Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifiering av tre DNA-lesioner med masspektrometri och bedömning av deras nivåer i vävnader från möss som utsätts för omgivande fina partiklar

Published: May 29, 2019 doi: 10.3791/59734
Automatic Translation
*1,2, *1, 3, 3, 3,4, 5, 5, 1
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver här metoder för känslig och noggrann kvantifiering av lesioner 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosin (1,n6-Dado) och 1,n2- etheno-2 '-deoxyguanosin (1,N2-DGUO) i DNA. Metoderna tillämpades på bedömningen av effekterna av omgivande fina partiklar (PM2,5) i vävnader (lungor, lever och njure) av exponerade A/J-möss.

Abstract

DNA-addukter och oxiderade DNA-baser är exempel på DNA-lesioner som är nyttiga bio markörer för toxicitetsbedömningen av substanser som är elektrofila, genererar reaktiva elektrofiler vid bio Transformation eller inducerar oxidativ stress. Bland de oxiderade nukleobaser, den mest studerade en är 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxogua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodguo), en bio markör av oxidativt inducerad bas skador i DNA. Aldehyder och epoxyaldehyder till följd av lipidperoxidations processen är elektrofila molekyler som kan bilda mutagena exocykliska DNA-addukter, såsom etheno addukter 1,n2-etheno-2 '-deoxyguanosin (1,n2- εdGuo) och 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosin (1,n6-εdado), som har föreslagits som potentiella bio markörer i patofysiologin av inflammation. Selektiva och känsliga metoder för deras kvantifiering i DNA är nödvändiga för att utveckla förebyggande strategier för att bromsa cell mutations frekvenser och kronisk sjukdoms utveckling (t. ex. cancer, neurodegenerativa sjukdomar). Bland de känsliga metoder som finns tillgängliga för deras upptäckt (högpresterande vätskekromatografi kopplad till elektrokemiska eller tandem masspektrometri detektorer, komet analys, immunoassay, 32P-postmärkning), de mest selektiva är de som bygger på hög prestanda vätskekromatografi kopplad till tandem masspektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet är en viktig fördel vid analys av komplexa biologiska prover och HPLC-ESI-MS/MS utvecklades som den gyllene standarden för kvantifiering av modifierade nukleosidor i biologiska matriser, såsom DNA, urin, plasma och saliv. Användningen av isotopiskt märkta interna standarder ger fördelen av korrigeringar för molekyl förluster under DNA hydrolys och analyten anriknings steg, samt för skillnader i analytjonisering mellan proverna. Det underlättar också identifieringen av den korrekta kromatografiska toppen när mer än en topp är närvarande.

Vi presenterar här validerade känsliga, exakta och exakta HPLC-ESI-MS/MS-metoder som framgångs rikt tillämpades för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i lung-, lever-och njure DNA från A/J-möss för bedömningen av effekterna av den omgivande PM2,5 -exponeringen.

Introduction

Vissa reaktiva syreradikaler (ROS) kan oxidera kol dubbel bindningar av DNA-baser och vissa kol atomer i deoxyribose del, generera oxiderade baser och DNA strand raster1. Som en negativt laddad molekyl rik på kväve-och syre atomer är DNA också ett mål för elektrofila grupper som kovalent reagerar med de nukleofila platserna (kväve och syre), vilket ger produkter som kallas DNA-addukter2. Så, DNA addukter och oxiderade DNA baser är exempel på DNA-lesioner som är användbara bio markörer för toxicitet bedömning av ämnen som är elektrofila, generera reaktiva elektrophiles på bio Transformation, eller inducera oxidativ stress1, och 2. Även om de modifierade DNA-baser kan avlägsnas från DNA genom bas eller nukleotid excision reparation (BER eller NER), induktion av en obalans mellan generering och avlägsnande av DNA-lesioner till förmån för de förstnämnda leder till en nettoökning av deras nivåer i DNA övertid3 < /C5 >. Resultat är ökningen av DNA-mutations frekvenser, minskat gen uttryck och minskad protein aktivitet2,4,5,6,7, effekter som är nära relaterade till utveckling av sjukdomar. DNA-mutationer kan påverka olika cellulära funktioner, såsom cellsignalering, cell cykel, genom integritet, telomer stabilitet, epigenomet, kromatin struktur, RNA splitsning, protein homeostas, metabolism, apoptos, och cell differentiering8 ,9. Strategier för att bromsa cell mutations frekvenser och kronisk sjukdoms utveckling (t. ex. cancer, neurodegenerativa sjukdomar) passerar genom kunskapen om mutationskällorna, bland dem, DNA-lesioner och deras orsaker.

ROS genereras endogent i överskott, på grund av förorening exponering, ihållande inflammation, sjukdomspatofysiologi (t. ex., diabetes), etc., är viktiga orsaker till bio molekyl ära skador, inklusive DNA och lipid skador1. Som ett exempel, den mycket reaktiva hydroxylradikal (OH) bildas från H2O2 reduktion av över gång metall joner (Fe2 +, cu+) oxiderar DNA baser, DNA-socker delen och fleromättade fett syror vid diffusions-kontrollerad och räntor10. Bland de 80 redan karakteriserade oxiderade nukleobaser3, den mest studerade en är 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxoGua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodGuo, figur 1), en lesion som kan inducera gt transversioner i däggdjurs celler10,11. Det bildas genom mono elektronisk oxidation av guanin, eller genom hydroxylgrupp radikal eller singlet syre attack av guanin i DNA1. Fleromättade fett syror är andra viktiga mål för mycket reaktiva oxidanter, såsom •Oh, som initierar processen för lipidperoxidation1,12. Det ger upphov till fett syra Hydro per oxider som kan sönderdelas till elektrofila aldehyder och epoxyaldehyder, såsom malondialdehyd, 4-hydroxi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxi-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyd, som kunna bilda mutagena exocykliska DNA-addukter, såsom malondialdehyd-, Propano-, eller etheno addukter1,12,13. Etheno addukter 1,n2-etheno-2 '-deoxyguanosin (1,n2-εdguo, figur 1) och 1,n6-etheno-2 '-Deoxyadenosin (1,n6-εdado, figur 1 ) har föreslagits som potentiella bio markörer i patofysiologin av inflammation14,15.

