Summary
הטיפול בעמוד השדרה של החולדה הוא מודל רב ערך ומשחזר של פגיעה חד-צדדית בחוט השדרה כדי לחקור את המנגנונים העצביים של locomotor התאוששות ויעילות הטיפול. מאמר זה כולל מדריך מפורט של שלב אחר שלב לביצוע הליך החצייה ולהערכת ביצועים locomotor בזירה בשטח פתוח.
Abstract
פגיעה בחוט השדרה גורמת להפרעות בתפקוד המוטורי, החושי והאוטונומי מתחת לרמת הנגע. דגמי בעלי חיים ניסיוניים הם כלים יקרי ערך כדי להבין את המנגנונים העצביים המעורבים בשחזור locomotor לאחר SCI ולעצב טיפולים לאוכלוסיות קליניות. ישנם מספר מודלים של SCI ניסיוני, כולל החבלה, דחיסה, ופציעות רוחבי המשמשים במגוון רחב של מינים. החצייה כרוכה בחתך חד צדדי של חוט השדרה ומשבשת את כל העולים ויורדים על צד אחד בלבד. הפגיעה בעמוד השדרה מייצרת פציעה סלקטיבית ובררנית מאוד בהשוואה לשיטות החבלה או הדחיסה שהיא שימושית לחקירת הפלסטיות העצבית במסלולים שנפגעו וניזוקו הקשורים להתאוששות תפקודית. אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט עבור ביצוע הT8 בית החזה ברמה החוליות של בחולדה כי התוצאה שיתוק הראשונית של הנגע בצד של הפצע עם התאוששות ספונטנית מדורגת של locomotor פונקציה על מספר שבועות. אנו מספקים גם פרוטוקול locomotor הבקיע להערכת התאוששות תפקודית בשדה הפתוח. הערכה locomotor מספקת פרופיל התאוששות לינארית ניתן לבצע הן מוקדם יותר ושוב לאחר הפציעה כדי להתאים במדויק בעלי חיים עבור נקודות זמן מתאים שבו לבצע בדיקות התנהגותיות מיוחדות יותר. טכניקת הזיהום הציג ניתן להתאים בקלות מודלים אחרים רוחבי ומינים, ואת הערכה locomotor ניתן להשתמש במגוון של SCI ומודלים פציעה אחרים כדי להבקיע פונקציה locomotor.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה (SCI) קשורה להפרעות חמורות בתפקוד המוטורי, החושי והאוטונומי. מודלים ניסויים בעלי חיים של SCI הם כלים יקרי ערך כדי להבין את האירועים האנטומיים והפיסיולוגיים המעורבים ב-SCI פתולוגיה, כדי לחקור את המנגנונים העצביים תיקון והתאוששות, ועל המסך עבור יעילות ובטיחות של טיפול פוטנציאלי תערבויות. העכברוש הוא המינים הנפוצים ביותר במחקר SCI1. מודלים חולדה הם בעלות נמוכה, קל להתרבות, ו סוללה גדולה של בדיקות התנהגותיות זמינים להעריך את התוצאות תפקודית2. למרות כמה הבדלים מיקומי בדרכי, חוט השדרה העכברוש משתף פונקציות דומות sensorimotor דומה עם יונקים גדולים יותר, כולל פרימטים3,4. חולדות גם לחלוק השלכות פיסיולוגיים והתנהגותיים של SCI המתייחסים לבני אדם5. פרימטים לא אנושיים ודגמי בעלי חיים גדולים יכולים לספק הערכה מקרוב יותר של SCI-6 והינם חיוניים להוכחת בטיחות ויעילות הטיפול לפני ניסויים אנושיים, אך משתמשים בהם פחות בגלל הרווחה האתית והחיה שיקולים, הוצאות ודרישות רגולטוריות7.
