Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering af tre DNA-læsioner ved massespektrometri og vurdering af deres niveauer i væv af mus udsat for omgivende fine partikler

Published: May 29, 2019 doi: 10.3791/59734
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 3,4, 5, 5, 1
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives metoder til følsom og nøjagtig kvantificering af læsioner 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-Dado) og 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosin (1,N2-DGUO) i DNA. Metoderne blev anvendt til vurdering af virkningerne af de omgivende fine partikler (PM2,5) i væv (lunge, lever og nyrer) af eksponerede A/J-mus.

Abstract

DNA-addukter og oxiderede DNA-baser er eksempler på DNA-læsioner, der er nyttige biomarkører til toksicitets vurdering af stoffer, der er elektro File, genererer reaktive elektrophiler ved biotransformation eller inducerer oxidativ stress. Blandt de oxiderede nukleobaser, den mest undersøgt en er 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxoGua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo), en biomarkør af oxidativt induceret base skade i DNA. Aldehyder og epoxyaldehyder som følge af lipid-peroxiderings processen er elektro File molekyler, der kan danne mutagene exocycliske DNA-addukter, såsom etheno adkanalerne 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosin (1,n2- εdGuo) og 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-εdado), som er blevet foreslået som potentielle biomarkører i Patofysiologi af inflammation. Selektive og følsomme metoder til kvantificering af DNA er nødvendige for udviklingen af forebyggende strategier til at bremse celle Mutations rater og kronisk sygdomsudvikling (f. eks. kræft, neurodegenerative sygdomme). Blandt de følsomme metoder til rådighed for deres påvisning (højtydende væskekromatografi koblet til elektrokemiske eller tandem massespektrometri detektorer, Comet assay, immunoassays, 32P-post mærkning), de mest selektive er dem baseret på højtydende væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet er en væsentlig fordel ved analyse af komplekse biologiske prøver og HPLC-ESI-MS/MS udviklet som guld standard for kvantificering af modificerede Nukleosider i biologiske matricer, såsom DNA, urin, plasma og spyt. Brugen af isotopisk mærkede interne standarder tilføjer fordelen ved korrektioner for Molekylær tab under DNA-hydrolyse-og analyt-berignings trinnene samt for forskelle i analytioniseringen mellem prøverne. Det bidrager også til identifikationen af den korrekte kromatografi, når der er mere end et højdepunkt.

Vi præsenterer her validerede følsomme, præcise og præcise HPLC-ESI-MS/MS metoder, der blev anvendt med succes til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,N6-Dado og 1,N2-DGUO i lunge, lever og nyre DNA af A/J-mus til vurdering af virkningerne af omgivelsernes PM2,5 -eksponering.

Introduction

Nogle reaktive oxygenarter (ROS) er i stand til at oxideres Carbon dobbeltbindinger af DNA-baser og nogle kulstofatomer i Deoxyribose-delen, genererer oxiderede baser og DNA-streng pauser1. Som et negativt ladet molekyle, der er rigt på nitrogen og oxygen atomer, er DNA også et mål for elektro File grupper, der kovalent reagerer med de nukleofile steder (nitrogen og ilt), hvilket giver produkter, der kaldes DNA-addukter2. Så, DNA addukter og oxiderede DNA-baser er eksempler på DNA-læsioner, der er nyttige biomarkører for toksicitets vurdering af stoffer, der er elektro File, generere reaktive elektro philes ved biotransformation, eller inducere oxidativ stress1, 2. i. Selv om de modificerede DNA baser kan fjernes fra DNA ved base eller nukleotid excision reparation (BER eller NER), induktion af en ubalance mellem generering og fjernelse af DNA-læsioner til fordel for førstnævnte fører til en nettostigning i deres niveauer i DNA overarbejde3 < /C5 >. Resultater er stigningen i DNA-Mutations rater, reduceret genekspression og formindsket protein aktivitet2,4,5,6,7, virkninger, der er tæt forbundet med udvikling af sygdomme. DNA-mutationer kan påvirke forskellige cellulære funktioner, såsom celle signalering, celle cyklus, genomintegritet, telomere stabilitet, epigenom, kromatin struktur, RNA splejsning, protein homøostase, metabolisme, apoptose og Celledifferentiering8 ,9. Strategier til at bremse celle Mutations rater og kronisk sygdomsudvikling (f. eks. kræft, neurodegenerative sygdomme) passerer gennem viden om Mutations kilderne, heriblandt DNA-læsioner og deres årsager.

ROS genereret endogent i overskud, på grund af forurening eksponering, vedvarende inflammation, sygdom Patofysiologi (f. eks diabetes), etc., er vigtige årsager til biomolekyle skade, herunder DNA og lipid skader1. Som et eksempel er den meget reaktive hydroxyl radikal (OH) dannet af H2O2 reduktion af Transition metalioner (fe2 +, cu+) oxiderer DNA baserne, DNA-sukker delen og flerumættede fedtsyrer ved diffusions kontrolleret priser10. Blandt de 80 allerede karakteriseret oxiderede nukleobaser3, den mest undersøgt ene er 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxogua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo, figur 1), en læsion, der er i stand til at inducere gt Trans versioner i pattedyrsceller10,11. Det dannes ved mono elektronisk oxidation af guanin eller ved hydroxyl radikal eller singlet oxygen angreb af guanin i DNA1. Flerumættede fedtsyrer er andre vigtige mål for meget reaktive oxidanter, såsom •Oh, som indleder processen med lipid peroxidering1,12. Det giver anledning til fedtsyre hydroperoxider, der kan nedbrydes til elektro File aldehyder og epoxyaldehyder, såsom malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4,5-epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyd, som er kunne danne mutagene exocycliske DNA-addukter, såsom malondialdehyd-, Propano-eller etheno-addukter1,12,13. Etheno adkanalerne 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosin (1,n2-εdguo, figur 1) og 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosin (1,n6-εdado, figur 1 ) er blevet foreslået som potentielle biomarkører i Patofysiologi af inflammation14,15.

Figure 1
Figur 1. Kemiske strukturer af de DNA-læsioner, der er kvantificeret i nærværende undersøgelse. dR = 2 ́-Deoxyribose. Dette tal er blevet ændret fra Oliveira et al.34. Klik her for at se en større version af dette tal.

Undersøgelser foretaget i begyndelsen af 1980 ' erne tillod følsom påvisning af 8-oxodGuo ved højtydende væskekromatografi koblet til elektrokemisk detektion (HPLC-ECD). Kvantificering af 8-oxodguo ved HPLC-ECD i flere biologiske systemer udsat for oxiderende betingelser førte til anerkendelse af 8-oxodguo som en biomarkør af oxidativt induceret base skade i DNA1,16. Selv om den er robust og giver mulighed for kvantificering af 8-oxodGuo i lavfmol-området17, afhænger HPLC-ECD-målingerne af nøjagtigheden af analysand-retentionstiden for analyt-identifikation og af kromatografi opløsningen for at undgå interferenser med andre prøve bestanddele. Da elektrokemisk detektion kræver brug af salt (f. eks. kaliumphosphat, natriumacetat) i den mobile fase, skal vedligeholdelse af passende analytiske betingelser rutine kolonne og rengøringstiden for udstyr.

Alternativt, brugen af bakteriel DNA reparation enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) og bagefter, humant 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), til påvisning og fjernelse af 8-oxoGua fra DNA, opstod som en måde for induktion af DNA alkali labile Websteder. De alkaliske labile steder omdannes til DNA-streng pauser og tillader en meget høj følsom indirekte kvantificering af 8-oxoGua ved alkalisk enkelt celle gel elektroforese ("Comet assay"). Den høje følsomhed og udførelsen af analyserne uden behov for cellulær DNA ekstraktion er de vigtigste fordele ved denne type analyse. Det giver de laveste Steady-State niveauer af 8-oxoGua i DNA, typisk 7-10 gange lavere end niveauerne opnået ved bioanalytiske metoder baseret på HPLC. Men det er en indirekte måling af 8-oxogua og nogle ulemper er manglen på specificitet eller den ukendte effektivitet af reparation enzymer brugt1,16,18.

Immunoassays er andre sæt metoder, der anvendes til påvisning af 8-oxoGua1 og exocyclic DNA addukter, såsom 1,n6-Dado og 1,n2-dguo12. På trods af følsomheden er en mangel ved brugen af antistoffer til påvisning af DNA-læsioner manglen på specificitet på grund af kryds reaktivitet til andre bestanddele af biologiske prøver, herunder de normale DNA baser1,12. De exocycliske DNA-addukter, herunder 1, n6-Dado og 1, n2-dguo, kan også påvises og kvantificeres af meget følsomme 32P-post mærknings-analyser12. Den høje følsomhed af 32P-post mærkning tillader brug af meget små mængder af DNA (f. eks 10 μg) til påvisning af omkring 1 adduct per 1010 normale baser19. Men brugen af radio-kemikalier, manglende kemisk specificitet og lav nøjagtighed er nogle ulemper19,20.

En fælles begrænsning af de ovenfor citerede metoder er den lave selektivitet eller specificitet for påvisning af de ønskede molekyler. I dette scenario er HPLC koblet til elektro spray ionisering tandem massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS og HPLC-MS3) udviklet som guld standard for kvantificering af modificerede Nukleosider i biologiske matricer, såsom DNA, urin, plasma og spyt 1 af , 19 ud af , 20. fordele ved HPLC-ESI-MS/MS metoder er følsomheden (typisk i den lave fmol Range) og den høje specificitet, som i) kromatografi separation, II) det karakteristiske og kendte mønster af molekyle fragmentering inde i massen spektrometer kollisions kammer og III) nøjagtig måling af den valgte masse til opladnings forhold (m/z) i flere reaktions overvågnings modus1,19. Brugen af isotopisk mærkede interne standarder tilføjer fordelen ved korrektioner for Molekylær tab under DNA-hydrolyse-og analyt-berignings trinnene samt for forskelle i analytioniseringen mellem prøverne. Det bidrager også til identifikationen af den korrekte kromatografi, når der er mere end én top til stede1,12,19,20.

Flere metoder baseret på HPLC-ESI-MS/MS er blevet anvendt til kvantificering af 8-oxodguo, 1, n6-Dado og 1,N2-dguo i dna ekstraheret fra forskellige biologiske prøver12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fine partikler (PM2,5) transporterer organiske og uorganiske kemikalier, såsom polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), nitro-PAH'er, aldehyder, ketoner, carboxylsyrer, quinoliner, metaller og vandopløselige ioner, som kan inducere betændelse og oxidativ stress, betingelser, der begunstiger forekomsten af biomolekyle skader og sygdom30,31,32,33. Vi præsenterer her validerede HPLC-ESI-MS/MS-metoder, der med succes blev anvendt til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,n6-Dado og 1,N2-dguo i LUNGE-, lever-og nyre-DNA fra A/J-mus til vurdering af virkninger af omgivelsernes PM2,5 -eksponering34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fire uger gamle mandlige A/J-mus, specifikt patogenfrie, blev indhentet fra avls centret for laboratoriedyr i Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, og blev i overensstemmelse hermed behandlet i den etiske komité for det medicinske fakultet, universitetet af São Paulo (protokol no 1310/09).

1. indsamling af mus væv

  1. Bedøvelses dyret med xylazin og ketamin. Til en mus med 30 g legemsvægt indsprøjtes en opløsning (højst 2 mL) indeholdende 2,63 mg ketamin og 0,38 mg xylazin, intraperitoneally.
  2. Saml blod (0,5-1,5 mL) til supplerende analyser (f. eks. antioxidant enzymaktivitet, malondialdehyd niveauer).
  3. Barber bughulen fra bækkenet til xiphoideprocessen. Foretag et snit i en lodret midterlinje i det hårløse område. Foretag indsnit i horisontale laterale linjer for at afsløre abdominalorganerne.
  4. Skær abdominal aorta at fremme exsanguination og at aflive dyret.
  5. Fjern væv af interesse (i dette tilfælde, lever, nyrer og lunger).
    1. For at fjerne leveren, skære ringere cava vene og Portal hepatisk vene.
    2. For at fjerne nyrerne, afsnit de renale vener og arterier.
    3. For at fjerne lungerne, foretage et snit i membran ekstremiteterne og omkreds tæt på thorax væggen. Brud Kravebenene ved at åbne en saks i det indre af brysthulen. Skær den extern knogle fra xiphoideprocessen mod luftrøret, for at eksponere lungerne og hjertet.
      1. Hold lungerne med en tang, del luftrøret og ledbånd omkring lungerne. Fjern forsigtigt blok lungerne plus hjerte. For at fjerne lungerne ud af blokken, holde hjertet med en tang og skære alle fartøjer i sin base.
  6. Det isolerede væv vaskes straks i en kold saltvandsopløsning (0,9% NaCl), overføres til kryogene rør, og rørene straks dyppes i flydende nitrogen. Efter endt arbejde opbevares rørene ved-80 °C.
    Forsigtig: flydende nitrogen i direkte kontakt med huden, slimhinden eller øjnene forårsager forbrændinger. Brug passende individuel beskyttelse for at undgå kontakt. Arbejd i et ventileret laboratorium for at undgå kvælning på grund af flydende nitrogen dampe.

2. DNA-ekstraktion

Bemærk: DNA ekstraktionsmetoden blev modificeret fra Loureiro et al. (2009)35 for at gøre det muligt at analysere de undersøgt læsioner her.

  1. Overfør rørene, der indeholder vævene, til tøris.
  2. Brug en kultur plade placeret på is som en base til at skære et stykke væv med en skalpel. Vægt 1 g til umiddelbar brug. Det resterende væv skal opbevares på tøris, indtil det vender tilbage til opbevaring ved-80 °C.
    Bemærk: det er vigtigt at undgå optøning af det resterende væv for at forhindre dannelsen af artefakter, hvis gentagelser af analyserne er nødvendige.
  3. Til hver 1 g væv i 50 mL udjævnede rør tilsættes 10 mL af den kommercielle celle lysis-opløsning, der indeholder 0,5 mM deferoxamin og opbevares på is.
    Bemærk: Tilsæt deferoxamin til mængden af opløsning til umiddelbar brug. For hver 100 mL opløsning tilsættes 0,0328 g af deferoxamin-mesylatsaltet.
  4. Homogenisere vævet ved hjælp af en vævs homogenisator indtil en homogen opløsning uden væv fragmenter er opnået. Hold røret koldt (på is) under homogenisering. Brug en lav hastighed for at undgå opvarmning.
  5. Der tilsættes 150 μL proteinase K-opløsning (20 mg/mL) til hver homogeniseret prøve. Ryst rørene ved inversion og opbevar dem ved stuetemperatur natten over.
  6. Der tilsættes 40 μl ribonuklease opløsning (15 mg/ml), rystes ved inversion, og rørene holdes ved stuetemperatur i 2 timer.
    Bemærk: Forbered ribonuklease en opløsning i natriumacetat buffer 10 mm, pH 5,2 for at undgå udfældning. Opløsningen opvarmes ved 100 °C i 15 minutter før brug for at opnå en opløsning, der er fri for deoxyribonuclease.
  7. Der tilsættes 5 mL af den kommercielle protein udfældnings opløsning, hvirvlen kraftigt, og centrifugeres ved 2.000 x g, 4 °c, i 10 minutter.
  8. Supernatanterne overføres til 50 mL-rør med 10 mL kold isopropanol. Vend rørene forsigtigt flere gange indtil observation af det udfældede DNA.
    Bemærk: protokollen kan sættes på pause her og holde rørene ved-20 °C.
  9. Saml det udfældede DNA med en Pasteur-pipette, der er lukket i slutningen. Den overføres til rør, der indeholder 4 mL 10 mM Tris-buffer, 1 mM deferoxamin, pH 7,0.
  10. Efter at DNA er fuldstændig opløst i ovennævnte opløsning (ikke vortex), tilsættes 4 mL chloroform opløsning, der indeholder 4% isoamylalkohol.
  11. Vend rørene 10 gange for homogenisering, centrifuge ved 2.000 x g, 4 °c, i 10 minutter for at adskille de to faser, og overfør den øvre fase til et nyt rør.
  12. Gentag trinene 2,10 og 2,11 to gange mere.
  13. Der tilsættes 8 mL absolut ethanol og 0,4 mL af en 5 M NaCl opløsning til udfældning af DNA.
  14. Saml igen det udfældede DNA og overfør det til 3 mL 70% ethanol. Gentag dette trin en gang til.
  15. Ethanol opløsningen kasseres med forsigtighed, og de rør, der indeholder det udfældede DNA på absorberende papir, vendes for at fjerne den overskydende opløsning.
  16. Der tilsættes 200 μL 0,1 mM deferoxamin opløsning for at opløse DNA. Hold rørene ved 4 °C, indtil DNA'ET er helt rehydreret (natten over).
  17. DNA-koncentrationen bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nm og dens renhed med 260/280 Nm absorbans ratio.
    Bemærk: for at bestemme DNA-koncentrationen skal en alikvot 10 μl af DNA-opløsningen overføres til 990 μl ultrarent vand (100x fortynding). Absorbansen multipliceres ved 260 nm (den skal være under 1) med 50 (50 μg/mL er koncentrationen af dobbeltstrenget DNA, når absorbansen af en 1 cm lang kurve længde opløsning ved 260 nm er 1) og den anvendte fortynding (100x) for at opnå DNA-koncentrationen i μg/mL. Hvis absorbansen ved 260 nm er over 1, er yderligere fortyndinger nødvendige. 260/280 Nm absorbans ratio skal være lig med eller over 1,8 for den ønskede DNA-renhed, men forholdet omkring 1,6 er acceptabelt.