Figure 1
I figur 1. Kemiska strukturerna hos de DNA-lesioner som kvantifierats i den här studien. dR = 2 ́-deoxyribose. Denna siffra har ändrats från Oliveira et al.34. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Studier som genomfördes i början av 1980-talet tillät den känsliga upptäckten av 8-oxodGuo av högpresterande vätskekromatografi kopplad till elektrokemisk detektion (HPLC-ECD). Kvantifiering av 8-oxodguo av HPLC-ECD i flera biologiska system utsätts för oxiderande förhållanden ledde till erkännandet av 8-oxodguo som en bio markör av oxidativt inducerad bas skador i DNA1,16. Även om det är robust och gör det möjligt att kvantifiera 8-oxodGuo i det låga fmol-området17, förlitar sig HPLC-ECD-mätningar på noggrannheten hos analytretentions tiden för analytidentifiering och på kromatografiupplösningen för att undvika interferenser av andra prov bestånds delar. Eftersom den elektrokemiska upptäckten kräver användning av salt (t. ex. kalium fosfat, natriumacetat) i den mobila fasen, behöver underhållet av lämpliga analytiska tillstånd rutinmässig kolonn och utrustning rengörings tid.

Alternativt, användning av bakterien DNA reparation enzym formamidopyrimidine DNA glykosylase (FPG) och, efteråt, mänskliga 8-oxoguanin glykosylase 1 (hOGG1), för detektion och avlägsnande av 8-oxogua från DNA, framkom som ett sätt för induktion av DNA alkali labila Platser. De alkalilabila platserna konverteras till DNA-strandbryt och tillåter mycket hög känslig indirekt kvantifiering av 8-oxogua genom alkalisk Single cell gel elektrofores ("kometanalys"). Den höga känsligheten och utförandet av analyserna utan behov av cellulära DNA-extraktion är de främsta fördelarna med denna typ av analys. Det ger den lägsta Steady-State nivåer av 8-oxoGua i DNA, typiskt 7-10 gånger lägre än de nivåer som erhålls genom bio analytiska metoder baserade på HPLC. Det är dock en indirekt mätning av 8-oxogua och vissa nack delar är bristen på specificitet eller den okända effektiviteten i reparera enzymer som används1,16,18.

Immunoassay är andra uppsättning metoder som används för detektion av 8-oxoGua1 och EXOCYKLISKA DNA addukter, såsom 1,n6-Dado och 1,n2-dguo12. Trots känsligheten, en brist på användning av anti kroppar för detektion av DNA-lesioner är bristen på specificitet på grund av korsreaktivitet till andra komponenter i biologiska prover, inklusive de normala DNA-baser1,12. Den exocykliska DNA addukter, inklusive 1,n6-Dado och 1,n2-dguo, kan också upptäckas och kvantifieras av mycket känsliga 32P-postmärkning analyser12. Den höga känsligheten hos 32P-postmärkning gör det möjligt att använda mycket små mängder DNA (t. ex. 10 μg) för detektion av ca 1 ankring per 1010 normal baser19. Emellertid, bruket av Radios ände-kemikalieer, brist av kemisk specificitet och låg exakthet är några missgynnar19,20.

En delad begränsning av de metoder som nämns ovan är den låga selektivitet eller specificitet för detektion av de önskade molekylerna. I det här scenariot utvecklades HPLC kopplat till elektrospray jonisering tandem masspektrometri (HPLC-ESI-MS/MS och HPLC-MS3) som guld standard för kvantifiering av modifierade nukleosidor i biologiska matriser, såsom DNA, urin, plasma och saliv 1 den första , den 19 , 20. fördelar med HPLC-ESI-MS/MS-metoder är känsligheten (vanligt vis i det låga fmol-intervallet) och den höga specificitet som i) den kromatografiska separationen, II) det karakteristiska och kända mönstret av molekylfragmentering i massan spektrometer kollision kammare, och III) exakt mätning av den valda massan att ladda förhållandet (m/z) i flera reaktions övervakning läge1,19. Användningen av isotopiskt märkta interna standarder ger fördelen av korrigeringar för molekyl förluster under DNA hydrolys och analyten anriknings steg, samt för skillnader i analytjonisering mellan proverna. Det hjälper också i identifieringen av den korrekta kromatografiska toppen när mer än en topp är närvarande1,12,19,20.

Flera metoder baserade på HPLC-ESI-MS/MS har använts för kvantifiering av 8-oxodguo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i DNA som extraherats från olika biologiska prover12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fina partiklar (PM2,5) bär organiska och oorganiska kemikalier, såsom polycykliska aromatiska kolväten (PAH), Nitro-PAH, aldehyder, ketoner, karboxylsyror, kinoliner, metaller och vattenlösliga joner, som kan framkalla inflammation och oxidativ stress, förhållanden som gynnar förekomsten av bio molekyl skador och sjukdomar30,31,32,33. Vi presenterar här validerade HPLC-ESI-MS/MS-metoder som framgångs rikt tillämpades för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i lung-, lever-och njure DNA från A/J-möss för bedömning av effekter av ambient PM2,5 exponering34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fyra veckors gamla manliga A/J-möss, specifik patogen fri, erhölls från avel centrum för försöks djur av Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, och behandlades därefter till etik kommittén för medicinska fakulteten, universitet av São Paulo (protokoll no 1310/09).

1. insamling av möss vävnader

  1. Anesthetize djuret med xylazin och Ketamin. För en mus med 30 g kropps vikt, injicera en lösning (högst 2 mL) som innehåller 2,63 mg Ketamin och 0,38 mg xylazin, intraperitonealt.
  2. Samla in blod (0,5-1,5 mL) för kompletterande analyser (t. ex. antioxidant enzym aktivitet, malondialdehyd nivåer).
  3. Raka bukhåren från bäckenet till den Xiphoid processen. Gör ett snitt i en vertikal mitt linje i det hårlösa området. Gör snitt i horisontella laterala linjer för att exponera buk organen.
  4. Skär bukkroppspulsådern för att främja exsanguination och euthanize djuret.
  5. Ta bort vävnaderna av intresse (i detta fall, lever, njurar och lungor).
    1. För att ta bort levern, skär sämre Cava ven och portalen hepatisk ven.
    2. För att ta bort njurarna, avsnitt njurvener och artärer.
    3. För att ta bort lungorna, göra ett snitt i membranet extremiteter och omkrets nära bröst korgen väggen. Bryt nyckelbenen genom att öppna en sax i det inre av bröst hålan. Skär den externa ben från Xiphoid processen mot luft strupen, för att exponera lungorna och hjärtat.
      1. Håll lungan med en pincett, avsnitt luft strupen och ligament runt lungorna. Ta försiktigt av block lungorna plus hjärtat. För att ta bort lungorna ur blocket, håll hjärtat med en pincett och skär alla kärl i sin bas.
  6. Tvätta de isolerade vävnaderna omedelbart i kall saltlösning (0,9% NaCl), överför till kryogena rör och doppa rören omedelbart i flytande kväve. Efter avslutad arbete, förvara rören vid-80 ° c.
    Varning: flytande kväve i direkt kontakt med huden, slem hinnan eller ögonen orsakar Bränn skador. Använd lämpligt individuellt skydd för att undvika kontakt. Arbeta i ett ventilerat laboratorium för att undvika kvävning på grund av flytande kväve ånga.

