, que utilizaron una columna de trampa para la limpieza de muestras y retención de 8-oxodguo antes de la elución de la muestra en la columna analítica, utilizando una válvula de conmutación entre las columnas. Alternativamente, se realizó un paso de concentración de 8-oxodGuo recolectado a partir de fracciones elutidas de las separaciones de HPLC de hidrolizados de ADN antes de los análisis de HPLC-ESI-MS/MS15, que es mucho más laborioso.
Los niveles basales reportados de 8-oxodguo en el tejido pulmonar de roedores, basados en análisis de HPLC, oscilan entre 180-450/108 dguo23,39,41,42,43, 1.340-2120/108 dguo44, o aproximadamente 3000/108 dguo45,46, con los valores más bajos obtenidos de los métodos de extracción de ADN mediante el uso de yoduro de sodio. El nivel medio de 8-oxodGuo que se encuentra aquí en el pulmón de los ratones expuestos al aire ambiente fue 2124/108 dguo. El nivel aumentó a 2466/108 dguo en los animales expuestos al aire ambiente enriquecido en PM2,5 (tabla 3)34. Es posible que se mejore la sensibilidad para la detección de diferencias entre grupos extrayendo el ADN con el método chaotrópico de yoduro sódico. En el presente estudio, los niveles medios de 8-oxodGuo encontrados en el control de ratones de pulmón, riñón y ADN hepático fueron, respectivamente, 2,0, 1,8 y 2,7 veces superiores al nivel basal mediano (1047/108 dguo) obtenidos por el Comité Europeo de normas sobre Daño de ADN (ESCODD) en una evaluación inter-laboratorio de 8-oxodGuo en ADN extraído de muestras estándar de hígado de cerdo38.
La principal limitación para la detección de 1,n6-Εdado y 1,n2-εdguo en el ADN es la sensibilidad del método, ya que estas lesiones ocurren en niveles muy bajos. Los niveles más bajos de 1,N2-dguo en ADN, cuantificados por HPLC-ESI-MS/MS, estaban en el rango de 0,87-4 lesiones por 108 dguo en una línea celular humana y los tejidos de rata25,47. Una manera de mejorar la sensibilidad y la selectividad para su cuantificación es concentrarlos de grandes muestras de hidrolizados de ADN, utilizando la extracción de fase sólida. Este paso de limpieza resuelve problemas cromatográficos que podrían surgir de inyecciones de más de 100 μg de ADN hidrolizados en columnas analíticas de HPLC. Utilizamos este enfoque en el método validado que se presenta aquí. Los niveles de 1,N6-εdado detectados en este estudio34 caen dentro del rango obtenido en estudios que emplean inmunoafinidad ultrasensitiva/32P-postetiquetado48,49, 50 , 51 y son menores que los descritos por otros grupos que emplean HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Del mismo modo, los niveles 1,N2-εdguo cuantificados aquí34 son consistentes con los niveles más bajos reportados por García25 y Angeli26 mediante el uso de HPLC-ESI-MS/MS.
Los sistemas HPLC-ESI-MS/MS con mayor sensibilidad que los equipos utilizados en este estudio están disponibles. El uso de estos sistemas permite el análisis de pequeñas cantidades de ADN, lo que amplía las aplicaciones de los métodos presentados aquí para situaciones en las que la disponibilidad de tejido es una limitación. Los métodos presentados aquí pueden ser adaptados para la cuantificación de otros desoxynucleósidos modificados, dependiendo de la disponibilidad de sus estándares y de los estándares isotópicos. El ajuste de las condiciones cromatográficas sería necesario para obtener picos agudos de todas las moléculas incluidas en los análisis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 y 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 y 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) y CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. f. Oliveira y A. A. F. Oliveira recibieron becas de FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) y CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior). M. h. g. Medeiros, P. di Mascio, p. h. n. Saldiva, y A. p. m. Loureiro recibieron becas de CNPq.
Algunas figuras y tablas presentes en esta obra fueron publicadas originalmente en Oliveira A.A.F. et al. efectos genotóxicos y epigenotóxicos en ratones expuestos a partículas finas ambientales concentradas (PM2,5) de la ciudad de São Paulo, Brasil. De partículas y de fibra toxicológica. 15, 40 (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [15N5]-2’-deoxyadenosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2’-deoxyguanosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrile | Carlo Erba Reagents | 412413000 | |
| alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa | Sigma | P5521 | |
| ammonium acetate | Merck | 101116 | |
| calf thymus DNA | Sigma | D1501 | |
| cell lysis solution | QIAGEN | 158908 | |
| chloroform | Carlo Erba Reagents | 412653 | |
| deferoxamine | Sigma | D9533 | |
| deoxyribonuclease I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| ethanol | Carlo Erba Reagents | 414542 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS system | HPLC: Agilent 1200 series ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C). ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP. | |
| HPLC/DAD system | Shimadzu | Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP) | |
| HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| isoamyl alcohol | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| isopropyl alcohol (isopropanol) | Carlo Erba Reagents | A412790010 | |
| ketamine | Ceva | Commercial name: Dopalen | |
| magnesium chloride | Carlo Erba Reagents | 349377 | |
| magnesium chloride | Sigma | M2393 | |
| methanol | Carlo Erba Reagents | L022909K7 | |
| phosphodiesterase I from Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| protein precipitation solution | QIAGEN | 158912 | |
| proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonuclease A | Sigma | R5000 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carlo Erba Reagents | 489983 | |
| xylazine | Syntec do Brasil | Commercial name: Xilazin |
References
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
- Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
- Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
- Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
- Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
- Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
- Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
- Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
- Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
- Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
- Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
- Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
- Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
- Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
- Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
- Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
- Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
- Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
- Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
- Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
- Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
- Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
- Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
- Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
- Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
- Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
- Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
- IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
- De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
- Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
- Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
- Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
- Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
- Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
- Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
- ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
- Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
- Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
- Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
- Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
- Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
- Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
- Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
- Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
- Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
- Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
- Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
- Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
- Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).
