Summary
Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.
Abstract
Os adutos do DNA e as bases oxidadas do ADN são exemplos das lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrophilic, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo. Dentre as nucleobases oxidadas, a mais estudada é a 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo), um biomarcador de dano base oxidativamente induzido no DNA. Os aldeídos e os epoxyaldehydes resultantes do processo da peroxidação do lipido são as moléculas substituição capazes de dar forma aos adutos exocíclicas mutagénicas do ADN, tais como os adutos 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine do eteno (1,n2- εdGuo) e 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que foram sugeridos como biomarcadores potenciais na fisiopatologia da inflamação. Métodos seletivos e sensíveis para sua quantificação no DNA são necessários para o desenvolvimento de estratégias preventivas para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas). Entre os métodos sensíveis disponíveis para sua detecção (cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detectores de espectrometria de massas eletroquímicas ou em tandem, ensaio cometa, imunoensaios, 32P-pós-rotulagem), os mais seletivos são aqueles baseados em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-ESI-MS/MS). A seletividade é uma vantagem essencial na análise de amostras biológicas complexas e a HPLC-ESI-MS/MS evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Também auxilia na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente.
Nós apresentamos aqui métodos sensíveis, exatos e precisos da HPLC-ESI-MS/MS validados que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo e 1,n2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de A/J para a avaliação dos efeitos da exposição ambiental PM2,5 .
Introduction
Algumas espécies reativas de oxigênio (ROS) são capazes de oxidar ligações duplas de carbono de bases de DNA e alguns carbonos na fração desoxirribose, gerando bases oxidadas e quebras de fio de DNA1. Como uma molécula carregada negativamente rica em átomos de nitrogênio e oxigênio, o DNA também é um alvo para grupos eletrofílicos que reagem covalentemente com os sítios nucleofílicos (nitrogênio e oxigênio), dando produtos que são chamados de adutos de DNA2. Assim, os adutos do ADN e as bases oxidadas do ADN são exemplos de lesões do ADN que são biomarcadores úteis para a avaliação da toxicidade das substâncias que são electrofílicas, geram eletrófilos reactivos em cima da biotransformação, ou induzem o stress oxidativo1, o 2. Embora as bases modificadas do ADN possam ser removidas do ADN pela base ou pelo reparo da excisão do nucleotide (BER ou NER), a indução de um desequilíbrio entre a geração e a remoção de lesões do ADN em favor do anterior conduz a um aumento líquido de seus níveis no tempo estipulado do ADN3 < /C5 >. Os resultados são o aumento das taxas de mutação do DNA, a redução da expressão gênica e a diminuição da atividade protéica2,4,5,6,7, efeitos que estão intimamente relacionados com a desenvolvimento de doenças. As mutações do DNA podem afetar diversas funções celulares, como sinalização celular, ciclo celular, integridade do genoma, estabilidade do telômero, epigenome, estrutura da cromatina, splicing de RNA, homeostase proteica, metabolismo, apoptose e diferenciação celular8 ,9. Estratégias para retardar as taxas de mutação celular e o desenvolvimento crônico da doença (por exemplo, câncer, doenças neurodegenerativas) passam pelo conhecimento das fontes de mutação, entre elas, as lesões do DNA e suas causas.
ROS gerados endogenamente em excesso, devido à exposição ao poluente, inflamação persistente, fisiopatologia da doença (por exemplo, diabetes), etc., são causas importantes de dano da biomolécula, incluindo o DNA e o dano lipídico1. Como exemplo, o radical hidroxila altamente reativo (OH) formado a partir de H2O2 redução por íons metálicos de transição (FE2 +,+ +) oxida as bases de DNA, a fração de açúcar de DNA e os ácidos graxos poliinsaturados em controle de difusão taxas de10. Entre os 80 já caracterizados nucleobases oxidadas3, o mais estudado é 8-oxo-7,8-diidroguanina (8-oxoGua) ou 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-Desoxiguanosina (8-oxodGuo, Figura 1), uma lesão que é capaz de induzir transversões gt em células mamíferas10,11. É formado pela oxidação eletrônica mono da guanina, ou pelo ataque de oxigênio radical hidroxila ou singlet de guanina no DNA1. Os ácidos graxos poliinsaturados são outros alvos importantes de oxidantes altamente reativos, como •Oh, que iniciam o processo de peroxidação lipídica1,12. Ele dá origem a hidroperóxidos de ácidos graxos que podem se decompor a aldeídos eletrofílicos e epoxialdeídos, tais como malondialdeído, 4-hidroxi-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4, 5-epóxi-(2E)-decenal, hexenal, acroleína, crotonaldeído, que são capaz de formar adutos de DNA exocílicos mutagénicos, como os adutos de malondialdeído, propano ou eteno1,12,13. Os adutos de eteno 1,n2-eteno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo , Figura 1) e 1,n6-eteno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-εdado, Figura 1 ) têm sido sugeridas como potenciais biomarcadores na fisiopatologia da inflamação14,15.
Figura 1. Estruturas químicas das lesões de DNA quantificadas no presente estudo. dR = 2 ́-desoxirribose. Este número foi modificado de Oliveira et al.34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Estudos realizados no início da década de 1980 permitiram a detecção sensível de 8-oxodGuo por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção eletroquímica (HPLC-ECD). A quantificação de 8-oxodguo por HPLC-ECD em diversos sistemas biológicos sujeitados às circunstâncias oxidantes conduziu ao Recognition de 8-oxodguo como um biomarcador de dano de base oxidativamente induzido no ADN1,16. Embora robusto e permitindo a quantificação de 8-oxodguo na escala baixa de fmol17, as medidas do HPLC-ECD confiam na exatidão do tempo da retenção do analito para a identificação do analito e na definição da cromatografia para evitar interferências de outros constituintes da amostra. Como a detecção eletroquímica requer o uso de sal (por exemplo, fosfato de potássio, acetato de sódio) na fase móvel, a manutenção de condições analíticas adequadas precisa de rotina de coluna e tempo de limpeza do equipamento.
Alternativamente, o uso do DNA bacteriano da enzima de reparo do ADN glicosilase do formamidopyrimidine (fpg) e, mais tarde, o glicolisase 1 do humano 8-oxoguanine (hOGG1), para a deteção e a remoção de 8 oxogua do ADN, emergiu como uma maneira para a indução do lábil do alcalóide do ADN Sites. Os locais lábeis do alcalóide são convertidos às rupturas da costa do ADN e permitem a quantificação indireta muito elevada sensível de 8 oxoGua pela electroforese alcalina do gel da única pilha ("ensaio do cometa"). A alta sensibilidade e a realização das análises sem a necessidade de extração de DNA celular são as principais vantagens deste tipo de ensaio. Dá os níveis os mais baixos do estado estacionário de 8 oxoGua no ADN, tipicamente 7-10 vezes mais baixos do que os níveis obtidos por métodos bioanalíticos baseados no HPLC. No entanto, é uma medida indireta de 8-oxogua e algumas desvantagens são a falta de especificidade ou a eficiência desconhecida das enzimas de reparo utilizadas1,16,18.
Os imunoensaios são outro conjunto de métodos utilizados para a detecção de 8-oxoGua1 e ADUTOS de DNA exocídrico, como 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo12. Apesar da sensibilidade, uma lacuna do uso de anticorpos para a detecção de lesões de DNA é a falta de especificidade devido à reatividade cruzada a outros componentes de amostras biológicas, incluindo as bases normais de DNA1,12. Os adutos exocílicos de DNA, incluindo 1, n6-DAdo e 1, n2-dguo, também podem ser detectados e quantificados por ensaios altamente sensíveis de 32P-postetiquetagem12. A sensibilidade elevada de 32P-postrotulagem permite o uso de quantidades muito pequenas de ADN (por exemplo, 10 μg) para a deteção de aproximadamente 1 aduto por 1010 bases normais19. No entanto, o uso de radioquímicos, a falta de especificidade química e a baixa acurácia são algumas desvantagens19,20.
Uma limitação compartilhada dos métodos citados acima é a baixa seletividade ou especificidade para a detecção das moléculas desejadas. Nesse cenário, a HPLC acoplada à espectrometria de massas em tandem de ionização por electrospray (HPLC-ESI-MS/MS e HPLC-MS3) evoluiu como padrão-ouro para quantificação de nucleosídeos modificados em matrizes biológicas, como DNA, urina, plasma e saliva 1. º , 19 anos de , 20. vantagens dos métodos de HPLC-ESI-MS/MS são a sensibilidade (tipicamente na baixa escala do fmol) e a especificidade elevada fornecida por i) a separação cromatográfica, II) o teste padrão característico e conhecido da fragmentação da molécula dentro da massa Câmara de colisão do espectrómetro, e III) a medida exata da massa selecionada para carregar a relação (m/z) no modo múltiplo da monitoração da reação1,19. O uso de padrões internos isotopicamente rotulados acrescenta a vantagem de correções para perdas de moléculas durante a hidrólise do DNA e as etapas de enriquecimento do analito, bem como para as diferenças da ionização do analito entre as amostras. Auxilia também na identificação do pico cromatográfico correto quando mais de um pico está presente1,12,19,20.
Vários métodos baseados em HPLC-ESI-MS/MS têm sido utilizados para quantificação de 8-oxodguo, 1,n6-dAdo e 1,n2-dguo em DNA extraído de diferentes amostras biológicas12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Partículas finas (PM2,5) transportar produtos químicos orgânicos e inorgânicos, tais como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHS), Nitro-PAHS, aldeídos, cetonas, ácidos carboxílicos, quinolinas, metais e íons solúveis em água, que podem induzir inflamação e estresse oxidativo, condições que favorecem a ocorrência de danos biomoléculas e doença30,31,32,33. Nós apresentamos aqui métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que foram aplicados com sucesso para a quantificação de 8-oxodGuo, de 1, den6-dAdo e de 1, den2-dguo no ADN do pulmão, do fígado e do rim de ratos de a/J para a avaliação do efeitos do ambiente PM2,5 exposição34.
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Protocol
Camundongos a/J machos de quatro semanas de idade, sem patógenos específicos, foram obtidos do centro reprodutor de animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil, e foram tratados de acordo com o Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de São Paulo (protocolo n º 1310/09).
1. coleção de tecidos de camundongos
- Anestesie o animal com xilazina e cetamina. Para um rato com 30 g de peso corporal, injete uma solução (não mais de 2 mL) contendo 2,63 mg de cetamina e 0,38 mg de xilazina, intraperitonealmente.
- Colete sangue (0,5-1,5 mL) para análises complementares (por exemplo, atividade enzimática antioxidante, níveis de malondialdeído).
- Raspar o cabelo abdominal da pélvis para o processo xifóide. Faça uma incisão em uma linha média vertical na área sem pêlos. Faça incisões em linhas laterais horizontais, a fim de expor os órgãos abdominais.
- Corte a aorta abdominal para promover o exsanguinação e para eutanizar o animal.
- Retire os tecidos de interesse (neste caso, fígado, rins e pulmões).
- Para remover o fígado, corte a veia cava inferior e a veia hepática Portal.
- Para remover os rins, seção as veias renais e artérias.
- Para remover os pulmões, faça uma incisão nas extremidades do diafragma e circunferência perto da parede torácica. Quebre as clavículas abrindo uma tesoura no interior da cavidade torácica. Corte o osso extern do processo xiphoide em direção à traquéia, a fim de expor os pulmões e o coração.
- Segure o pulmão com uma pinça, seção da traquéia e os ligamentos ao redor dos pulmões. Retire cuidadosamente os pulmões bloco mais coração. Para remover os pulmões do bloco, segure o coração com uma pinça e corte todos os vasos em sua base.
- Lave os tecidos isolados imediatamente em solução salina fria (0,9% NaCl), transfira para tubos criogênicos e mergulhe imediatamente os tubos em nitrogênio líquido. Depois de completar o trabalho, guarde os tubos a-80 ° c.
Cuidado: o nitrogênio líquido em contato direto com a pele, mucosa ou olhos provoca queimaduras. Use a proteção individual apropriada para evitar o contato. Trabalhe em um laboratório ventilado para evitar a asfixia devido ao vapor de nitrogênio líquido.
2. extração de DNA
Nota: o método de extração de DNA foi modificado de Loureiro et al. (2009)35 para permitir a análise das lesões estudadas.
- Transfira os tubos contendo os tecidos para o gelo seco.
- Use uma placa de cultura colocada no gelo como uma base para cortar um pedaço de tecido com um bisturi. Peso 1 g para uso imediato. O tecido remanescente deve ser mantido em gelo seco até que retorne ao armazenamento em-80 ° c.
Nota: é importante evitar o descongelar do tecido remanescente para evitar a formação de artefatos se forem necessárias repetições das análises. - A cada 1 g de tecido em 50 mL tampados tubos, adicionar 10 mL da solução de lise celular comercial contendo 0,5 mM deferoxamina e manter no gelo.
Nota: Adicionar deferoxamina ao volume de solução para utilização imediata. Para cada 100 mL de solução, adicione 0, 328 g do sal de mesilato de deferoxamina. - Homogeneizar os tecidos usando um homogeneizador de tecido até que uma solução homogênea sem fragmentos de tecido é obtida. Mantenha o tubo frio (no gelo) durante a homogeneização. Use uma velocidade baixa para evitar o aquecimento.
- Adicionar 150 μL de solução de proteinase K (20 mg/mL) a cada amostra homogeneizada. Agitar os tubos por inversão e mantê-los à temperatura ambiente durante a noite.
- Adicionar 40 μL de solução de ribonuclease A (15 mg/mL), agitar por inversão e manter os tubos à temperatura ambiente durante 2 h.
Nota: Prepare A solução de ribonuclease A em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 5,2 para evitar a precipitação. Aqueça a solução a 100 ° c durante 15 minutos antes de utilizar para obter uma solução livre de desoxirribonuclease. - Adicione 5 mL da solução comercial da precipitação da proteína, vortex vigorously, e centrifugue em 2.000 x g, 4 ° c, por 10 minutos.
- Transfira os sobrenadantes para 50 mL de tubos tampados contendo 10 mL de isopropanol frio. Inverta os tubos suavemente várias vezes até a observação do DNA precipitado.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui, mantendo os tubos a-20 ° c. - Colete o DNA precipitado usando uma pipeta Pasteur fechada no final. Transferi-lo para tubos contendo 4 mL de tampão Tris de 10 mM, 1 mM de deferoxamina, pH 7,0.
- Depois que o DNA é completamente dissolvido na solução acima (não vórtice), adicione 4 mL de uma solução de clorofórmio contendo 4% de álcool isoamílico.
- Inverta os tubos 10 vezes para a homogeneização, centrifugador em 2.000 x g, 4 ° c, por 10 minutos para separar as duas fases, e transfere a fase superior a um tubo novo.
- Repita as etapas 2,10 e 2,11 mais duas vezes.
- Adicione 8 mL de etanol absoluto e 0,4 mL de uma solução de NaCl de 5 M para precipir o DNA.
- Colete novamente o DNA precipitado e transfira-o para 3 mL de etanol a 70%. Repita este passo mais uma vez.
- Descarte a solução de etanol com cautela e inverta os tubos contendo o DNA precipitado em papel absorvente para remover o excesso da solução.
- Adicionar 200 μL de solução de deferoxamina a 0,1 mM para dissolver o ADN. Manter os tubos a 4 ° c até que o DNA seja completamente rehidratado (durante a noite).
- Determine a concentração do ADN medindo a absorvância em 260 nanômetro e sua pureza pela relação da absorvência de 260/280 nanômetro.
Nota: para determinar a concentração de ADN, transferir uma alíquota de 10 μL da solução de ADN para 990 μL de água ultrapura (diluição de 100X). Multiplicar a absorvência a 260 nm (deve ser inferior a 1) por 50 (50 μg/mL é a concentração de DNA de dupla encalhada quando a absorvência de uma solução de comprimento de 1 cm em 260 nm é 1) e pela diluição utilizada (100x) para obter a concentração de DNA em μg/mL. Se a absorvância a 260 nm estiver acima de 1, são necessárias diluições adicionais. A relação da absorvência de 260/280 nanômetro deve ser igual ou acima de 1,8 para a pureza desejada do ADN, mas as relações em torno de 1,6 são aceitáveis.
3. hidrólise enzimática de DNA
- Receita de análise
- 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo análises: para uma alíquota contendo 150 μg de DNA, adicionar 7,5 μL de 200 mm Tris/MgCl2 tampão (pH 7,4), 1,4 μL da solução padrão interna contendo 250 fmol/μL de [15N5 ] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo e 15 unidades de desoxirribonuclease I. Ajuste o volume final para 200 μl com água ultrapura, subtraindo os volumes de enzimas a serem utilizados na etapa 3.2.1.
- análises de 8-oxodGuo: para uma alíquota contendo 80 μg de DNA, adicione 3,8 μL de tampão Tris/MgCl2 de 200 mm (pH 7,4), 2 μl da solução padrão interna contendo 1.000 fmol/μL de [15N5] 8-oxodguo e 8 unidades de desoxirribonuclease I. Ajuste o volume final para 100 μL com água ultrapura, subtraindo os volumes de enzimas a serem utilizados na etapa 3.2.2.
Nota: os padrões internos [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo e [15n5] 8-oxodguo podem ser sintetizada e caracterizados como descrita35,36,37. As quantidades dos padrões internos nos volumes de amostra injetados devem ser as mesmas dos volumes de curva de calibração injetada.
- Incubar as amostras a 37 ° c durante 1 hora.
- Amostras da etapa 3,1: Adicionar 0, 6 unidades de fosfodiesterase I de Crotalus atrox e 15 unidades de fosfatase alcalina da mucosa intestinal bovina.
- Amostras da etapa 3,2: Adicionar 0, 32 unidades de fosfodiesterase I de Crotalus atrox e 8 unidades de fosfatase alcalina da mucosa intestinal bovina.
- Incubar as amostras a 37 ° c durante 1 hora.
- Centrifugue as amostras a 14.000 x g durante 10 minutos.
- Amostras da etapa 3.2.1: separe 10 μL de cada amostra para quantificação dos desoxinucleosídeos (dAdo, dGuo) por HPLC/DAD (etapa 9). Sujeitar o volume residual à extração em fase sólida (passo 4).
- Amostras da etapa 3.2.2: Transfira 80 μL do sobrenadante para frascos para injetáveis de 50 μL (1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo) no sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reserve os restantes 20 μL para quantificação de dGuo por HPLC/DAD (passo 9).
4. extração em fase sólida para análises de 1, n6-εdado e 1, n2-εdguo
- Carregar os cartuchos (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) com 1 mL da seguinte sequência de soluções: 100% metanol, água deionizada, amostra de DNA hidrolisado, água deionizada, 10% metanol, 15% metanol e 100% metanol (a ser coletado).
Nota: não deixe os cartuchos secos entre as aplicações das diferentes soluções. Adicione a próxima solução imediatamente após a solução anterior entrar no cartucho completamente. - O vácuo seca a última fração de eluição (100% metanol) contendo os adutos.
- Ressuscitem as amostras secas em 83,1 μL de água ultrapura imediatamente antes da análise de HPLC-ESI-MS/MS, para obter 200 fmol de cada padrão interno em 50 μL de cada amostra.
5. preparação de curvas de calibração
- Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 300 a 6.000 fmol de 8-oxodGuo padrão, com a quantidade fixa de 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo em cada ponto. Considere esses valores no volume injetado.
- Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 1 a 40 fmol de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo, com montantes fixos de 200 fmol de [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1, N 2-εdguo em cada ponto. Considere esses valores no volume injetado.
- Prepare pelo menos cinco pontos no intervalo de 0, 5-1 nmol de dGuo e de dAdo. Considere esses valores no volume injetado.
6. preparação de amostras de DNA para validação de método
- 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo análises: Adicionar quantidades variáveis de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo (por exemplo, 1,75, 8,75, 17,5 e 35 fmol) e quantidades fixas de [15N5] 1, N6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (350 fmol) a 100 μg de DNA de timo de bezerro e realizar a hidrólise enzimática conforme descrito na etapa 3. Processe as amostras em quadruplicate em dois dias diferentes. Use as amostras para a precisão do método e a avaliação de precisão.
Nota: o volume final dos hidrolisados de DNA será de 200 μL (etapa 3), dos quais 10 μL serão separados para quantificação de desoxinucleosídeos por HPLC/DAD (etapa 9). A solução remanescente (190 μL) será submetida à extração em fase sólida (etapa 4), a fração seca será reressuscitada em 83,1 μL (etapa 4,3), a partir da qual 50 μL serão injetados no sistema HPLC-ESI-MS/MS. As quantidades de 1,n6-Εdado e 1,n2-εdguo injetado serão 1, 5, 10 e 20 fmol, com 200 fmol de [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n 2-εdguo em cada amostra. - análises 8-oxodGuo: Adicione quantidades variadas de 8-oxodGuo (por exemplo, 734, 1.468, 2.938 e 4.408 fmol) e uma quantidade fixa de [15N5] 8-oxodguo (2.000 fmol) a 100 μg de DNA de timo de bezerro e realize a hidrólise enzimática conforme descrito na etapa 3. Processe as amostras em quadruplicate em dois dias diferentes. Use as amostras para a precisão do método e a avaliação de precisão.
Nota: o volume final dos hidrolisados do ADN será 100 μl (etapa 3), de que 50 μL serão injetados no sistema de HPLC-ESI-MS/MS. As quantidades de 8-oxodGuo injetadas serão 367, 734, 1469, e 2204 fmol, com 1.000 fmol de [15N5] 8-oxodguo em cada amostra. - Adicionar 13,125 fmol de 1,N6-εdado (para obter 7,5 fmol no volume de injeção) e 35 fmol de 1,N2-εdguo (para obter 20 fmol no volume de injeção) para oito amostras de 100 μg de DNA de timo de bezerro.
- Acrescente as normas internas [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) a quatro das amostras. Proceder com a hidrólise de DNA e extração em fase sólida de todas as amostras.
- Acrescente as normas internas [15n5] 1,n6-εdado e [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) às outras quatro amostras.
- Use as amostras para calcular a recuperação dos adutos da extração em fase sólida.
7. HPLC-ESI-MS/MS análise de 8-oxodGuo
- Inutilizando o padrão 8-oxodGuo no equipamento, ajuste os parâmetros ESI-MS/MS para a melhor deteção de seu teste padrão da fragmentação pela monitoração múltipla da reação (MRM): m/z 284 [m + h] + → m/z 168 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
- Use os mesmos parâmetros para a detecção de[15N5] 8-oxodguo : m/z 289 [m + h]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
Nota: Utilize um equipamento equivalente ou superior ao equipamento utilizado neste trabalho (consulte a tabela de materiais). Os parâmetros ESI-MS/MS foram definidos conforme descrito na tabela 1.
- Use os mesmos parâmetros para a detecção de[15N5] 8-oxodguo : m/z 289 [m + h]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
- Filtrar (usando 0,22 μm membranas porosas) e degasify (usando um sonicator) todos os solventes de HPLC à base de água.
- Use as seguintes condições de cromatografia para as análises, montando o sistema como mostrado na Figura 2.
Nota: a coluna a está ligada à bomba binária. Seu eluente é direcionado para detecção e desperdício de UV nos primeiros 16 min e de 32 para 46 min da cromatografia, como mostrado na Figura 2a. Esta é a coluna através da qual a amostra é eluída imediatamente após a injeção. A coluna B está conectada à bomba isocrática e ao espectrómetro de massa. Ele recebe o eluente da coluna A apenas no intervalo de 16-32 min, quando a válvula é comutada para a posição mostrada na Figura 2b. O interruptor da válvula permite a conexão entre as duas colunas, que são eluída pelo inclinação binário da bomba. A configuração mostrada na Figura 2b permite maior separação e estreitamento do pico. Adicionalmente, apenas a fração cromatográfica de interesse atinge o espectrómetro de massas, melhorando a sensibilidade e a seletividade.- Elute a 50 x 2,0 mm i.d., 2,5 μm, coluna C18 (coluna A da Figura 2) acoplado a um cartucho de segurança c18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico (solvente a) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) a uma vazão de 150 μl/min e 25 ° c.
- Use o seguinte programa de gradiente para a bomba binária: de 0 a 25 min, 0-15% do solvente B; 25 a 28 min, 15-80% do solvente B; 28 a 31 min, 80% do solvente B; 31 a 33 min, 80-0% do solvente B; 33 a 46 min, 0% do solvente B.
- Use a válvula de comutação para direcionar os primeiros 16 min de eluente ao desperdício e a fração de 16-32 min para uma segunda coluna (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, C18, coluna B da Figura 2) conectada à fonte ESI e condicionada pela bomba isocrática com uma solução de 15% me thanol em água contendo 0,1% de ácido fórmico (150 μL/min).
Nota: antes de usar o programa da válvula de comutação da etapa 7.3.1.2, verifique se os 8-oxodguo elutos padrão da primeira coluna após 16 min. É importante fechar a válvula em 32 min para usar o gradiente da bomba binária para eluir 8-oxodguo da segunda coluna e obter um pico cromatográfico afiado. A lesão 8-oxodguo elutos da segunda coluna em aproximadamente 36 min. variações do tempo de retenção do analito podem ocorrer dependendo da coluna e do equipamento utilizado. Adaptações do programa de gradiente de solvente HPLC podem ser necessárias.
- Elute a 50 x 2,0 mm i.d., 2,5 μm, coluna C18 (coluna A da Figura 2) acoplado a um cartucho de segurança c18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico (solvente a) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) a uma vazão de 150 μl/min e 25 ° c.
Figura 2. Sistema de duas colunas usadas para 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo) análises. A) configuração utilizada nos primeiros 16 min e de 32 a 46 min da cromatografia; B) configuração utilizada no intervalo de 16-32 min, permitindo maior separação e estreitamento do pico na coluna B antes da eluição à fonte ESI do espectrómetro de massa. Este número foi republicado de Oliveira et al.34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
8. HPLC-ESI-MS/MS análise de 1, n 6 -εdado e 1, n 2 -εdguo
- Inutilizando os padrões 1, n6-Εdado e 1, n2-εdguo no equipamento, defina os parâmetros ESI-MS/MS para a melhor detecção de seus padrões de fragmentação por monitoramento de reação múltipla (MRM): m/z 276 [m + h]+ → m/z 160 [m 2 '-deoxyribose + h]+ para detecção de 1,N6-εdado e m/z 292 [m + h]+ → m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + h ]+ para detecção de 1,N2-εdguo.
- Use os mesmos parâmetros para a detecção de [15n5] 1, n6-εdado (m/z 281 [m + h]+m/z → 165 [m-2 '-deoxyribose + H]+) e [15n 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + h]+ → m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + H]+). Defina os parâmetros ESI-MS/MS conforme descrito na tabela 1.
| Parâmetros ESI-MS/MS | 8-oxodGuo | Adutos de etheno |
| Cortina de gás | 20 libras por polegada quadrada | 20 libras por polegada quadrada |
| Gás Nebulizing | 55 | 50 |
| Gás da fonte do íon | 50 libras por polegada quadrada | 40 libras por polegada quadrada |
| Gás de dissociação induzida por colisão | Médio | Médio |
| Ion spray de tensão | 5000 | 4500 |
| Temperatura da sonda ESI | 450 | 450 |
| Potencial de declumentação | 31 V, 8-oxodGuo | 41 V, 1, N6-εdado |
| 31 V, [15N5] 8-oxodguo | 41 V, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 45 V, 1, N2-εdguo | ||
| 45V, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Energia de colisão | 23 eV, 8-oxodGuo | 25 eV, 1, N6-εdado |
| 23 eV, [15N5] 8-oxodguo | 25 eV, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 27 eV, 1, N2-εdguo | ||
| 27 eV, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Potencial de saída de célula de colisão | 16 V, 8-oxodGuo, | 8 V, 1, N6-εdado |
| 16 V, [15N5] 8-oxodguo | 8 V, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 16 V, 1, N2-εdguo | ||
| 16 V, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Potencial de entrada | 10 V | 10 V |
Tabela 1. Parâmetros utilizados no equipamento ESI-MS/MS para detecção das lesões do DNA. Esta tabela foi modificada de Oliveira et al.34.
- Filtrar (usando 0,22 μm membranas porosas) e degasify (usando um sonicator) todos os solventes de HPLC à base de água.
- Use as seguintes condições de cromatografia para as análises.
- Elute a 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, coluna C18 acoplada a um cartucho de segurança C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de acetato de amônio de 5 mM, pH 6,6 (solvente A) e acetonitrila (solvente B) a uma vazão de 130 μL/min e 25 ° c.
- Use o seguinte programa de gradiente para a bomba binária: de 0 a 10 min, 0% de solvente B; 10 a 39 min, 0-20% do solvente B; 39 a 41 min, 20-75% do solvente B; 41 a 46 min, 75% do solvente B; 46 a 47 min, 75-0% do solvente B; 47 a 60 min, 0% do solvente B.
- Use a válvula de comutação para direcionar o primeiro 35 min de eluente ao desperdício e a fração 35-42 min para a fonte ESI. Certifique-se de que as normas aduto eluir da coluna no intervalo definido (35-42 min). Faça ajustes, se necessário.
- Elute a 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, coluna C18 acoplada a um cartucho de segurança C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de acetato de amônio de 5 mM, pH 6,6 (solvente A) e acetonitrila (solvente B) a uma vazão de 130 μL/min e 25 ° c.
9. quantificação de 2 '-deoxyribonucleosides normais por HPLC-UV
- Utilize um equipamento semelhante ao equipamento utilizado neste trabalho (consulte a tabela de materiais).
- Elute um 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, coluna C18 anexado a um cartucho de segurança C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) com um gradiente de 0,1% de ácido fórmico e metanol.
- Use o seguinte programa de gradiente: de 0 a 25 min, 0 a 18% de metanol; de 25 a 27 min, de 18 a 0% de metanol; de 27 a 37 min, 0% de metanol) a uma vazão de 1 mL/min e 30 ° c.
- Injetar 5 μL de cada amostra reservada para quantificação de 2 '-deoxynucleosídeos.
- Ajuste o detetor do paizinho em 260 nanômetro para a integração dos picos de dGuo e de dAdo.
10. quantificação das lesões do DNA
- Integre os picos de 8-oxodGuo, [15n5] 8-Oxodguo, 1,n6-εdado, [15n5] 1,n6-εdado, 1,n2-εdguo, e [15n5] 1,n2 -εdguo das análises HPLC-ESI-MS/MS.
- Calcule as proporções de área de 8-oxodGuo/[15n5] 8-oxodguo, 1, n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado, e 1,n2-εdguo/[15n5 ] 1,N2-εdguo para as curvas de calibração e as amostras.
- Plotar as curvas de calibração usando as proporções de área obtidas na etapa 10.1.1 no eixo y e as quantidades de analitos presentes em cada ponto no eixo x.
- Calcule as quantidades (fmol) das lesões em cada amostra injetada usando as relações calculadas na etapa 10.1.1 e as curvas da calibração da etapa 10.1.2.
- Integre os picos de dGuo e de dAdo das análises HPLC-UV.
- Plotar as curvas de calibração usando as áreas obtidas na etapa 10,2 no eixo y e as quantidades de analitos presentes em cada ponto no eixo x.
- Calcule as quantidades (nmol) de dGuo e de dAdo em cada amostra injetada usando as áreas obtidas na etapa 10,2 e as curvas da calibração da etapa 10.2.1.
- Calcular as quantidades (nmol) de dGuo e dAdo presentes em cada amostra injetada no sistema HPLC-ESI-MS/MS, Considerando que os valores calculados na etapa 10.2.2 estão presentes no volume amostral de 5 μL, enquanto 50 μL foram injetados no sistema HPLC-ESI-MS/MS.
Nota: para calcular a quantidade de dGuo nas amostras utilizadas para a análise de 8-oxodGuo, basta multiplicar a quantidade (nmol/μL) obtida no passo 10.2.2 por 50. Para calcular as quantidades de dAdo e dGuo nas amostras utilizadas para análises de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo, considerar a etapa de concentração após a extração em fase sólida. O volume de 50 μL injetado no sistema HPLC-ESI-MS/MS corresponde a 114,32 μL da amostra original. Os montantes (nmol/μL) obtidos na etapa 10.2.2 devem ser multiplicados por 114,32 para obter os valores corretos. - Calcule as frações molar 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-εdado/dado, 1,n2-εdguo/dguo. As proporções (fmol lesão/nmol deoxynucleoside normal) dão o número de lesões por 106 dguo normal ou dAdo.
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Representative Results
As concentrações médias de DNA (± DP) obtidas do fígado de camundongos (tecido ~ 1 g), pulmão (tecido de ~ 0,2 g) e rim (tecido ~ 0,4 g) foram, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 e 3.223 ± 723 μg/mL no volume final de 200 μL. Um cromatograma representativo obtido por HPLC-DAD do DNA purificado é mostrado na Figura 3. A presença dos quatro 2 '-deoxynucleosides, livre dos ribonucleosides do RNA, que eluir imediatamente antes dos 2 '-deoxynucleosides correspondentes, demonstra a pureza do ADN.
Os cromatogramas representativos das análises de HPLC-ESI-MS/MS para a quantificação de 8-oxodGuo, 1,n6-Εdado e 1,n2-εdguo em amostras do ADN do tecido dos ratos são mostrados nas figuras 4 a 6. O cromatograma obtido com a detecção de UV na Figura 4 mostra os quatro 2 '-deoxynucleosides farmacológicos da primeira coluna até ~ 10 min, com uma boa separação de 8-oxodguo, eliminando interferências indesejadas. Os 2 '-desoxinucleosídeos normais não estavam presentes nas análises de 1,n6-εdado e 1,n2-εdguo, pois foram eliminados no procedimento de extração em fase sólida. Os espectros de massa dos padrões utilizados neste trabalho são mostrados na Figura 7.
As curvas de calibração linear típicas para quantificação de 8-oxodGuo, 1,n6-Εdado e 1,n2-εdguo são mostradas na Figura 834. Os métodos foram precisos e precisos, conforme apresentado na tabela 234. A precisão entre os dias calculada para alíquotas de DNA suplementada com 367 fmol de 8-oxodGuo foi de 16,97%, suplementada com 10 fmol de 1,N2-εdguo foi de 14, 1%, e suplementada com 1 Fmol de 1,N6-εdado foi de 16,66%. Os limites de quantificação (S/N = 10) para as normas injetadas na coluna foram de 25 fmol para 8-oxodGuo, 0,3 fmol para 1,n6-εdado e 1 Fmol para 1,n2-εdguo34.
Os métodos foram aplicados à quantificação de 8-oxodGuo, 1,n2-Εdguo e 1,n6-εdado em amostras de DNA pulmonar, hepática e renal de tecidos de camundongos a/J expostos corpo inteiro ao ar ambiente enriquecido em PM2,5, comparado com expostos ao ar ambiente in situ como o controle do estudo34. Os níveis encontrados são mostrados na tabela 3, e indicam a indução de lesões de DNA no pulmão, fígado e rim pela PM2,5 exposição34.
Figura 3 . Cromatograma do hidrolisado de uma amostra do ADN extraída do pulmão do rato. O cromatograma foi obtido a 260 nm do sistema HPLC-Dad. Os quatro 2 '-deoxynucleosides são indicados: C.c., 2 '-Deoxycytidine; dA, 2 '-Desoxiadenosina; dG,2 '-Desoxiguanosina; dT,2 '-desoxitimidina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Cromatogramas representativos que mostram a deteção de 8-oxo-7,8-dihydro-2 ́-deoxyguanosine (8-oxodguo) e o padrão interno [15N5] 8-oxodguo por HPLC-ESI-MS/MS, assim como os 2 '-deoxynucleosides normais farmacológicos da primeira coluna e desviado para a deteção do paizinho (λ = 260 nanômetro) e o desperdício. A amostra de DNA foi extraída do pulmão do camundongo. As análises por HPLC-ESI-MS/MS foram realizadas com monitoramento de reação múltipla (MRM) utilizando-se as fragmentações especificadas nas imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Cromatogramas representativos que mostram a detecção de 1, N 6 anos de -etheno-2 ́-deoxyadenosine (1,n6-εdado) e o padrão interno [15n5] 1, N 6 anos de -εdado por HPLC-ESI-MS/MS. A amostra de DNA foi extraída do rim do rato. As análises foram realizadas com o monitoramento de múltiplas reações (MRM) utilizando-se as fragmentações especificadas nas imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Cromatogramas representativos que mostram a detecção de 1, N 2. º -etheno-2 ́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) e o padrão interno [15n5] 1, N 2. º -εdguo por HPLC-ESI-MS/MS. A amostra de DNA foi extraída do fígado do rato. As análises foram realizadas com o monitoramento de múltiplas reações (MRM) utilizando-se as fragmentações especificadas nas imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 . Espectros de massa das normas utilizadas neste trabalho. Os espectros foram obtidos em MS2 utilizando a energia de colisão de 20 eV para fragmentar o [M + H]+ íons. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 . Curvas de calibração obtidas por HPLC-ESI-MS/MS para quantificação de 8-oxo-7,8-dihidro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodguo), 1,n2-etheno-2́-deoxyguanosine (1,n2-εdguo) e 1, N6-etheno-2́-deoxyadenosine (1,N6-εdado). Área relativa significa as relações de área entre a lesão e seu respectivo [15N5] padrão interno. Este número foi modificado de Oliveira et al.34. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros ESI-MS/MS | 8-oxodGuo | Adutos de etheno |
| Cortina de gás | 20 libras por polegada quadrada | 20 libras por polegada quadrada |
| Gás Nebulizing | 55 | 50 |
| Gás da fonte do íon | 50 libras por polegada quadrada | 40 libras por polegada quadrada |
| Gás de dissociação induzida por colisão | Médio | Médio |
| Ion spray de tensão | 5000 | 4500 |
| Temperatura da sonda ESI | 450 | 450 |
| Potencial de declumentação | 31 V, 8-oxodGuo | 41 V, 1, N6-εdado |
| 31 V, [15N5] 8-oxodguo | 41 V, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 45 V, 1, N2-εdguo | ||
| 45V, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Energia de colisão | 23 eV, 8-oxodGuo | 25 eV, 1, N6-εdado |
| 23 eV, [15N5] 8-oxodguo | 25 eV, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 27 eV, 1, N2-εdguo | ||
| 27 eV, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Potencial de saída de célula de colisão | 16 V, 8-oxodGuo, | 8 V, 1, N6-εdado |
| 16 V, [15N5] 8-oxodguo | 8 V, [15n5] 1, n6-εdado | |
| 16 V, 1, N2-εdguo | ||
| 16 V, [15n5] 1, n2-εdguo | ||
| Potencial de entrada | 10 V | 10 V |
Tabela 1. Parâmetros utilizados no equipamento ESI-MS/MS para detecção das lesões do DNA. Esta tabela foi modificada de Oliveira et al.34.
| Nível basal | Adicionado | Detectado | Detectado (-) basal | Precisão | Cv | ||||
| Média ± DP (fmol) | fmol | Média ± DP (fmol) | Média (fmol) | % | % | ||||
| 8-oxodGuo | |||||||||
| 373, 0 | ± | 2,71 | 0 | 372,79 | ± | 50,6 | - | - | 13,57 |
| 373,98 | ± | 4,86 | 367 | 755,41 | ± | 107,92 | 381 | 103,93 | 14,29 |
| 374,84 | ± | 5,19 | 734 | 1069,57 | ± | 108,51 | 695 | 94,65 | 10,14 |
| 357,94 | ± | 15, 5 | 1469 | 1671,67 | ± | 44,27 | 1314 | 89,43 | 2,65 |
| 371, 7 | ± | 2,43 | 2204 | 2272, 1 | ± | 40,2 | 1901 | 86,25 | 1,77 |
| 1, N2-εdguo | |||||||||
| 0,54 | ± | 0, 1 | 0 | 0,54 | ± | 0, 9 | - | - | 16,88 |
| 0,54 | ± | 0, 1 | 1 | 1,47 | ± | 0,16 | 0,93 | 93,39 | 11,17 |
| 0,55 | ± | 0, 1 | 5 | 5,30 | ± | 0,72 | 4,76 | 95,11 | 13,50 |
| 0,53 | ± | 0, 1 | 10 | 10,60 | ± | 0,39 | 10, 6 | 100,63 | 3,67 |
| 0,54 | ± | 0, 1 | 20 | 20,20 | ± | 0,93 | 19,66 | 98,29 | 4,60 |
| 1, N6-εdado | |||||||||
| 2, 8 | ± | 0,10 | 0 | 2,29 | ± | 0,39 | - | - | 17, 5 |
| 2, 5 | ± | 0, 4 | 1 | 3, 6 | ± | 0,47 | 1, 1 | 100,89 | 15,31 |
| 1,99 | ± | 0, 6 | 5 | 7,87 | ± | 1,66 | 5,88 | 117,60 | 21,10 |
| 2, 3 | ± | 0, 7 | 10 | 12,43 | ± | 1,25 | 10,41 | 104, 6 | 10, 6 |
| 1,97 | ± | 0, 3 | 20 | 22,42 | ± | 3,89 | 20,46 | 102,29 | 17,34 |
Tabela 2. Acurácia do método e coeficiente de variação (CV) para quantificação de 8-oxodGuo,1, N 2. º - Εdguo e 1, N 6 anos de -εdado no DNA. Esta tabela foi modificada de Oliveira et al.34.
| Ar ambiente | PM2,5 | N | Valor de P | |||||
| Média ± SEM | Média ± SEM | |||||||
| Pulmão | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 2124 | ± | 56,96 | 2466 | ± | 93,10 | 6 | 0, 1 |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | Nd | Nd | - | - | ||||
| 1, N6-εdado/108 dAdo | 1,41 | ± | 0,23 | 1,44 | ± | 0,13 | 7 | Ns |
| Fígado | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 2848 | ± | 183,5 | 2949 | ± | 223,8 | 6 5 | Ns |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | 7,79 | ± | 2,49 | 24,94 | ± | 5,21 | 4 | 0, 2 |
| 1, N6-εdado/108 dAdo | 2,82 | ± | 0,30 | 2,18 | ± | 0,25 | 6 | Ns |
| Rim | ||||||||
| 8-oxodGuo/108 dguo | 1854 | ± | 87,13 | 2363 | ± | 157,0 | 6 | 0, 2 |
| 1, N2-εdguo/108 dguo | Nd | Nd | - | - | ||||
| 1, N6-εdado/108 dAdo | 1, 9 | ± | 0,15 | 1,52 | ± | 0,12 | 7 | 0, 4 |
| (NS, não significativo; ND, não detectado) | ||||||||
Tabela 3. Níveis das lesões do ADN em amostras do tecido dos ratos de a/J. Os camundongos foram expostos ao ar ambiente e ao ar ambiente enriquecido em PM2,5 (PM2,5 concentrado 30 vezes). Os meios entre os dois grupos (ar ambiente e PM2,5) foram comparados por meio do teste t. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes quando o valor de P foi inferior a 0, 5. Esta tabela foi modificada de Oliveira et al.34.
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Discussion
Um problema principal encontrado nas análises 8-oxodguo por métodos da HPLC é a indução possível de sua formação durante os procedimentos do workup da extração do ADN, da hidrólise do ADN, e da concentração de hidrolisados do ADN22,38. A fim de minimizar o problema da formação vesícula 8-oxodguo, recomenda-se a adição de deferoxamina a todas as soluções de extração de DNA, armazenamento e hidrólise, o uso do método de iodeto de sódio agente e evitar o fenol na extração de DNA, como bem como o uso de quantidades de DNA próximos a 100 μg no procedimento de hidrólise para minimizar a contribuição da oxidação espúria para o resultado final39. Levamos em conta as recomendações citadas acima, exceto o uso do método de iodeto de sódio para extração de DNA. Em vez disso, para simplificar, utilizamos soluções comerciais para extração de DNA, acrescentando-lhes deferoxamina antes de usar. Além, os hidrolisados obtidos do ADN foram injetados diretamente em uma primeira coluna do sistema de HPLC-ESI-MS/MS para uma separação precedente de 8 oxodguo dos Nucleosides normais. Imediatamente antes da eluição de 8-oxodGuo, uma válvula de comutação foi usada para desviar o eluente da primeira coluna a uma segunda coluna onde a separação mais adicional e o estreitamento máximo foram conseguidos. Esta aproximação permitiu a sensibilidade adequada para a quantificação de 8 oxodGuo livre das interferências. A aproximação a mais similar para a quantificação de 8 oxodGuo no ADN foi descrita por chao e por colegas de trabalho22, que usaram uma coluna da armadilha para a limpeza da amostra e a retenção 8-oxodguo antes da eluição da amostra na coluna analítica, usando uma válvula de comutação entre as colunas. Alternativamente, uma etapa de concentração de 8-oxodguo coletada das frações eluidas das separações da HPLC de hidrolisados do ADN antes das análises de HPLC-ESI-MS/MS foi executada15, que é muito mais laborious.
Níveis basais relatados de 8-oxodguo em tecido pulmonar de roedores, com base em análises de HPLC, variam de 180-450/108 dguo23,39,41,42, 43, 1.340-2120/108 dguo44, ou aproximadamente 3000/108 dguo45,46, com os mais baixos valores obtidos dos métodos da extração do ADN usando o iodeto do sódio. O nível 8-oxodGuo médio encontrado aqui no pulmão dos ratos expostos ao ar ambiental era 2124/108 dguo. O nível aumentou para 2466/108 dguo nos animais expostos ao ar ambiente enriquecido em PM2,5 (tabela 3)34. É possível que a sensibilidade para a detecção de diferenças entre os grupos possa ser melhorada através da extração do DNA com o método de iodeto de sódio chaotrópico. No presente estudo, os níveis médios de 8-oxodGuo encontrados nos camundongos controle pulmão, rim e DNA hepático foram, respectivamente, 2,0, 1,8 e 2,7 vezes superiores ao nível basal mediano (1047/108 dguo) obtidos pelo Comitê Europeu de normas de oxidativa Dano do ADN (ESCODD) em uma avaliação interlaboratorial do 8-oxodGuo no ADN extraído das amostras padrão do fígado de porco38.
A principal limitação para a detecção de 1,n6-Εdado e 1,n2-εdguo no DNA é a sensibilidade do método, pois essas lesões ocorrem em níveis muito baixos. Os níveis mais baixos de 1,N2-dguo no DNA, quantificados por HPLC-ESI-MS/MS, estavam na faixa de 0,87-4 lesões por 108 dguo em uma linha celular humana e tecidos de ratos25,47. Uma maneira de melhorar a sensibilidade e a seletividade para sua quantificação é concentrá-las de grandes amostras de hidrolisados de DNA, utilizando extração em fase sólida. Esta etapa de limpeza resolve problemas cromatográficos que podem surgir de injeções de mais de 100 μg de hidrolisados de DNA em colunas analíticas de HPLC. Utilizou-se essa abordagem no método validado aqui apresentado. Os níveis de 1,N6-εdado detectados neste estudo34 caem dentro da faixa obtida em estudos empregando imunoafinidade ultrassensora/32P-postetiquetagem48,49, 50 , 51 e são inferiores aos descritos por outros grupos empregando HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Similarmente, os níveis 1,N2-εdguo quantificados aqui34 são consistentes com os níveis mais baixos relatados por Garcia25 e Angeli26 usando HPLC-ESI-MS/MS.
Estão disponíveis sistemas HPLC-ESI-MS/MS com maior sensibilidade do que os equipamentos utilizados neste estudo. O uso desses sistemas permite a análise de menores quantidades de DNA, o que amplia as aplicações dos métodos aqui apresentados para situações em que a disponibilidade tecidual é uma limitação. Os métodos aqui apresentados podem ser adaptados para a quantificação de outros desoxinucleosídeos modificados, dependendo da disponibilidade de seus padrões e padrões isotópicas. O ajuste das condições cromatográficas seria necessário a fim de obter picos agudos de todas as moléculas incluídas nas análises.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 e 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 e 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) e CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira e A. A. F. Oliveira receberam bolsas de estudo da FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) e CAPES (coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva e A. P. M. Loureiro receberam bolsas do CNPq.
Algumas figuras e tabelas presentes neste trabalho foram originalmente publicadas em Oliveira A.A.F. et al. efeitos genotóxicos e epigenotóxicos em camundongos expostos a matéria particulada de partículas finas (PM2,5) da cidade de São Paulo, Brasil. Toxicologia de partículas e fibras. 15, 40 (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [15N5]-2’-deoxyadenosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2’-deoxyguanosine | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitrile | Carlo Erba Reagents | 412413000 | |
| alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa | Sigma | P5521 | |
| ammonium acetate | Merck | 101116 | |
| calf thymus DNA | Sigma | D1501 | |
| cell lysis solution | QIAGEN | 158908 | |
| chloroform | Carlo Erba Reagents | 412653 | |
| deferoxamine | Sigma | D9533 | |
| deoxyribonuclease I (DNase I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| ethanol | Carlo Erba Reagents | 414542 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| HPLC-ESI-MS/MS system | HPLC: Agilent 1200 series ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C). ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP. | |
| HPLC/DAD system | Shimadzu | Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP) | |
| HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) | Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| isoamyl alcohol | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| isopropyl alcohol (isopropanol) | Carlo Erba Reagents | A412790010 | |
| ketamine | Ceva | Commercial name: Dopalen | |
| magnesium chloride | Carlo Erba Reagents | 349377 | |
| magnesium chloride | Sigma | M2393 | |
| methanol | Carlo Erba Reagents | L022909K7 | |
| phosphodiesterase I from Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| protein precipitation solution | QIAGEN | 158912 | |
| proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| ribonuclease A | Sigma | R5000 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Carlo Erba Reagents | 489983 | |
| xylazine | Syntec do Brasil | Commercial name: Xilazin |
References
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