2. DNA-extraktion

Anmärkning: DNA-extraktionsmetoden ändrades från Loureiro et al. (2009)35 för att möjliggöra analyserna av de lesioner som studerades här.

  1. Överför rören som innehåller vävnaderna till torris.
  2. Använd en kultur tallrik placerad på isen som en bas för att skära en bit vävnad med en skalpell. Vikt 1 g för omedelbar användning. Resterande vävnad ska hållas på torris tills den återgår till förvaring vid-80 ° c.
    Obs: det är viktigt att undvika upptining av den återstående vävnaden för att förhindra bildandet av artefakter om repetitioner av analyserna behövs.
  3. Tillsätt 10 mL av den kommersiella cell Lys lösningen som innehåller 0,5 mM Deferoxamin till varje 1 g vävnad i 50 mL-täckta tuber och fortsätt på isen.
    Anmärkning: tillsätt Deferoxamin till volymen av lösningen för omedelbar användning. För varje 100 ml lösning, tillsätt 0,0328 g av Deferoxamin MESYLAT salt.
  4. Homogenisera vävnaderna med hjälp av en vävnad Homogenisatorer tills en homogen lösning utan vävnadsfragment erhålls. Håll röret kallt (på isen) under homogenisering. Använd en låg hastighet för att undvika uppvärmning.
  5. Tillsätt 150 μL proteinas K-lösning (20 mg/mL) till varje homogeniserat prov. Skaka rören genom inversion och förvara dem i rums temperatur över natten.
  6. Tillsätt 40 μL ribonukleas en lösning (15 mg/mL), skaka med inversion och håll rören i rums temperatur i 2 h.
    Obs: Förbered ribonukleas en lösning i natriumacetat buffert 10 mM, pH 5,2 för att undvika nederbörd. Värm lösningen vid 100 ° c i 15 min före användning för att få en lösning fri från deoxyribonuclease.
  7. Tillsätt 5 mL av den kommersiella protein nederbördslösningen, skaka kraftigt och centrifugera vid 2 000 x g, 4 ° c, i 10 minuter.
  8. Överför supernatanterna till 50 mL täckta rör som innehåller 10 mL kall isopropanol. Invertera rören försiktigt flera gånger tills observationen av den utfällda DNA.
    Obs: protokollet kan pausas här, hålla rören vid-20 ° c.
  9. Samla upp det utfällda DNA med en Pasteurs pipett stängt i änden. Överför det till rör som innehåller 4 mL 10 mM tris buffert, 1 mM Deferoxamin, pH 7,0.
  10. När DNA är helt upplöst i ovanstående lösning (inte virvel), tillsätt 4 mL av en kloroformlösning som innehåller 4% isoamylalkohol.
  11. Invertera rören 10 gånger för homogenisering, Centrifugera vid 2 000 x g, 4 ° c, i 10 minuter för att separera de två faserna och överför den övre fasen till ett nytt rör.
  12. Upprepa stegen 2,10 och 2,11 ytterligare två gånger.
  13. Tillsätt 8 mL absolut etanol och 0,4 mL av en 5 M NaCl lösning för att fälla ut DNA.
  14. Samla upp det utfällda DNA och överför det till 3 mL 70% etanol. Upprepa detta steg en gång till.
  15. Kassera etanol lösningen med försiktighet och vänd om rören som innehåller det utfällda DNA-materialet på absorberande papper för att avlägsna lösningens överskott.
  16. Tillsätt 200 μL av 0,1 mM deferoxaminlösning för att lösa upp DNA. Bibehåll rören vid 4 ° c tills DNA är helt rehydrerat (över natten).
  17. Bestäm DNA-koncentrationen genom att mäta absorbansen vid 260 Nm och dess renhet med 260/280 nm Absorbansförhållande.
    Anmärkning: för bestämning av DNA-koncentrationen, överför en alikvot av 10 μL av DNA-lösningen till 990 μL ultrarent vatten (100x spädning). Multiplicera absorbansen vid 260 Nm (den bör vara under 1) med 50 (50 μg/mL är koncentrationen av dubbelsträngat DNA när absorbansen för en 1 cm lång lösning vid 260 Nm är 1) och den utspädning som används (100x) för att erhålla DNA-koncentrationen i μg/mL. Om absorbansen vid 260 Nm är över 1, krävs ytterligare utspädningar. 260/280 nm Absorbansförhållande bör vara lika med eller över 1,8 för den önskade DNA-renheten, men kvoterna runt 1,6 är acceptabla.

3. enzymatisk DNA-hydrolys

  1. Analys recept
    1. 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo analyser: till en alikvot som innehåller 150 μg DNA, tillsätt 7,5 μl 200 mm tris/mgcl2 -buffert (pH 7,4), 1,4 μl av den interna standardlösningen som innehåller 250 fmol/μl [15N5 ] 1,n6-εdado och [15N5] 1,n2-εdguo och 15 enheter av deoxyribonuclease webbplats i. Justera den slutliga volymen till 200 μl med ultrarent vatten, subtrahera volymerna av enzymer som skall användas på steg 3.2.1.
    2. 8-oxodGuo analyser: tillsätt 3,8 μL av den 200 mM tris/MgCl2 -bufferten (pH 7,4), 2 μl av den interna standardlösningen som innehåller 1 000 fmol/μl [15N5] 8-oxodguo och 8 enheter av deoxyribonukleas i i en alikvot som innehåller 80 μg DNA. Justera den slutliga volymen till 100 μL med ultrarent vatten och subtrahera volymerna av enzymer som ska användas i steg 3.2.2.
      Anmärkning: de interna standarderna [15n5] 1,n6-εdado, [15n5] 1,n2-εdguo och [15n5] 8-oxodguo kan syntetiseras och karakteriseras som beskrivs35,36,37. Kvantiteterna av de interna standarderna i de injicerade prov volymerna bör vara desamma som i volymerna för den injicerade kalibrerings kurvan.
  2. Inkubera proverna vid 37 ° c i 1 timme.
    1. Prover från steg 3,1: Tillsätt 0,006 enheter fosfodiesteras I från Crotalus atrox och 15 enheter av alkaliskt fosfatas från bovint tarm slem hinna.
    2. Prover från steg 3,2: Tillsätt 0,0032 enheter fosfodiesteras I från Crotalus atrox och 8 enheter av alkaliskt fosfatas från bovint tarm slem hinna.
  3. Inkubera proverna vid 37 ° c i 1 timme.
  4. Centrifugera proverna vid 14 000 x g i 10 minuter.
  5. Prover från steg 3.2.1: separera 10 μL av varje prov för kvantifiering av deoxynucleosides (dAdo, dGuo) med HPLC/DAD (steg 9). Utsätta resterande volym för fast fas extraktion (steg 4).
  6. Prover från steg 3.2.2: överför 80 μL av supernatanten till injektions flaskor för injektioner av 50 μL (1 000 fmol [15N5] 8-oxodguo) i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Reservera resterande 20 μL för kvantifiering av dGuo med HPLC/DAD (steg 9).

