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Neuroscience

चूहा में थोरैसिक स्पाइनल कॉर्ड हेमीसेक्शन सर्जरी और ओपन-फील्ड लोकोमोटर आकलन

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59738
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 2Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 3Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC), Université de Montréal

Summary

चूहा वक्ष रीढ़ की हड्डी hemisection चलन वसूली और उपचार प्रभावकारिता के तंत्रिका तंत्र की जांच करने के लिए एकतरफा रीढ़ की हड्डी की चोट का एक मूल्यवान और reproduible मॉडल है. इस आलेख में अर्धखंड प्रक्रिया करने के लिए और एक खुले क्षेत्र के क्षेत्र में चलन प्रदर्शन का आकलन करने के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका शामिल है।

Abstract

स्पाइनल कॉर्ड चोट (एससीआई) घाव के स्तर के नीचे मोटर, संवेदी, और स्वायत्त समारोह में गड़बड़ी का कारण बनता है। प्रायोगिक पशु मॉडल एससीआई के बाद लोकोमोटर वसूली में शामिल तंत्रिका तंत्र को समझने के लिए और नैदानिक आबादी के लिए उपचार डिजाइन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता में उपयोग किया जाता है कि भ्रम, संपीड़न, और transection चोटों सहित कई प्रयोगात्मक एससीआई मॉडल हैं। एक अर्धखंड में रीढ़ की हड्डी की एकपक्षीय ट्रांससेक्शन शामिल होता है और केवल एक तरफ सभी आरोही और अवरोही पथ को बाधित करता है। स्पाइनल हेमीसेक्शन contusion या संपीड़न तकनीक है कि बख्शा और क्षतिग्रस्त कार्यात्मक वसूली के साथ जुड़े रास्ते में तंत्रिका प्लास्टिक की जांच के लिए उपयोगी है की तुलना में एक अत्यधिक चयनात्मक और reproduible चोट पैदा करता है. हम चूहे में T8 कशेरुक स्तर पर एक वक्ष हेमीसेक्शन प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत है कि कई पर चलन समारोह के वर्गीकृत सहज वसूली के साथ घाव के पक्ष पर hindlimb के एक प्रारंभिक पक्षाघात में परिणाम सप्ताह. हम भी खुले क्षेत्र में कार्यात्मक वसूली का आकलन करने के लिए एक चलन स्कोरिंग प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। चलन मूल्यांकन एक रैखिक वसूली प्रोफ़ाइल प्रदान करता है और दोनों जल्दी और बार बार चोट के बाद किया जा सकता है क्रम में सही रूप में उचित समय अंक जिसमें अधिक विशेष व्यवहार परीक्षण का संचालन करने के लिए जानवरों स्क्रीन. प्रस्तुत हेमीसेक्शन तकनीक को आसानी से अन्य ट्रांससेक्शन मॉडल और प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और चलन मूल्यांकन को विभिन्न प्रकार के एससीआई और अन्य चोट मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि लोकोमोटर समारोह स्कोर किया जा सके।

Introduction

स्पाइनल कॉर्ड चोट (एससीआई) मोटर, संवेदी, और स्वायत्त समारोह में गंभीर गड़बड़ी के साथ जुड़ा हुआ है। SCI के प्रायोगिक पशु मॉडल एससीआई पैथोलॉजी में शामिल शारीरिक और शारीरिक घटनाओं को समझने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं, मरम्मत और वसूली में तंत्रिका तंत्र की जांच करने के लिए, और संभावित चिकित्सीय की प्रभावकारिता और सुरक्षा के लिए स्क्रीन करने के लिए हस्तक्षेप. चूहा SCI अनुसंधान1में सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रजातियों है. चूहा मॉडल कम लागत, पुन: पेश करने के लिए आसान कर रहे हैं, और व्यवहार परीक्षण की एक बड़ी बैटरी कार्यात्मक परिणामों का आकलन करने के लिए उपलब्ध हैं2. पथ स्थानों में कुछ अंतर के बावजूद, चूहे रीढ़ की हड्डी के शेयरों समग्र इसी तरह sensorimotor बड़े स्तनधारियों के साथ कार्य करता है, primatesसहित 3,4. चूहे भी एससीआई के अनुरूप शारीरिक और व्यवहार के परिणामों को साझा करते हैं जो मनुष्यों से संबंधित5. गैर मानव प्राइमेट और बड़े पशु मॉडल मानव SCI6 के एक करीब सन्निकटन प्रदान कर सकते हैं और उपचार सुरक्षा और मानव प्रयोग से पहले प्रभावकारिता साबित करने के लिए आवश्यक हैं, लेकिन कम आमतौर पर नैतिक और पशु कल्याण के कारण उपयोग किया जाता है विचार, खर्च, और नियामक आवश्यकताओं7.

चूहा transection SCI मॉडल एक विच्छेदन चाकू या iridectomy कैंची एक laminectomy के बाद का उपयोग कर एक चयनात्मक घाव के साथ रीढ़ की हड्डी के लक्षित रुकावट द्वारा किया जाता है. एक पूर्ण ट्रांससेक्शन की तुलना में, चूहे में आंशिक ट्रांससेक्शन एक कम गंभीर चोट, आसान पश्चात पशु देखभाल, सहज चलन वसूली, और मनुष्यों में अधिक बारीकी से मॉडल एससीआई जो आंशिक रूप से कम से कम के साथ अधूरा है रीढ़ की हड्डी और अधिस्पिनल संरचनाओं को जोड़ने वाला ऊतक8. एक एकतरफा हेमीसेक्शन केवल एक तरफ सभी आरोही और अवरोही इलाकों को बाधित करता है, और अंतर्निहित जैविक तंत्र की खोज को बढ़ाने, परिमाणात्मक और अत्यधिक प्रतिलिपि बनाने योग्य चलन घाटे का उत्पादन करता है। अर्धखंड का सबसे प्रमुख कार्यात्मक परिणाम एक ही पक्ष पर एक प्रारंभिक अंग पक्षाघात और कई सप्ताह9,10से अधिक चलन समारोह के वर्गीकृत सहज वसूली के साथ घाव के स्तर से नीचे है, 11 , 12. अर्धखंड मॉडल विशेष रूप से क्षतिग्रस्त और अवशिष्ट पथों और कार्यात्मक वसूली9,11,12के साथ जुड़े सर्किट के तंत्रिका प्लास्टिक की जांच करने के लिए उपयोगी है, 13,14,15,16,17,18. विशेष रूप से, वक्ष स्तर पर किया जाने वाला अर्धखंड, अर्थात्, रीढ़ की हड्डी के सर्किट के ऊपर जो हिन्दीम चलन को नियंत्रित करता है, लोकोमोटर नियंत्रण में परिवर्तनों की जांच करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होता है। के रूप में एक गैर रेखीय संबंध घाव गंभीरता और SCI19के बाद चलकोमोटर वसूली के बीच मौजूद है, कार्यात्मक परिणामों का आकलन करने के लिए उचित व्यवहार परीक्षण प्रयोगात्मक मॉडल में सर्वोपरि है.

रैट2,20में कार्यात्मक चलन वसूली के विशिष्ट पहलुओं का आकलन करने के लिए व्यवहार परीक्षणों की एक व्यापक बैटरी उपलब्ध है . कई चलन परीक्षण एस आई आई आई के बाद जल्दी विश्वसनीय उपाय प्रदान नहीं करते हैं क्योंकि चूहे भी अपने शरीर के वजन का समर्थन करने के लिए अक्षम हैं। सहज चलन प्रदर्शन का एक उपाय जो चोट के बाद घाटे के प्रति संवेदनशील है, और पूर्व ऑपरेटिव प्रशिक्षण या विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, उपयुक्त समय बिंदुओं के लिए चलन वसूली की निगरानी करने के लिए फायदेमंद है जिसमें पूरक विशेष व्यवहार परीक्षण. मार्टिनेज ओपन फील्ड मूल्यांकन स्कोर10,मूल रूप से चूहे में गर्भाशय ग्रीवा SCI के बाद चलकोमोटर प्रदर्शन के मूल्यांकन के लिए विकसित, एक में सहज ओवरग्राउंड चलन के दौरान वैश्विक चलन प्रदर्शन का आकलन एक 20 सूत्री क्रमबद्ध स्कोर है खुला मैदान. स्कोरिंग एक रूब्रिक का उपयोग कर प्रत्येक अंग के लिए अलग से आयोजित किया जाता है कि संधि अंग आंदोलन, वजन समर्थन, अंक की स्थिति, कदम क्षमताओं, forelimb-hindlimb समन्वय, और पूंछ सहित चलन उपायों की एक श्रृंखला के विशिष्ट मापदंडों का मूल्यांकन करता है स्थिति. मूल्यांकन स्कोर बासो, बीटी और ब्रेस्नाहान (बीबीबी) ओपन-फील्ड रेटिंग स्केल से लिया गया है जो थोरैसिक contusion21के बाद चलन प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह सही और मज़बूती से दोनों forelimb और Hindlimb चलन समारोह का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित है, विभिन्न स्कोरिंग पैरामीटर है कि BBB के पदानुक्रमित स्कोरिंग के साथ अनुकूल नहीं है की स्वतंत्र मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, और एक रैखिक वसूली प्रदान करता है प्रोफ़ाइल10| इसके अतिरिक्त, BBB की तुलना में, मूल्यांकन स्कोर संवेदनशील और अधिक गंभीर चोट मॉडल10,11,20,22में विश्वसनीय है. आकलन स्कोर का उपयोग चूहे के बाद ग्रीवा10,12 और थोरैसिक9 एससीआई में और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट23के संयोजन में लोकोमोटर हानि का आकलन करने के लिए किया गया है .

हम यहाँ महिला लांग-एवन्स चूहे में T8 कशेरुक स्तर पर एक वक्ष हेमीसेक्शन एससीआई प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और खुले क्षेत्र में Hindlimb चलन वसूली का आकलन करने के लिए।

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Protocol

इस लेख में वर्णित प्रयोगों पशु देखभाल पर कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया और Universit में नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया de Montral.

1. थोरैसिक अर्धखंड शल्य चिकित्सा

  1. सर्जरी के लिए एक aseptic वातावरण बनाए रखने के लिए उचित सुरक्षात्मक उपकरण (ग्लोव्स, मुखौटा, और गाउन) पहनें। शराब पोंछे के साथ सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें, और सर्जिकल क्षेत्र पर बाँझ सर्जिकल पर्दे रखें। शल्य चिकित्सा उपकरण और शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर जगह बाँझ.
  2. इसतरह गैस के मिश्रण के तहत चूहे को एनेस्थेटाइज करें (3% प्रेरण, 0.5 डिग्री 3% रखरखाव) और ऑक्सीजन (1 एल/ टो की अंगुली चुटकी और कॉर्निया प्रतिवर्त प्रतिक्रियाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करके उचित शल्य चिकित्सा संवेदनाहारी गहराई की पुष्टि करें। लगातार पूरी प्रक्रिया के दौरान चूहे की निगरानी, और शल्य संवेदनाहारी गहराई बनाए रखने के लिए आवश्यक के रूप में संवेदनाहारी वितरण की मात्रा को समायोजित।
  3. कूल्हे और गर्दन के बीच पृष्ठीय ट्रंक दाढ़ी, शल्य क्षेत्र पर चूहे जगह, शराब पोंछे और proviodine समाधान के साथ चीरा साइट कीटाणुरहित, और एक प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड गुदा द्वारा नजर रखी का उपयोग कर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने थर्मामीटर.
  4. आंखों पर नेत्र मरहम रखें ताकि उन्हें हाइड्रेटेड रखा जा सके और आवश्यकतानुसार सर्जरी के दौरान फिर से लागू किया जा सके।
  5. एक स्केलपेल के साथ T6-T10 कशेरुकी overlaying त्वचा में एक 2.5 सेमी चीरा बनाओ. कुंद विच्छेदन कैंची का उपयोग कर त्वचा और सतही वसा को वापस लें।
    नोट: T6-T10 कशेरुक खंडों या तो 2एन डी वक्ष कशेरुक24के ध्यान देने योग्य protuberance से शुरू खोपड़ी के आधार से पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के खंडों के कोमल palpation द्वारा या तो rostrally की पहचान की जा सकती है , या द्वारा caudally सबसे पीछे चल रिब जो 13वें वक्ष कशेरुक ी कशेरुक में आंदोलन को प्रेरित करेगा के palpation.
  6. कुंद विच्छेदन कैंची और एक आत्म बनाए रखने retractor का उपयोग कर T7-T9 कशेरुकी के पृष्ठीय पहलू पर डालने पैराकशेरुक मांसपेशियों को अलग करें। स्पिनयुक्त प्रक्रियाओं और कशेरुक ीलाम को बेनकाब करने के लिए ठीक संदंश और कपास टिप एप्लिकेटर्स का उपयोग करके किसी भी शेष ऊतक को साफ करें।
    नोट: यह, और निम्न चरणों बहुत सूक्ष्म दृश्यद्वारा सहायता प्राप्त कर रहे हैं ($ 5 डिग्री 15x).
  7. ध्यान से नाजुक हड्डी trimmers के साथ T7 और T8 कशेरुकी पर द्विपक्षीय रूप से पहलुओं (ज़िगापोफिसियल जोड़ों) में कटौती। एक स्केलपेल (1 मिमी गहराई) अंडरलेइंग कॉर्ड को घायल नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है के साथ T8 और T9 कशेरुक ीले पटल के बीच पृष्ठीय संयोजी ऊतक कट।
  8. हड्डी trimmers के साथ T8 कशेरुक की spinous प्रक्रिया निकालें. घुमावदार हेमोस्टेटिक बलप्स के साथ ध्यान से T7 spinous प्रक्रिया पर clamped, T8 laminae थोड़ा rostrally ($ 20 डिग्री) के caudal अंत बारी बारी से, T8 पटल के नीचे हड्डी trimmers डालने, और एक midline कटौती पटल के साथ विस्तार करना. रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के लिए कशेरुक पटल मध्यस्थ के बाईं और दाईं ओर कटौती दोहरा कर laminectomy जारी रखें.
    नोट: laminectomy से बनाई गई सभी हड्डी के टुकड़े को दूर करने के लिए सावधान रहें।
  9. उजागर रीढ़ की हड्डी नहर में ड्रिप लिडेकेन (2%, 0.1 एमएल) और ठीक बल और iridectomy कैंची का उपयोग कर T8 रीढ़ की हड्डी खंड overlaying ड्यूरा को हटा दें। उजागर कॉर्ड के लिए lidocaine प्रशासन दोहराएँ और उजागर T7-T9 कशेरुक के बीच विस्तार spinous प्रक्रियाओं के बीच बनाई गई एक केंद्र लाइन के दृश्य द्वारा कॉर्ड की मिडलाइन की पहचान.
    नोट: T7 और T9 पर spinous प्रक्रियाओं के साथ, T8 पर उजागर पृष्ठीय जड़ Ganglia भी midline की पहचान सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक 30 जी सुई कॉर्ड के midline में रखा जा सकता है बाद में हेमीसेक्शन के साथ सहायता करने के लिए.
  10. हेमी एक अलग चाकू के साथ एक तरफ मध्य रेखा से रीढ़ की हड्डी को काटना. वेंडल पक्ष पर पूर्वकाल रीढ़ की हड्डी धमनी के माध्यम से कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहें (कशेरुक शरीर के लिए फर्म दबाव लागू नहीं है)। iridectomy कैंची का उपयोग करना, ध्यान से रीढ़ की हड्डी के घाव पक्ष पर किसी भी शेष ऊतक के माध्यम से कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें कि ventrolateral चतुर्भुज उचित transected है.
  11. रीढ़ की हड्डी के ऊपर उजागर गुहा में बाँझ नमकीन से लथपथ हेमोस्टेटिक स्पंज ($6 x 2 मिमी) रखें और मांसपेशियों की परतों (4-0 पॉलीग्लैक्टिन 910) सीवन करें। अगले, चीरा साइट के आसपास त्वचा सीवन.
  12. पर्याप्त एनाल्जेसिक (buprenorphine 0.05 mg/kg subcutaneous [s.c.]), एंटीबायोटिक (enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.), प्रदान करें और सर्जरी के तुरंत बाद 5 सीसी स्तनपान कराने वाली घंटी के समाधान (इंट्रापेरिटोनल [i.p.]) के साथ खोए हुए तरल पदार्थ की भरपाई करें।
  13. संज्ञाहरण से चूहे निकालें. चूहे को गर्म वातावरण में गर्म करने के लिए पैड या लैंप ($ 33 डिग्री सेल्सियस) के नीचे तब तक रखें जब तक कि जानवर पूरी तरह से जाग न जाए।
  14. पहले 3 पोस्ट सर्जिकल दिनों में दैनिक पूरक analgesia प्रदान करें और लगातार दर्द के लक्षण के लिए निगरानी, वजन घटाने, अनुचित micturition, संक्रमण, घाव भरने के साथ समस्याओं, या autophagia.

2. ओपन-फील्ड परीक्षण प्रक्रिया और चलन प्रदर्शन स्कोरिंग

  1. 1 सप्ताह के लिए दैनिक चूहों संभाल और उन्हें दो 5-मिनट सत्र के लिए क्षेत्र के लिए habituate परीक्षण से पहले acclimatize करने के लिए उठाया जा रहा है, धीरे से मध्य ट्रंक से, जबकि खुले मैदान में और परीक्षण के दौरान माप विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए.
  2. ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए परीक्षण सत्र रिकॉर्ड करने के लिए परिपत्र plexiglass खुले क्षेत्र के मैदान का सामना करना पड़ जमीनी स्तर पर एक कैमरा प्लेस (30 डिग्री 60 फ्रेम /
  3. वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करें और चलन गतिविधि को प्रोत्साहित करने के लिए मंद प्रकाश की स्थिति के तहत क्षेत्र के केंद्र में चूहे जगह है।
  4. विश्लेषण के लिए चलन bouts की एक पर्याप्त राशि सुनिश्चित करने के लिए 4 मिनट के लिए परीक्षण सत्र जारी रखें. उठाओ और क्षेत्र के केंद्र में चूहों की जगह जब वे 20 से अधिक समय के लिए स्थिर रहने के लिए चलन को बढ़ावा देने के.
  5. में प्रदान की rubric पूरा करके दर्ज परीक्षण सत्र के स्कोर चलन प्रदर्शनतालिका 1निम्नलिखित subsections में मानकों के अनुसार.
    नोट: यह चर प्लेबैक गति और फ्रेम द्वारा फ्रेम विश्लेषण (जैसे, वीएलसी मीडिया प्लेयर) के लिए अनुमति देता है कि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दर्ज परीक्षण सत्र के दोहराया देखने के द्वारा अलग से प्रत्येक पैरामीटर स्कोर करने के लिए उपयोगी है।
    1. संधि अंग आंदोलनों के लिए, टखने, घुटने, और कूल्हे के लिए अलग से या तो सामान्य के रूप में सहज चलन के दौरान Hindlimb संयुक्त आंदोलनों स्कोर (गति की सीमा के आधे से अधिक, सम्मानित स्कोर $ 2), मामूली (गति की सीमा के आधे से कम, सम्मानित स्कोर $ 1), या अनुपस्थित (पुरस्कार प्राप्त स्कोर $ 0)।
    2. वजन समर्थन के लिए, अनुबंध करने के लिए hindlimb विस्तारक मांसपेशियों की क्षमता का मूल्यांकन और लोड शरीर के वजन का समर्थन जब अंग जमीन पर अलग से है जब चूहा स्थिर है और साथ ही सक्रिय चलन के दौरान. वजन समर्थन मौजूद है जब 1 के एक स्कोर पुरस्कार और 0 का स्कोर जब वजन समर्थन अनुपस्थित है।
      नोट: स्टेशनरी वजन समर्थन सक्रिय वजन समर्थन के लिए एक अनुलाभ माना जाता है.
    3. अंक स्थिति के लिए, पश्चअंग अंकों की स्थिति का मूल्यांकन करें जबकि चूहा स्थिर होता है और चलन के दौरान। 2 के एक स्कोर पुरस्कार जब hindlimb अंक बढ़ा रहे हैं, एक दूसरे से अलग स्थान, और परीक्षण अवधि के 50% से अधिक में चलन के दौरान टॉनिक (सामान्य माना जाता है). पुरस्कार 1 के स्कोर जब अंक मुख्य रूप से flexed रहते हैं और 0 का स्कोर जब अंक मुख्य रूप से atonic रहते हैं.
    4. कदम के लिए, इस पैरामीटर को पूरा केवल अगर चूहा कदम के दौरान अपने शरीर के वजन का समर्थन कर सकते हैं. प्रारंभिक संपर्क के समय और कदम के दौरान स्विंग चरण की तरलता के अलावा जमीन से लिफ्ट पर Hindlimb पंजा प्लेसमेंट के उन्मुखीकरण रेटिंग द्वारा कदम का मूल्यांकन।
      नोट: निम्नलिखित उप-खंडों में वर्णित इस पैरामीटर के लिए 3 स्कोर अलग-अलग मूल्यांकन हैं: 1) अंग संपर्क पर पंजा प्लेसमेंट का अक्षीय अभिविन्यास (dorsal/plantar प्लेसमेंट), 2) प्रारंभिक संपर्क में पंजा प्लेसमेंट का अनुदैर्घ्य अभिविन्यास और लिफ्ट के दौरान (शरीर अक्ष के समान या आंतरिक रूप से घुमाया गया/बाहरी), और 3) स्विंग के दौरान अंग आंदोलन की गुणवत्ता (नियमित या अनियमित)।
      1. अंग संपर्क पर पंजा नियुक्ति के लिए, 0 के रूप में अंग संपर्क पर पंजा प्लेसमेंट के अक्षीय अभिविन्यास स्कोर जब पृष्ठीय प्लेसमेंट कदम के 50% से अधिक में होते हैं।
        नोट: प्लांटर प्लेसमेंट संपर्क और लिफ्ट (चरण 2.5.4.2), स्विंग आंदोलन (चरण 2.5.4.3) और forelimb-hindlimb समन्वय (चरण 2.5.5) पर पंजा के उन्मुखीकरण स्कोरिंग के लिए एक अनुलाभ माना जाता है।
      2. अंग संपर्क और लिफ्ट में पंजा अभिविन्यास के लिए, 2 के स्कोर पुरस्कार जब अनुदैर्घ्य पंजा और शरीर अक्ष समानांतर हैं और 1 का स्कोर जब अंग बाह्य या आंतरिक रूप से घुमाया जाता है, दोनों अंग संपर्क और लिफ्ट के लिए अलग से.
      3. स्विंग आंदोलन के लिए, 2 का स्कोर पुरस्कार जब hindlimb जोड़ों स्विंग के दौरान एक सामंजस्यपूर्ण और नियमित रूप से रास्ते में कदम और 1 के स्कोर जब जोड़ों के झटकेदार या spasmodic आंदोलनों स्विंग के दौरान होते हैं।
    5. फोरलिम्ब-हिंडलिम्ब समन्वय के लिए, इस पैरामीटर को केवल तभी पूरा करें जब परीक्षण के दौरान लगातार 4 कदम होते हैं और यदि अंग सक्रिय रूप से शरीर के वजन का समर्थन कर सकते हैं। 3 के स्कोर को तब प्रदान करें जब समन्वय संगत होता है (और 90% चरणों का), 2 जब लगातार (50-90% कदम), 1 जब कभी-कभी (और चरणों का 50%), या 0 जब अनुपस्थित (0% चरणों का)।
      नोट: Forelimb-hindlimb समन्वय hindlimb रन बनाए जा रहा है और शरीर के एक ही पक्ष पर forelimb के बीच कदम में एक नियमित रूप से परिवर्तन के रूप में परिभाषित किया गया है.
    6. पूंछ की स्थिति के लिए, या तो ऊपर के रूप में चलन के दौरान पूंछ की स्थिति का मूल्यांकन (जमीन से, सम्मानित स्कोर $ 1) या नीचे (भूमि को छूने, सम्मानित स्कोर $ 0).
      नोट: चलन के दौरान एक ऊंचा पूंछ की स्थिति चूहे में ट्रंक स्थिरता का एक संकेत है। अर्धखंड के बाद, पूंछ आम तौर पर के करीब आयोजित किया जाता है या ट्रंक स्थिरता बिगड़ा हुआ है के रूप में जमीन को छू।
    7. 20 अंक की एक अधिकतम के प्रत्येक hindlimb के लिए एक कुल प्रदान करने के लिए प्रत्येक पैरामीटर से व्यक्तिगत स्कोर जोड़ें.
      नोट: 20 का स्कोर सामान्य चलन प्रदर्शन को इंगित करता है। स्कोर और lt;20 चलन हानि की बढ़ती मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं और 0 का स्कोर अंग पक्षाघात इंगित करता है।

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Representative Results

संगति के एक उच्च डिग्री के साथ प्रजननीय घावों को अर्धखंड तकनीक के साथ उत्पन्न किया जा सकता है। प्रयोगात्मक समूहों के बीच घावों के आकार का आकलन करने और तुलना करने के लिए, रीढ़ की हड्डी के कुल पार-सेक्शन के प्रतिशत के रूप में घाव के अधिकतम क्षेत्र को आसानी से रीढ़ की हड्डी के हिस्सों के हिस्टोलॉजिकल दाग के साथ गणना की जा सकती है। चित्र 1 बाएं हेमीकॉर्ड के एक प्रतिनिधि घाव और 47.3% के एक औसत घाव आकार के साथ चूहों के बीच साझा अधिकतम घाव क्षेत्र के अनुपात के एक ओवरले से पता चलता है - पार अनुभागीय कॉर्ड क्षेत्र के 4.0% (द $ 6).

Figure 1
चित्र 1: प्रतिनिधि रीढ़ की हड्डी के घावों. (ए) एक अर्धाग्र चूहे से घाव उपरिकेंद्र पर एक कोरोनल रीढ़ की हड्डी अनुभाग के माइक्रोफोटोग्राफ क्रिसिल बैंगनी (सेल निकायों, बैंगनी) और लक्सोल तेजी से नीले (माइलिन, नीले) के साथ दाग दारे और सफेद पदार्थ को नुकसान का संकेत देता है जो बाईं ओर केंद्रित है हेमीकॉर्ड. डी, पृष्ठीय; वी, अधर; एल, छोड़ दिया; आर, ठीक है. स्केल बार: 1 मिमी (बी) चूहों के एक समूह में अधिक से अधिक घाव क्षेत्र के साझा अनुपात के Schematic ओवरले (एन ] 6) . दाईं ओर पृष्ठीय funiculus में पार corticospinal पथ के स्थान काले रंग में छायांकित है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अर्धखंड का प्राथमिक परिणाम पहले दो से तीन पश्चात दिनों के दौरान घाव के किनारे पर पिछले लिंब का प्रारंभिक पक्षाघात है। अधिक प्रभावित हिंदलिम्ब के लोकोमोटर प्रदर्शन चोट के बाद पहले कुछ हफ्तों में हेमीसेक्शन के बाद चूहे में तेजी से सुधार करता है। विपरीत Hindlimb में छोटे घाटे आमतौर पर शुरू में हेमीसेक्शन है कि अधिक प्रभावित अंग के लिए मुआवजे को प्रतिबिंबित कर सकते हैं के बाद मनाया जाता है, या postural स्थिरता की कमी से उत्पन्न घाटे, वजन समर्थन, और लगातार कदम. विपरीत हिंदमेंड में एक बड़ा और निरंतर घाटा विरोधी हेमीकॉर्ड में विस्तारित द्विपक्षीय घाव का संकेत देगा।

तालिका 1 में एक नमूना चलन प्रदर्शन स्कोरिंग रूब्रिक प्रदान की जाती है।

तालिका 1: नमूना स्कोरिंग शीट. नमूना चलन प्रदर्शन स्कोरिंग रूब्रिक। प्रत्येक पैरामीटर के लिए, संभावित स्कोर कोष्ठक में इंगित किए जाते हैं। मैं, आंतरिक; ई, बाहरी; पी, समानांतर; FL-HL, forelimb-hindlimb. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अक्षुण्ण अवस्था में लोकोमोटर निष्पादन में प्रतिनिधि परिवर्तन का समय- तथा चूहों के पृथक समूहों में बाईं ओर अर्धखंड के बाद पहले पांच सप्ताहों में (द र् 6 प्रति समूह) चित्र 2में दर्शाया गया है।

Figure 2
चित्र 2: बरकरार राज्य में खुले मैदान में और एक बाईं ओर वक्ष अर्धखंड के बाद पांच सप्ताह के लिए Hindlimb चलन प्रदर्शन में परिवर्तन के प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रम. अर्धखंड के बाद पहले तीन सप्ताह के दौरान बायां हिन्दअंग (ए) का निष्पादन बरकरार मूल्यों से काफी प्रभावित होता है , और अर्धखंड के बाद पहले सप्ताह के दौरान दाएँ हिन् दी (बी) का कार्य-निष्पादन काफी प्रभावित होता है. डेटा को समूह माध्य के रूप में प्लॉट किया जाता है - मानक विचलन (एसडी; द ] 6 प्रति समूह)। सांख्यिकीय विश्लेषण Kruskal-Wallis गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण समय अंक के बीच समूह के अंतर का आकलन करने के लिए डन के कई तुलना परीक्षणों के साथ पूरक के साथ प्रदर्शन किया गया. *पी एंड एलटी; 0.05, * *पी एंड एलटी; 0.001. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अर्धखंड तकनीक की एक प्रमुख शक्ति घाव की चयनात्मकता और पुन: उत्पादनीयता है जो जानवरों के बीचहिस्टोलॉजिकल और व्यवहार फीनोटाइप्स में कम परिवर्तनशीलता की ओर ले जाती है . उचित रीढ़ की हड्डी के स्तर पर एकतरफा घाव सुनिश्चित करने के लिए, उचित कशेरुक खंड और रीढ़ की हड्डी मिडलाइन दोनों की सही पहचान महत्वपूर्ण है। चूंकि अर्धखंड प्रक्रिया के दौरान कटौती की दिशा में बारी बारी से रीढ़ की हड्डी की प्रवृत्ति हो सकती है, इसलिए प्रक्रिया के दौरान दोनों तरफ रखे गए ठीक बल के साथ कॉर्ड को नाजुक रूप से स्थिर करना फायदेमंद हो सकता है। धीरे प्रकाश तनाव के तहत टेप पूंछ के साथ एक stereotaxic फ्रेम में चूहे रखकर प्रक्रिया के दौरान स्थिरता और उचित कशेरुक संरेखण के साथ मदद कर सकते हैं. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम और एक स्पिनस प्रक्रिया से जुड़ी एक रीढ़ की हड्डी दबाना भी कशेरुक स्तंभ की स्थिरता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम पाते हैं कि इसकी उपस्थिति शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ कॉर्ड के लिए उपयोग को प्रतिबंधित कर सकते हैं और के दौरान अजीब दृष्टिकोण कोण की आवश्यकता है सर्जरी. यह भी laminectomy से रीढ़ की हड्डी नहर में छोड़ दिया किसी भी हड्डी के टुकड़े को दूर करने के रूप में वे रस्सी के लिए अवांछित संपीड़न चोट पैदा कर सकता है और माध्यमिक क्षति को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है.

चूहे लगातार इस तरह के मुख्य तापमान और साँस लेने के रूप में आवश्यक महत्वपूर्ण संकेत पर नजर रखने के लिए सर्जरी के दौरान मनाया जाना चाहिए, के रूप में हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण प्रशासन के दौरान और शुरू में सर्जरी के बाद दोनों मृत्यु का एक प्रमुख कारण है। एक गुदा जांच और प्रतिक्रिया नियंत्रित हीटिंग पैड के साथ कोर शरीर के तापमान का विनियमन बहुत तापमान जटिलताओं से बच सकते हैं। एक पल्स oximeter भी संवेदनाहारी गहराई को विनियमित करने के लिए रक्त oxygenation और दिल की दर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम पाते हैं कि तरल पदार्थ पुनःपूर्ति लैक्टेट घंटी के समाधान के साथ सर्जरी के तुरंत बाद शरीर के तापमान के लिए गर्म चूहा सर्जरी के बाद जगाने के लिए एक और अधिक तेजी से वसूली समय में परिणाम, शरीर के तापमान के autonomic नियंत्रण हासिल है, और पीने के लिए और खाने में सक्षम हो.

चूहे की शल्य चिकित्सा के बाद की निगरानी हेमीसेक्शन सर्जरी के बाद आवश्यक है, विशेष रूप से अनुचित micturition के लक्षण के लिए, दर्द, संक्रमण, वजन घटाने, घाव भरने के साथ समस्याओं, या autophagia. मूल्यांकन और उपचार के लिए पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ परामर्श के बाद शल्य चिकित्सा जटिलताओं की स्थिति में महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, तीव्र रीढ़ की हड्डी के सदमे या अवांछित द्विपक्षीय घावों micturition कि संभावित घातक संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. सावधानी से सर्जरी के बाद चूहे के मूत्राशय की निगरानी और मैन्युअल रूप से प्रति दिन तीन बार शून्य अगर मूत्राशय के अधर की ओर से कोमल दबाव से भरा caudally उतरते. हम मादा लांग-एवन्स चूहों का उपयोग करते हैं क्योंकि उनके पास पुरुषों की तुलना में काफी कम और सीधा मूत्रमार्ग होता है जो स्वचालित मूत्राशय, आसान मिटूरेशन, और मूत्र पथ संक्रमण की कम दरों की अधिक तेजी से शुरुआत करता है2। वजन भी नजर रखी जानी चाहिए और एक नुकसान और 20% आधारभूत वारंट से भोजन और पानी के सेवन में जांच. दांतों को मलकलेशन, इलियस के लिए पेट, और चूहों को उचित अनुपूरक तरल पदार्थ और पोषण जैसे हाइड्रोजेल या तरल आहार के लिए जांच की जानी चाहिए। एक पुटी शायद ही कभी चीरा साइट है कि पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ परामर्श में जटिलता के बिना एक सिरिंज के साथ सुरक्षित रूप से सूखा जा सकता है के तहत फार्म कर सकते हैं.

मार्टिनेज ओपन फील्ड चलन मूल्यांकन प्रक्रिया एक सरल तकनीक है कि किसी भी विशेष उपकरण, preoperative प्रशिक्षण, या पशु के भोजन के अभाव प्रदर्शन की आवश्यकता नहीं है प्रदान करता है. आकलन के रूप में जल्दी के रूप में पशु संज्ञाहरण से ठीक हो और उचित वसूली सूचकांक के लिए जानवरों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, शरीर के वजन का समर्थन की वसूली) जब और अधिक कठोर और विशिष्ट चलन परीक्षण के रूप में पूरक किया जा सकता है ओवरग्राउंड चलन26,27,28, ट्रेडमिल चलन29,30,31,32, ग्रिड के दौरान शुद्ध विश्लेषण का स्वचालित चाल मूल्यांकन चलना33, और सीढ़ी दौड़ते हुए9,34. महत्वपूर्ण बात यह है, जबकि BBB पैमाने लोकोमोटर वसूली के साथ रैखिक नहीं दिखाया गया है के रूप में स्कोर कुछ मूल्यों के आसपास क्लस्टर करते हैं19,मार्टिनेज खुले क्षेत्र चलन मूल्यांकन वसूली की प्रक्रिया के दौरान एक रैखिक स्कोरिंग प्रोफ़ाइल प्रदान करता है 10. विश्वसनीय व्यवहार डेटा सुनिश्चित करने के लिए, परीक्षण और विश्लेषण के दौरान confounders की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. परीक्षण के दौरान परिवर्तनशीलता कम करने में मदद करने के लिए, सत्र दिन के एक ही समय में, एक ही कमरे में और एक ही प्रयोगकर्ता द्वारा होने चाहिए. ओपन-फील्ड मूल्यांकन बार-बार सत्र9,10,11,12,23पर मज़बूती से किया जा सकता है , लेकिन चूहे पर्यावरण के लिए आदत बन सकते हैं समय और परीक्षण के दौरान उनकी गतिविधि को कम करने के परिणामस्वरूप विश्लेषण के लिए चलन bouts की एक अपर्याप्त राशि में जिसके परिणामस्वरूप. परीक्षण के दौरान गतिहीनता पर काबू पाने के लिए, चूहों कि 20 सेकंड से अधिक समय के लिए स्थिर रहने उठाया और क्षेत्र के केंद्र में प्रतिस्थापित करने के लिए चलन को बढ़ावा देने के लिए कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, पहचान के लिए चिह्नित परीक्षण के दौरान क्षेत्र में एक विशिष्ट सहित परीक्षण चूहे में चलन गतिविधि को बढ़ावा देने में मदद कर सकते हैं. लोकोमोटर स्कोरिंग में विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए दो raters स्कोरिंग, अधिमानतः अंधा, विश्लेषण का संचालन करना चाहिए के रूप में पहले से वर्णित10.

अंत में, हम चूहे में एक वक्ष रीढ़ की हड्डी हेमीसेक्शन के संचालन और एक खुले मैदान के क्षेत्र में सहज Hindlimb चलन प्रदर्शन का आकलन करने के लिए तरीकों का वर्णन. हालांकि पार्श्व hemisections के संचालन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया था, तकनीक आसानी से या तो पृष्ठीय अर्धखंड35प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है , चौंका बारी अर्धखंड36,37, या पूर्ण transections 38 वांछित घाव स्थान और बख्शा की राशि के आधार पर उतरते supraspinal innervation. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तकनीक का उपयोग बड़े पशु मॉडलों में भी किया जा सकता है, जिनमें बिल्लियों39,40,41 और गैर-मानव प्राइमेट6,42 शामिल हैं, जो छोटे-छोटे के बीच पाए गए तुलनात्मक घाटे के साथ देखे गए हैं और बड़े जानवरों, यह वसूली के दोनों neurobiological तंत्र की जांच के लिए और पूर्व नैदानिक चिकित्सीय परीक्षण के लिए उपयोगी बनाने.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों (CIHR) द्वारा समर्थित किया गया था; एमओपी-142288) से एम.एम.एम. को फोंड्स डे रीचे कुबेक सेन्ट ( FRQS) से वेतन पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था, और A.R.B FRQS से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baytril CDMV 11242
Blunt dissection scissors World Precision Instruments 503669
Buprenorphine hydrochoride CDMV
Camera lens Pentax C31204TH 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera Basler acA2000-165uc 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas Praxair
Cotton tipped applicators CDMV 108703
Delicate bone trimmers Fine Science Tools 16109-14
Dissecting knife Fine Science Tools 10055-12
Dumont fine forceps (#5) Fine Science Tools 11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H) CDMV 111689
Feedback-controlled heating pad Harvard Apparatus 55-7020
Female Long-Evans rats Charles River Laboratories Strain code: 006 225-250g
Gelfoam CDMV 102348
Curved hemostat forceps Fine Science Tools 13003-10
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrogel 70-01-5022 Clear H20
Isofluorane CDMV 118740
Lactated Ringer's solution CDMV 116373
Lidocaine (2%) CDMV 123684
Needle 30 ga CDMV 4799
Open-field area Custom Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment CDMV 110704
Personal computer  With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline CDMV 1399
Proviodine CDMV 4568
Rodent Liquid Diet Bioserv F1268
Scalpal blade #11 CDMV 6671
Self-retaining retractor World Precision Instruments 14240
Vannas iridectomy spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer Dispomed 975-0510-000
VLC media player VideoLAN videolan.org/vlc

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 148 रीढ़ की हड्डी की चोट अर्धखंड चलन खुले मैदान हिंदलिंब चूहा सर्जरी
चूहा में थोरैसिक स्पाइनल कॉर्ड हेमीसेक्शन सर्जरी और ओपन-फील्ड लोकोमोटर आकलन
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Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic… More

Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat. J. Vis. Exp. (148), e59738, doi:10.3791/59738 (2019).

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