ההמרה עכברוש מודלים SCI מבוצעים על ידי הפרעה ממוקדת של חוט השדרה עם נגע סלקטיבי באמצעות סכין לחיתוך או מספריים iridectomy לאחר כריתת למינציה. לעומת רוחבי מלאה, הטרנס חלקית התוצאות החולדה בפציעה חמורה פחות, טיפול בבעלי חיים קלה יותר, התאוששות locomotor ספונטנית, והדוק יותר מודלים SCI בבני אדם אשר לא שלם באופן חלקי עם חוסך חלקית של רקמה המחברת את חוט השדרה ואת המבנים הסופרעמוד8. הדלקת המעי החד מפריעה לכל העולה ויורדת על צד אחד בלבד, ומייצרת locomotor גרזמים מיוניתן לכימות ומאוד, שיפור החקירה של המנגנון הביולוגי הבסיסי. התוצאה התפקודית הבולטת ביותר של ההאחריכת הוא שיתוק הגפיים הראשונית באותו צד ומתחת לרמה של הנגע עם התאוששות ספונטנית מדורגת של locomotor פונקציה במשך מספר שבועות9,10, מיכל בן 11 , 12. דגם המסכה שימושי במיוחד כדי לחקור את הפלסטיות העצבית של השרשרות והמעגלים הקשורים להתאוששות תפקודית9,11,12, 13,14,15,16,17,18. באופן ספציפי, ביצוע החצייה ברמת בית החזה, כלומר, מעל מעגלי השדרה כי שליטה התנועה הגפיים, שימושי במיוחד עבור חקירת שינויים locomotor בקרת. כמו קשר שאינו ליניארי קיים בין חומרת הנגע להתאוששות locomotor לאחר SCI19, בדיקות התנהגותיות המתאים כדי להעריך את התוצאות תפקודית היא העליונה במודלים ניסיוניים.
סוללה מקיפה של בדיקות התנהגותיות זמינים כדי להעריך היבטים ספציפיים של התאוששות תפקודית locomotor ב עכברוש2,20. בדיקות locomotor רבות לא מספקים אמצעים אמינים מוקדם לאחר SCI כמו חולדות הם נכים מדי כדי לתמוך במשקל הגוף שלהם. מידה של ביצועים locomotor ספונטניים רגיש לפגיעות מוקדם לאחר הפציעה, ואינו דורש הכשרה מראש או ציוד מיוחד, מועיל כדי לפקח על ההתאוששות locomotor לנקודות הזמן המתאימות ל תוספת בדיקות התנהגותיות מיוחדות. הערכה מרטינז פתוח שדה הציון10, שפותחה במקור עבור הערכת locomotor ביצועים לאחר SCI הצווארי בעכברוש, הוא ציון 20 נקודת מסודר הערכה הביצועים הגלובליים locomotor במהלך תנועה הקרקע ספונטנית ב שדה פתוח. הניקוד מבוצע בנפרד עבור כל איבר באמצעות טבלת עזר להערכת הישגים המוערכת פרמטרים ספציפיים של מגוון של מדדים locomotor, כולל תנועת הגפיים הפרקולארית, תמיכה במשקל, מיקום הספרה, היכולת לצעוד, התאום האחורי של הגפיים, וזנב עמדה. תוצאת ההערכה נגזרת מן באסו, ביטי ו Bresnahan (BBB) קנה המידה שדה השטח הפתוח שנועד להעריך ביצועים locomotor לאחר החבלה בחזה21. הוא מותאם במדויק ואמין להעריך הן forelimb ו הlocomotor הפונקציה הגוף, מאפשר הערכה עצמאית של פרמטרים שונים הבקיע כי הוא לא מוכן עם הניקוד ההיררכי של BBB, ומספק שחזור ליניארי . פרופיל10 בנוסף, בהשוואה bbb, תוצאת ההערכה היא רגישה ואמינה במודלים חמורים יותר נזק10,11,20,22. תוצאת ההערכה שימש להערכת locomotor ליקוי בחולדה בעקבות צוואר הרחם10,12 ובית החזה9 SCI לבד בשילוב עם פגיעה מוחית טראומטית23.
אנו מציגים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט לביצוע SCI הT8 הבית החזה ברמה השדרה היחידה של האישה עכברוש ארוך-אוונס, ועל הערכת התאוששות הlocomotor הגפיים בשדה הפתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים המתוארים במאמר זה בוצעו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת מונטריאול.
1. ניתוח החצייה בחזה
- ללבוש ציוד הגנה מתאים (כפפות, מסכה, ושמלת) כדי לשמור על סביבה אספטי לניתוח. לנקות את האזור כירורגי עם מגבונים אלכוהול, ולמקם וילונות כירורגי סטרילי על השדה כירורגי. לעקר כלים כירורגיים ולמקם בשדה כירורגי.
- מייבשים את החולדה תחת שילוב של גז איזופלוט (3% אינדוקציה, 0.5-3% תחזוקה) וחמצן (1 ל/דקות). לאשר עומק הרדמה כירורגי הנכון על ידי אימות העדר צביטה הבוהן התגובה רפלקס המצמוץ. ברציפות לפקח על החולדה במהלך ההליך כולו, ולהתאים את כמות משלוח הרדמה כנדרש כדי לשמור על עומק הרדמה כירורגית.
- לגלח את הגזע הגבי בין הירך והצוואר, מניחים את העכברוש על השדה כירורגי, לחטא את האתר החתך עם מגבונים אלכוהול ופתרון הספק, ולשמור על טמפרטורת הגוף ליבה ב 37 ° צ' באמצעות כרית הסקה מבוקרת משוב בפיקוח על ידי פי הטבעת דחום.
- הניחו משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי לשמור אותם מהתייבשות ולהחיל מחדש במהלך הניתוח כנדרש.
- לעשות חתך 2.5 ס מ בעור מעל הנחת החוליות T6-T10 עם אזמל. למשוך את העור ושומן שטחי באמצעות מספריים לחיתוך קהה.
הערה: מגזרים T6-T10 החוליות ניתן לזהות גם rostrally על ידי מישוש עדין של מקטעי עמוד השדרה הראשי מהבסיס של הגולגולת החל איזשהו בולטת של החוליה 2 החזה השני24, או מקבל על ידי מישוש של הצלע הצפה האחוריים ביותר אשר יגרום לתנועה בחוליות החזה שלה -13. - הפרד בין השרירים הפרחוליות מוסיף על ההיבט הגבי של החוליות T7-T9 באמצעות מספריים לחיתוך קהה ומפסק שמירה עצמית. Debride כלה וברור את כל הרקמה הנותרת באמצעות מלקחיים עדינים כותנה המוליך לחשוף את התהליכים spinous ואת החוליות למינציה.
הערה: זה, והשלבים הבאים מסייעת רבות להדמיה מיקרוסקופית (~ 5-15x). - חותכים בזהירות את ההיבטים (המפרקים הבקיעים) על הT7 והT8 חוליות עם טרימרים עצם עדינים. חותכים את רקמת החיבור החלק התחתון בין T8 ו T9 החוליות למינציה שטחית עם אזמל (עומק 1 מ"מ) להיות זהיר לא לפגוע הכבל התחתון.
- הסר את התהליך spinous של חוליה T8 עם טרימרים עצם. עם מלקחיים מעוקל הומוסטטי מהודק בקפידה על התהליך T7 spinous, לסובב את הקצה caudal של T8 מלמינציה מעט rostrally (~ 20 °), להכניס את העצמות העצם תחת T8 lamina, ולהפוך את קו האמצע לחתוך הארכת לאורך lamina. המשך הניתוח למינציה על ידי חזרה על חתכים בצד שמאל וימין של החוליה המדיאלי האמצעי לתהליכים רוחבי כדי לחשוף את חוט השדרה.
הערה: היזהרו להסיר את כל שברי העצם שנוצרו מניתוח למינציה. - לידוקאין לטפטף (2%, 0.1 mL) בתעלת עמוד השדרה החשופה ולהסיר את השכבה היתר של הדור השדרה T8 באמצעות מלקחיים עדינים מספריים iridectomy. חזור על מינהל לידוקאין לחוט החשוף וזהה את קו האמצע של החוט על ידי הדמיה של קו מרכזי שנוצר בין התהליכים הספיסתיים החורגים בין החוליה החשופה T7-T9.
הערה: יחד עם התהליכים spinous ב-T7 ו T9, השורש החשוף של שורש הראש ב T8 יכול לשמש גם כדי לסייע זיהוי של קו האמצע ומחט של 30 גרם ניתן להציב את קו האמצע של חוט לסייע עם הזיהום הבאים. - הוא מטעה את חוט השדרה מאמצע הקו לכיוון צד אחד עם סכין מבתר. להיזהר לא לחתוך דרך עורק השדרה הקדמי על הצד הגחוני (לא להחיל לחץ המשרד על הגוף החוליות). באמצעות מספריים iridectomy, לחתוך בזהירות דרך כל הרקמה הנותרת על הצד מגירסה של חוט השדרה כדי להבטיח את הרביע הרוחבי הוא מתאים להמרה.
- מניחים ספוג חיטוי מלוחים ספוגים הומוסטטי (~ 6 x 2 מ"מ) בחלל חשוף מעל חוט השדרה ולתפור את שכבות השריר (4-0 polyglactin 910). בשלב הבא, תפר את העור. מסביב לאתר החתך
- לספק משכך כאבים נאותים (ביפרנורפין 0.05 mg/ק"ג תת עורית [ספורטינג ראגה]), אנטיביוטי (enrofloxacin, 10 מ"ג/ק"ג ספורטינג ראגה), ולחדש לחדש את הנוזלים עם הפתרון של 5 cc הרטמן (הצפק) מיד לאחר הניתוח.
- . תסיר את העכברוש מההרדמה מניחים את החולדה בסביבה חמה תחת כרית חימום או מנורה (~ 33 ° c) עד שהחיה ערה לגמרי.
- לספק כאבים משלימים מדי יום במשך 3 הימים האחרונים שלאחר ניתוח ולפקח ללא הרף עבור סימנים של כאב, ירידה במשקל, micturition לא תקין, זיהום, בעיות עם ריפוי הפצע, או האוטומטית.
2. הליך בדיקה בשדה הפתוח והlocomotor ביצועים
- להתמודד עם חולדות מדי יום במשך 1 שבוע ו habituate אותם לזירה עבור שני הפעלות 5 דקות לפני בדיקה כדי להיות שנאסף, בעדינות מאמצע הגזע, תוך בשדה הפתוח כדי להבטיח אמינות המדידה במהלך הבדיקה.
- הניחו מצלמה בקומת הקרקע מול הזירה הפלקסיגלס בשטח הפתוח כדי להקליט הפעלות בדיקה לניתוח לא מקוון (30-60 מסגרות למינימום).
- התחל הקלטת וידאו והציבו את החולדה במרכז הזירה תחת תנאי תאורה עמומים כדי לעודד פעילות locomotor.
- להמשיך את הבדיקה בדיקה עבור 4 דקות כדי להבטיח כמות נאותה של locomotor התקפי לניתוח. להרים ולהחליף חולדות במרכז הזירה כאשר הם נשארים נייח יותר מ -20 s כדי לקדם תנועה.
- ציון locomotor ביצועים של הפעלת הבדיקה המוקלטת על-ידי השלמת הטבלת הישגים שסופקה בשולחן 1לפי הפרמטרים בסעיפים הבאים.
הערה: מומלץ להבקיע כל פרמטר בנפרד על-ידי הצגה חוזרת של הפעלת הבדיקה המוקלטת באמצעות תוכנה המאפשרת מהירות הפעלה משתנה וניתוח מסגרת אחר מסגרת (לדוגמה, נגן המדיה VLC).- עבור תנועות הגפיים הפרקולריות, הציון תנועות משותפות הגוף במהלך תנועה ספונטנית בנפרד עבור הקרסול, הברך, והירך כרגיל או נורמלי (יותר ממחצית טווח התנועה, הוענק ציון = 2), קל (פחות ממחצית טווח התנועה, הוענק ציון = 1), או נעדר (הוענק ציון = 0).
- עבור תמיכה במשקל, להעריך את היכולת של השרירים פושט הגפיים הגוף לחוזה ולתמוך הטעון משקל מערכת כאשר האיבר הוא על הקרקע בנפרד כאשר העכברוש הוא נייח, כמו גם במהלך תנועה פעיל. הענקת ציון של 1 כאשר קיימת תמיכה במשקל וציון 0 כאשר חסרה תמיכה במשקל.
הערה: תמיכה במשקל נייח נחשבת כאתר הפרקוויזיט לתמיכה במשקל פעיל. - עבור מיקום הספרה, להעריך את המיקום של הספרות האחרונות בעוד העכברוש הוא נייח במהלך תנועה. הענקת ציון של 2 כאשר הספרות האחרונות מורחבות, מורווחים זה מזה, וטוניק במהלך תנועה ביותר מ 50% מתקופת הבדיקה (נחשב נורמלי). הענקת ציון של 1 כאשר הספרות נשארות מתוקנות בעיקר וציון של 0 כאשר הספרות נשארות בעיקר טוני.
- עבור צעד, להשלים פרמטר זה רק אם העכברוש יכול לתמוך במשקל הגוף שלה במהלך הצעידה. הערכת צעד על ידי דירוג הכיוון של מיקום כף יד הגפיים בזמן המגע הראשוני במעלית מהקרקע בנוסף נזילות של שלב הנדנדה במהלך הצעידה.
הערה: ישנם 3 ציונים עבור פרמטר זה המתואר בסעיפים הקטנים הבאים הערכת בנפרד: 1) כיוון הציר של כפה מיקום במגע האיבר (מיקום הראש/plantar), 2) כיוון האורך של כף המיקום על הקשר הראשוני ובמהלך המעלית (במקביל לציר הגוף או לסיבוב פנימי/חיצוני) ו-3) איכות תנועת הגפיים במהלך הנדנדה (רגיל או לא סדיר).- עבור מיקום כף היד על הקשר איבר, הציון כיוון הציר של מיקום כף היד במגע האיבר כמו 0 כאשר המיקומים האלה מתרחשים יותר מ 50% של צעדים.
הערה: מיקום Plantar הוא נחשב perquisite עבור הבקיע את הכיוון של כפה על איש קשר ולהרים (שלב 2.5.4.2), הנדנדה התנועה (שלב 2.5.4.3) ותיאום forelimb-הגפיים (שלב 2.5.5). - לכיוון כפה על קשר איבר ולהרים, הענקת ציון של 2 כאשר כף האורך ואת צירי הגוף מקבילים וציון של 1 כאשר האיבר מסובב חיצוני או פנימי, בנפרד עבור שני קשר איבר ולהרים.
- עבור התנועה הנדנדה, הענקת ציון של 2 כאשר המפרקים החודש להעביר באופן הרמוני ורגיל במהלך הנדנדה ציון של 1 כאשר תנועות מיובש או ספריות של המפרקים להתרחש במהלך הנדנדה.
- עבור מיקום כף היד על הקשר איבר, הציון כיוון הציר של מיקום כף היד במגע האיבר כמו 0 כאשר המיקומים האלה מתרחשים יותר מ 50% של צעדים.
- לתאום הגיבוי העצמי, להשלים פרמטר זה רק אם 4 שלבים רצופים מתרחשים במהלך הבדיקה ואם הגפיים יכולים באופן פעיל לתמוך במשקל הגוף. הענקת ציון של 3 כאשר הקואורדינציה עקבית (> 90% מהצעדים), 2 כאשר בתדירות גבוהה (50-90% מהשלבים), 1 כאשר מדי פעם (< 50% מהצעדים), או 0 כאשר נעדרים (0% מהצעדים).
הערה: Forelimb-תיאום החוצה האיבר מוגדר בתור החילוף הרגיל בצעד בין האיבר התחתון להיות הבקיע ואת forelimb באותו צד של הגוף. - עבור מיקום הזנב, להעריך את מיקום הזנב במהלך תנועה כלפי מעלה (מעל הקרקע, הוענק ציון = 1) או למטה (לגעת בקרקע, הוענק ציון = 0).
הערה: מיקום זנב מוגבה במהלך תנועה הוא מחוון של יציבות העורק בחולדה. לאחר הזיהום, הזנב מוחזק בדרך כלל קרוב או נוגע בקרקע כמו יציבות העורק הוא לקוי. - הוסף את התוצאות הבודדות מכל אחד מהפרמטרים כדי לספק סכום עבור כל אחד מהאיברים המרביים של 20 נקודות לכל היותר.
הערה: ציון של 20 מציין ביצועים locomotor נורמליים. ציונים < 20 מייצגים הגדלת כמויות של ליקוי locomotor וציון של 0 מציין שיתוק הגפיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן ליצור נגעים הניתנים לקריאה בעלת מידת עקביות גבוהה בטכניקת ההיאחקות. כדי להעריך ולהשוות בין נגעים בין קבוצות ניסיוני, האזור המקסימלי של הנגע כאחוז של החתך הכולל של חוט השדרה יכול להיות מחושב בקלות עם כתמים היסטולוגית של סעיפים חוט השדרה. איור 1 מציג את הנגע הנציג של ההימיקורד השמאלי ואת כיסוי של החלק של אזור נגע מקסימאלי משותף בין חולדות עם גודל הנגע ממוצע של 47.3% ± 4.0% של אזור הכבל החוצה החתך (n = 6).
איור 1: נגעים בעמוד השדרה הנציג. (A) מיקרוצילום של סעיף השדרה הדו במוקד הנגע מתוך עכברוש מנוכר מוכתם עם cresyl סגול (גוף תאים, סגול) ו luxol מהיר כחול (מאלין, כחול) המציין נזק לחומר אפור ולבן מרוכז בשמאל . המיקורד הזה . ד. (פ') לגעד; L, שמאלה; . אר, נכון סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. (ב) סכמטי של החלק המשותף של אזור הנגעים המקסימלי בקבוצה של חולדות (n = 6). המיקום של corticospinal מחצה בתוך כרמלית התחתית בצד ימין מוצלל בשחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
התוצאה העיקרית של ההיעלת היא שיתוק ראשוני של האיבר הקודם בצד הנגע במהלך הימים הראשונים עד שלושה שלאחר הניתוח. Locomotor הביצועים של האיבר הקודם המושפע יותר משפר במהירות בחולדה לאחר הפגיעה בשבועות הראשונים לאחר הפציעה. החסרונות הקטנים בגפיים הפוכים מצויים בדרך כלל בתחילה לאחר ההבחנות שיכולות לשקף פיצוי על האיבר המושפע יותר, או כתוצאה ממחסור ביציבות באמצעות משקל, תמיכה במשקל ובצעד עקבי. גרעון גדול ומתעקש בגפיים הנגדית מעיד על פגיעה דו-צדדית המשתרעת אל תוך המיקורד הנגדי.
טבלת להערכת הישגים לדוגמה locomotor ביצועים מסופקת בטבלה 1.
טבלה 1: הבקיע לדוגמה גיליון. לדוגמה, locomotor להערכת הישגים של תוצאות ביצועים. עבור כל פרמטר, התוצאות האפשריות מסומנות בסוגריים. אני, פנימי; E, חיצוני; P, במקביל; . חליל-הל, פורלימגה-הרגל אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
מסלול הזמן של הנציג משתנה בlocomotor במצב שלם ובמשך חמשת השבועות הראשונים לאחר שהצד השמאלי מופיע בקבוצות נפרדות של חולדות (n = 6 לכל קבוצה) מתואר באיור 2.
איור 2: מהלך הזמן הנציג של שינויים בביצועי locomotor הגפיים בשדה הפתוח במצב שלם ובמשך חמישה שבועות לאחר המצבה של בית החזה השמאלי. הביצועים של האיבר הקודם השמאלי (A) לקויי באופן משמעותי מערכים שלמים בשלושת השבועות הראשונים לאחר הפגיעה, ובמהלך השבוע הראשון לאחר החצייה. נתונים מותווים כממוצע קבוצה ± סטיית תקן (SD; n = 6 לכל קבוצה). ניתוחים סטטיסטיים נערכו עם בדיקות קרוקל-ווליס לא פרמטרית שנוספו עם דאן בדיקות השוואה מרובות כדי להעריך את ההבדלים הקבוצה בין נקודות זמן. *p < 0.05, * * *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החוזק העיקרי של טכניקת ההיחיצות הוא הסלקטיביות והתוכסות של הנגע המוביל לשונות מופחתת בפנוטיפים היסטלוגיים והתנהגותיים בין בעלי חיים25. על מנת להבטיח פגיעה חד צדדית ברמת עמוד השדרה המתאימה, זיהוי מדויק של מקטע החוליות הנכון ואת חוט השדרה באמצע הדרך הוא קריטי. כפי שיכול להיות נטייה חוט השדרה לסובב בכיוון של לחתוך במהלך הליך החצייה, זה יכול להיות מועיל כדי לייצב את החוט בעדינות עם מלקחיים עדינים להציב בכל צד במהלך ההליך. הצבת החולדה במסגרת סטריאוטקאית עם הזנב מודבק בעדינות תחת מתח קל יכול לעזור עם יציבות ויישור החוליות הנכון במהלך ההליך. מלחציים בעמוד השדרה המחוברים למסגרת הסטריאוטקאית ותהליך ספינאלי יכול לשמש גם כדי לשפר את היציבות של העמודה החוליות, אבל אנחנו מוצאים כי נוכחותו יכולה להגביל את הגישה כבל עם כלים כירורגיים דורש זוויות גישה מביך במהלך ה ניתוח. זה חיוני גם כדי להסיר את כל שברי העצם שנותרו בתעלת השדרה מן הניתוח למינציה כפי שהם יכולים לגרום לפגיעה בלתי רצויה בחוט השדרה ולקדם נזק משני.
חולדות צריך להיות כל הזמן נצפתה במהלך הניתוח כדי לפקח על הסימנים החיוניים הנחוצים כגון הטמפרטורה הליבה והנשימה, כמו היפותרמיה היא הגורם המוביל של התמותה הן במהלך מינהל ההרדמה ובתחילה לאחר הניתוח. התקנה של טמפרטורת הגוף הליבה עם בדיקה רקטלית ומשוב מבוקרת חימום pad יכול במידה ניכרת למנוע סיבוכים בטמפרטורה. אוקסימטר דופק יכול לשמש גם כדי לנטר חמצן דם וקצב הלב כדי להסדיר עומק הרדמה. אנו מוצאים כי חידוש הנוזלים מיד לאחר הניתוח עם הפתרון של לקטט מחומם הגוף התוצאות בזמן התאוששות מהירה יותר עבור החולדה להתעורר לאחר הניתוח, להחזיר את השליטה האוטונומית של טמפרטורת הגוף, ולהיות מסוגל לשתות ולאכול.
ניטור לאחר כירורגי של החולדה הוא חיוני לאחר ניתוח הדלקת, במיוחד עבור סימנים של micturition לא תקין, כאב, זיהום, ירידה במשקל, בעיות עם ריפוי הפצע, או אוטומטית. התייעצות עם צוות וטרינרי להערכה וטיפול היא חיונית במצבים של סיבוכים שלאחר ניתוח. בפרט, התחשמלות בעמוד השדרה או נגעים דו-צדדיים בלתי מכוונות עלולים להפריע למחלות שעלולות להוביל לזיהומים קטלניים. בזהירות לפקח על שלפוחית השתן של החולדה לאחר הניתוח ולבטל ידנית שלוש פעמים ביום אם מלא על ידי לחץ עדין מן הצד הגחוני של שלפוחית השתן יורד. אנו משתמשים חולדות לונג אוונס, כפי שיש להם השופכה קצר באופן משמעותי וישר יותר מאשר הזכרים מוביל התפרצות מהירה יותר של שלפוחית השתן אוטומטי, מיקרו מיותר קל, ושיעורי נמוך יותר של דלקות בדרכי השתן2. משקולות צריך גם להיות מנוטרים ואובדן > 20% מן הבסיס צווי החקירה לתוך צריכת מזון ומים. את השיניים יש לבדוק לצורך הסגר, הבטן למעי, וחולדות שניתנו להם נוזלים משלימים ותזונה כגון הידרוג'ל או תזונה נוזלית. ציסטה עשויה לעתים נדירות להיווצר תחת האתר חתך כי ניתן לרוקן בבטחה עם מזרק ללא סיבוך בהתייעצות עם צוות וטרינרי.
הליך ההערכה הlocomotor הפתוח של מרטינז מספק טכניקה פשוטה שאינה דורשת שום ציוד מיוחד, הכשרה מבצעית או מניעת מזון של בעל החיים לבצע. ההערכה יכולה להתבצע בשלב מוקדם ככל שבעל החיים מתאושש מהרדמה והוא יכול לשמש למסך בעלי חיים עבור מדדי ההתאוששות המתאימה (למשל, התאוששות של תמיכה במשקל הגוף) כאשר locomotor בדיקות קפדני יותר ספציפי יכול להיות שיושלם כמו הילוך אוטומטי הערכה של הרינגיי26,27,28, מנתח קימטיות במהלך הליכון תנועה29,30,31,32, רשת , הליכה33. וסולם מהלך9,34 חשוב מכך, בעוד סולם BBB הוכח לא להיות ליניארי עם שחזור locomotor כמו ציונים נוטים אשכול סביב ערכים מסוימים19, מרטינז פתוח שדה הבדיקה locomotor מספק פרופיל הבקיע ליניארי במהלך תהליך ההחלמה 10. כדי להבטיח נתונים התנהגותיים אמינים, חשוב למזער את מספר הקונמייסדים במהלך בדיקה וניתוח. כדי לסייע בהפחתת השונות במהלך בדיקה, הפעלות אמורות להתרחש באותו זמן ביום, באותו חדר ובאמצעות אותו ניסוי. הערכת השדה הפתוח ניתן לבצע באופן אמין על הפעלות חוזרות ונשנות9,10,11,12,23, אבל חולדות יכול להיות נובעת לסביבה מעל זמן להפחית את פעילותם במהלך בדיקות וכתוצאה מכך כמות מספקת של locomotor התקפי לניתוח. כדי להתגבר על חוסר ניידות במהלך בדיקות, חולדות שנשארות נייח יותר מ -20 שניות נאספו והוחלפו במרכז הזירה כדי לקדם את תנועה. בנוסף, כולל מסוים בזירה במהלך בדיקות כי הוא מסומן לזיהוי יכול לעזור לקדם את locomotor פעילות בתוך הבדיקה עכברוש. כדי להבטיח אמינות בlocomotor הבקיע שני מרצרים, רצוי לעוור, צריך לנהל את הבדיקות כפי שתוארו בעבר10.
לסיכום, אנו מתארים שיטות לניהול הזרוע הבית החזה העמוד השדרה בחולדה והערכה ספונטנית locomotor הגפיים הביצועים בזירה השדה הפתוח. למרות שהתהליך לניהול הצדדים הצדדיים תוארה, ניתן להתאים את הטכניקה בקלות לביצועמ35הצדדים, התנדנד לסירוגין36,37, או transections מלאים 38 בהתאם למיקום הנגע הרצוי וכמות שנחסך בירידה בעמוד השדרה. חשוב לציין שניתן להשתמש בטכניקה גם במודלים של בעלי חיים גדולים יותר, כולל חתולים39,40,41 ופרימטים לא אנושיים6, ה42 עם מגרטים דומים הנצפים בין קטן ובעלי חיים גדולים, מה שהופך אותו לשימושי לחקירת מנגנונים נוירוביולוגים של התאוששות ולבדיקות טיפוליות בניסויים קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR; מגב-142288) ל-M.M. M.M נתמך על ידי פרס משכורת של מעלעלי דה רצ'רצ'ה קוויבק סנטרה (FRQS), ו-A. R. B נתמך על ידי מלגת FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