3. DNA-enzymatisk hydrolyse

  1. Analyse opskrift
    1. 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo-analyser: til en alikvot indeholdende 150 μg DNA tilsættes 7,5 μl af 200 mm Tris/mgcl2 -buffer (pH 7,4), 1,4 μl af den interne standardopløsning, der indeholder 250 fmol/μl [15N5 ] 1,n6-εdado og [15N5] 1,n2-εdguo og 15 enheder af deoxyribonuclease site i. den endelige volumen justeres til 200 μl med ultrarent vand, og de mængder enzymer, der skal anvendes på trin 3.2.1, fratrækkes.
    2. 8-oxodGuo-analyser: til en alikvot indeholdende 80 μg DNA tilsættes 3,8 μL 200 mM Tris/MgCl2 -buffer (pH 7,4), 2 μl af den interne standardopløsning, der indeholder 1.000 fmol/μl [15N5] 8-oxodguo, og 8 enheder deoxyribonuclease site I. Den endelige volumen justeres til 100 μl med ultrarent vand, og mængden af enzymer, der skal anvendes i trin 3.2.2, fratrækkes.
      Bemærk: de interne standarder [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo og [15n5] 8-oxodguo kan syntetiseres og karakteriseres som beskrevet35,36,37. Mængderne af de interne standarder i de injicerede prøvevolumener bør være de samme som i de injicerede kalibreringskurve volumener.
  2. Prøverne inkubeeres ved 37 °C i 1 time.
    1. Prøver fra trin 3,1: tilsæt 0,006 enheder fosfodiesterase I fra Crotalus atrox og 15 enheder alkalisk fosfatase fra intestinal slimhinde i tarmen.
    2. Prøver fra trin 3,2: tilsæt 0,0032 enheder fosfodiesterase I fra Crotalus atrox og 8 enheder alkalisk fosfatase fra intestinal slimhinde i tarmen.
  3. Prøverne inkubeeres ved 37 °C i 1 time.
  4. Prøverne centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter.
  5. Prøver fra trin 3.2.1: separate 10 μL af hver prøve til kvantificering af deoxynukleosider (dAdo, dGuo) ved HPLC/DAD (trin 9). Underkastes rest volumenet til fastfaseekstraktion (trin 4).
  6. Prøver fra trin 3.2.2: Overfør 80 μL af supernatanten til hætteglas til injektion på 50 μL (1.000 fmol af [15N5] 8-oxodguo) i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. De resterende 20 μL reserveres til kvantificering af dGuo ved HPLC/DAD (trin 9).

4. fastfaseekstraktion til analyser af 1, n6-εdado og 1, n2-εdguo

  1. Cylinderampullerne (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) skal indlæses med 1 mL af følgende opløsninger: 100% methanol, deioniseret vand, hydrolyseret DNA-prøve, deioniseret vand, 10% methanol, 15% methanol og 100% methanol (skal opsamles).
    Bemærk: Lad ikke patronerne tørre mellem de forskellige løsningers anvendelser. Tilføj den næste løsning umiddelbart efter, at den forrige løsning kommer helt ind i patronen.
  2. Vakuum tør den sidste elutions fraktion (100% methanol), der indeholder addukter.
  3. De tørrede prøver gensuspenderes i 83,1 μl ultrarent vand umiddelbart før HPLC-ESI-MS/MS-analysen for at opnå 200 fmol af hver intern standard i 50 μl af hver prøve.

5. klargøring af kalibreringskurver

  1. Der forberedes mindst fem punkter i intervallet 300 til 6.000 fmol af 8-oxodGuo-standard, med den faste mængde på 1.000 fmol af [15N5] 8-oxodguo i hvert punkt. Overvej disse mængder i den injicerede mængde.
  2. Der skal forberedes mindst fem point i intervallet 1 til 40 fmol af 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo, med faste mængder på 200 fmol af [15n5] 1,n6-εdado og [15n5] 1, N 2-εdguo i hvert punkt. Overvej disse mængder i den injicerede mængde.
  3. Forbered mindst fem punkter i intervallet 0,05-1 nmol af dGuo og dAdo. Overvej disse mængder i den injicerede mængde.

6. klargøring af DNA-prøver til metodevalidering

  1. 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo analyser: Tilsæt varierende mængder af 1, n6-εdado og 1, n2-εdguo (f. eks. 1,75, 8,75, 17,5 og 35 fmol) og faste beløb på [15N5] 1, N6-εdado og [15N5] 1,N2-εdguo (350 FMOL) til 100 μg kalv thymus-DNA og udføre den enzymatiske hydrolyse som beskrevet i trin 3. Prøverne behandles i fire eksemplarer på to forskellige dage. Brug prøverne til metodens nøjagtighed og præcisions vurdering.
    Bemærk: det endelige volumen af DNA-hydrolysaterne vil være 200 μL (trin 3), hvorfra 10 μL adskilles med henblik på kvantificering af deoxynucleosider ved HPLC/DAD (trin 9). Den resterende opløsning (190 μL) vil blive udsat for fastfaseekstraktion (trin 4), den tørrede fraktion vil blive resuspenderet i 83,1 μL (trin 4,3), hvorfra 50 μL vil blive injiceret i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Mængderne af 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo injiceres vil være 1, 5, 10 og 20 fmol, med 200 fmol af [15n5] 1,n6-εdado og [15n5] 1,n 2-εdguo i hver prøve.
  2. 8-oxodGuo-analyser: Tilsæt varierende mængder af 8-oxodGuo (f. eks. 734, 1.468, 2.938 og 4.408 fmol) og en fast mængde [15N5] 8-oxodguo (2.000 fmol) til 100 μg kalv thymus DNA og udføre den enzymatiske hydrolyse som beskrevet i trin 3. Prøverne behandles i fire eksemplarer på to forskellige dage. Brug prøverne til metodens nøjagtighed og præcisions vurdering.
    Bemærk: det endelige volumen af DNA-hydrolysaterne vil være 100 μL (trin 3), hvorfra 50 μL vil blive injiceret i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Mængderne af 8-oxodGuo injiceres vil være 367, 734, 1469 og 2204 fmol, med 1.000 fmol af [15N5] 8-oxodguo i hver prøve.
  3. Der tilsættes 13,125 fmol af 1,N6-εdado (for at opnå 7,5 fmol i injektionsvolumenet) og 35 fmol af 1,N2-εdguo (for at opnå 20 fmol i Injektionsvolumen) til otte prøver på 100 μg kalve-thymus-DNA.
    1. Tilføj de interne standarder[15n5] 1,n6-εdado og [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) til fire af prøverne. Fortsæt med DNA-hydrolyse og fastfaseekstraktion af alle prøver.
    2. Tilføj de interne standarder[15n5] 1,n6-εdado og [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) til de fire andre prøver.
    3. Brug prøverne til at beregne genvindingen af addukter fra fastfaseekstraktion.

7. analyse af HPLC-ESI-MS/MS for 8-oxodGuo

  1. Ved at bruge 8-oxodGuo-standarden i udstyret skal ESI-MS/MS-parametrene indstilles til den bedste påvisning af dens fragmenterings mønster ved multiple reaktions overvågning (MRM): m/z 284 [m + H] + → m/z 168 [m-2 '-Deoxyribose + H]+.
    1. Brug de samme parametre til påvisning af [15N5] 8-oxodguo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-Deoxyribose + H]+.
      Bemærk: Brug et udstyr, der svarer til eller er bedre end det udstyr, der anvendes i dette arbejde (Se tabellen over materialer). ESI-MS/MS-parametrene blev fastsat som beskrevet i tabel 1.
  2. Filtrer (ved hjælp af 0,22 μm porøse membraner) og degasify (ved hjælp af en sonicator) alle vandbaserede HPLC-opløsningsmidler.
  3. Brug følgende kromatografibetingelser for analyserne, montering af systemet som vist i figur 2.
    Bemærk: kolonne A er forbundet med den binære pumpe. Dens elueringsvæske er rettet mod UV-detektion og affald i de første 16 min og fra 32 til 46 min af kromatografien, som vist i figur 2a. Dette er den kolonne, hvorigennem prøven elupes umiddelbart efter injektion. Kolonne B er forbundet med den isokratiske pumpe og masse spektrometer. Den modtager kun elueringsvæske i kolonne A i intervallet 16-32 min., når ventilen skiftes til den position, der er vist i figur 2b. Ventil skiftet gør det muligt at oprette forbindelse mellem de to søjler, som elupes af den binære pumpe gradient. Den konfiguration, der er vist i figur 2b , giver mulighed for yderligere spids adskillelse og indsnævring. Desuden er det kun den kromatografiske fraktion af interesse, der når massespektrometer, hvilket forbedrer følsomheden og selektiviteten.
    1. Elute en 50 x 2,0 mm id, 2,5 μm, C18 kolonne (kolonne A i figur 2) koblet til en C18 sikkerhedsvagt patron (4,0 x 3,0 mm id) med en gradient af 0,1% myresyre (solvent a) og methanol indeholdende 0,1% myresyre (solvens B) ved en strømningshastighed på 150 μl/min og ved 25 °C.
      1. Brug følgende gradient program for den binære pumpe: fra 0 til 25 min, 0-15% af opløsningsmiddel B; 25 til 28 min, 15-80% af opløsningsmidlet B; 28 til 31 min, 80% af opløsningsmidlet B; 31 til 33 min, 80-0% af opløsningsmidlet B; 33 til 46 min, 0% af solvens B.
      2. Brug koblings ventilen til at dirigere de første 16 minutter af elueringsvæske til affald og 16-32 min fraktion til en anden kolonne (150 x 2,0 mm id, 3,0 μm, C18, kolonne B i figur 2) forbundet til ESI-kilden og konditioneret af den isokratiske pumpe med en opløsning på 15% mig thanol i vand, der indeholder 0,1% myresyre (150 μL/min).
        Bemærk: før du bruger koblings ventil programmet for trin 7.3.1.2, skal du kontrollere, om 8-oxodguo standard eluerer fra den første kolonne efter 16 min. Det er vigtigt at lukke ventilen ved 32 min for at bruge gradient af den binære pumpe til at eluere 8-oxodGuo fra den anden kolonne og få en skarp kromatografisk Peak. Læsion 8-oxodguo eluerer fra den anden kolonne på ca. 36 min. der kan forekomme variationer i analysmens retentions tidspunkt afhængigt af den anvendte kolonne og det benyttede udstyr. Det kan være nødvendigt at tilpasse HPLC-opløsningsmiddel gradient programmet.

Figure 2
Figur 2. System af to kolonner, der anvendes til 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodGuo) analyser. A) konfiguration anvendt i de første 16 min og fra 32 til 46 min af kromatografi; B) konfiguration anvendt i intervallet 16-32 min, tillader yderligere separation og Peak indsnævring i kolonne B før ELUERING til ESI-kilden af massespektrometer. Dette tal er blevet genudgivet fra Oliveira et al.34. Klik her for at se en større version af dette tal.

8. analyse af HPLC-ESI-MS/MS for 1, n 6 -εdado og 1, n 2 -εdguo

  1. Ved at bruge standarderne 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo i udstyret, indstilles ESI-MS/MS Parameters for den bedste påvisning af deres FRAGMENTERINGS mønstre ved multiple reaktions overvågning (MRM): m/z 276 [m + h]+ → m/z 160 [m 2 '-Deoxyribose + h]+ til påvisning af 1,N6-εdado og M/z 292 [m + h]+ → m/z 176 [m-2 '-Deoxyribose + h ]+ til påvisning af 1,N2-εdguo.
    1. Brug de samme parametre til påvisning af [15N5] 1,N6-εdado (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 '-Deoxyribose + H]+) og [15N 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + H]+ → m/z 181 [m-2 '-Deoxyribose + H]+). Angiv ESI-MS/MS-parametrene som beskrevet i tabel 1.
ESI-MS/MS-parametre 8-oxodGuo Eteno-addukter
Gardin gas 20 psi (en) 20 psi (en)
Nebulizing gas 55 af 50 af
Ion-Kildegas 50 PSI 40 PSI
Kollisions induceret Dissociations gas Medium Medium
Ion-spray spænding 5000 af 4500 af
ESI-Probe temperatur 450 af 450 af
Declustering af potentiale 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision celle exit potentiale 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Indgang potentiale 10 V 10 V

Tabel 1. Parametre, der anvendes i ESI-MS/MS-udstyr til påvisning af DNA-læsioner. Denne tabel er blevet ændret fra Oliveira et al.34.

  1. Filtrer (ved hjælp af 0,22 μm porøse membraner) og degasify (ved hjælp af en sonicator) alle vandbaserede HPLC-opløsningsmidler.
  2. Brug følgende kromatografibetingelser for analyserne.
    1. Elute en 150 x 2,0 mm id, 3,0 μm, C18 kolonne koblet til en C18 sikkerhedsvagt patron (4,0 x 3,0 mm id) med en gradient på 5 mM ammonium acetat, pH 6,6 (opløsningsmiddel A) og acetonitril (solvens B) ved en strømningshastighed på 130 μL/min og 25 °C.
      1. Brug følgende gradient program for den binære pumpe: fra 0 til 10 min, 0% af opløsningsmiddel B; 10 til 39 min, 0-20% af opløsningsmidlet B; 39 til 41 min, 20-75% af solvens B; 41 til 46 min, 75% af solvens B; 46 til 47 min, 75-0% af opløsningsmidlet B; 47 til 60 min, 0% af solvens B.
      2. Brug koblings ventilen til at dirigere den første 35 min. af elueringsvæske til affald og 35-42 min fraktion til ESI-kilden. Sørg for, at adduct-standarderne elutere fra kolonnen i det angivne interval (35-42 min). Foretag justeringer, hvis det er nødvendigt.

9. kvantificering af normale 2 '-deoxyribonucleosider ved HPLC-UV

  1. Brug et udstyr, der svarer til det udstyr, der anvendes i dette arbejde (Se tabellen over materialer).
  2. Elute en 250 mm x 4,6 mm id, 5 μm, C18 kolonne fastgjort til en C18 sikkerhedsvagt patron (4,0 x 3,0 mm id) med en gradient af 0,1% myresyre og methanol.
    1. Brug følgende gradient program: fra 0 til 25 min, 0 til 18% methanol; fra 25 til 27 min, 18 til 0% methanol; fra 27 til 37 min, 0% methanol) ved en strømningshastighed på 1 mL/min og 30 °C.
    2. Der indsprøjtes 5 μL af hver prøve, der var forbeholdt 2 '-deoxynucleosides kvantificering.
    3. Indstil DAD-detektoren ved 260 nm til integrering af dGuo-og dAdo-toppene.

10. kvantificering af DNA-læsioner

  1. Integrer toppene af 8-oxodGuo, [15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado, [15n5] 1,n6-εdado, 1,n2-εdguo og [15n5] 1,n2 -εdguo fra analyser af HPLC-ESI-MS/MS.
    1. Beregn areal forholdet for 8-oxodGuo/[15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo/[15n5 ] 1,N2-εdguo for kalibreringskurverne og prøverne.
    2. Kalibreringskurverne afbildes ved hjælp af de område forhold, der er opnået i trin 10.1.1 i y-aksen, og de mængder analysander, der er til stede i hvert punkt i x-aksen.
    3. Mængderne (fmol) af læsioner i hver injiceret prøve beregnes ved hjælp af de forhold, der er beregnet i trin 10.1.1, og kalibreringskurverne for trin 10.1.2.
  2. Integrer toppene af dGuo og dAdo fra HPLC-UV-analyserne.
    1. Kalibreringskurverne afbildes ved hjælp af de områder, der er opnået i trin 10,2 i y-aksen, og de mængder analysander, der findes i hvert punkt i x-aksen.
    2. Mængderne (nmol) af dGuo og dAdo beregnes i hver injiceret prøve ved hjælp af de områder, der er opnået i trin 10,2, og kalibreringskurverne for trin 10.2.1.
  3. De mængder (nmol) af dGuo og dAdo, der er til stede i hver prøve injiceret i HPLC-ESI-MS/MS-systemet, beregnes i betragtning af, at de beregnede mængder i trin 10.2.2 er til stede i prøvevolumenet på 5 μL, mens 50 μL blev injiceret i HPLC-ESI-MS/MS-systemet.
    Bemærk: for at beregne mængden af dGuo i de prøver, der anvendes til analyse af 8-oxodGuo, skal man blot multiplicere mængden (nmol/μL), der er opnået i trin 10.2.2, med 50. For at beregne mængderne af dAdo og dGuo i de prøver, der anvendes til analyser af 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo, skal koncentrations trinnet tages i betragtning efter massiv fase ekstraktion. Mængden af 50 μL injiceret i HPLC-ESI-MS/MS-systemet svarer til 114,32 μL af den oprindelige prøve. De mængder (nmol/μL), der opnås i trin 10.2.2, skal ganges med 114,32 for at opnå de korrekte værdier.
  4. Beregn molarfraktionerne 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdado/Dado, 1,n2-εdguo/dguo. Kvotienterne (fmol lesion/nmol normal deoxynucleosid) giver antallet af læsioner pr. 106 normal dguo eller Dado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den gennemsnitlige DNA-koncentration (± SD) opnået fra mus lever (~ 1 g væv), lunge (~ 0,2 g væv) og nyre (~ 0,4 g væv) var henholdsvis 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 og 3.223 ± 723 μg/mL i det endelige volumen af 200 μL. Et repræsentativt kromatogram fremstillet ved HPLC-DAD af det oprensede DNA er vist i figur 3. Tilstedeværelsen af de fire 2 '-deoxynukleosider, fri for RNA ribonucleosider, der elueres umiddelbart før de tilsvarende 2 '-deoxynucleosider, demonstrerer DNA-renheden.

Repræsentative kromatogrammer fra HPLC-ESI-MS/MS analyser til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,N6-εdado og 1,N2-εdguo i mus vævs DNA-prøver er vist i figur 4 til 6. Kromatogrammet opnået med UV-detektion i figur 4 viser de fire 2 '-deoxynukleosider, der eluterer fra den første kolonne indtil ~ 10 min, med en god adskillelse fra 8-oxodGuo, hvilket eliminerer uønskede interferenser. De normale 2 '-deoxynukleosider var ikke til stede i analyserne af 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo, da de blev elimineret i den faste fase ekstraktionsprocedure. Massespektre af de standarder, der anvendes i dette arbejde, er vist i figur 7.

Typiske lineære kalibreringskurver til kvantificering af 8-oxodGuo, 1, N6-Εdado og 1, n2-εdguo er vist i figur 834. Metoderne var nøjagtige og præcise, som det fremgår af tabel 234. Den inter-dag præcision beregnet for DNA aliquoter suppleret med 367 fmol af 8-oxodGuo var 16,97%, suppleret med 10 fmol af 1,N2-εdguo var 14,01%, og suppleret med 1 Fmol af 1,n6-εdado var 16,66%. Kvantificerings grænserne (S/N = 10) for de i kolonnen injicerede standarder var 25 fmol for 8-oxodGuo, 0,3 fmol for 1,n6-εdado og 1 fmol for 1,n2-εdguo34.

Metoderne blev anvendt til kvantificering af 8-oxodGuo, 1,n2-Εdguo og 1,n6-εdado i LUNGE-, lever-og nyre-DNA-prøver af A/J-mus væv udsat hele kroppen til omgivende luft beriget i PM2,5, sammenlignet med der er udsat for in situ-luft, som studie kontrol34. De fundne niveauer er vist i tabel 3, og indikerer INDUKTION af DNA-læsioner i lunge, lever og NYRER ved PM2,5 eksponering34.

Figure 3
Figur 3 . Kromatogram af hydrolysatet af en DNA-prøve ekstraheret fra muse lunge. Kromatogrammet blev opnået ved 260 nm fra HPLC-Dad-systemet. De fire 2 '-deoxynucleosider er indiceret: dC, 2 '-deoxycytidin; dA, 2 '-deoxyadenosin; dG, 2 '-deoxyguanosin; dT, 2 '-deoxythymidin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Repræsentative kromatogrammer, der viser påvisning af 8-oxo-7, 8-dihydro-2 ́-deoxyguanosin (8-oxodguo) og den interne standard [15N5] 8-oxodguo ved HPLC-ESI-MS/MS, samt de normale 2 '-deoxynucleosider elueret fra den første kolonne og omdirigeret til DAD påvisning (λ = 260 nm) og affald. DNA-prøven blev ekstraheret fra muse lunge. Analyserne af HPLC-ESI-MS/MS blev udført med multipel reaktions overvågning (MRM) ved hjælp af de fragmentationer, der er specificeret i billederne. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 . Repræsentative kromatogrammer, der viser påvisning af 1, N 6 af -etheno-2 ́-deoxyadenosin (1,N6-εdado) og den interne standard [15N5] 1, N 6 af -εdado ved HPLC-ESI-MS/MS. DNA-prøven blev ekstraheret fra muse nyrer. Analyserne blev udført med multipel reaktions overvågning (MRM) ved hjælp af de fragmentationer, der er specificeret i billederne. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 6
Figur 6 . Repræsentative kromatogrammer, der viser påvisning af 1, N 2 af -etheno-2 ́-deoxyguanosin (1,N2-εdguo) og den interne standard [15N5] 1, N 2 af -εdguo ved HPLC-ESI-MS/MS. DNA-prøven blev ekstraheret fra muselever. Analyserne blev udført med multipel reaktions overvågning (MRM) ved hjælp af de fragmentationer, der er specificeret i billederne. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 7
Figur 7 . Massespektre af de standarder, der anvendes i dette arbejde. Spektrene blev opnået i MS2 ved hjælp af kollisions energien på 20 eV for at fragmentere [M + H]+ ioner. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 8
Figur 8 . Kalibreringskurver fremstillet ved HPLC-ESI-MS/MS til kvantificering af 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxodguo), 1,n2-etheno-2 ́-deoxyguanosin (1,n2-εdguo) og 1, N6-etheno-2́-deoxyadenosin (1,N6-εdado). Relativ område betyder område forholdet mellem læsionen og dens respektive [15N5] interne standard. Dette tal er blevet ændret fra Oliveira et al.34. Klik her for at se en større version af dette tal.

ESI-MS/MS-parametre 8-oxodGuo Eteno-addukter
Gardin gas 20 psi (en) 20 psi (en)
Nebulizing gas 55 af 50 af
Ion-Kildegas 50 PSI 40 PSI
Kollisions induceret Dissociations gas Medium Medium
Ion-spray spænding 5000 af 4500 af
ESI-Probe temperatur 450 af 450 af
Declustering af potentiale 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision celle exit potentiale 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Indgang potentiale 10 V 10 V

Tabel 1. Parametre, der anvendes i ESI-MS/MS-udstyr til påvisning af DNA-læsioner. Denne tabel er blevet ændret fra Oliveira et al.34.

Basal niveau Tilføjet Opdaget Detekteret (-) basal Nøjagtighed Cv
Gennemsnit ± SD (fmol) af fmol Gennemsnit ± SD (fmol) Gennemsnit (fmol) % %
8-oxodGuo
373,00 af ± 2,71 af 0 372,79 af ± 50,6 af - - 13,57 af
373,98 af ± 4,86 af 367 af 755,41 af ± 107,92 af 381 af 103,93 af 14,29 af
374,84 af ± 5,19 af 734 af 1069,57 af ± 108,51 af 695 af 94,65 af 10,14 af
357,94 af ± 15,05 af 1469 af 1671,67 af ± 44,27 af 1314 af 89,43 af 2,65 af
371,07 af ± 2,43 af 2204 af 2272,01 af ± 40,2 af 1901 af 86,25 af 1,77 af
1, N2-εdguo
0,54 af ± 0,01 af 0 0,54 af ± 0,09 af - - 16,88 af
0,54 af ± 0,01 af 1 1,47 af ± 0,16 af 0,93 af 93,39 af 11,17 af
0,55 af ± 0,01 af 5 5,30 af ± 0,72 af 4,76 af 95,11 af 13,50 af
0,53 af ± 0,01 af 10 10,60 af ± 0,39 af 10,06 af 100,63 af 3,67 af
0,54 af ± 0,01 af 20 20,20 af ± 0,93 af 19,66 af 98,29 af 4,60 af
1, N6-εdado
2,08 af ± 0,10 af 0 2,29 af ± 0,39 af - - 17,05 af
2,05 af ± 0,04 af 1 3,06 af ± 0,47 af 1,01 af 100,89 af 15,31 af
1,99 af ± 0,06 af 5 7,87 af ± 1,66 af 5,88 af 117,60 af 21,10 af
2,03 af ± 0,07 af 10 12,43 af ± 1,25 af 10,41 af 104,06 af 10,06 af
1,97 af ± 0,03 af 20 22,42 af ± 3,89 af 20,46 af 102,29 af 17,34 af

Tabel 2. Metodens nøjagtighed og variationskoefficient (CV) til kvantificering af 8-oxodGuo, 1, N 2 af - Εdguo og 1, N 6 af -εdado i DNA. Denne tabel er blevet ændret fra Oliveira et al.34.

Luften PM2,5             N P-værdi
Gennemsnit ± SEM Gennemsnit ± SEM   
Lunge
8-oxodGuo/108 dguo 2124 af ± 56,96 af 2466 af ± 93,10 af 6 0,01 af
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 Dado 1,41 af ± 0,23 af 1,44 af ± 0,13 af 7 Ns
Leveren
8-oxodGuo/108 dguo 2848 af ± 183,5 af 2949 af ± 223,8 af 6 5 Ns
1, N2-εdguo/108 dguo 7,79 af ± 2,49 af 24,94 af ± 5,21 af 4 0,02 af
1, N6-εdado/108 Dado 2,82 af ± 0,30 af 2,18 af ± 0,25 af 6 Ns
Nyre
8-oxodGuo/108 dguo 1854 af ± 87,13 af 2363 af ± 157,0 af 6 0,02 af
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 Dado 1,09 af ± 0,15 af 1,52 af ± 0,12 af 7 0,04 af
(NS, ikke signifikant; ND, ikke fundet)

Tabel 3. Niveauer af DNA-læsioner i A/J-mus vævsprøver. Musene blev udsat for luft og omgivende luft beriget i PM2,5 (PM2,5 koncentreret 30 gange). Midler mellem de to grupper (omgivende luft og PM2,5) blev sammenlignet ved hjælp af t-test. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikante, når P-værdien var mindre end 0,05. Denne tabel er blevet ændret fra Oliveira et al.34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et stort problem, der findes i 8-oxodguo-analyserne ved HPLC-metoder, er den mulige induktion af dets dannelse under arbejdsprocedurerne for DNA-ekstraktion, DNA-hydrolyse og koncentration af DNA-hydrolysater22,38. For at minimere problemet med 8-oxodGuo artifaktuel dannelse anbefales det at tilføje deferoxamin til alle DNA-ekstraktions-, opbevarings-og hydrolyse opløsninger, anvendelse af natriumiodide chaotrope metoden og undgåelse af phenol i DNA-ekstraktion, som samt brugen af DNA-mængder tæt på 100 μg i hydrolyse proceduren for at minimere bidraget fra falsk oxidation til det endelige resultat39. Vi tog hensyn til anbefalingerne nævnt ovenfor, bortset fra brugen af natriumiodide chaotropic metode til DNA-ekstraktion. I stedet, for enkelhed, vi brugte kommercielle løsninger til DNA-ekstraktion, tilføje deferoxamin til dem før brug. Desuden blev de opnåede DNA-hydrolysater sprøjtet direkte ind i en første kolonne i HPLC-ESI-MS/MS-systemet for en tidligere adskillelse af 8-oxodGuo fra de normale Nukleosider. Umiddelbart før eluering af 8-oxodguo, blev en koblings ventil anvendt til at aflede den første kolonne elueringsvæske til en anden kolonne, hvor yderligere adskillelse og Peak indsnævring blev opnået. Denne fremgangsmåde tillod tilstrækkelig følsomhed for 8-oxodGuo kvantificering fri for interferenser. Den mest ensartede metode til kvantificering af 8-oxodGuo i DNA blev beskrevet af Chao og kollegaer22, som brugte en fælde kolonne til prøve oprydning og 8-oxodguo retention før prøve eluering i analysekolonnen ved hjælp af en koblings ventil mellem kolonnerne. Alternativt blev et koncentrationstrin på 8-oxodGuo indsamlet fra fraktioner elueret fra HPLC-separationer af DNA-hydrolysater før HPLC-ESI-MS/MS-analyser udført15, hvilket er meget mere omstøjt.

Rapporterede basal niveauer af 8-oxodguo i gnaver lungevæv, baseret på HPLC-analyser, spænder fra 180-450/108 dguo23,39,41,42,43, 1.340-2120/108 dguo44, eller ca. 3000/108 dguo45,46, med de laveste værdier opnået fra DNA ekstraktionsmetoder ved hjælp af natriumiodide. Den gennemsnitlige 8-oxodGuo niveau fundet her i lungerne af mus udsat for omgivende luft var 2124/108 dguo. Niveauet steg til 2466/108 dguo i de dyr, der blev udsat for omgivende luft beriget i PM2,5 (tabel 3)34. Det er muligt, at følsomheden for påvisning af forskelle mellem grupper kan forbedres ved at udtrække DNA med natriumiodide chaotropic metode. I nærværende undersøgelse var de gennemsnitlige 8-oxodGuo-niveauer i kontrol musene lunge-, nyre-og lever DNA henholdsvis 2,0, 1,8 og 2,7 gange højere end median basal niveauet (1047/108 dguo) opnået af European Standards Committee on oxidative DNA-skader (ESCODD) i en laboratorievurdering af 8-oxodGuo i DNA ekstraheret fra standard prøver af svinelever38.

Den vigtigste begrænsning for påvisning af 1,n6-εdado og 1,n2-εdguo i DNA er metoden følsomhed, da disse læsioner forekommer på meget lave niveauer. De laveste niveauer af 1,N2-dguo i DNA, kvantificeret ved HPLC-ESI-MS/MS, var i intervallet 0,87-4 læsioner per 108 dguo i en menneskelig cellelinje og rotte væv25,47. En måde at forbedre følsomheden og selektiviteten for deres kvantificering er at koncentrere dem fra store prøver af DNA-hydrolysater ved hjælp af fastfaseekstraktion. Dette oprydnings trin løser kromatografiske problemer, der kan opstå ved injektioner af mere end 100 μg DNA-hydrolysater i HPLC-Analysekolonner. Vi brugte denne fremgangsmåde i den validerede metode præsenteret her. Niveauerne af 1,N6-εdado, der er påvist i dette studie34 , falder inden for intervallet opnået i undersøgelser, der anvender ultralyd immun affinitet/32P-post mærkning48,49, 50 af , 51 og er lavere end dem, der er beskrevet af andre grupper, der anvender HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Tilsvarende er de 1,N2-εdguo niveauer, der er kvantificeret her34 , i overensstemmelse med de laveste niveauer, der er indberettet af Garcia25 og Angeli26 ved hjælp af HPLC-ESI-MS/MS.

HPLC-ESI-MS/MS-systemer med højere følsomhed end det udstyr, der anvendes i denne undersøgelse, er tilgængelige. Brugen af sådanne systemer gør det muligt at analysere mindre mængder DNA, hvilket udvider anvendelsen af de metoder, der præsenteres her, til situationer, hvor vævs tilgængeligheden er en begrænsning. De metoder, der præsenteres her, kan tilpasses til kvantificeringen af andre modificerede deoxynukleosider, afhængigt af tilgængeligheden af deres standarder og isotop standarder. Justering af kromatografiske forhold vil være nødvendig for at opnå skarpe toppe af alle molekyler, der indgår i analyserne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 og 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 og 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) og CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira og A. A. F. Oliveira modtog stipendier fra FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) og CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva og A. P. M. Loureiro modtog stipendier fra CNPq.

Nogle tal og tabeller i dette arbejde blev oprindeligt offentliggjort i Oliveira A.A.F. et al. genotoksiske og epigeno toksiske virkninger hos mus eksponeret for koncentrerede omgivende fine partikler (PM2,5) fra São Paulo City, Brasilien. Partikel-og fiber toksikologi. 15af 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Tags

Immunologi og infektion massespektrometri DNA-addukter DNA-oxidation genotoksicitet oxidativ stress fine partikler
Kvantificering af tre DNA-læsioner ved massespektrometri og vurdering af deres niveauer i væv af mus udsat for omgivende fine partikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Franco de Oliveira, T., Falcão… More

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H. N., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter