Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Торакальный спинной мозг гемисекции хирургии и открытого поля локомоторной оценки в Крыса

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59738
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 2Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 3Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC), Université de Montréal

Summary

Крыса грудной позвоночных гемисекции позвоночника является ценным и воспроизводимой моделью одностороннего повреждения спинного мозга для изучения нервных механизмов локомоторного восстановления и эффективности лечения. Эта статья включает в себя подробное пошаговое руководство для выполнения процедуры гемисекции и оценки работы локомотивов на арене открытого поля.

Abstract

Повреждение спинного мозга (SCI) вызывает нарушения в двигательной, сенсорной и вегетативной функции ниже уровня поражения. Экспериментальные модели животных являются ценными инструментами для понимания нервных механизмов, участвующих в восстановлении локомотивов после SCI и для разработки методов лечения для клинических популяций. Есть несколько экспериментальных моделей SCI, включая ушиб, сжатие и транссекционные травмы, которые используются в самых различных видов. Гемисекция включает в себя односторонний перерезка спинного мозга и нарушает все восходящие и нисходящие участки только на одной стороне. Спинной гемисекции производит очень селективной и воспроизводимой травмы по сравнению с ушибом или сжатия методы, которые полезны для исследования нервной пластичности в избавленных и поврежденных путей, связанных с функциональным восстановлением. Мы представляем подробный пошаговой протокол для выполнения грудной гемисекции на уровне T8 позвонков у крысы, что приводит к первоначальному параличу задней конечности на стороне поражения с градуированным спонтанное восстановление функции локомотива в течение нескольких Недель. Мы также предоставляем протокол оценки функционального восстановления в открытом поле. Локомоторная оценка обеспечивает линейный профиль восстановления и может быть выполнена как рано, так и неоднократно после травмы, с тем чтобы точно проверить животных на соответствующие временные точки, в которых для проведения более специализированного поведенческого тестирования. Представленный метод гемисекции может быть легко адаптирован к другим моделям и видам транссекции, а оценка локомотива может быть использована в различных МОЦ и других моделях травм для оценки функции локомотива.

Introduction

Повреждение спинного мозга (SCI) связано с серьезными нарушениями в двигательной, сенсорной и вегетативной функции. Экспериментальные животные модели SCI являются ценными инструментами для понимания анатомических и физиологических событий, связанных с патологией SCI, для исследования нервных механизмов в ремонте и восстановлении, а также для проверки эффективности и безопасности потенциальных терапевтических Мероприятий. Крыса является наиболее часто используемых видов в исследовании SCI1. Крысиные модели являются низкими затратами, легко размножаются, и большая батарея поведенческих тестов доступны для оценки функциональных результатов2. Несмотря на некоторые различия в расположении тракта, крыса спинного мозга акций в целом аналогичные функции сенсорной с более крупными млекопитающими, в том числе приматов3,4. Крысы также разделяют аналогичные физиологические и поведенческие последствия ДЛЯ SCI, которые относятся к людям5. Нечеловеческие приматы и крупные модели животных могут обеспечить более близкое приближение человека SCI6 и имеют важное значение для доказательства безопасности лечения и эффективности до экспериментов человека, но менее часто используются из-за этических и благополучия животных соображения, расходы и нормативные требования7.

Крыса transection SCI модели выполняются целевым прерыванием спинного мозга с селективным повреждением с помощью вскрытия нож или иридэктомии ножницы после ламинэктомии. По сравнению с полной transection, частичный transection в крысы приводит к менее тяжелой травмы, легче послеоперационного ухода за животными, спонтанное восстановление локомотива, и более тесно модели SCI у людей, которые преимущественно неполным с частичной щадящей ткани, соединяющие спинной мозг и надспинальные структуры8. Односторонняя гемисекция нарушает все восходящие и нисходящие участки только с одной стороны, и производит количественно и высоко воспроизводимый дефицит локомотиводвигателей, усиливая изучение основных биологических механизмов. Наиболее заметным функциональным следствием гемисекции является первоначальный паралич конечностей на той же стороне и ниже уровня поражения с градуированным спонтанное восстановление локомотивной функции в течение нескольких недель9,10, 11 Год , 12. Модель гемисекции особенно полезна для исследования нервной пластичности поврежденных и остаточных трактов и схем, связанных с функциональным восстановлением9,11,12, 13,14,15,16,17,18. В частности, гемисекция выполняется на грудном уровне, т.е., выше спинного цепи, которые контролируют движение hindlimb, особенно полезно для исследования изменений в локомоторном контроле. Поскольку существует нелинейная связь между тяжестью поражения и восстановлением локомотора после SCI19,соответствующее поведенческое тестирование для оценки функциональных исходов имеет первостепенное значение в экспериментальных моделях.

Всеобъемлющая батарея поведенческих тестов доступны для оценки конкретных аспектов функционального восстановления локомотива у крысы2,20. Многие локомоторные тесты не обеспечивают надежные меры на ранней стадии после SCI, как крысы слишком отключены, чтобы поддерживать их вес тела. Мера спонтанной производительности локомотива, который чувствителен к дефициту рано после травмы, и не требует предоперационной подготовки или специализированного оборудования, является полезным для того, чтобы контролировать восстановление локомотива для соответствующих точек времени, в которых дополнять специализированное поведенческое тестирование. Мартинес открытого поля оценки оценка10, первоначально разработанный для оценки работы локомотива после шейки матки SCI в крысы, является 20-точечный ординатор оценки глобальной работы локомотива во время спонтанного наземного передвижения в открытое поле. Скоринг проводится отдельно для каждой конечности с помощью рубрики, которая оценивает конкретные параметры ряда локомоторных мер, включая движение суставных конечностей, поддержку веса, положение в цифре, способности шага, координацию передних конечностей и хвост Позиции. Оценка оценки происходит от Basso, Битти и Bresnahan (BBB) открытого поля рейтинговая шкала предназначена для оценки локомоторной производительности после грудной контузии21. Он адаптирован для точной и надежной оценки как передних конечностей, так и функции локомотива, позволяет независимую оценку различных параметров скоринга, которые не поддаются иерархическому скорингу BBB, и обеспечивает линейное восстановление профиль10. Кроме того, по сравнению с BBB, оценка оценка чувствительна и надежна в более тяжелых моделей травм10,11,20,22. Оценка оценка была использована для оценки нарушения локомотива у крысы после шейки матки10,12 и грудной9 SCI в одиночку и в сочетании с черепно-мозговой травмой23.

Мы представляем здесь подробный пошаговый протокол для выполнения грудной гемисекции SCI на уровне T8 позвонков у самки крысы Лонг-Эванс, а также для оценки восстановления локомоторного локомотора задних конечностей в открытом поле.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты, описанные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были одобрены комитетом по этике Монреальского университета.

1. Торакальная гемисекционная хирургия

  1. Носите соответствующее защитное оборудование (перчатки, маска и платье) для поддержания асептической среды для операции. Очистите хирургическую область с помощью спиртовых салфеток и поместите стерильные хирургические шторы над хирургическим полем. Стерилизовать хирургические инструменты и поместить на хирургическое поле.
  2. Анестезируйка крысы под смесью изофлуранского газа (3% индукции, 0,5-3% обслуживания) и кислорода (1 л/мин). Подтвердите надлежащую хирургическую глубину анестезии, проверяя отсутствие щепотки и рефлекторных реакций роговицы. Непрерывно контролировать крысу в течение всей процедуры, и настроить количество анестезируетических родов, необходимых для поддержания хирургической глубины анестезии.
  3. Бритье ствола между бедром и шеей, место крысы на хирургическом поле, дезинфицировать разрез сайт с алкоголем салфетки и провиодин раствор, и поддерживать температуру тела на 37 градусов по Цельсию с помощью обратной связи контролируемых нагревательной колодки контролируется ректальной Термометр.
  4. Поместите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы держать их гидратированных и повторно на протяжении всей операции по мере необходимости.
  5. Сделайте 2,5 см разрез ампелы на коже, накладывающий позвонки Т6-Т10 скальпелем. Удалите кожу и поверхностный жир с помощью тупых ножниц вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: T6'T10 позвонков сегментов могут быть определены либо ростралли по нежным пальпации спинного спинного сегмента позвоночника от основания черепа, начиная с заметным выступом2-й грудной позвонок24, или caudally пальпация самых задних плавающих ребер, которые будут вызывать движение в 13-й грудной позвонки.
  6. Отделите парапозвонковые мышцы, вставляемые на тонкую сторону позвонков T7-T9, используя тупые ножницы для вскрытия и самосохраняющийся втягивающий сятрактор. Debride и очистить любые оставшиеся ткани с помощью тонких щипцы и хлопок наконечником аппликаторов подвергать спиннородных процессов и позвоночных ламина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этому и следующим шагам в значительной степени способствует микроскопическая визуализация (5–15 x).
  7. Тщательно вырежьте грани (зигапофизиальные суставы) на двусторонней основе на позвонках T7 и T8 с нежными костными триммерами. Вырезать спинной соединительной ткани между T8 и T9 позвонков ламины поверхностно с скальпелем (1 мм глубины), стараясь не травмировать подкладка шнура.
  8. Удалите спинной процесс позвонка T8 с костными триммерами. С изогнутыми гемостатическими щипцы тщательно зажаты на T7 спинной процесс, поверните каудальный конец T8 ламина слегка ростглина ( й 20 " вставьте кости триммеры под T8 ламина, и сделать средней линии разреза расширения вдоль ламина. Продолжить ламинэктомии, повторяя порезы на левой и правой стороне позвоночной ламины медиаль для поперечных процессов подвергать спинного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы удалить все фрагменты костей, созданных из ламинэктомии.
  9. Капаните лидокаин (2%, 0,1 мл) в открытый позвоночный канал и удалить dura наложения T8 спинного сегмента с помощью тонких щипц и ножницы иридэктомии. Повторите введение лидокаина в открытый шнур и определите средней линии шнура путем визуализации центральной линии, созданной между спиннозными процессами, простирающимися между открытым позвонком T7-T9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наряду с спинновидной процессов на T7 и T9, подвергаются спинной корень ганглиев на T8 также может быть использован для оказания помощи идентификации средней линии и 30 G игла может быть помещена в средней линии шнура, чтобы помочь с последующим гемисекцией.
  10. Гемисектировать спинной мозг от средней линии к одной стороне с рассекающим ножом. Будьте осторожны, чтобы не прорезать переднюю спинномозговую артерию на брюшной стороне (не применять твердое давление на тело позвонка). Используя ножницы иридэктомии, тщательно прорезать все оставшиеся ткани на пораженной стороне спинного мозга, чтобы обеспечить вентролатеральный квадрант надлежащим образом трансected.
  11. Поместите стерильную соленую гемостатическую губку (6 х 2 мм) в облучение полости над спинным мозгом и шов мышечных слоев (4-0 полилактина 910). Далее шов кожи вокруг разреза сайта.
  12. Обеспечить адекватный анальгетик (бупренорфин 0,05 мг/кг подкожного , антибиотик (энрофлоксацин, 10 мг/кг с.к.), и пополнить потерянные жидкости с помощью 5 куб.с. раствора лактированного звонаря (интраперитонеальный цир.) сразу после операции.
  13. Удалите крысу из анестезии. Поместите крысу в теплую среду под грелкой или лампой (33 градусов по Цельсию) до полного пробуждения животного.
  14. Обеспечить дополнительную обезболивающую ежедневно в течение первых 3 послеоперационных дней и постоянно контролировать признаки боли, потеря веса, неправильное micturition, инфекции, проблемы с заживлением ран, или аутофагии.

2. Процедура тестирования на открытом поле и оценка производительности локомотива

  1. Обработка крыс ежедневно в течение 1 недели и привыкать их на арену в течение двух 5-минутных сессий до тестирования, чтобы акклиматизироваться к подобрали, мягко из середины ствола, в то время как в открытом поле и для обеспечения надежности измерения во время тестирования.
  2. Поместите камеру на уровне земли перед круговой ареной с открытым полем для записи сеансов тестирования для автономного анализа (минимум 30–60 кадров/с).
  3. Начните видеозапись и поместите крысу в центре арены в условиях тусклого света, чтобы стимулировать активность локомотивов.
  4. Продолжить сеанс тестирования в течение 4 минут, чтобы обеспечить достаточное количество локомотивных приступов для анализа. Возьмите и замените крыс в центре арены, когда они остаются неподвижными дольше, чем 20 с для содействия передвижения.
  5. Оценка локомотивной производительности записанного тестирования сессии, завершив рубрику, представленную вТаблица 1в соответствии с параметрами в следующих подразделах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно одержать оценку каждого параметра отдельно путем повторного просмотра записанного сеанса тестирования с помощью программного обеспечения, которое позволяет использовать переменную скорость воспроизведения и анализ кадра по кадру (например, медиаплеер VLC).
    1. Для суставных движений конечностей, оценка задних движений суставов во время спонтанного передвижения отдельно для лодыжки, колена и бедра, как нормальный (более половины диапазона движения, награжден оценка No 2), незначительные (менее половины диапазона движения, награжден оценка 1) или отсутствует (присужденная оценка No 0).
    2. Для поддержки веса, оценить способность мышц заднего конечностей разгибателя для сокращения и поддержки загружены веса тела, когда конечность находится на земле отдельно, когда крыса неподвижна, а также во время активного передвижения. Награда оценка 1, когда вес поддержки присутствует и оценка 0, когда вес поддержки отсутствует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стационарная поддержка веса считается местом для активной поддержки веса.
    3. Для получения цифры оцените положение цифр задних конечностей, в то время как крыса неподвижна и во время передвижения. Награда оценка 2, когда задние цифры расширены, расположенные отдельно друг от друга, и тоник во время передвижения в более чем 50% от периода тестирования (считается нормальным). Награда оценка 1, когда цифры остаются преимущественно согнуты и оценка 0, когда цифры остаются преимущественно атонической.
    4. Для шага, завершить этот параметр только в том случае, если крыса может поддерживать свой вес тела во время шага. Оцените шагая по рейтингу ориентации размещения лап задних конечностей во время первоначального контакта и при подъеме с земли в дополнение к текучести фазы качели во время шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть 3 балла за этот параметр, описанный в следующих подразделах отдельно оценки: 1) осевой ориентации размещения лапы при контакте конечностей (дорсаль / подошвенный размещения), 2) продольная ориентация размещения лапы при первоначальном контакте и во время подъема (параллельно оси тела или вращается внутри/внешне), и 3) качество движения конечностей во время качели (регулярные или нерегулярные).
      1. Для размещения лапы при контакте конечностей, оценка осевой ориентации размещения лапы при контакте конечности, как 0, когда склады дорс на самом этом месте происходят в более чем 50% шагов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Место размещения подошвенного считается perquisite для оценки ориентации лапы при контакте и подъеме (шаг 2.5.4.2), качели движения (шаг 2.5.4.3) и предыконечной-hindlimb координации (шаг 2.5.5).
      2. Для ориентации лапы при контакте конечности и подъеме, награда оценка 2, когда продольные лапы и осей тела параллельны и оценка 1, когда конечность вращается внешне или внутренне, отдельно для контакта конечностей и лифта.
      3. Для движения свинга, награда оценка 2, когда задние суставы двигаться в гармонично и регулярно во время качели и оценка 1, когда отрывистые или спазмочные движения суставов происходят во время качели.
    5. Для координации передних конечностей и хиндслимбов, завершить этот параметр только в том случае, если 4 последовательных шагов происходят во время тестирования, и если конечности могут активно поддерживать вес тела. Награда оценка 3, когда координация является последовательной (йgt;90% шагов), 2, когда частые (50-90% шагов), 1, когда случайные (злите; 50% шагов), или 0 при отсутствии (0% шагов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Координация forelimb-hindlimb определена как регулярное изменение в шагая между hindlimb будучи забиваемым и передним на такой же стороне тела.
    6. Для хвоста позиции, оценить хвост положение во время передвижения, как либо вверх (от земли, награжден оценка No 1) или вниз (прикосновение к земле, награжден оценка No 0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенное положение хвоста во время передвижения является показателем стабильности ствола у крысы. После гемисекции, хвост, как правило, удерживается близко к земле или касаясь земли, как стабильность ствола нарушается.
    7. Добавьте индивидуальные баллы от каждого параметра, чтобы обеспечить в общей сложности для каждой задней конечности максимум 20 очков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка 20 указывает на нормальную производительность локомотива. Оценки злт;20 представляют собой увеличение количества локомотивных нарушений и оценка 0 указывает на паралич конечностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Воспроизводимые поражения с высокой степенью консистенции могут быть сгенерированы с помощью метода гемисекции. Для оценки и сравнения размеров поражений между экспериментальными группами, максимальная площадь поражения в процентах от общего поперечного сечения спинного мозга может быть легко рассчитана с гистологическим окрашиванием секций спинного мозга. На рисунке 1 показано репрезентативное поражения левого гемикорда и наложение доли максимальной площади поражения, разделяемых между крысами со средним размером поражения 47,3% и 4,0% поперечного сеченного шнура (n No 6).

Figure 1
Рисунок 1: Представитель поражений позвоночника. (A) Микрофотография корональной спинномозговой секции в эпицентре поражения от гемисектированной крысы, окрашенной кресиловым (клеточные тела, фиолетовый) и luxol быстро синий (миелин, синий) с указанием повреждения серого и белого вещества, сосредоточенного в левой hemicord. D, дорсал; V, вентрал; L, слева; R, право. Шкала бар: 1 мм. (B) Схематическая накладка общей доли максимальной области поражения в группе крыс (n No 6). Расположение скрещенного кортикоспинального тракта в спинном фуникусе с правой стороны затенено черным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Основным последствием гемисекции является первоначальный паралич задней конечности на стороне поражения в течение первых двух-трех послеоперационных дней. Локомоторная производительность более пострадавших задних конечностей быстро улучшается в крысы после гемисекции в течение первых нескольких недель после травмы. Небольшие дефициты в противоположной hindlimb обычно наблюдаются первоначально после hemisection, которые могут отражать компенсацию для более пострадавших конечностей, или дефицит в результате отсутствия постуральной стабильности, вес поддержки, и последовательной активизации. Большой и сохраняющийся дефицит в противоположном задней конечности будет означать двустороннее урезание, распространяющееся на противоположный гемикорд.

Образец локомоторной зачетной рубрики приводится в таблице 1.

Таблица 1: Образец скоринга листа. Пример локомотивной производительности забил рубрику. Для каждого параметра возможные оценки указаны в скобках. Я, внутренний; E, внешний; P, параллель; FL-HL, передний конечности-химлим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Временной ход репрезентативных изменений в производительности локомотива в нетронутом состоянии и в течение первых пяти недель после левой стороны гемисекции в отдельных группах крыс (n No 6 в группе) изображен на рисунке 2.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель времени курс изменений в hindlimb локомоторной производительности в открытом поле в нетронутом состоянии и в течение пяти недель после левой стороны грудной гемисекции. Производительность левой заднейконечности (A ) значительно нарушается от нетронутых значений в течение первых трех недель после гемисекции, и правой задней конечности (B) в течение первой недели после гемисекции. Данные отображаются как среднее групповое отклонение (SD; n no 6 на группу). Статистические анализы были проведены с Kruskal-Wallis непараметрических тестов дополнили Многочисленные сравнительные тесты Данн для оценки групповых различий между точками времени. р-р злт; 0,05,п. р.; 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основной силой метода гемисекции является избирательность и воспроизводимость поражения, что приводит к снижению изменчивости гистологических и поведенческих фенотипов между животными25. Для того, чтобы обеспечить одностороннее повреждение на соответствующем уровне позвоночника, точная идентификация как надлежащего сегмента позвоночника и спинного мозга средней линии имеет решающее значение. Как может быть тенденция для спинного мозга, чтобы вращаться в направлении разреза во время процедуры гемисекции, это может быть полезно для стабилизации шнура деликатно с тонкими щипками размещены на обеих сторонах во время процедуры. Размещение крысы в стереотаксической раме с хвостом, аккуратно заклеемым при легком напряжении, может помочь в стабильности и надлежащем выравнивании позвонков во время процедуры. Спинной зажим, прикрепленный к стереотаксической раме и спинномозговой процесс, также может быть использован для повышения стабильности позвоночного столба, но мы находим, что его присутствие может ограничить доступ к шнуру с помощью хирургических инструментов и требует неудобных углов подхода во время Хирургии. Важно также, чтобы удалить любые фрагменты костей, оставленных в позвоночном канале от ламинэктомии, поскольку они могут вызвать нежелательные повреждения сжатия в мозг и способствовать вторичного повреждения.

Крысы должны постоянно наблюдаться во время операции для мониторинга необходимых жизненно важных признаков, таких как температура ядра и дыхание, как гипотермия является основной причиной смертности как во время анестезии администрации и первоначально после операции. Регулирование температуры основного тела с помощью ректального зонда и контролируемой обратной связью нагревательной площадки позволяет значительно избежать температурных осложнений. Оксиметр пульса может также использоваться для мониторинга оксигенации крови и частоты сердечных приступов для регулирования анестезии глубины. Мы находим, что пополнение жидкости сразу после операции с раствором лактата звонара нагревается до температуры тела приводит к более быстрому времени восстановления для крысы, чтобы пробудиться после операции, восстановить вегетативный контроль температуры тела, и быть в состоянии пить и есть.

Послеоперационный мониторинг крысы имеет важное значение после операции гемисекции, особенно при признаках неправильного micturition, боль, инфекция, потеря веса, проблемы с заживлением ран, или аутофагии. Консультации с ветеринарным персоналом для оценки и лечения имеет решающее значение в ситуациях послеоперационных осложнений. В частности, острый спинной шок или непреднамеренные двусторонние поражения могут мешать micturition, что может привести к потенциально смертельным инфекциям. Тщательно контролировать мочевой пузырь крысы после операции и вручную недействительными три раза в день, если полный нежное давление со стороны брюшной мочевого пузыря спуск каудально. Мы используем женщин Лонг-Эванс крыс, поскольку они имеют значительно короче и прямее уретры, чем мужчины, что приводит к более быстрому наступлению автоматического мочевого пузыря, легче micturition, и более низкие показатели инфекций мочевыводящих путей2. Веса также должны быть проверены и потери йgt;20% от базового ордера расследования в пищу и воду. Зубы должны быть проверены на malocclusion, живот для ileus, и крыс ы, учитывая соответствующие дополнительные жидкости и питания, такие как гидрогель или жидкой диеты. Киста редко может образовываться под разрезом, который можно безопасно осушить шприцем без осложнений в консультации с ветеринарным персоналом.

Процедура оценки локомоторной оценки открытого поля Martinez обеспечивает простую технику, которая не требует какого-либо специализированного оборудования, предоперационной подготовки или лишения животного пищи для выполнения. Оценка может быть проведена уже в начале восстановления животного после наркоза и может быть использована для проверки животных на соответствующие показатели восстановления (например, восстановление поддержки веса тела), когда более строгие и специфические локомотивные испытания могут быть дополнены, такие как автоматизированная оценка походки наземного движения26,27,28,кинематические анализы во время беговой дорожки движения29,30,31,32, сетка ходьба33, и лестница ступенька ходьба9,34. Важно отметить, что в то время как шкала BBB было показано, что не будет линейным с локомотиввосстановления, как оценки, как правило, кластервокруг определенных значений19, Мартинес открытого поля локомотив нойоценки обеспечивает линейный профиль скоринга во время процесса восстановления 10. Для обеспечения надежных поведенческих данных важно свести к минимуму количество confounders во время тестирования и анализа. Чтобы уменьшить изменчивость во время тестирования, сеансы должны происходить в одно и то же время суток, в одной комнате и в одном и том же экспериментаторе. Оценка открытого поля может быть надежно выполненав течение повторных сессий 9,10,11,12,23,но крысы могут привыкнуть к окружающей среде более время и уменьшить их активность во время тестирования в результате недостаточного количества локомотивных приступов для анализа. Чтобы преодолеть неподвижность во время тестирования, крысы, которые остаются неподвижными в течение более 20 секунд, подбираются и заменяются в центре арены для содействия передвижению. Кроме того, в том числе conspecific на арене во время тестирования, который отмечен для идентификации может способствовать деятельности локомотивов в тест крысы. Для обеспечения надежности в локомотиве забил два оценщика, предпочтительно ослепленный, следует проводить анализы, как ранее описано10.

В заключение, мы описываем методы проведения грудного спинного мозга гемисекции у крысы и оценки спонтанного hindlimb локомотив производительности в открытом поле арене. Хотя процедура для проведения боковой гемиsections был описан, техника может быть легко адаптирована для выполнения либо дорсальные гемиsections35, пошатнулся чередующихся гемисекций36,37, или полные transections 38 в зависимости от желаемого места поражения и количества избавленного от нисходящей надспинальной иннервации. Важно отметить, что этот метод также может быть использован в более крупных животных моделей, в том числе кошек39,40,41 и нечеловеческих приматов6,42 с сопоставимыми дефицитами наблюдается между малыми и крупных животных, что делает его полезным для исследования как нейробиологических механизмов восстановления, так и для доклинического терапевтического тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR; MOP-142288) м.м.м. была поддержана наградой по заработной плате от Fonds de Recherche Квебек Аканте (ФРЗС), а A.R.B была поддержана стипендией от ФРЗС.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baytril CDMV 11242
Blunt dissection scissors World Precision Instruments 503669
Buprenorphine hydrochoride CDMV
Camera lens Pentax C31204TH 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera Basler acA2000-165uc 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas Praxair
Cotton tipped applicators CDMV 108703
Delicate bone trimmers Fine Science Tools 16109-14
Dissecting knife Fine Science Tools 10055-12
Dumont fine forceps (#5) Fine Science Tools 11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H) CDMV 111689
Feedback-controlled heating pad Harvard Apparatus 55-7020
Female Long-Evans rats Charles River Laboratories Strain code: 006 225-250g
Gelfoam CDMV 102348
Curved hemostat forceps Fine Science Tools 13003-10
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrogel 70-01-5022 Clear H20
Isofluorane CDMV 118740
Lactated Ringer's solution CDMV 116373
Lidocaine (2%) CDMV 123684
Needle 30 ga CDMV 4799
Open-field area Custom Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment CDMV 110704
Personal computer  With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline CDMV 1399
Proviodine CDMV 4568
Rodent Liquid Diet Bioserv F1268
Scalpal blade #11 CDMV 6671
Self-retaining retractor World Precision Instruments 14240
Vannas iridectomy spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer Dispomed 975-0510-000
VLC media player VideoLAN videolan.org/vlc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
  2. Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
  3. Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
  4. Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
  5. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  6. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
  7. Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
  8. Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
  9. Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
  10. Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
  11. Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
  12. Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
  13. Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
  14. Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
  15. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  16. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  17. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  18. Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
  19. Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
  20. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  21. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  22. Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
  23. Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
  24. Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
  25. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
  26. Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
  27. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  28. Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
  29. Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
  30. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  31. Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
  32. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
  33. Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
  34. Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
  35. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
  36. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  37. van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
  38. Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
  39. Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
  40. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
  41. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
  42. Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).

Tags

Неврология Выпуск 148 повреждение спинного мозга гемисекция передвижение открытое поле задние конечности крыса хирургия
Торакальный спинной мозг гемисекции хирургии и открытого поля локомоторной оценки в Крыса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic… More

Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat. J. Vis. Exp. (148), e59738, doi:10.3791/59738 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter