Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisering av tre DNA lesjoner ved Mass massespektrometri og vurdering av deres nivåer i vev av mus utsatt for ambient Fine partikler

Published: May 29, 2019 doi: 10.3791/59734
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 3,4, 5, 5, 1
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her metoder for sensitiv og nøyaktig kvantifisering av lesjoner 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-Deoksyadenosinregionen (1,n6-dAdo) og 1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) i DNA. Metodene ble brukt på vurderingen av virkningene av svevestøv partikler (PM2,5) i vev (lunge, lever og nyre) av eksponerte A/J mus.

Abstract

DNA-addukter og oksidert DNA-baser er eksempler på DNA-lesjoner som er nyttige biomarkører for toksisitet vurdering av stoffer som er Elektrofil, generere reaktive elektrofiler ved biotransformasjon, eller indusere oksidativt stress. Blant oksidert nucleobases, den mest studerte en er 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) eller 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), en biomarkør av oxidatively indusert base skade i DNA. Aldehyder og epoxyaldehydes som følge av lipid peroxidation prosessen er Elektrofil molekyler i stand til å danne mutagent exocyclic DNA addukter, slik som etheno addukter 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,N2- εdGuo) og 1,n6-etheno-2'-Deoksyadenosinregionen (1,n6-εdAdo), som har blitt foreslått som potensielle biomarkører i patofysiologi av betennelse. Selektive og følsomme metoder for deres kvantifisering i DNA er nødvendig for utvikling av forebyggende strategier for å bremse celle mutasjon priser og kronisk sykdom utvikling (f. eks, kreft, nevrodegenerative sykdommer). Blant de sensitive metoder tilgjengelig for deteksjon (høy ytelse flytende kromatografi koplet til elektrokjemiske eller tandem masse massespektrometri detektorer, komet analysen, immunanalyser, 32P-postlabeling), den mest selektive er de basert på høy ytelse flytende kromatografi koplet til tandem Mass massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet er en viktig fordel når analysere komplekse biologiske prøver og HPLC-ESI-MS/MS utviklet seg som gullstandarden for kvantifisering av modifiserte nucleosides i biologiske matriser, som DNA, urin, plasma og spytt. Bruken av isotopically merket interne standarder legger til fordel for rettelser for molekylet tap under DNA hydrolyse og analytt berikelse skritt, samt for forskjeller i analytt ionisering mellom prøvene. Den likeledes hjelpemidler inne identifikasjonen av det korrekt kromatografiske fjellpigg når mer enn ettall fjellpigg er gave.

Vi presenterer her validert sensitiv, nøyaktig og presis HPLC-ESI-MS/MS metoder som ble med hell søkt om kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo og 1,n2-dGuo i lunge, lever og nyre DNA av A/J mus for vurderingen av virkningene av ambient PM2,5 eksponering.

Introduction

Noen reaktive oksygen arter (ROS) er i stand til å oksidere karbon doble bånd av DNA baser og noen karbonatomer i deoxyribose moiety, genererer oksidert baser og DNA strand pauser1. Som et negativt ladet molekyl rik på nitrogen og oksygen atomer, er DNA også et mål for Elektrofil grupper som covalently reagerer med nukleofil nettsteder (nitrogen og oksygen), noe som gir produkter som kalles DNA addukter2. Så, DNA addukter og oksidert DNA baser er eksempler på DNA lesjoner som er nyttige biomarkører for toksisitet vurdering av stoffer som er Elektrofil, generere reaktive elektrofiler ved biotransformasjon, eller indusere oksidativt stress1, 2i det. Selv om de modifiserte DNA baser kan fjernes fra DNA ved basen eller nukleotid forbrukeravgift reparasjon (BER eller NER), induksjon av en ubalanse mellom generering og fjerning av DNA lesjoner i favør av den tidligere fører til en netto økning på sine nivåer i DNA over tid3 < /c5>. Resultatene er økningen av DNA mutasjon priser, redusert genuttrykk, og redusert protein aktivitet2,4, 5,6,7, effekter som er nært knyttet til utvikling av sykdommer. DNA mutasjoner kan påvirke ulike cellulære funksjoner, slik som celle signalering, celle syklus, Genova integritet, telomere stabilitet, epigenome, kromatin struktur, RNA skjøting, protein homeostase, metabolisme, apoptose, og celle differensiering8 ,9. Strategier for å forsinke celle mutasjon priser og kronisk sykdom utvikling (f. eks, kreft, nevrodegenerative sykdommer) passere gjennom kunnskap om mutasjon kilder, blant dem, DNA lesjoner og deres årsaker.

ROS generert endogenously i overkant, på grunn av forurensende eksponering, vedvarende betennelse, sykdom patofysiologi (f. eks, diabetes), etc., er viktige årsaker til biomolekyler Kader, inkludert DNA og lipid skade1. Som et eksempel, den svært reaktive hydroksyl radikale (OH) dannet fra H2O2 reduksjon av overgangen metall ioner (Fe2 +, Cu+) oksiderer DNA baser, DNA sukker moiety og flerumettede fettsyrer ved diffusjon-kontrollerte priser10. Blant 80 allerede karakterisert oksidert nucleobases3, den mest studerte en er 8-Oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) eller 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-OxodGuo, figur 1), en lesjon som er i stand til å indusere gt transversions i pattedyrceller10,11. Det er dannet av mono elektronisk oksidasjon av Guanin, eller ved hydroksyl radikale eller singlet oksygen angrep av Guanin i DNA1. Flerumettede fettsyrer er andre viktige mål for svært reaktive oksidanter, for eksempel •Oh, som starter prosessen med lipid peroxidation1,12. Det gir opphav til fatty acid hydroperoxides som kan brytes ned til Elektrofil aldehyder og epoxyaldehydes, som malondialdehyde, 4-AHA-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4, 5-epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyde, som er stand til å danne mutagent exocyclic DNA addukter, slik som malondialdehyde-, propano-, eller etheno addukter1,12,13. Den etheno addukter 1,n2-etheno-2'-Deoxyguanosine (1,n2-ΕdGuo, figur 1) og 1,n6-etheno-2'-deoksyadenosinregionen (1,n6-εdAdo, figur 1 ) har blitt foreslått som potensielle biomarkører i patofysiologi av betennelse14,15.