4. solid fas extraktion för analyser av 1, n6-εdado och 1, n2-εdguo

  1. Ladda cylinderampuller (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 μm, 1 mL) med 1 mL av följande sekvens av lösningar: 100% metanol, avjoniserat vatten, hydrolyserat DNA-prov, avjoniserat vatten, 10% metanol, 15% metanol, och 100% metanol (som skall samlas in).
    Obs: lämna inte patronerna torra mellan applikationerna av de olika lösningarna. Lägg till nästa lösning omedelbart efter den föregående lösningen kommer in i patronen helt.
  2. Vakuum torka den sista elutionfraktionen (100% metanol) som innehåller addukterna.
  3. Omsuspendera de torkade proverna i 83,1 μL ultrarent vatten omedelbart före HPLC-ESI-MS/MS-analysen för att erhålla 200 fmol av varje intern standard i 50 μL av varje prov.

5. beredning av kalibrerings kurvor

  1. Förbered minst fem punkter i intervallet 300 till 6 000 fmol av 8-oxodGuo standard, med det fasta beloppet 1 000 fmol [15N5] 8-oxodguo i varje punkt. Överväg dessa mängder i den injicerade volymen.
  2. Förbered minst fem punkter i intervallet 1 till 40 fmol av 1,n6-Εdado och 1,n2-εdguo, med fasta belopp av 200 fmol av [15n5] 1,n6-εdado och [15n5] 1, N 2-εdguo i varje punkt. Överväg dessa mängder i den injicerade volymen.
  3. Förbered minst fem punkter i intervallet 0,05-1 nmol av dGuo och dAdo. Överväg dessa mängder i den injicerade volymen.

6. beredning av DNA-prover för metod validering

  1. 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo analyser: Lägg till varierande belopp av 1, n6-εdado och 1, n2-εdguo (e.g., 1,75, 8,75, 17,5 och 35 fmol) och fasta belopp av [15N5] 1, N6-εdado och [15N5] 1,N2-εdguo (350 fmol) till 100 μg kalv Thymus DNA och utför den enzymatiska hydrolys som beskrivs i steg 3. Bearbeta proverna i fyrdubblat i två olika dagar. Använd proverna för metodens noggrannhet och precisions bedömning.
    Anmärkning: den slutliga volymen av DNA-hydrolysaterna kommer att vara 200 μL (steg 3), från vilket 10 μL separeras för kvantifiering av deoxynucleosides med HPLC/DAD (steg 9). Den kvarvarande lösningen (190 μL) kommer att genomgå en fast fas extraktion (steg 4), den torkade fraktionen kommer att återsuspenderas i 83,1 μL (steg 4,3), från vilken 50 μL kommer att injiceras i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Beloppen av 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo injicerat ska är 1, 5, 10, och 20 fmol, med 200 fmol av [15n5] 1,n6-εdado och [15n5] 1,n 2-εdguo i varje prov.
  2. 8-oxodGuo analyser: tillsätt varierande mängder 8-oxodGuo (t. ex. 734, 1 468, 2 938 och 4 408 fmol) och ett fast belopp på [15N5] 8-oxodguo (2 000 fmol) till 100 μg kalv Thymus DNA och utför den enzymatiska hydrolys som beskrivs i steg 3. Bearbeta proverna i fyrdubblat i två olika dagar. Använd proverna för metodens noggrannhet och precisions bedömning.
    Anmärkning: den slutliga volymen av DNA-hydrolysaterna kommer att vara 100 μL (steg 3), från vilket 50 μL kommer att injiceras i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Mängderna av 8-oxodGuo injiceras kommer att vara 367, 734, 1469, och 2204 fmol, med 1 000 fmol av [15N5] 8-oxodguo i varje prov.
  3. Tillfoga 13,125 fmol av 1,n6-εdado (att erhålla 7,5 fmol i injektion volymen) och 35 fmol av 1,n2-εdguo (att erhålla 20 fmol i injektion volymen) till åtta tar prov av 100 μg av kalv Thymus DNA.
    1. Lägg till de interna standarderna[15n5] 1,n6-εdado och [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) till fyra av proverna. Fortsätt med DNA hydrolys och solid fas extraktion av alla prover.
    2. Tillfoga de inre standarderna [15n5] 1,n6-εdado och [15n5] 1,n2-εdguo (200 fmol) till de andra fyrana tar prov.
    3. Använd proverna för att beräkna återvinningen av addukter från fast fas extraktion.

7. HPLC-ESI-MS/MS-analys av 8-oxodGuo

  1. Infusing den 8-oxodGuo standarden i utrustningen, ställa in ESI-MS/MS parametrar för bästa detektering av dess fragmentering mönster av flera reaktion övervakning (MRM): m/z 284 [m + H] + → m/z 168 [m-2 '-Deoxyribose + H]+.
    1. Använd samma parametrar för detektion av [15N5] 8-oxodguo: m/z 289 [m + H]+m/z → 173 [m-2 '-deoxyribose + H]+.
      Obs: Använd en utrustnings ekvivalent eller bättre än den utrustning som används i detta arbete (se material tabell). ESI-MS/MS-parametrarna fastställdes på det sätt som beskrivs i tabell 1.
  2. Filter (med 0,22 μm porösa membran) och degasify (med en Sonicator) alla vattenbaserade HPLC lösnings medel.
  3. Använd följande kromatografivillkor för analyserna och montera systemet som visas i figur 2.
    Obs: kolumn A är ansluten till den binära pumpen. Dess elueringslösning riktas mot UV-detektering och avfall under de första 16 minuter och från 32 till 46 min av kromatografi, som visas i figur 2A. Detta är den kolumn genom vilken provet elueras omedelbart efter injektionen. Kolumn B är ansluten till Isokratisk pump och masspektrometer. Den tar emot eluenten av kolumn A endast i 16-32 min intervall, när ventilen är bytt till den position som visas i figur 2b. Ventil växlingen möjliggör anslutning mellan de två kolumnerna, som elueras av den binära pumpgradienten. Den konfiguration som visas i figur 2b tillåter ytterligare topp separation och förträngning. Dessutom når endast den kromatografiska fraktionen av intresse masspektrometer, vilket förbättrar känsligheten och selektiviteten.
    1. Elute en 50 x 2,0 mm i.d., 2,5 μm, C18-kolonn (kolumn A i figur 2) kopplad till en C18 säkerhets patron (4,0 x 3,0 mm i.d.) med en lutning på 0,1% myrsyra (lösnings medel a) och metanol innehåll ande 0,1% myrsyra (Spädnings vätska B) med en flödes hastighet på 150 μl/min och vid 25 ° c.
      1. Använd följande gradient program för den binära pumpen: från 0 till 25 min, 0-15% av lösnings medel B; 25 till 28 min, 15-80% av spädnings vätskan B; 28 till 31 min, 80% av spädnings vätskan B; 31 till 33 min, 80-0% av spädnings vätskan B; 33 till 46 min, 0% av spädnings vätskan B.
      2. Använd kopplings ventilen för att styra de första 16 minuter av eluenten till avfall och 16-32 min fraktion till en andra kolumn (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, C18, kolumn B i figur 2) ansluten till ESI-källan och konditioneras av isokratiska pumpen med en lösning av 15% mig vatten innehåll ande 0,1% myrsyra (150 μL/min).
        Obs: innan du använder kopplings ventilen program i steg 7.3.1.2, kontrol lera om 8-oxodguo standard eluerar från den första kolumnen efter 16 min. Det är viktigt att stänga ventilen på 32 min att använda lutningen på den binära pumpen till eluera 8-oxodguo från den andra kolumnen och få en skarp kromatografisk topp. Lesionen 8-oxodGuo eluar från den andra kolonnen vid ungefär 36 min. variationer av retentions tiden för analyten kan inträffa beroende på vilken kolumn och utrustning som används. Anpassningar av HPLC-vätskans gradient-program kan behövas.

Figure 2
I figur 2. System med två kolumner som används för 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodGuo) analyser. A) konfiguration som används under de första 16 minuter och från 32 till 46 min av kromatografi; B) konfiguration som används i intervallet 16-32 min, vilket möjliggör ytterligare separation och topp förträngning i kolumn B före elueringen till masspektromometerns ESI-källa. Denna siffra har återpublicerats från Oliveira et al.34. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

8. HPLC-ESI-MS/MS-analys av 1, n 6 -εdado och 1, n 2 -εdguo

  1. Infusing 1,n6-εdado och 1,n2-ΕDGUO standarder i utrustningen, ställa in ESI-MS/MS Parameters för bästa detektering av deras fragmentering mönster av flera reaktion övervakning (MRM): m/z 276 [m + h]+ → m/z 160 [m 2 '-deoxyribose + h]+ för detektering av 1,N6-εdado och M/z 292 [m + h]+ → m/z 176 [m-2 '-deoxyribose + h ]+ för detektion av 1,N2-εdguo.
    1. Använd samma parametrar för detektion av [15n5] 1,N6-εdado (m/z 281 [m + H]+m/z → 165 [m-2 '-deoxyribose + H]+) och [15N 5] 1,N2-εdguo (m/z 297 [m + h]+ → m/z 181 [m-2 '-deoxyribose + H]+). Ange de ESI-MS/MS-parametrar som beskrivs i tabell 1.
ESI-MS/MS-parametrar 8-oxodGuo Etheno addukter
Gardin, gas 20 psi 20 psi
Nebulisering gas 55 50
Jon källa gas 50 psi 40 psi
Kollisionsinducerad dissociation gas Medium Medium
Jon spray spänning 5000 4500
Temperatur för ESI-sond 450 450
Avklustring potential 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision cell exit potential 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Entré potential 10 V 10 V

I tabell 1. Parametrar som används i ESI-MS/MS-utrustningen för detektion av DNA-lesioner. Denna tabell har modifierats från Oliveira et al.34.

  1. Filter (med 0,22 μm porösa membran) och degasify (med en Sonicator) alla vattenbaserade HPLC lösnings medel.
  2. Använd följande kromatografivillkor för analyserna.
    1. Elute en 150 x 2,0 mm i.d., 3,0 μm, C18-kolonn kopplad till en C18 säkerhets patron (4,0 x 3,0 mm i.d.) med en gradient av 5 mM ammoniumacetat, pH 6,6 (spädnings vätska A) och acetonitril (spädnings vätska B) med en flödes hastighet på 130 μL/min och 25 ° c.
      1. Använd följande gradient program för den binära pumpen: från 0 till 10 min, 0% av lösnings medel B; 10 till 39 min, 0-20% av spädnings vätskan B; 39 till 41 min, 20-75% av spädnings vätskan B; 41 till 46 min, 75% av spädnings vätskan B; 46 till 47 min, 75-0% av spädnings vätskan B; 47 till 60 min, 0% av spädnings vätskan B.
      2. Använd kopplings ventilen för att styra den första 35 min av elueringslösning till avfall och 35-42 min fraktion till ESI-källan. Var noga med att ställa in kanal standarderna från kolonnen i det inställda intervallet (35-42 min). Gör justeringar vid behov.

9. kvantifiering av normala 2 '-deoxyribonukleosides av HPLC-UV

  1. Använd en utrustning som liknar den utrustning som används i detta arbete (se material tabellen).
  2. Elute en 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, C18 kolonn knuten till en C18 säkerhets patron (4,0 x 3,0 mm i.d.) med en gradient av 0,1% myrsyra och metanol.
    1. Använd följande övertoningsprogram: från 0 till 25 min, 0 till 18% metanol; från 25 till 27 min, 18 till 0% metanol; från 27 till 37 min, 0% metanol) med en flödes hastighet på 1 mL/min och 30 ° c.
    2. Injicera 5 μL av varje prov som reserver ATS för 2 '-deoxynucleosides-kvantifiering.
    3. Ställ in DAD-detektorn på 260 Nm för integrering av dGuo-och dAdo-topparna.

10. kvantifiering av DNA-lesioner

  1. Integrera topparna av 8-oxodGuo, [15n5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado, [15n5] 1,n6-εdado, 1,n2-εdguo, och [15n5] 1,n2 -εdguo från HPLC-ESI-MS/MS-analyserna.
    1. Beräkna Area kvoterna för 8-oxodGuo/[15N5] 8-oxodguo, 1,n6-εdado/[15n5] 1,n6-εdado, och 1,n2-εdguo/[15n5 ] 1,N2-εdguo för kalibrerings kurvorna och proverna.
    2. Rita kalibrerings kurvorna med hjälp av de områdes förhållanden som erhålls i steg 10.1.1 i y-axeln och mängden analyter som finns i varje punkt i x-axeln.
    3. Beräkna de belopp (fmol) av lesioner i varje injicerat prov med hjälp av de nyckeltal som beräknats i steg 10.1.1 och kalibrerings kurvor för steg 10.1.2.
  2. Integrera dGuo-och dAdo-topparna från HPLC-UV-analyserna.
    1. Rita kalibrerings kurvorna med hjälp av de områden som erhålls i steg 10,2 i y-axeln och mängden analyter som finns i varje punkt i x-axeln.
    2. Beräkna beloppen (nmol) för dGuo och dAdo i varje injicerat prov med hjälp av de områden som erhölls i steg 10,2 och kalibrerings kurvorna för steg 10.2.1.
  3. Beräkna de belopp (nmol) av dGuo och dAdo som finns i varje prov som injiceras i HPLC-ESI-MS/MS-systemet, med tanke på att de belopp som beräknats i steg 10.2.2 förekommer i prov volymen på 5 μL, medan 50 μL injicerades i HPLC-ESI-MS/MS-systemet.
    Anmärkning: för att beräkna mängden dGuo i de prover som används för 8-oxodGuo analys, bara multiplicera mängden (nmol/μL) erhålls i steg 10.2.2 av 50. För att beräkna beloppen för dAdo och dGuo i de prover som används för analyser av 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo, överväga koncentrationen steg efter fast fas extraktion. Volymen av 50 μL som injiceras i HPLC-ESI-MS/MS-systemet motsvarar 114,32 μL av det ursprungliga provet. De belopp (nmol/μL) som erhålls i steg 10.2.2 bör multipliceras med 114,32 för att erhålla rätt värden.
  4. Beräkna molar fraktioner 8-oxodGuo/dGuo, 1,n6-Εdado/Dado, 1,n2-εdguo/dguo. Proportionerna (fmol-lesion/nmol det normala deoxynucleoside) ger numrera av lesioner per 106 normal dguo eller Dado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De genomsnittliga DNA-koncentrationerna (± SD) som erhållits från möss lever (~ 1 g vävnad), lunga (~ 0,2 g vävnad) och njure (~ 0,4 g vävnad) var respektive 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021, och 3 223 ± 723 μg/mL i den slutliga volymen av 200 μL. Ett representativt kromatogram som erhålls genom HPLC-DAD av det renade DNA visas i figur 3. Närvaron av de fyra 2 '-deoxynucleosides, fri från RNA ribonukleosides, som eluera omedelbart före motsvarande 2 '-deoxynucleosides, visar DNA renhet.

Representativa kromatogram från HPLC-ESI-MS/MS-analyser för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo i möss vävnad DNA-prover visas i figurerna 4 till 6. Kromatogrammet som erhålls med UV-detektion i figur 4 visar de fyra 2 '-deoxynucleosides som avgivande från den första kolonnen fram till ~ 10 min, med en god separation från 8-oxodguo, vilket eliminerar oönskade interferenser. Det normala 2 '-deoxynucleosides var inte närvarande i analyserna av 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo, som de eliminerades i det solida arrangerar gradvis extraktionstillvägagångs sättet. Mass spektrum av de standarder som används i detta arbete visas i figur 7.

Typiska linjära kalibrerings kurvor för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1, n6-εdado och 1, n2-εdguo visas i figur 834. Metoderna var exakta och precisa, som presenteras i tabell 234. Den inter-Day precision beräknat för DNA-Ali kvoter kompletterat med 367 fmol av 8-oxodguo var 16,97%, kompletterat med 10 fmol av 1,N2-εdguo var 14,01%, och kompletterat med 1 fmol av 1,N6-εdado var 16,66%. Gränserna för kvantifiering (S/N = 10) för de standarder som injiceras på kolonnen var 25 fmol för 8-oxodGuo, 0,3 fmol för 1,n6-εdado, och 1 Fmol för 1,n2-εdguo34.

Metoderna tillämpades på kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n2-εdguo och 1,n6-εdado i lung-, lever-och njure DNA-prover av A/J-möss vävnader exponerade hela kroppen till omgivande luft anrikad i PM2,5, jämfört med som exponerats för in situ Omgivnings luft som studie kontroll34. De nivåer som finns visas i tabell 3, och indikerar induktion av DNA-lesioner i lung-, lever-och njure av PM2,5 exponering34.

Figure 3
Figur 3 . Kromatogram av Hydrolysatet av ett DNA-prov som extraherats från mus lunga. Kromatogrammet erhölls vid 260 Nm från HPLC-Dad-systemet. De fyra 2 '-deoxynucleosides indikeras: dC, 2 '-deoxycytidine; dA, 2 '-deoxyadenosin; dG, 2 '-deoxyguanosin; dT, 2 '-deoxythymidine. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Representativa kromatogram som visar detektion av 8-oxo-7, 8-dihydro-2 ́-deoxyguanosin (8-oxodguo) och den interna standarden [15N5] 8-oxodguo av HPLC-ESI-MS/MS, samt de normala 2 '-deoxynucleosides avgivande från första kolonnen och avledas till Dad detektering (λ = 260 Nm) och avfall. DNA-provet extraherades från mus lunga. Analyserna av HPLC-ESI-MS/MS utfördes med multipel reaktions övervakning (MRM) med hjälp av de fragmenteringar som anges i bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 . Representativa kromatogram som visar påvisande av 1, N 6 att ha -etheno-2 ́-deoxyadenosin (1,n6-εdado) och den interna standarden [15N5] 1, N 6 att ha -εdado av HPLC-ESI-MS/MS. DNA-provet extraherades från mus njure. Analyserna utfördes med multipel reaktions övervakning (MRM) med hjälp av de fragmenteringar som anges i bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 6
Figur 6 . Representativa kromatogram som visar påvisande av 1, N 2 för att -etheno-2 ́-deoxyguanosin (1,n2-εdguo) och den interna standarden [15N5] 1, N 2 för att -εdguo av HPLC-ESI-MS/MS. DNA-provet extraherades från mus levern. Analyserna utfördes med multipel reaktions övervakning (MRM) med hjälp av de fragmenteringar som anges i bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 7
Figur 7 . Spektra av de standarder som används i detta arbete. Spektrat erhölls i MS2 med hjälp av kollision energi 20 eV att fragmentera [M + H]+ joner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 8
Figur 8 . Kalibrerings kurvor som erhållits genom HPLC-ESI-MS/MS för kvantifiering av 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodguo), 1,n2-etheno-2 ́-deoxyguanosin (1,n2-εdguo) och 1, N6-etheno-2́-deoxyadenosin (1,N6-εdado). Relativ Area betyder områdes förhållandena mellan lesionen och dess respektive [15N5] intern standard. Denna siffra har ändrats från Oliveira et al.34. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

ESI-MS/MS-parametrar 8-oxodGuo Etheno addukter
Gardin, gas 20 psi 20 psi
Nebulisering gas 55 50
Jon källa gas 50 psi 40 psi
Kollisionsinducerad dissociation gas Medium Medium
Jon spray spänning 5000 4500
Temperatur för ESI-sond 450 450
Avklustring potential 31 V, 8-oxodGuo 41 V, 1, N6-εdado
31 V, [15N5] 8-oxodguo 41 V, [15N5] 1, N6-εdado
45 V, 1, N2-εdguo
45V, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision energi 23 eV, 8-oxodGuo 25 eV, 1, N6-εdado
23 eV, [15N5] 8-oxodguo 25 eV, [15N5] 1, N6-εdado
27 eV, 1, N2-εdguo
27 eV, [15N5] 1, N2-εdguo
Kollision cell exit potential 16 V, 8-oxodGuo, 8 V, 1, N6-εdado
16 V, [15N5] 8-oxodguo 8 V, [15N5] 1, N6-εdado
16 V, 1, N2-εdguo
16 V, [15N5] 1, N2-εdguo
Entré potential 10 V 10 V

I tabell 1. Parametrar som används i ESI-MS/MS-utrustningen för detektion av DNA-lesioner. Denna tabell har modifierats från Oliveira et al.34.

Basal nivå Tillade Upptäckt Upptäckta (-) basala Noggrannhet Cv
Medelvärde ± SD (fmol) Mer från fmol Medelvärde ± SD (fmol) Genomsnitt (fmol) % %
8-oxodGuo
373,00 ± 2,71 0 372,79 ± 50,6 - - 13,57
373,98 ± 4,86 367 755,41 ± 107,92 381 103,93 14,29
374,84 ± 5,19 734 1069,57 ± 108,51 695 94,65 10,14
357,94 ± 15,05 1469 1671,67 ± 44,27 1314 89,43 2,65
371,07 ± 2,43 2204 2272,01 ± 40,2 1901 86,25 1,77
1, N2-εdguo
0,54 ± 0,01 0 0,54 ± 0,09 - - 16,88
0,54 ± 0,01 1 1,47 ± 0,16 0,93 93,39 11,17
0,55 ± 0,01 5 5,30 ± 0,72 4,76 95,11 13,50
0,53 ± 0,01 10 10,60 ± 0,39 10,06 100,63 3,67
0,54 ± 0,01 20 20,20 ± 0,93 19,66 98,29 4,60
1, N6-εdado
2,08 ± 0,10 0 2,29 ± 0,39 - - 17,05
2,05 ± 0,04 1 3,06 ± 0,47 1,01 100,89 15,31
1,99 ± 0,06 5 7,87 ± 1,66 5,88 117,60 21,10
2,03 ± 0,07 10 12,43 ± 1,25 10,41 104,06 10,06
1,97 ± 0,03 20 22,42 ± 3,89 20,46 102,29 17,34

I tabell 2. Metodens noggrannhet och variationskoefficient (CV) för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1, N 2 för att - Εdguo och 1, N 6 att ha -εdado i DNA. Denna tabell har modifierats från Oliveira et al.34.

Luften PM2,5             N P-värde
Medelvärde ± SEM Medelvärde ± SEM   
Lung
8-oxodGuo/108 dguo 2124 ± 56,96 2466 ± 93,10 6 0,01
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 Dado 1,41 ± 0,23 1,44 ± 0,13 7 Ns
Lever
8-oxodGuo/108 dguo 2848 ± 183,5 2949 ± 223,8 6 5 Ns
1, N2-εdguo/108 dguo 7,79 ± 2,49 24,94 ± 5,21 4 0,02
1, N6-εdado/108 Dado 2,82 ± 0,30 2,18 ± 0,25 6 Ns
Njure
8-oxodGuo/108 dguo 1854 ± 87,13 2363 ± 157,0 6 0,02
1, N2-εdguo/108 dguo Nd Nd - -
1, N6-εdado/108 Dado 1,09 ± 0,15 1,52 ± 0,12 7 0,04
(NS, inte signifikant; ND, inte upptäckt)

I tabell 3. Nivåer av DNA-lesioner i A/J-möss vävnadsprover. Mössen utsattes för omgivnings luft och omgivande luft anrikad i PM2,5 (PM2,5 koncentrerad 30 gånger). Medel mellan de två grupperna (omgivnings luft och PM2,5) jämfördes med t-test. Resultaten ansågs vara statistiskt signifikanta när P-värdet var mindre än 0,05. Denna tabell har modifierats från Oliveira et al.34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett stort problem som finns i 8-oxodguo analyser av HPLC metoder är en möjlig induktion av dess bildande under workup förfaranden för DNA-extraktion, DNA hydrolys, och koncentrationen av DNA-hydrolysater22,38. För att minimera problemet med 8-oxodGuo artifaktuella formation, rekommenderas tillsats av Deferoxamin till alla DNA-extraktion, lagring och hydrolys lösningar, användning av natriumjodid chaotropic metod och undvikande av fenol i DNA-extraktion, som samt användning av DNA-mängder nära 100 μg i hydrolys förfarandet för att minimera bidraget av falsk oxidation till resultatet39. Vi tog hänsyn till rekommendationerna ovan, utom användningen av natriumjodid chaotropic metod för DNA-extraktion. Istället, för enkelhetens skull, använde vi kommersiella lösningar för DNA-extraktion, lägga Deferoxamin till dem före användning. Dessutom injicerades de erhållna DNA-hydrolysaterna direkt i en första kolonn av HPLC-ESI-MS/MS-systemet för en tidigare separation av 8-oxodGuo från de normala nukleosidorna. Omedelbart före elueringen av 8-oxodguo, en kopplings ventil användes för att avleda den första kolumnen elueringslösning till en andra kolumn där ytterligare separation och topp förträngning uppnåddes. Detta tillvägagångs sätt tillät adekvat känslighet för 8-oxodGuo kvantifiering fri från interferenser. Den mest likartade metoden för kvantifiering av 8-oxodGuo i DNA beskrevs av Chao och medarbetare22, som använde en fälla kolumn för prov rensning och 8-oxodguo retention innan provet eluering i analys kolumnen, med hjälp av en kopplings ventil mellan kolumnerna. Alternativt, en koncentration steg av 8-oxodGuo samlats in från fraktioner eluerade från HPLC separationer av DNA-hydrolysater före HPLC-ESI-MS/MS analyser utfördes15, vilket är mycket mer mödosamt.

Rapporterade basala nivåer av 8-oxodguo hos gnagare i lung vävnad, baserat på HPLC-analyser, från 180-450/108 dguo23,39,41,42,43, 1 340-2120/108 dguo44, eller cirka 3000/108 dguo45,46, med de lägsta värdena från DNA-extraktionsmetoder genom att använda natriumiodide. Den genomsnittliga 8-oxodGuo nivå som finns här i lungan av möss som utsätts för omgivande luft var 2124/108 dguo. Nivån ökade till 2466/108 dguo hos de djur som exponerades för omgivnings luft ANRIKAT i PM2,5 (tabell 3)34. Det är möjligt att känsligheten för detektion av skillnader mellan grupper kan förbättras genom extraktion av DNA med natriumjodid chaotropic metod. I den före ligg ande studien var de genomsnittliga 8-oxodGuo nivåerna som finns i kontroll möss lunga, njure, och lever-DNA, respektive, 2,0, 1,8, och 2,7 gånger högre än median basal nivån (1047/108 dguo) som erhållits av Europeiska standardiserings kommittén för oxidativ DNA-skada (ESCODD) i en Inter-Laboratory bedömning av 8-oxodGuo i DNA som extraheras från standarda tar prov av Pig lever38.

Den viktigaste begränsningen för detektion av 1,n6-εdado och 1,n2-εdguo i DNA är metoden känslighet, eftersom dessa lesioner uppträder på mycket låga nivåer. De lägsta nivåerna av 1,N2-dguo i DNA, kvantifierade av HPLC-ESI-MS/MS, var i intervallet 0,87-4 lesioner per 108 dguo i en mänsklig cellinjen och rått vävnader25,47. Ett sätt att förbättra känsligheten och selektiviteten för deras kvantifiering är att koncentrera dem från stora prover av DNA-hydrolysater, med hjälp av fast fas extraktion. Detta rensnings steg löser kromatografiska problem som kan uppkomma vid injektioner av mer än 100 μg DNA-hydrolysater i HPLC-analyskolonner. Vi använde denna metod i den validerade metod som presenteras här. Nivåerna av 1,N6-εdado som upptäckts i denna studie34 faller inom det intervall som erhållits i studier som använder ultra immunaffinitet/32P-postmärkning48,49, 50 , 51 och är lägre än de som beskrivs av andra grupper som använder HPLC-ESI-MS/MS21,23,24. Likaså de 1,N2-εdguo nivåer kvantifierade här34 är förenliga med de lägsta nivåerna som rapporter ATS av Garcia25 och ANGELI26 med hjälp av HPLC-ESI-MS/MS.

HPLC-ESI-MS/MS-system med högre känslighet än den utrustning som används i denna studie finns tillgängliga. Användningen av sådana system möjliggör analyser av mindre mängder DNA, vilket breddar tillämpningarna av de metoder som presenteras här för situationer där vävnads tillgänglighet är en begränsning. De metoder som presenteras här kan anpassas för kvantifiering av andra modifierade deoxynucleosides, beroende på tillgängligheten av deras standarder och isotopiska standarder. Justering av kromatografiska förhållanden skulle vara nödvändigt för att få skarpa toppar av alla molekyler som ingår i analyserna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 och 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 och 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) och CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira och A. A. F. Oliveira erhöll stipendier från FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) och CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva och A. P. M. Loureiro mottog stipendier från CNPq.

Några siffror och tabeller som finns i detta arbete publicerades ursprungligen i Oliveira A.A.F. et al. genotoxiska och epigenotoxiska effekter hos möss som exponerats för koncentrerade omgivande fina partiklar (PM2,5) från São Paulo City, Brasilien. Partikel-och Fibertoxikologi. 15, 40 (2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[15N5]-2’-deoxyadenosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine Cambridge Isotope Laboratories NLM-3899-CA-10
acetonitrile Carlo Erba Reagents 412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa Sigma P5521
ammonium acetate Merck 101116
calf thymus DNA Sigma D1501
cell lysis solution QIAGEN 158908
chloroform Carlo Erba Reagents 412653
deferoxamine Sigma D9533
deoxyribonuclease I (DNase I) Bio Basic Inc DD0649
ethanol Carlo Erba Reagents 414542
formic acid Sigma-Aldrich F0507
HPLC-ESI-MS/MS system HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system Shimadzu Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18) Phenomenex 00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18) Phenomenex 00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18) Phenomenex 00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.) Phenomenex AJO-4287
isoamyl alcohol Sigma-Aldrich M32658
isopropyl alcohol (isopropanol) Carlo Erba Reagents A412790010
ketamine Ceva Commercial name: Dopalen
magnesium chloride Carlo Erba Reagents 349377
magnesium chloride Sigma M2393
methanol Carlo Erba Reagents L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox Sigma P4506
protein precipitation solution QIAGEN 158912
proteinase K Sigma-Aldrich P2308
ribonuclease A Sigma R5000
sodium chloride Sigma-Aldrich S9625
SPE-C18 (Strata-X) Phenomenex 8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane Carlo Erba Reagents 489983
xylazine Syntec do Brasil Commercial name: Xilazin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40 (2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Tags

Immunologi och infektion masspektrometri DNA-addukter DNA-oxidation genotoxicitet oxidativ stress fina partiklar
Kvantifiering av tre DNA-lesioner med masspektrometri och bedömning av deras nivåer i vävnader från möss som utsätts för omgivande fina partiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Franco de Oliveira, T., Falcão… More

Franco de Oliveira, T., Falcão de Oliveira, A. A., Lemos, M., Veras, M., Saldiva, P. H. N., Gennari de Medeiros, M. H., Di Mascio, P., de Melo Loureiro, A. P. Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter. J. Vis. Exp. (147), e59734, doi:10.3791/59734 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter