Summary
大鼠胸腔脊柱切除术是单侧脊髓损伤的宝贵且可重复的模型,用于研究运动运动恢复和治疗效果的神经机制。本文包括详细的分步指南,用于执行截断过程和评估运动在露天竞技场中的性能。
Abstract
脊髓损伤 (SCI) 导致运动、感觉和自主功能在病变水平以下的紊乱。实验动物模型是了解SCI后运动恢复所涉及的神经机制和为临床人群设计疗法的宝贵工具。有几个实验性SCI模型,包括挫伤,压缩和转位损伤,用于各种各样的物种。截路涉及脊髓的单方面分段,仅破坏一侧的所有上升和下降区域。脊柱截断产生高度选择性和可重复的伤害相比,挫伤或压缩技术,是有用的研究神经可塑性在备用和损坏的路径与功能恢复。我们提出了一个详细的分步协议,用于在大鼠的T8椎骨水平上进行胸腔切除,导致病变侧后肢最初瘫痪,并在几个上部分运动功能的分级自发恢复星期。我们还提供运动计分协议,以评估开放场的功能恢复。运动评估提供线性恢复配置文件,可以在受伤后进行早期和重复执行,以便准确筛选动物的适当时间点,以便进行更专业的行为测试。提出的截面技术可以很容易地适应其他分段模型和物种,并且运动运动评估可用于各种SCI和其他损伤模型,以得分运动功能。
Introduction
脊髓损伤 (SCI) 与运动、感觉和自主功能的严重干扰相关。SCI的实验动物模型是了解SCI病理学中涉及的解剖学和生理事件,研究修复和恢复的神经机制,以及筛选潜在治疗疗效和安全性的宝贵工具干预。大鼠是SCI研究中最常用的物种。大鼠模型成本低,易于复制,并且有大量的行为测试可用于评估功能结果2。尽管在肠道位置上有一些差异,大鼠脊髓与大型哺乳动物(包括灵长类动物3、4)具有整体相似的感光运动功能。大鼠也分享与SCI类似的生理和行为后果,与人类有关5。非人类灵长类动物和大型动物模型可以提供更接近人类SCI 6,在人类实验前证明治疗安全性和有效性至关重要,但由于伦理和动物福利,使用较少注意事项、开支和监管要求7。
大鼠切除SCI模型通过在拉面切除术后使用解剖刀或子宫切除术剪刀对脊髓进行选择性病变的定向中断。与完全分段相比,大鼠的部分分段导致较不严重的损伤,更容易术后动物护理,自发运动恢复,以及更密切的模型SCI在人类,这是主要是不完整与部分备用连接脊髓和超脊髓结构的组织8.单侧截断仅破坏一侧的所有升降区,并产生可量化且高度可重复的运动缺陷,从而加强对底层生物机制的探索。截瘫最突出的功能后果是同一侧和病变水平以下的初始肢体瘫痪,在数周内运动功能的分级自发恢复9,10,11,12.截面模型特别有助于研究受损和残余的路段和与功能恢复相关的电路的神经可塑性 9、11、12, 13,14,15,16,17,18。具体来说,在胸腔水平上进行的截断,即控制后肢运动的脊柱上方,对于研究运动控制的变化特别有用。由于SCI19后病变严重程度与运动恢复之间存在非线性关系,在实验模型中,评估功能结果的适当行为测试至关重要。
一套全面的行为测试可用于评估大鼠2、20功能运动恢复的具体方面。许多运动测试在SCI之后不能提供可靠的措施,因为大鼠太残疾,无法支撑其体重。对受伤后早期缺陷敏感的自发运动性能的测量,并且不需要术前培训或专用设备,对于监测运动恢复情况(以达到补充专业的行为测试。Martinez 开放场评估分数10,最初是为了评估大鼠宫颈 SCI 后的运动性能而开发的,是一个 20 分的正号分数,用于评估在大鼠的自发过地运动期间的全球运动性能。开放领域。评分是单独执行每个肢体使用一个标尺,评估一系列运动测量的具体参数,包括关节肢体运动,重量支持,数字位置,步进能力,前肢-四肢协调,和尾部位置。评估分数来自巴索、贝蒂和布雷斯纳汉(BBB)的露天评分表,旨在评估胸挫后运动性能21。它适用于准确可靠地评估前肢和后肢运动功能,允许独立评估与 BBB 的分层评分不相适应的不同评分参数,并提供线性恢复配置文件10.此外,与BBB相比,评估分数是敏感和可靠的较重伤害模型10,11,20,22。评估分数已用于评估在颈椎10、12和胸腔9SCI之后,并结合创伤性脑损伤23的大鼠运动损伤。
我们在此提供了一个详细的分步协议,用于在雌性长埃文斯大鼠的T8椎骨水平上执行胸腔切除SCI,以及评估在开放场的后肢运动恢复。
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Protocol
本文所述的实验是按照加拿大动物护理理事会的指导方针进行的,并经蒙特利尔大学道德委员会批准。
1. 胸腔切除手术
- 穿戴适当的防护设备(手套、面罩和长袍),以维持无菌手术环境。用酒精湿巾清洁手术区域,并在手术场上放置无菌手术窗帘。消毒手术工具,并放置在手术场上。
- 在胶质气体(3%诱导,0.5~3%维护)和氧气(1升/分钟)的混合物下麻醉大鼠。通过验证没有脚趾捏和角膜反射反应来确认适当的手术麻醉深度。在整个过程中持续监测大鼠,并根据需要调整麻醉量以保持手术麻醉深度。
- 刮去臀部和颈部之间的背干,将大鼠放在手术场上,用酒精湿巾和药水溶液消毒切口部位,并使用直肠监测的反馈控制加热垫将核心体温保持在37°C温度计。
- 将眼部膏放在眼睛上,保持眼睛水分,并根据需要在整个手术过程中重新涂抹。
- 在皮肤上用手术刀覆盖 T6_T10 椎骨,进行 2.5 厘米切口。使用钝切除剪刀缩回皮肤和表面脂肪。
注:T6-T10椎部可以通过从颅底开始从第2个胸椎24的明显突起开始,通过顺背脊柱段的柔和触感,通过顺骨识别,或者通过最后浮肋的触感,这将诱导运动在13胸椎。 - 使用钝解剖剪刀和自我固定缩回器,将插入 T7_T9 椎骨背端的椎骨肌肉分开。除去并清除任何剩余的组织,使用细钳和棉倾斜施用器,以暴露脊柱过程和椎骨层。
注:微观可视化(±5~15x)极大地帮助了本步和以下步骤。 - 用细腻的骨修剪器在 T7 和 T8 椎骨上小心地切割刻面(双关节)。用手术刀(1毫米深度)在表面切开T8和T9椎间膜之间的背结组织,小心不要伤害下颌。
- 使用骨修剪器移除 T8 椎骨的旋转过程。用弯曲止血钳小心地夹在T7旋转工艺上,稍微旋转T8层压的乳面端(±20°),将骨修剪器插入T8层压下,并沿着层状延伸中线切口。继续拉皮内切开术,重复椎骨层膜的左侧和右侧的切口,以横向过程暴露脊髓。
注:小心删除从层切除术中产生的所有骨骼碎片。 - 在外露的脊柱管中滴下利多卡因(2%,0.1 mL),并使用细钳和伊化剪去除覆盖T8脊柱段的杜拉。对裸露的脐带重复利多卡因给给,并通过可视化在暴露的 T7_T9 椎间延伸的旋转过程之间创建的中心线来识别线的中线。
注:除了 T7 和 T9 上的旋转过程外,T8 上暴露的背根结节也可用于帮助识别中线,并且 30 G 针头可以放置在线的中线,以帮助进行后续的截断。 - 用解剖刀将脊髓从中线向一侧切。小心不要穿过腹侧的前脊柱动脉(不要对椎体施加坚定的压力)。使用子宫切除剪刀,小心地切穿脊髓病变侧的任何剩余组织,以确保心边象限被适当横切。
- 将无菌盐水浸泡的止血海绵(+6 x 2 mm)放在脊髓上方的外露腔中,缝合肌肉层(4-0聚酰辛910)。接下来,缝合切口部位周围的皮肤。
- 提供足够的镇痛药(丁丙诺啡0.05毫克/千克皮下[s.c.]),抗生素(内罗伐沙因,10毫克/千克s.c.),并在手术后立即用5cc哺乳环的溶液(腹内[i.p.])补充流失的液体。
- 把老鼠从麻醉中取出。将大鼠置于加热垫或灯下的温暖环境中(±33°C),直到动物完全清醒。
- 在手术后的3天中每天提供补充性痛风,并持续监测疼痛、体重减轻、子宫内痛、感染、伤口愈合问题或自噬的迹象。
2. 露天测试程序和运动性能评分
- 每天处理大鼠1周,在测试前让他们在竞技场上训练两次5分钟,以适应从中干箱轻轻捡起,同时在露天场地,并确保测试期间的测量可靠性。
- 将摄像机放置在地面,面向圆形有机玻璃露天竞技场,以记录离线分析测试会话(最小 30~60 帧)。
- 开始录像,在昏暗的灯光下将大鼠放在竞技场中央,以鼓励运动活动。
- 继续测试会话 4 分钟,以确保有足够的运动量进行分析。当老鼠保持静止时间超过20时,在竞技场中央捡起并替换它们,以促进运动。
- 通过完成在表 1根据以下小节中的参数。
注: 通过使用允许可变播放速度和逐帧分析的软件(例如 VLC 媒体播放器)重复查看录制的测试会话,对每个参数进行单独评分会很有帮助。- 对于关节肢体运动,在自发运动期间分别为脚踝、膝盖和髋关节作为正常动作评分后肢关节运动(超过运动范围的一半,授予分数 = 2),轻微(小于运动范围的一半,授予分数= 1),或缺席(评分 = 0)。
- 对于体重支持,评估后肢扩展肌肉在大鼠静止时以及活动运动期间分别在地面上收缩和支持加载体重的能力。当存在体重支持时,奖励 1 分,在缺少重量支撑时奖励 0 的分数。
注: 固定重量支撑被视为主动体重支撑的固定功能。 - 对于数字位置,在大鼠静止和运动期间评估后肢数字的位置。当后肢数字被扩展时,奖励2分,在超过50%的测试期间(视为正常值)中,在运动期间给予补品。当数字保持主要弯曲时,奖励 1 的分数;当数字仍主要保持音质时,奖励分数为 0。
- 对于步进,仅当大鼠在步进期间能够支撑其体重时,才完成此参数。评估步进,在初始接触时和从地面升空时,除了步进过程中摆动阶段的流动性外,还对后肢爪放置的方向进行评级。
注: 以下小节中描述的此参数有 3 个分数,分别评估:1) 爪放置在肢体接触处的轴向(背/浮放置),2) 爪放置在初始接触时放置的纵向提升过程中(平行于身体轴或内部/外部旋转),以及3)摆动过程中肢体运动的质量(常规或不规则)。- 对于肢体接触时的爪子放置,当背放置发生在超过 50% 的步数中时,在肢体接触处的爪子放置的轴向打分为 0。
注: 植物放置被视为在接触和提升时对爪子方向进行评分(步骤 2.5.4.2)、摆动运动(步骤 2.5.4.3)和前肢-后肢协调(步骤 2.5.5)的贴图位置。 - 对于肢体接触和提升时的爪子方向,当纵向爪和车身轴平行时,将奖励 2 分;当肢体在外部或内部旋转时,分别为肢体接触和提升授予 1 的分数。
- 对于摆动运动,当后肢关节在摆动过程中以和谐和有规律的方式移动时,奖励 2 分;在摆动过程中发生关节的抖动或痉挛运动时,奖励 1 分。
- 对于肢体接触时的爪子放置,当背放置发生在超过 50% 的步数中时,在肢体接触处的爪子放置的轴向打分为 0。
- 对于前肢-前肢协调,只有在测试期间连续执行4个步骤,并且四肢是否能积极支撑体重时,才完成此参数。协调一致时,奖励分数为 3(+gt;90% 的步骤),2 分(50-90% 的步骤),1 分时(+lt;50% 的步骤),或缺席时的 0(步骤的 0%)。
注: 前肢-后肢协调被定义为在被评分的后肢和身体同一侧的前肢之间的定期交替。 - 对于尾部位置,在运动期间评估尾部位置为向上(离地,授予分数 = 1)或向下(接触地面,授予分数 = 0)。
注:运动期间尾部位置升高是大鼠躯干稳定性的指示器。截断后,尾部通常靠近或接触地面,因为树干稳定性受损。 - 从每个参数中添加单个分数,以提供最多 20 分的每个后肢的总分数。
注: 分数为 20 表示正常运动性能。分数 <20 表示运动障碍量增加,分数为 0 表示肢体瘫痪。
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Representative Results
使用切片技术可以生成具有高度一致性的可重复病变。为了评估和比较实验组之间的病变大小,病变的最大面积占脊髓总横截面的百分比,可以通过脊髓部分的组织染色轻松计算。图1显示了左脐带的代表性病变,以及平均病变大小为47.3%= 横截面线区(n = 6)的大鼠之间共享的最大病变面积比例的叠加。
图1:代表性脊柱病变。(A) 病变震中冠状脊柱部分的微照片,由一只沾有紫罗兰(细胞体、紫色)和luxol快蓝色(骨髓,蓝色)的被切除的老鼠,表示对集中在左侧的灰色和白色物质的损害赫米科德D,背;五、腹腔;L,左;R,对。刻度条:1 毫米 (B) 一组大鼠中最大病变区域的共享比例的架构叠加 (n = 6)。右侧背风中的交叉皮质脊柱道的位置以黑色为底。请点击此处查看此图的较大版本。
切除的主要后果是,在术后两到三天,病变一侧的后肢最初瘫痪。在受伤后的最初几周,在大鼠的半截断后,较受影响的后肢的运动性能迅速提高。相反的后肢小缺陷通常先在截面后观察到,可以反映对受影响较重的肢体的补偿,或由于缺乏姿势稳定性、体重支持和一致的步进而导致的缺陷。相反的后肢中大量且持续的赤字将表明双边病变延伸到相反的半边体。
表 1中提供了一个示例运动性能评分标准。
表 1:示例评分表。示例运动性能评分标准。对于每个参数,可能的分数在括号中指示。I,内部;E,外部;P,平行;FL-HL,前肢。请点击此处下载此文件。
图2中描述了在完整状态下和在不同大鼠组(n = 6组)的左侧截路后前五周内,运动性能的代表性变化时间过程。
图 2:在完整状态的开放场和左侧胸腔切除后的五周内,后肢运动性能变化的代表性时间过程。左后肢 (A) 在切除后的前三周内,从完整值中明显受损,在截面后的第一周右后肢 (B) 受到显著损害。数据绘制为组均值 + 标准偏差(SD;n = 每组 6)。使用 Kruskal-Wallis 非参数测试进行了统计分析,并辅以 Dunn 的多个比较测试,以评估时间点之间的组差异。•p < 0.05, =p < 0.001。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
截面技术的一个主要优点是病变的选择性和可重复性,这导致动物之间的组织学和行为表型的变异性降低25。为了确保在适当的脊髓水平上发生单侧病变,准确识别适当的椎部和脊髓中线至关重要。由于在截断过程中,脊髓有沿切口方向旋转的倾向,因此在手术过程中,在两侧放置细钳,对脊髓均匀稳定是有益的。将大鼠置于立体框架中,在轻张力下轻轻绑住尾巴,有助于在手术过程中保持稳定性和正确的椎骨对齐。连接到立体框架的脊柱夹和旋转过程也可用于增强椎骨柱的稳定性,但我们发现,它的存在可能会限制使用手术工具进入脊髓,并且需要在手术。还必须从层切除术中去除脊髓管中留下的任何骨骼碎片,因为它们对脊髓造成不必要的压缩损伤,并引发继发性损伤。
在手术过程中,应经常观察大鼠以监测必要的生命体征,如核心温度和呼吸,因为体温过低是麻醉期间和手术后死亡的主要原因。使用直肠探头和反馈控制的加热垫调节核心体温,可以大大避免温度并发症。脉搏血氧仪也可用于监测血液氧合和心率,以调节麻醉深度。我们发现,手术后立即用乳酸环的溶液加热到体温,使大鼠在手术后觉醒,恢复体温的自主控制,并能够饮用和进食,从而立即补充液体。
手术后对大鼠的监测是必不可少的,尤其是对于不当的子宫内科、疼痛、感染、体重减轻、伤口愈合问题或自噬症。在手术后并发症的情况下,与兽医人员协商进行评估和治疗至关重要。特别是,急性脊柱休克或意外的双边病变可能会干扰耳垂,可能导致潜在的致命感染。手术后仔细监测大鼠的膀胱,如果膀胱腹侧从腹腔内承受的轻压,每天手动作三次空隙。我们使用雌性长埃文斯大鼠,因为它们比雄鼠的尿道短得多,尿道更直,导致自动膀胱的更快发病,更容易出现,尿路感染率更低2。体重也应监测,基线损失>20%,要求对食物和水摄入量进行调查。应检查牙齿是否患有疏水,腹部为肠子,大鼠应给予适当的补充液体和营养,如水凝胶或液体饮食。囊肿可能很少在切口部位下形成,在与兽医人员协商时,可以使用注射器安全地排出,而不会出现并发症。
Martinez 露天运动评估程序提供了一种简单的技术,无需任何专用设备、术前训练或动物的食物剥夺即可执行。评估可以在动物从麻醉中恢复时尽早进行,并可用于筛选动物的相应恢复指数(例如,恢复体重支持),当更严格和具体的运动测试可以补充时,例如自动步态评估地面运动26,27,28 ,运动学分析在跑步机运动29,30,31,32, 网格走33,梯级走9,34。重要的是,虽然BBB刻度已被证明不是线性的,与运动恢复,因为分数往往聚集在某些值19周围,但Martinez开场运动评估在恢复过程中提供了线性评分曲线10.为了确保可靠的行为数据,在测试和分析期间尽量减少混杂物的数量是很重要的。为了帮助减少测试期间的可变性,会话应在一天中的同一时间、同一房间和同一实验者进行。开放场评估可以可靠地执行重复会议9,10,11,12,23,但老鼠可能会习惯环境超过在测试期间减少其活动,导致用于分析的运动量不足。为了克服测试期间的静止状态,在竞技场中央拾起并更换静止超过20秒的老鼠,以促进运动。此外,在测试期间在竞技场中包括一个被标记为识别的共性,可以帮助促进测试大鼠的运动活动。为了确保在运动电机评分两个评分者的可靠性,最好是盲目的,应进行分析,如前面描述10。
最后,我们描述了在大鼠进行胸脊髓切除的方法,并评估了在露天竞技场中自发的后肢运动性能。虽然描述了进行横向截错的程序,但该技术可以很容易地调整,以执行背截面截面35、交错交替截面36、37或全分段38取决于所需的病变位置和幸免下皮内侧。重要的是,该技术也可用于较大的动物模型,包括猫39,40,41和非人类灵长类动物6,42与小和大型动物,使其可用于研究恢复的神经生物学机制和临床前治疗测试。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大卫生研究所(CIHR;;澳门币-142288)到M.M.M.M.M.M.M.M.由魁北克圣德基金会(FRQS)颁发薪金奖,A.R.B得到FRQS研究金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
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