Figure 1
Figur 1. Kjemiske strukturer av DNA lesjoner kvantifisert i denne studien. dR = 2 ́-deoxyribose. Dette tallet er modifisert fra Oliveira et al.34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Studier utført tidlig på 1980-tallet tillot sensitiv påvisning av 8-oxodGuo av høy ytelse flytende kromatografi koplet til elektrokjemiske deteksjon (HPLC-ECD). Kvantifisering av 8-oxodGuo av HPLC-ECD i flere biologiske systemer utsatt for oksiderende forhold førte til anerkjennelse av 8-oxodGuo som en biomarkør av oxidatively indusert base skade i DNA1,16. Selv om den er robust og tillater kvantifisering av 8-oxodGuo i det lave fmol området17, er HPLC-ECD-målinger avhengig av nøyaktigheten av analytt oppbevaringstid for analytt identifisering og kromatografi oppløsning for å unngå forstyrrelser i andre utvalgs bestanddeler. Som elektrokjemiske deteksjon krever bruk av salt (f. eks, kalium fosfat, natrium acetate) i den mobile fasen, vedlikehold av tilstrekkelig analytiske forhold behov rutine kolonne og utstyr rengjøring tid.

Alternativt, bruk av bakteriell DNA reparasjon enzym formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) og, etterpå, menneskelige 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), for påvisning og fjerning av 8-oxoGua fra DNA, dukket opp som en måte for induksjon av DNA alkali labilt Nettsteder. Den alkali labilt nettsteder er konvertert til DNA strand pauser og la svært høysensitiv indirekte kvantifisering av 8-oxoGua av alkalisk enkelt celle gel elektroforese ("komet analysen"). Den høye følsomheten og gjennomføringen av analysene uten behov for mobilnettet DNA utvinning er de viktigste fordelene med denne typen analysen. Det gir lavest steady-state nivåer av 8-oxoGua i DNA, typisk 7-10 ganger lavere enn nivåene innhentet av bioanalytical metoder basert på HPLC. Men det er en indirekte måling av 8-oxoGua og noen ulemper er mangelen på spesifisitet eller ukjent effektiviteten av reparasjon enzymer som brukes1,16,18.

Immunanalyser er andre sett av metoder som brukes for påvisning av 8-oxoGua1 og exocyclic DNA addukter, for eksempel 1,N6-dAdo og 1,n2-dGuo12. Til tross for følsomheten, en brist av bruk av antistoffer for påvisning av DNA lesjoner er mangelen på spesifisitet på grunn av kryss-reaktivitet til andre komponenter av biologiske prøver, inkludert normal DNA baser1,12. Exocyclic DNA addukter, inkludert 1,n6-DAdo og 1,n2-dGuo, kan også oppdages og kvantifisert av svært følsomme 32P-postlabeling analyser12. Den høye følsomheten til 32P-postlabeling tillater bruk av svært små mengder DNA (f. eks 10 μg) for påvisning av ca 1 epoxyaddukt per 1010 normal baser19. Men bruken av radio-kjemikalier, mangel på kjemisk spesifisitet og lav nøyaktighet er noen ulemper19,20.

En felles begrensning av metodene sitert ovenfor er den lave selektivitet eller spesifisitet for påvisning av de ønskede molekyler. I dette scenariet, HPLC koblet til electrospray ionisering tandem masse massespektrometri (HPLC-ESI-MS/MS og HPLC-MS3) utviklet seg som gullstandarden for kvantifisering av modifisert nucleosides i biologiske matriser, som DNA, urin, plasma og spytt 1 den andre , 19 andre priser , 20. fordeler med HPLC-ESI-MS/MS metoder er følsomheten (vanligvis i lav fmol rekkevidde) og den høye spesifisitet levert av i) den kromatografiske separasjon, II) den karakteristiske og kjente mønster av molekyl fragmentering inne i massen spektrometer kollisjons kammer, og III) nøyaktig måling av den valgte massen til lade ratio (m/z) i flere reaksjons overvåkingsmodus1,19. Bruken av isotopically merket interne standarder legger til fordel for rettelser for molekylet tap under DNA hydrolyse og analytt berikelse skritt, samt for forskjeller i analytt ionisering mellom prøvene. Den likeledes hjelpemidler inne identifikasjonen av det korrekt kromatografiske fjellpigg når mer enn ettall fjellpigg er gave1,12,19,20.

Adskillige metoder basert på HPLC-ESI-MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS ha blitt anvendt for kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo og 1,N2-dGuo inne DNA utdraget fra annerledes Biological prøvene12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fine partikler (PM2,5) bærer organiske og uorganiske kjemikalier som Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), Nitro-PAH, aldehyder, ketoner, kar bok syls syrer, quinolines, metaller og vannløselige ioner, som kan indusere betennelser og oksidativt stress, forhold som favoriserer forekomsten av biomolekyler Kader og sykdom30,31,32,33. Vi presenterer her validert HPLC-ESI-MS/MS metoder som ble med hell søkt om kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo og 1,N2-dGuo i lunge, lever og nyre DNA av A/J mus for vurderingen av effekter av ambient PM2,5 eksponering34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fire ukers gamle mannlige A/J mus, spesifikke patogen gratis, ble innhentet fra avl Center of Laboratory dyr av Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, og ble behandlet i henhold til etikk Committee of The Faculty of Medicine, Universitetet São Paulo (protokoll no 1310/09).

1. innsamling av mus vev

  1. Bedøve dyret med xylazine og ketamin. Hvis du har en mus med 30 g kroppsvekt, injiserer du en løsning (ikke mer enn 2 mL) som inneholder 2,63 mg ketamin og 0,38 mg xylazine, intraperitonealt.
  2. Samle blod (0,5-1,5 mL) for utfyllende analyser (f.eks. antioksidant enzym aktivitet, malondialdehyde nivåer).
  3. Barbere mage håret fra bekkenet til xiphoid prosessen. Lag et snitt i en vertikal midtlinje i naken området. Lag snitt i horisontale laterale linjer for å avdekke abdominal organer.
  4. Skjær abdominal aorta for å fremme exsanguination og å euthanize dyret.
  5. Fjern vevet av interesse (i dette tilfellet, lever, nyrer og lunger).
    1. For å fjerne leveren, kutt dårligere cava vene og Portal hepatic vene.
    2. For å fjerne nyrene, § nyre årer og arterier.
    3. For å fjerne lungene, gjør et snitt i membranen ekstremiteter og omkrets nær brystveggen. Bryt clavicles ved å åpne en saks i det indre av bryst hulen. Skjær extern benet fra xiphoid prosessen mot luftrøret, for å avdekke lungene og hjertet.
      1. Hold lungene med en tang, del luftrøret og leddbånd rundt lungene. Fjern forsiktig blokken lungene pluss hjertet. For å fjerne lungene ut av blokken, hold hjertet med en tang og kutt alle fartøy i sin base.
  6. Vask det isolerte vevet umiddelbart i kald saltvann oppløsning (0,9% NaCl), Overfør til kryogene rør, og dypp rørene umiddelbart i flytende nitrogen. Etter endt arbeid, Oppbevar rørene ved-80 ° c.
    FORSIKTIG: flytende nitrogen i direkte kontakt med huden, slimhinnen eller øynene forårsaker brannskader. Bruk riktig individuell beskyttelse for å unngå kontakt. Arbeid i et ventilert laboratorium for å unngå kvelning på grunn av flytende nitrogendamp.

2. DNA-ekstraksjon

Merk: DNA utvinnings metoden ble modifisert fra Loureiro et al. (2009)35 for å tillate analyser av lesjoner studert her.

  1. Overfør rørene som inneholder vevet til tørr is.
  2. Bruk en kultur plate plassert på isen som en base for å skjære et stykke vev med en skalpell. Vekt 1 g for umiddelbar bruk. Det resterende vevet skal oppbevares på tørr is til det går tilbake til lagring ved-80 ° c.
    Merk: det er viktig å unngå å tine av det resterende vevet for å forhindre dannelse av artefakter hvis det er behov for repetisjoner av analysene.
  3. Til hver 1 g av vev i 50 mL avkortet rør, tilsett 10 mL av den kommersielle cellelyse løsning som inneholder 0,5 mM deferoxamine og holde på isen.
    Merk: Legg deferoxamine til volumet av løsningen for umiddelbar bruk. For hver 100 mL oppløsning, tilsett 0,0328 g av deferoxamine mesylate salt.
  4. Homogenisere vevet ved hjelp av et vev homogenisator til en homogen løsning uten vev fragmenter er innhentet. Hold røret kaldt (på isen) under homogenisering. Bruk en lav hastighet for å unngå oppvarming.
  5. Tilsett 150 μL av proteinase K-oppløsning (20 mg/mL) til hver homogenisert prøve. Rist rørene ved inversjon og oppbevar dem ved romtemperatur over natten.
  6. Tilsett 40 μL av ribonuklease en oppløsning (15 mg/mL), rist ved inversjon og hold rørene i romtemperatur i 2 timer.
    Merk: Forbered ribonuklease en løsning i natrium acetate buffer 10 mM, pH 5,2 for å unngå nedbør. Varm opp oppløsningen ved 100 ° c i 15 minutter før bruk for å få en løsning uten deoxyribonuclease.
  7. Tilsett 5 mL av kommersiell protein nedbør løsning, Vortex kraftig, og sentrifuger på 2 000 x g, 4 ° c, i 10 minutter.
  8. Overfør supernatanter til 50 mL avkortet rør som inneholder 10 mL kald isopropanol. Inverter rørene forsiktig flere ganger til observasjon av igangsatte DNA.
    Merk: protokollen kan stanses midlertidig her og holde rørene ved-20 ° c.
  9. Samle inn utløst DNA ved hjelp av en Pasteur pipette stengt på slutten. Overfør den til rør som inneholder 4 mL 10 mM Tris buffer, 1 mM deferoxamine, pH 7,0.
  10. Etter at DNA er helt oppløst i ovennevnte løsning (ikke Vortex), tilsett 4 mL av en kloroform løsning som inneholder 4% av isoamylacetat alkohol.
  11. Inverter rørene 10 ganger for homogenisering, sentrifuge ved 2 000 x g, 4 ° c, i 10 minutter for å skille de to fasene, og overføre den øvre fase til et nytt rør.
  12. Gjenta trinnene 2,10 og 2,11 to ganger til.
  13. Tilsett 8 mL absolutt etanol og 0,4 mL av en 5 M NaCl løsning for å utløse DNA.
  14. Samle igjen den igangsatte DNA og overføre den til 3 mL 70% etanol. Gjenta dette trinnet én gang til.
  15. Kast etanol løsningen med forsiktighet og invertere rørene som inneholder utløst DNA på absorberende papir for å fjerne overflødig av løsningen.
  16. Tilsett 200 μL av 0,1 mM deferoxamine løsning for å oppløse DNA-en. Oppretthold rørene ved 4 ° c til DNA er helt rehydrert (over natten).
  17. Bestem DNA-konsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 NM og dens renhet av 260/280 NM absorbansen ratio.
    Merk: for å bestemme DNA-konsentrasjonen, overfører du en alikvot på 10 μL av DNA-oppløsningen til 990 i ultrarent vann (100 – fortynning). Multipliser absorbansen ved 260 NM (det bør være under 1) av 50 (50 μg/mL er konsentrasjonen av dobbelt strandet DNA når absorbansen av en 1 cm banelengde løsning på 260 NM er 1) og av fortynning brukes (100 ganger) for å oppnå DNA-konsentrasjonen i mikrogram/mL. Hvis absorbansen ved 260 NM er over 1, er det nødvendig med ekstra fortynninger. Den 260/280 NM absorbansen ratio bør være lik eller over 1,8 for ønsket DNA renhet, men prosenter rundt 1,6 er akseptable.

3. DNA enzymatisk hydrolyse

  1. Analyse oppskrift
    1. 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-ΕDGUO analyser: en Alikvot inneholdende 150 mikrogram DNA, tilsett 7,5 μL av 200 mM Tris/MgCl2 buffer (pH 7,4), 1,4 μL av den interne standardløsningen som inneholder 250 fmol/μL av [15N5 ] 1,n6-εdAdo og [15N5] 1,n2-εdGuo og 15 enheter av deoxyribonuclease i. Juster det endelige volumet til 200 μL med ultrarent vann, og trekk deretter volumene av enzymer som skal brukes på trinn 3.2.1.
    2. 8-oxodGuo analyser: til en alikvot inneholdende 80 μg av DNA, tilsett 3,8 μL av 200 mM Tris/MgCl2 buffer (pH 7,4), 2 μL av den interne standardløsningen som inneholder 1 000 Fmol/μL av [15N5] 8-oxodGuo, og 8 enheter av deoxyribonuclease i. Juster det endelige volumet til 100 μL med ultrarent vann, og trekk fra volumene av enzymer som skal brukes på trinn 3.2.2.
      Merk: de interne standardene [15n5] 1,n6-εdAdo, [15n5] 1,n2-εdGuo og [15n5] 8-oxodGuo kan synthetized og karakteriseres som beskrevet35,36,37. Mengdene av de interne standardene i de innsatte prøve volumene bør være de samme som i volumene med injisert kalibrerings kurver.
  2. Ruge prøvene ved 37 ° c i 1 time.
    1. Prøver fra trinn 3,1: tilsett 0,006 enheter av fosfodiesterase jeg fra Crotalus Atrox og 15 enheter av alkalisk fosfatase fra storfe-tarmslimhinnen.
    2. Prøver fra trinn 3,2: tilsett 0,0032 enheter av fosfodiesterase jeg fra Crotalus Atrox og 8 enheter av alkalisk fosfatase fra storfe-tarmslimhinnen.
  3. Ruge prøvene ved 37 ° c i 1 time.
  4. Sentrifuger prøvene ved 14 000 x g i 10 minutter.
  5. Prøver fra trinn 3.2.1: Skill 10 μL av hver prøve for kvantifisering av deoxynucleosides (dAdo, dGuo) av HPLC/DAD (trinn 9). Utsett rest volumet for fast fase ekstraksjon (trinn 4).
  6. Prøver fra trinn 3.2.2: overføring 80 μL av supernatanten til hetteglass for injeksjoner av 50 μL (1 000 fmol av [15N5] 8-oxodGuo) i HPLC-ESI-MS/MS system. Reserver de resterende 20 μL for kvantifisering av dGuo av HPLC/DAD (trinn 9).

4. solid fase ekstraksjon for analyser av 1, n6-ΕdAdo og 1, n2-εdGuo

  1. Legg i patronene (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) med 1 mL av følgende sekvens av løsninger: 100% metanol, deionisert vann, hydrolysert DNA-prøve, deionisert vann, 10% metanol, 15% metanol og 100% metanol (som skal samles inn).
    Merk: ikke la patronene være tørre mellom applikasjonene til de ulike løsningene. Legg til neste løsning umiddelbart etter at forrige løsning kommer inn i kassetten helt.
  2. Vakuum tørk den siste eluering fraksjonen (100% metanol) som inneholder addukter.
  3. Resuspend de tørkede prøvene i 83,1 μL av ultrarent vann umiddelbart før HPLC-ESI-MS/MS-analyse, for å oppnå 200 fmol av hver interne standard i 50 μL av hver prøve.

5. utarbeidelse av kalibrerings kurver

  1. Forbered minst fem punkter i intervallet på 300 til 6 000 fmol av 8-oxodGuo standard, med fast mengde 1 000 fmol av [15N5] 8-oxodGuo i hvert punkt. Vurder disse beløpene i volumet injisert.
  2. Forbered minst fem punkter i intervallet 1 til 40 fmol av 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo, med faste mengder 200 fmol av [15n5] 1,n6-εdAdo og [15n5] 1, N 2-εdGuo i hvert punkt. Vurder disse beløpene i volumet injisert.
  3. Forbered minst fem poeng i intervallet av 0,05-1 nmol av dGuo og dAdo. Vurder disse beløpene i volumet injisert.

6. utarbeidelse av DNA-prøver for metode validering

  1. 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo analyser: Legg til varierende mengder 1,n6-εdAdo og 1,n2-εdGuo (for eksempel 1,75, 8,75, 17,5 og 35 fmol) og faste mengder [15N5] 1, N6-εdAdo og [15N5] 1,N2-εdGuo (350 fmol) til 100 mikrogram kalv thymus DNA og utføre enzymatisk hydrolyse som beskrevet i trinn 3. Behandle prøvene i quadruplicate på to forskjellige dager. Bruk eksemplene for metode nøyaktighet og presisjons vurdering.
    Merk: det endelige volumet av DNA-hydrolysater vil være 200 μL (trinn 3), hvorav 10 μL vil bli separert for kvantifisering av deoxynucleosides av HPLC/DAD (trinn 9). Den resterende oppløsningen (190 μL) vil bli utsatt for solid fase ekstraksjon (trinn 4), den tørkede fraksjonen vil bli resuspendert i 83,1 μL (trinn 4,3), som 50 μL vil bli injisert i HPLC-ESI-MS/MS system. Beløpene på 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo injisert vil være 1, 5, 10 og 20 fmol, med 200 fmol av [15n5] 1,n6-εdAdo og [15n5] 1,n 2-εdGuo i hvert utvalg.
  2. 8-oxodGuo analyser: Legg til varierende mengder av 8-oxodGuo (f.eks. 734, 1 468, 2 938 og 4 408 fmol) og et fast beløp på [15N5] 8-oxodGuo (2 000 fmol) til 100 MIKROGRAM med thymus-DNA og utfør enzymatisk hydrolyse som beskrevet i trinn 3. Behandle prøvene i quadruplicate på to forskjellige dager. Bruk eksemplene for metode nøyaktighet og presisjons vurdering.
    Merk: det endelige volumet av DNA-hydrolysater vil være 100 μL (trinn 3), som 50 μL vil bli injisert i HPLC-ESI-MS/MS system. Mengden av 8-oxodGuo injisert vil være 367, 734, 1469, og 2204 fmol, med 1 000 fmol av [15N5] 8-oxodGuo i hver prøve.
  3. Tilsett 13,125 fmol av 1,N6-εdAdo (for å få 7,5 fmol i injeksjonsvolumet) og 35 Fmol av 1,N2-εdGuo (for å få 20 fmol i injeksjonsvolumet) til åtte prøver av 100 mikrogram av kalv thymus DNA.
    1. Legg til de interne standardene[15n5] 1,n6-εdAdo og [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) til fire av prøvene. Fortsett med DNA hydrolyse og solid fase ekstraksjon av alle prøvene.
    2. Legg til de interne standardene[15n5] 1,n6-εdAdo og [15n5] 1,n2-εdGuo (200 fmol) i de fire andre prøvene.
    3. Bruk prøvene til å beregne utvinningen av addukter fra solid fase ekstraksjon.

7. HPLC-ESI-MS/MS analyse av 8-oxodGuo

  1. Infusjonen den 8-oxodGuo standard i utstyret, angi ESI-MS/MS parametere for best påvisning av fragmentering mønster av flere reaksjons overvåking (MRM): m/z 284 [m + H] + → m/z 168 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
    1. Bruk de samme parametrene for påvisning av [15N5] 8-oxodGuo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
      Merk: Bruk utstyr som tilsvarer eller er bedre enn det utstyret som brukes i dette arbeidet (se tabell over materialer). ESI-MS/MS parametrene ble satt som beskrevet i tabell 1.
  2. Filter (ved hjelp av 0,22 μm porøse membraner) og degasify (ved hjelp av en sonicator) alle vann baserte HPLC løsemidler.
  3. Bruk følgende kromatografi forhold for analysene, montering av systemet som vist i figur 2.
    Merk: kolonne A er koblet til den binære pumpen. Dens eluent er rettet mot UV deteksjon og avfall i de første 16 min og fra 32 til 46 min av kromatografi, som vist i figur 2a. Dette er den kolonnen der prøven er eluert umiddelbart etter injeksjon. Kolonne B er koblet til isocratic pumpen og massen spektrometer. Det mottar eluent av kolonne A bare i 16-32 min intervall, når ventilen er byttet til posisjonen vist i figur 2b. Ventilen veksling tillater tilkobling mellom de to kolonnene, som er eluert av den binære pumpen gradient. Konfigurasjonen vist i figur 2b tillater ytterligere topp separasjon og innsnevring. I tillegg er det bare kromatografiske brøkdel av interessen når massen spektrometer, bedre følsomhet og selektivitet.
    1. Eluere en 50 x 2,0 mm ID, 2,5 μm, C18 kolonne (kolonne A i figur 2) koplet til en C18 sikkerhetsvakt patron (4,0 x 3,0 mm ID) med en stigning på 0,1% maursyre syre (løsemiddel a) og metanol som inneholder 0,1% maursyre syre (løsemiddel B) med en strømningshastighet på 150 μL/min og 25 ° c.
      1. Bruk følgende gradient program for den binære pumpen: fra 0 til 25 min, 0-15% av løsemiddel B; 25 til 28 min, 15-80% av løsemiddel B; 28 til 31 min, 80% av oppløsningsmidlet B; 31 til 33 min., 80-0% av løsemiddel B; 33 til 46 min., 0% av løsemiddel B.
      2. Bruk bytte ventilen til å dirigere de første 16 min av eluent til avfall og 16-32 min brøkdel til en annen kolonne (150 x 2,0 mm ID, 3,0 μm, C18, kolonne B i figur 2) koblet til ESI kilde og betinget av isocratic pumpen med en løsning på 15% meg thanol i vann inneholdende 0,1% maursyre syre (150 μL/min).
        Merk: før du bruker bytte ventil programmet til trinn 7.3.1.2, må du kontrollere at 8-oxodGuo standard elutes fra første kolonne etter 16 min. Det er viktig å lukke ventilen på 32 min for å bruke gradient av den binære pumpen til eluere 8-oxodGuo fra den andre kolonnen og få en skarp kromatografiske peak. Lesjon 8-oxodGuo elutes fra den andre kolonnen på cirka 36 min. variasjoner av Oppbevaringstiden for analytt kan forekomme, avhengig av hvilken kolonne og hvilket utstyr som brukes. Tilpasninger av HPLC løsemiddel gradient programmet kan være nødvendig.

Figure 2
Figur 2. System av to kolonner som brukes for 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo) analyser. A) konfigurasjon som brukes i de første 16 min og fra 32 til 46 min av kromatografi; B) konfigurasjon brukes i intervallet 16-32 min, slik at videre separasjon og topp innsnevring i kolonne B før ELUERING til ESI kilden til massen spektrometer. Dette tallet har blitt publiseres fra Oliveira et al.34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

8. HPLC-ESI-MS/MS analyse av 1, n 6 -ΕdAdo og 1, n 2 -εdGuo

  1. Infusjonen den 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo standarder inn i utstyret, angi ESI-MS/MS parametere for best påvisning av deres fragmentering mønstre av flere reaksjon overvåking (MRM): m/z 276 [m + h]+ → m/z 160 [m 2 '-deoxyribose + h]+ for påvisning av 1,N6-εdAdo og M/z 292 [m + h]+ → m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + h ]+ for påvisning av 1,N2-εdGuo.
    1. Bruk de samme parametrene for påvisning av [15N5] 1,N6-εdAdo (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 '-deoxyribose + H]+) og [15n 5] 1,N2-εdGuo (m/z 297 [m + H]+ → m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + H]+). Angi ESI-MS/MS-parametere som beskrevet i tabell 1.
ESI-MS/MS parametere 8-oxodGuo Etheno addukter
Curtain gass 20 PSI 20 PSI
Forstøvning gass 55 for alle 50 for alle
Ion kilde gass 50 av PSI 40 av PSI
Kollisjon-indusert dissosiasjon gass Medium Medium
Ion spray spenning 5000 for alle 4500 for alle
ESI probe temperatur 450 for alle 450 for alle
Declustering potensial 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdAdo
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15N5] 1, N2-εdGuo
Kollisjon energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdAdo
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdAdo
27 eV, 1, N2-εdGuo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdGuo
Kollisjon celle exit potensial 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdAdo
16 V, [15N5] 8-oxodGuo 8 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16 V, [15N5] 1, N2-εdGuo
Mulighet for inngang 10 V og 10 V og

Tabell 1. Parametere som brukes i ESI-MS/MS utstyr for påvisning av DNA lesjoner. Denne tabellen er endret fra Oliveira et al.34.

  1. Filter (ved hjelp av 0,22 μm porøse membraner) og degasify (ved hjelp av en sonicator) alle vann baserte HPLC løsemidler.
  2. Bruk følgende kromatografi betingelser for analysene.
    1. Eluere en 150 x 2,0 mm ID, 3,0 μm, C18 kolonne koblet til en C18 sikkerhetsvakt patron (4,0 x 3,0 mm ID) med en stigning på 5 mM ammonium acetate, pH 6,6 (løsemiddel A) og acetonitril (løsemiddel B) ved en strømningshastighet på 130 μL/min og 25 ° c.
      1. Bruk følgende gradient program for den binære pumpen: fra 0 til 10 min, 0% av løsemiddel B; 10 til 39 min, 0-20% av oppløsningsmidlet B; 39 til 41 min, 20-75% av oppløsningsmidlet B; 41 til 46 min, 75% av oppløsningsmidlet B; 46 til 47 min., 75-0% av løsemiddel B; 47 til 60 min., 0% av løsemiddel B.
      2. Bruk bytte ventilen til å lede de første 35 min av eluent til avfall og 35-42 min brøkdel til ESI kilden. Kontroller at epoxyaddukt standarder eluere fra kolonnen i det angitte intervallet (35-42 min). Foreta justeringer om nødvendig.

9. kvantifisering av normal 2 '-deoxyribonucleosides av HPLC-UV

  1. Bruk et utstyr som ligner på utstyret som brukes i dette arbeidet (se tabell over materialer).
  2. Eluere en 250 mm x 4,6 mm ID, 5 μm, C18 kolonne festet til en C18 sikkerhetsvakt patron (4,0 x 3,0 mm ID) med en gradient på 0,1% maursyre syre og metanol.
    1. Bruk følgende gradient programmet: fra 0 til 25 min, 0 til 18% metanol; fra 25 til 27 min, 18 til 0% metanol; fra 27 til 37 min, 0% metanol) ved en strømningshastighet på 1 mL/min og 30 ° c.
    2. Injiser 5 μL av hver prøve som er reservert for 2-deoxynucleosides kvantifisering.
    3. Sett DAD-detektoren på 260 NM for integrering av dGuo-og dAdo-toppene.

10. kvantifisering av DNA-lesjoner

  1. Integrer toppene i 8-oxodGuo, [15n5] 8-OxodGuo, 1,n6-εdAdo, [15n5] 1,n6-ΕdAdo, 1,n2-εdGuo og [15n5] 1,n2 -εdGuo fra HPLC-ESI-MS/MS analyser.
    1. Beregn området prosenter av 8-oxodGuo/[15n5] 8-OxodGuo, 1,N6-εdAdo/[15N5] 1,n6-εdAdo, og 1,N2-εdGuo/[15n5 ] 1,N2-εdGuo for kalibrerings kurvene og prøvene.
    2. Plot kalibreringen kurvene ved hjelp av området prosenter innhentet i trinn 10.1.1 i y-aksen og mengder analytter tilstede i hvert punkt i x-aksen.
    3. Beregn beløpene (fmol) av lesjoner i hvert injisert prøve ved hjelp av prosenter beregnet i trinn 10.1.1 og kalibrering kurver av trinn 10.1.2.
  2. Integrer toppene i dGuo og dAdo fra HPLC-UV-analysene.
    1. Plot kalibreringen kurvene ved hjelp av områdene innhentet i trinn 10,2 i y-aksen og mengder analytter tilstede i hvert punkt i x-aksen.
    2. Beregn beløpene (nmol) av dGuo og dAdo i hver injisert prøve ved hjelp av områdene innhentet i trinn 10,2 og kalibrering kurver av trinn 10.2.1.
  3. Beregn beløpene (nmol) av dGuo og dAdo stede i hvert utvalg injisert i HPLC-ESI-MS/MS system, med tanke på at beløpene beregnet i trinn 10.2.2 er til stede i utvalgs volumet på 5 μL, mens 50 μL ble injisert i HPLC-ESI-MS/MS system.
    Merk: for å beregne mengden av dGuo i prøvene som brukes for 8-oxodGuo analyse, bare multiplisere mengden (nmol/μL) innhentet i trinn 10.2.2 av 50. For å beregne mengden av dAdo og dGuo i prøvene brukes til analyser av 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo, vurdere konsentrasjonen trinn etter solid fase ekstraksjon. Volumet på 50 μL injisert i HPLC-ESI-MS/MS-systemet tilsvarer 114,32 μL av den opprinnelige prøven. Beløpene (nmol/μL) som ble innhentet i trinn 10.2.2, bør multipliseres med 114,32 for å få de riktige verdiene.
  4. Beregn molar fraksjoner 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdAdo/DAdo, 1,n2-εdGuo/dGuo. Forholdstallene (fmol lesjon/nmol normal deoxynucleoside) gir antall lesjoner per 106 normal DGuo eller dAdo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gjennomsnittlig DNA-konsentrasjoner (± SD) innhentet fra mus leveren (~ 1 g vev), lunge (~ 0,2 g vev) og nyre (~ 0,4 g vev) var henholdsvis 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021, og 3 223 ± 723 μg/mL i det endelige volumet av 200 μL. En representativ kromatogram innhentet av HPLC-pappa av renset DNA er vist i Figur 3. Tilstedeværelsen av de fire 2 '-deoxynucleosides, fri fra RNA ribonucleosides, som eluere umiddelbart før tilsvarende 2 '-deoxynucleosides, demonstrerer DNA renhet.

Representative kromatogrammene fra HPLC-ESI-MS/MS-analyser for kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N6-ΕdAdo og 1,n2-ΕdGuo i mus vevsprøver er vist i tall 4 til 6. Kromatogram innhentet med UV-deteksjon i Figur 4 viser de fire 2 '-deoxynucleosides tent fra første kolonne til ~ 10 min, med et godt skille fra 8-oxodGuo, eliminerer uønskede forstyrrelser. Den normale 2 '-deoxynucleosides var ikke tilstede i analysene av 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo, da de ble eliminert i den solide fase utvinningsprosessen. Mass Spectra av standardene som brukes i dette arbeidet er vist i figur 7.

Typiske lineære kalibrerings kurver for kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo vises i Figur 834. Metodene var nøyaktige og presise, som presentert i tabell 234. Den Inter-dagers presisjon beregnet for DNA alikvoter supplert med 367 fmol av 8-oxodGuo var 16,97%, supplert med 10 fmol av 1,N2-εdGuo var 14,01%, og supplert med 1 Fmol av 1,N6-εdAdo var 16,66%. Grensene for kvantifisering (S/N = 10) for standardene injisert på kolonne var 25 fmol for 8-oxodGuo, 0,3 fmol for 1,n6-εdAdo, og 1 Fmol for 1,n2-εdGuo34.

Metodene ble brukt på kvantifisering av 8-oxodGuo, 1,N2-ΕdGuo og 1,n6-εdAdo i lunge, lever og nyre DNA prøver av A/J mus vev eksponert hele kroppen til ambient luft beriket i PM2,5, sammenlignet med som er eksponert for in situ omgivelsesluft som studie kontroll34. Nivåene funnet er vist i tabell 3, og indikerer INDUKSJON av DNA lesjoner i lunge, lever og NYRE av PM2,5 eksponering34.

Figure 3
Figur 3 . Kromatogram av hydrolysat av en DNA-prøve utvunnet fra mus lunge. Kromatogram ble oppnådd ved 260 NM fra HPLC-Dad-systemet. De fire 2 '-deoxynucleosides er indikert: dC, 2 '-deoxycytidine; dA, 2 '-deoksyadenosinregionen; dG, 2 '-deoxyguanosine; dT, 2 '-deoksytymidinmolekylene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Representative kromatogrammene som viser påvisning av 8-Oxo-7, 8-dihydro-2 ́-deoxyguanosine (8-oxodGuo) og den interne standarden [15N5] 8-oxodGuo av HPLC-ESI-MS/MS, samt normal 2 '-deoxynucleosides tent fra første kolonne og viderekoblet til DAD deteksjon (λ = 260 NM) og avfall. DNA-prøven ble Hentet fra muse lunge. Analysene av HPLC-ESI-MS/MS ble utført med flere reaksjons overvåking (MRM) ved hjelp av fragmentations spesifisert i bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 5
Figur 5 . Representative kromatogrammene som viser deteksjon av 1, N 6 andre priser -etheno-2 ́-deoksyadenosinregionen (1,n6-εdAdo) og den interne standarden [15N5] 1, N 6 andre priser -εdAdo av HPLC-ESI-MS/MS. DNA-prøven ble Hentet fra mus nyre. Analysene ble utført med flere reaksjons overvåkning (MRM) ved bruk av fragmentations som er angitt i bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 6
Figur 6 . Representative kromatogrammene som viser deteksjon av 1, N 2 andre priser -etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdGuo) og den interne standarden [15N5] 1, N 2 andre priser -εdGuo av HPLC-ESI-MS/MS. DNA-prøven ble Hentet fra mus leveren. Analysene ble utført med flere reaksjons overvåkning (MRM) ved bruk av fragmentations som er angitt i bildene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 7
Figur 7 . Mass Spectra av standardene som brukes i dette arbeidet. Den Spectra ble innhentet i MS2 bruke kollisjonsenergien på 20 eV å fragment [M + H]+ ioner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 8
Figur 8 . Kalibrerings kurver innhentet av HPLC-ESI-MS/MS for kvantifisering av 8-Oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n2-etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdGuo) og 1, N6-etheno-2́-deoksyadenosinregionen (1,N6-εdAdo). Relativ areal betyr område forholdet mellom lesjon og dets respektive [15N5] intern standard. Dette tallet er modifisert fra Oliveira et al.34. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ESI-MS/MS parametere 8-oxodGuo Etheno addukter
Curtain gass 20 PSI 20 PSI
Forstøvning gass 55 for alle 50 for alle
Ion kilde gass 50 av PSI 40 av PSI
Kollisjon-indusert dissosiasjon gass Medium Medium
Ion spray spenning 5000 for alle 4500 for alle
ESI probe temperatur 450 for alle 450 for alle
Declustering potensial 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdAdo
31 V, [15N5] 8-oxodGuo 41 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
45 V, 1, N2-εdGuo
45V, [15N5] 1, N2-εdGuo
Kollisjon energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdAdo
23 eV, [15N5] 8-oxodGuo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdAdo
27 eV, 1, N2-εdGuo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdGuo
Kollisjon celle exit potensial 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdAdo
16 V, [15N5] 8-oxodGuo 8 V, [15N5] 1, N6-εdAdo
16 V, 1, N2-εdGuo
16 V, [15N5] 1, N2-εdGuo
Mulighet for inngang 10 V og 10 V og

Tabell 1. Parametere som brukes i ESI-MS/MS utstyr for påvisning av DNA lesjoner. Denne tabellen er endret fra Oliveira et al.34.

Basal nivå Lagt Oppdaget Oppdaget (-) basal Nøyaktighet CV
Gjennomsnitt ± SD (fmol) fmol Gjennomsnitt ± SD (fmol) Gjennomsnitt (fmol) % %
8-oxodGuo
373,00 for alle ± 2,71 for alle 0 372,79 for alle ± 50,6 for alle - - 13,57 for alle
373,98 for alle ± 4,86 for alle 367 for alle 755,41 for alle ± 107,92 for alle 381 for alle 103,93 for alle 14,29 for alle
374,84 for alle ± 5,19 for alle 734 for alle 1069,57 for alle ± 108,51 for alle 695 for alle 94,65 for alle 10,14 for alle
357,94 for alle ± 15,05 for alle 1469 for alle 1671,67 for alle ± 44,27 for alle 1314 for alle 89,43 for alle 2,65 for alle
371,07 for alle ± 2,43 for alle 2204 for alle 2272,01 for alle ± 40,2 for alle 1901 for alle 86,25 for alle 1,77 for alle
1, N2-εdGuo
0,54 for alle ± 0,01 for alle 0 0,54 for alle ± 0,09 for alle - - 16,88 for alle
0,54 for alle ± 0,01 for alle 1 1,47 for alle ± 0,16 for alle 0,93 for alle 93,39 for alle 11,17 for alle
0,55 for alle ± 0,01 for alle 5 5,30 for alle ± 0,72 for alle 4,76 for alle 95,11 for alle 13,50 for alle
0,53 for alle ± 0,01 for alle 10 10,60 for alle ± 0,39 for alle 10,06 for alle 100,63 for alle 3,67 for alle
0,54 for alle ± 0,01 for alle 20 20,20 for alle ± 0,93 for alle 19,66 for alle 98,29 for alle 4,60 for alle
1, N6-εdAdo
2,08 for alle ± 0,10 for alle 0 2,29 for alle ± 0,39 for alle - - 17,05 for alle
2,05 for alle ± 0,04 for alle 1 3,06 for alle ± 0,47 for alle 1,01 for alle 100,89 for alle 15,31 for alle
1,99 for alle ± 0,06 for alle 5 7,87 for alle ± 1,66 for alle 5,88 for alle 117,60 for alle 21,10 for alle
2,03 for alle ± 0,07 for alle 10 12,43 for alle ± 1,25 for alle 10,41 for alle 104,06 for alle 10,06 for alle
1,97 for alle ± 0,03 for alle 20 22,42 for alle ± 3,89 for alle 20,46 for alle 102,29 for alle 17,34 for alle

Tabell 2. Metode nøyaktighet og variasjonskoeffisient (CV) for kvantifisering av 8-oxodGuo, 1, N 2 andre priser - εdGuo og 1, N 6 andre priser -εdAdo i DNA. Denne tabellen er endret fra Oliveira et al.34.

Omgivelsesluft 2,5 PM             N P-verdi
Gjennomsnitt ± SEM Gjennomsnitt ± SEM   
Lunge
8-oxodGuo/108 dGuo 2124 for alle ± 56,96 for alle 2466 for alle ± 93,10 for alle 6 0,01 for alle
1, N2-εdGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dAdo 1,41 for alle ± 0,23 for alle 1,44 for alle ± 0,13 for alle 7 Ns
Leveren
8-oxodGuo/108 dGuo 2848 for alle ± 183,5 for alle 2949 for alle ± 223,8 for alle 6 5 Ns
1, N2-εdGuo/108 dGuo 7,79 for alle ± 2,49 for alle 24,94 for alle ± 5,21 for alle 4 0,02 for alle
1, N6-εdAdo/108 dAdo 2,82 for alle ± 0,30 for alle 2,18 for alle ± 0,25 for alle 6 Ns
Nyre
8-oxodGuo/108 dGuo 1854 for alle ± 87,13 for alle 2363 for alle ± 157,0 for alle 6 0,02 for alle
1, N2-εdGuo/108 dGuo Nd Nd - -
1, N6-εdAdo/108 dAdo 1,09 for alle ± 0,15 for alle 1,52 for alle ± 0,12 for alle 7 0,04 for alle
(NS, ikke signifikant; ND, ikke oppdaget)

Tabell 3. Nivåer av DNA-lesjoner i A/J-mus vevsprøver. Musene ble eksponert for omgivelsesluft og til omgivelsesluft beriket med PM2,5 (PM2,5 konsentrert 30 ganger). Midler mellom de to gruppene (ambient luft og PM2,5) ble sammenlignet med t test. Resultatene ble betraktet som statistisk signifikant når P-verdien var mindre enn 0,05. Denne tabellen er endret fra Oliveira et al.34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et stort problem funnet i 8-oxodGuo analyser av HPLC metoder er mulig induksjon av dannelsen under workup prosedyrene for DNA-ekstraksjon, DNA hydrolyse, og konsentrasjonen av DNA hydrolysater22,38. For å minimere problemet med 8-oxodGuo artifactual formasjon, anbefales det tilsetning av deferoxamine til alle DNA-ekstraksjon, lagring og hydrolyse løsninger, bruk av natrium iodide chaotropic metode og unngåelse av fenol i DNA-ekstraksjon, som samt bruk av DNA-beløp nær 100 μg i hydrolyse prosedyren for å minimere bidraget av falsk oksidasjon til det endelige resultatet39. Vi tok hensyn til anbefalingene sitert ovenfor, bortsett fra bruk av natrium iodide chaotropic metode for DNA-ekstraksjon. I stedet, for enkelhet, brukte vi kommersielle løsninger for DNA-ekstraksjon, og legger deferoxamine til dem før bruk. I tillegg ble de oppnådde DNA-hydrolysater direkte injisert i en første kolonne av HPLC-ESI-MS/MS system for en tidligere separasjon av 8-oxodGuo fra den normale nucleosides. Umiddelbart før eluering av 8-oxodGuo ble en vekslings ventil brukt til å avlede den første kolonnen eluent til en andre kolonne der ytterligere separasjon og maksimal innsnevring ble oppnådd. Denne tilnærmingen tillot tilstrekkelig følsomhet for 8-oxodGuo kvantifisering uten forstyrrelser. Den mest lignende tilnærmingen for kvantifisering av 8-oxodGuo i DNA ble beskrevet av Chao og kollegaer22, som brukte en felle kolonne for sample opprydding og 8-oxodGuo oppbevaring før prøven eluering inn i analytiske kolonnen, ved hjelp av en bytte ventil mellom kolonnene. Alternativt, et konsentrasjons trinn på 8-oxodGuo samlet inn fra fraksjoner eluert fra HPLC separasjoner av DNA-hydrolysater før HPLC-ESI-MS/MS analyser ble utført15, som er mye mer arbeidskrevende.

Rapportert basal nivåer av 8-oxodGuo i gnager lunge vev, basert på HPLC analyser, spenner fra 180-450/108 dGuo23,39,41,42,43, 1 340-2120/108 dGuo44, eller ca 3000/108 dGuo45,46, med de laveste verdiene innhentet fra DNA-utvinning metoder ved hjelp av natrium iodide. Gjennomsnittlig 8-oxodGuo nivå finnes her i lungene av mus eksponert for omgivelsesluft var 2124/108 dGuo. Nivået økte til 2466/108 dGuo i dyrene eksponert for omgivelsesluft BERIKET med PM2,5 (tabell 3)34. Det er mulig at følsomheten for påvisning av forskjellene mellom gruppene kan forbedres ved å trekke ut DNA med natrium iodide chaotropic metoden. I denne studien, gjennomsnittlig 8-oxodGuo nivåer funnet i kontroll mus lunge, nyre, og lever DNA var henholdsvis 2,0, 1,8, og 2,7 ganger høyere enn median basal nivå (1047/108 dGuo) innhentet av den europeiske Standards komité for oksidativt DNA Damage (ESCODD) i en Inter-laboratoriet vurdering av 8-oxodGuo i DNA utvunnet fra standard prøver av gris leveren38.

Den viktigste begrensningen for påvisning av 1,n6-ΕdAdo og 1,n2-εdGuo i DNA er metoden følsomhet, da disse lesjoner oppstår på svært lave nivåer. Det lavest høyder av 1,N2-dGuo inne DNA, kvantifisert av HPLC-ESI-MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS, var inne rekken av 0,87-4 leksjonen per 108 dGuo inne en human cellen line og rotten vev25,47. En måte å forbedre følsomheten og selektivitet for deres kvantifisering er å konsentrere dem fra store prøver av DNA-hydrolysater, ved hjelp av solid fase ekstraksjon. Dette oppryddings trinnet løser kromatografiske problemer som kan oppstå fra injeksjoner med mer enn 100 μg DNA-hydrolysater i HPLC analytiske kolonner. Vi brukte denne tilnærmingen i den validerte metoden som presenteres her. Nivåene av 1,N6-εdAdo oppdaget i denne studien34 faller innenfor området innhentet i studier ansette ultrasensitive immunoaffinity/32P-postlabeling48,49, 50 for alle , 51 og er lavere enn de som er beskrevet av andre grupper ansette HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Tilsvarende 1,N2-εdGuo nivåer kvantifisert her34 er i samsvar med de laveste nivåene rapportert av Garcia25 og ANGELI26 ved hjelp HPLC-ESI-MS/MS.

HPLC-ESI-MS/MS-systemer med høyere følsomhet enn utstyret som brukes i denne studien er tilgjengelig. Bruken av slike systemer tillater analyser av mindre mengder DNA, som utvider anvendelser av metodene som presenteres her for situasjoner der vev tilgjengelighet er en begrensning. Metodene som presenteres her kan tilpasses for kvantifisering av andre modifiserte deoxynucleosides, avhengig av tilgjengeligheten av deres standarder og isotopanrikning standarder. Justering av kromatografiske forhold vil være nødvendig for å oppnå skarpe topper av alle molekyler som inngår i analysene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Pros. 2012/22190-3 og 2012/08616-8), CNPq (Pros. 454214/2014-6 og 429184/2016-6), KAPPER, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/KAPPER/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Pros. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/KAPPER; Pros. 573530/2008-4), NAP-Redoxoma (PRPUSP; Pros. 2011.1.9352.1.8) og CEPID Redoxoma (FAPESP; 2013/07937-8). T. F. Oliveira og A. F. Oliveira mottatt stipend fra FAPESP (Pros. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) og KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva, og A. P. M. Loureiro mottatt stipend fra CNPq.

Noen figurer og tabeller til stede i dette arbeidet ble opprinnelig publisert i Oliveira A.A.F. et al. gentoksisk og epigenotoxic effekter hos mus eksponert for konsentrerte partikler med svevestøv (PM2,5) fra São Paulo City i Brasil. Partikkel og fiber toksikologiske. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Tags

Immunologi og infeksjon Mass massespektrometri DNA addukter DNA oksidasjon gentoksisitet oksidativt stress svevestøv
Kvantifisering av tre DNA lesjoner ved Mass massespektrometri og vurdering av deres nivåer i vev av mus utsatt for ambient Fine partikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Franco de Oliveira, T., Falcão… More

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H. N., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter