Summary
Sıçan torasik spinal hemiseksiyon lokomotor kurtarma ve tedavi etkinliğini nöral mekanizmaları araştırmak için tek taraflı omurilik hasarı değerli ve tekrarlanabilir bir modeldir. Bu makalede, hemiseksiyon prosedürü gerçekleştirmek ve bir açık alan arenada lokomotor performansını değerlendirmek için ayrıntılı bir adım adım kılavuz içerir.
Abstract
Omurilik hasarı (SCı), lezyonun altındaki motor, duyusal ve otonjik işlevdeki bozukluklara neden olmaktadır. Deneysel hayvan modelleri, SCı 'den sonra lokomotor iyileşmesi ile ilgili nöral mekanizmaları anlamak ve klinik nüfusa yönelik tedaviler tasarlamak için değerli araçlardır. Çok çeşitli türlerde kullanılan çürüme, sıkıştırma ve transeksiyon yaralanmaları da dahil olmak üzere çeşitli deneysel SCı modelleri vardır. Bir hemiseksiyon omuriliğin tek taraflı transeksiyonunu içerir ve tüm artan ve azalan yolları sadece bir tarafta bozur. Spinal hemiseksiyon, fonksiyonel iyileşme ile ilişkili kurtarılan ve hasarlı yolların nöral plastisite araştırılması için yararlı olan çürüme veya sıkıştırma tekniklerine kıyasla son derece seçici ve tekrarlanabilir bir yaralanma üretir. Biz fare içinde T8 vertebral düzeyde bir göğüs hemiseksiyon gerçekleştirmek için ayrıntılı bir adım-adım protokol sunuyoruz, birkaç üzerinde lokomotor fonksiyonunun dereceli spontan kurtarma ile lezyonun tarafında ilk felci sonucu Hafta. Ayrıca açık alanda fonksiyonel iyileşmeyi değerlendirmek için bir lokomotor Puanlama Protokolü sağlıyoruz. Lokomotor değerlendirmesi doğrusal bir kurtarma profili sağlar ve daha özel davranışsal testler yapmak için uygun zaman noktaları için hayvanları doğru şekilde ekrana almak için yaralanmadan sonra hem erken hem de art arda gerçekleştirilebilir. Sunulan hemiseksiyon tekniği, diğer transeksiyon modellerine ve türlerine kolayca adapte edilebilir ve Lokomotor değerlendirmesi, lokomotor fonksiyonuna karşı çeşitli SCı ve diğer yaralanma modellerinde kullanılabilir.
Introduction
Omurilik hasarı (SCı) motor, duyusal ve otonjik işlevdeki şiddetli bozukluklarla ilişkilidir. SCı 'nin deneysel hayvan modelleri, SCı patolojisinde yer alan anatomik ve fizyolojik olayları anlamak, onarım ve iyileşmenin nöral mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel terapötik tedavinin etkinliğini ve güvenliğini görmek için değerli araçlardır. Müdahale. Sıçan, SCı araştırma1' de en sık kullanılan türdür. Rat modelleri düşük maliyetli, yeniden oluşturulması kolay, ve davranış testleri büyük bir pil fonksiyonel sonuçları değerlendirmek için kullanılabilir2. Sistem lokasyonlarında bazı farklılıklar olmasına rağmen, sıçan omuriliği, primatlar3,4de dahil olmak üzere büyük memeliler ile genel benzer sensorimotor fonksiyonları paylaşır. Fareler Ayrıca insan5ile ilgili SCI için benzer fizyolojik ve davranışsal sonuçları paylaşır. İnsan dışı primat ve büyük hayvan modelleri insan SCı6 ' nın daha yakın bir yaklaşımı sağlayabilir ve insan deneyinden önce tedavi güvenliğini ve etkinliğini kanıtlamak için önemlidir, ancak etik ve hayvan refahı nedeniyle daha az yaygın olarak kullanılır hususlar, giderler ve düzenleyici Gereksinimler7.
Rat transeksiyon SCI modelleri, laminektomi sonrası diseksiyon bıçağı veya iridectomi makası kullanılarak seçici bir lezyon ile omuriliğin hedeflenen kesilmesi ile gerçekleştirilir. Tam bir transeksiyon ile karşılaştırıldığında, sıçan kısmi transeksiyon daha az şiddetli yaralanmalara neden, daha kolay postoperatif hayvan bakımı, spontan lokomotor kurtarma, ve daha yakından modelleri SCı ağırlıklı olarak eksik olan insanlarda kısmi koruyucu omurilik ve Supraspinal orijinli yapıları bağlayan doku8. Tek taraflı bir hemiseksiyon tüm artan ve azalan yolları sadece bir tarafta bozar ve ölçülebilir ve son derece tekrarlanabilir lokomotor açıkları üretir ve altta yatan biyolojik mekanizmaların araştırılması artırılabilir. Hemiseksiyonun en belirgin fonksiyonel sonucu, birkaç hafta içinde lokomotor fonksiyonunun dereceli spontan geri kazanımı ile aynı tarafta ve lezyonun altında ilk ekstremite felç olduğunu,9,10, 11 ' i , 12. hemiseksiyon modeli özellikle hasarlı ve kalıntı yolları ve fonksiyonel kurtarma ile ilişkili devreler nöronal plastisite araştırmak için yararlıdır9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Özellikle, torasik düzeyde yapılan hemiseksiyon, Yani, arka ekstremite lokomotisi kontrol eden spinal devrelerin üzerinde, lokomotor kontrolünde yapılan değişiklikleri araştırmak için özellikle yararlıdır. SCı19' dan sonra lezyon şiddeti ve Lokomotor kurtarma arasında doğrusal olmayan bir ilişki var olarak, fonksiyonel sonuçları değerlendirmek için uygun davranışsal testler deneysel modellerde çok önemlidir.
Fare2,20fonksiyonel lokomotor kurtarma belirli yönlerini değerlendirmek için davranış testleri kapsamlı bir pil mevcuttur. Birçok lokomotor testleri, sıçan olarak vücut ağırlığını desteklemek için çok devre dışı olduğu için SCı 'nin başlarında güvenilir tedbirler sağlamaz. Yaralanma sonrası erken açıkları duyarlı spontan lokomotor performansı bir ölçü, ve preoperatif eğitim veya özel ekipman gerektirmeyen, uygun zaman noktaları için lokomotor kurtarma izlemek için hangi hangi için yararlıdır özel davranış testi ek. Martinez açık alan değerlendirme puanı10, aslında sıçan servikal SCI sonra lokomotor performansını değerlendirmek için geliştirilen, bir 20-puan sıralı puanı spontan üstü lokomotiit sırasında küresel lokomotor performansını değerlendirmek bir açık alan. Puanlama, eklem ekstremite hareketi, ağırlık desteği, basamak pozisyonu, Adımlama yetenekleri, forelimb-hindekstremite koordinasyonu ve kuyruk gibi bir dizi lokomotor önleminin belirli parametrelerini değerlendiren bir dereceli Puanlama anahtarı kullanarak her ekstremite için ayrı olarak gerçekleştirilir Konum. Değerlendirme puanı, torasik çürüme21' den sonra lokomotor performansını değerlendirmek üzere tasarlanan Basso, Beattie ve Bresnahan (BBB) açık alan derecelendirme ölçeğinde elde edilir. Bu doğru ve güvenilir hem forelimb ve hindekstremite lokomotor işlevini değerlendirmek için adapte edilir, BBB hiyerarşik Puanlama ile sağlamlık değil farklı Puanlama parametrelerinin bağımsız değerlendirilmesi için izin verir ve doğrusal bir kurtarma sağlar profili10. Ayrıca, bbb karşılaştırıldığında, değerlendirme puanı hassas ve daha şiddetli yaralanma modelleri güvenilir10,11,20,22. Değerlendirme puanı, servikal10,12 ve torasik9 SCI tek başına ve travmatik beyin hasarı23ile kombinasyon halinde aşağıdaki sıçan lokomotor bozukluğu değerlendirmek için kullanılmıştır.
Biz burada kadın Long-Evans sıçan T8 vertebral düzeyinde bir torasik hemiseksiyon SCı gerçekleştirmek için ve açık alanda hindekstremite lokomotor kurtarma değerlendirmek için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede açıklanan deneyler, Kanada hayvan bakımı Konseyi 'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Université de Montréal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. torasik hemiseksiyon cerrahisi
- Cerrahi için aseptik bir ortam sağlamak için uygun koruyucu ekipman (eldiven, maske ve elbise) giyin. Cerrahi alanı alkol mendilleri ile temizleyin ve cerrahi alan üzerinde Steril Cerrahi perdeler yerleştirin. Cerrahi tarlada Steril Cerrahi aletler ve yer.
- İsofluran gazının (% 3 indüksiyon, 0.5 − 3% bakım) ve oksijeni (1 L/dak) karışımı altında sıçan anestezi. Ayak tutam ve kornea refleks yanıtlarının yokluğunda doğrulayarak uygun cerrahi anestezik derinliği onaylayın. Tüm prosedür sırasında sıçan sürekli izlemek ve cerrahi anestezik derinliği korumak için gerekli anestezik teslimat miktarını ayarlayın.
- Kalça ve boyun arasındaki dorsal gövdeyi tıraş edin, sıçan ameliyatı cerrahi alana yerleştirin, kesi alanını alkol mendilleri ve proviodine çözeltisi ile dezenfekte edin ve 37 °C ' de çekirdek vücut sıcaklığının korunması, rektal tarafından izlenen bir geri besleme kontrollü ısıtma yastığı kullanarak Termometre.
- Onları susuz tutmak ve gerektiğinde ameliyat boyunca yeniden uygulamak için gözlerde oftalmik merhem yerleştirin.
- T6 − T10 vertebraları bir neşter ile taşarak deride 2,5 cm kesi yapın. Deri ve yüzeysel yağ künt Diseksiyon makas kullanarak geri çekin.
Not: T6 − T10 vertebral segmentleri, 2ND torasik vertebra24veya kaudal tarafından belirgin bir titreşim başlayarak kafatasının tabanında dorsal omurilik segmentlerinin nazik palpasyonu ile ya rostrally tespit edilebilir 13. torasik vertebra hareket edecek en posterior yüzen kaburga palpasyonu. - T7 − T9 vertebra 'nın dorsal yönünü künt diseksiyon makası ve kendinden istinat Retraktörü kullanarak eklemeli paravertebral kasları ayırın. Debride ve spinöz süreçleri ve vertebra laminalar ortaya çıkarmak için ince forseps ve pamuk uçlu aplemler kullanarak kalan doku temizleyin.
Not: Bu, ve aşağıdaki adımlar büyük ölçüde mikroskobik görselleştirme (~ 5 − 15x) ile desteklenir. - Hassas kemik kesicileri ile T7 ve T8 vertebraları üzerinde ardışık olarak (zygapophy T8 ve T9 vertebral laminalar arasındaki dorsal bağ dokusunu, bir neşter (1 mm derinlik) ile yüzeysel olarak yıkarak, underdöşeme kablosunu incitmemeye dikkat edin.
- T8 vertebra spinöz süreci kemik Trimmers ile çıkarın. , T7 spinöz süreç üzerinde dikkatlice yapışmış eğri hemostatik forseps ile, T8 laminun kaudal ucunu biraz rostrally (~ 20 °) döndürün, T8 lamina altında kemik kesicileri yerleştirin ve lamina boyunca uzanan bir orta çizgi kesme yapın. Omurilik ortaya çıkarmak için enine süreçlere vertebral lamina medial sol ve sağ tarafındaki kesikler tekrarlayarak laminektomi devam edin.
Not: laminektomi oluşturulan tüm kemik parçalarını kaldırmak için dikkatli olun. - Damla lidokain (% 2, 0,1 ml) maruz spinal kanalda ve ince forseps ve iridektomi makas kullanarak T8 spinal segment taşarak dura çıkarın. Lidokain yönetimini maruz kalan kordona tekrarlayın ve maruz kalan T7 − T9 vertebra arasında uzanan spinöz süreçler arasında oluşturulan bir merkez hattının görselleştirilmesi ile kablonun orta çizgisini belirleyin.
Not: T7 ve T9 üzerinde spinöz süreçler ile birlikte, T8 üzerinde maruz dorsal kök ganglionlar da orta hat tanımlaması yardımcı olmak için kullanılabilir ve bir 30 G iğne sonraki hemisection yardımcı olmak için kablo orta çizgisinde yerleştirilebilir. - Omuriliği orta hattan bir tarafa doğru, diseksiyon bıçağıyla hemisect. Ventral tarafında anterior spinal arter üzerinden kesmemeye dikkat edin (vertebral vücuda sağlam basınç uygulanmaz). İridektomi makas kullanarak, dikkatli bir şekilde omuriliğin lezioned tarafında kalan doku üzerinden kesilmiş ventrolateral çeyreği uygun şekilde geçiş sağlamak için.
- Omuriliğin üzerinde maruz kalan boşlukta steril tuz batırılmış hemostatik sünger (~ 6 x 2 mm) yerleştirin ve Kas katmanları (4-0 polyglactin 910) sütür. Sonra, kesi yerinin etrafında cilt dikiş.
- Cerrahiden hemen sonra yeterli analjezik (buprenorfik 0,05 mg/kg subkutan [s.c.]), antibiyotik (Enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.) ve 5 cc lakslu zil sesi (intraperitoneal [IX]) ile kayıp sıvıları doldurmak sağlar.
- Faresi anesteziden çıkarın. Sıçan, sıcak bir ortamda bir Isıtma Pad veya lamba (~ 33 °C) altında hayvan tamamen uyanık kadar yerleştirin.
- İlk 3 cerrahi sonrası gün boyunca günlük ek analjezi sağlamak ve sürekli ağrı, kilo kaybı, yanlış mikturition, enfeksiyon, yara iyileşmesi ile ilgili sorunlar, ya da autophagia belirtileri izlemek.
2. açık alan test prosedürü ve Lokomotor performans skorlama
- 1 hafta boyunca her gün fareler kolu ve iki 5-dk oturumlar için arenaya habituate önce almak için boyunca uyum sağlamasına için test öncesinde, Orta gövde nazikçe, açık alan ve test sırasında ölçüm güvenilirliği sağlamak için.
- Çevrimdışı analiz için test oturumlarını kaydetmek üzere dairesel Pleksiglas açık alan arenasına bakan zemin seviyesinde bir kamera yerleştirin (minimum 30 − 60 kare/sn).
- Video kaydı başlayın ve Lokomotor etkinliğini teşvik etmek için loş ışık koşullarında arenanın ortasına sıçan yerleştirin.
- Analiz için yeterli miktarda lokomotor nöbeti sağlamak için test seansına 4 dakika devam edin. Lokomotif teşvik etmek için 20 s 'den daha uzun süre sabit kaldığınızda arenanın merkezinde fareler alın ve değiştirin.
- Kaydedilmiş test oturumunun lokomotor performansını, verilen dereceli Puanlama anahtarınıTablo 1Aşağıdaki alt bölümlerde parametrelere göre.
Not: her bir parametreyi, değişken oynatma hızı ve Frame-by-Frame Analizi (örneğin, VLC Media Player) için izin veren yazılımları kullanarak kaydedilmiş test oturumunun tekrar görüntülenmesi yoluyla ayrı olarak puanlanması yararlıdır.- Eklem ekstremite hareketleri için, kendiliğinden lokomotif sırasında ayak bileği, diz ve kalça veya normal olarak (hareket aralığının yarısından fazlası, ödül = 2 ' den fazla), hafif (hareket aralığının yarısından daha az, ödül puanı verildi = 1) veya bulunmayan (ödül = 0).
- Ağırlık desteği için, taşekstremite ekstansiyon kaslarının sözleşme ve destek yüklü vücut ağırlığı yeteneğini değerlendirmek ne zaman ekstremite ayrı olarak sıçan sabit olduğu ve aktif lokomotif sırasında yerde. Ödül bir puan 1 kilo desteği mevcut olduğunda ve 0 puan kilo desteği olmadığında.
Not: sabit ağırlık desteği aktif ağırlık desteği için bir ikramiye olarak kabul edilir. - Basamak konumu için, sıçan sabit ve lokomotif sırasında arka ekstremite basamak konumunu değerlendirmek. Ödül bir puan 2 ne zaman hindekstremite basamak uzatılır, birbirinden ayrı aralıklı, ve tonik daha fazla içinde lokomotlu sırasında% 50 test döneminin (normal kabul). Rakam, basamak ağırlıklı olarak atonik kalırken, rakamlara 1 derece esnek ve puanı 0 olarak kalırsa bir puan kazandı.
- Stepping için, sadece sıçan adım sırasında vücut ağırlığını destekleyebiliyorsa bu parametreyi tamamlayın. İlk temas sırasında ve Adımlama sırasında salıncak aşamasının akışkanlığı ek olarak yerden asansörün sırasında hindekstremite pençe yerleştirme yönünü derecelendirerek adım değerlendir.
Not: aşağıdaki alt bölümlerde ayrı olarak değerlendirilerek açıklanan bu parametre için 3 puan vardır: 1) ekstremite temas (dorsal/plantar yerleştirme) Paw yerleştirme eksenel oryantasyon, 2) ilk temas pençe yerleştirme boyuna yönü ve Asansör sırasında (vücut eksenine paralel veya dahili/dıştan döndürülmüş), ve 3) salıncak sırasında ekstremite hareketinin kalitesi (düzenli veya düzensiz).- Ekstremite temasa Paw yerleştirme için, dorsal yerleşimler adımların% 50 daha fazla oluştuğunda 0 olarak ekstremite temas pençe yerleştirme eksenel yönünü puan.
Not: plantar yerleştirme iletişim ve Asansör (adım 2.5.4.2), salıncak hareketi (adım 2.5.4.3) ve forelimb-hindekstremite koordinasyonu (adım 2.5.5) pençe oryantasyonu Puanlama için bir ikramiye olarak kabul edilir. - Ekstremite temas ve Asansör Paw oryantasyon için, ödül 2 uzunlamasına pençe ve vücut eksenleri paralel ve 1 zaman ekstremite dış veya dahili olarak, hem ekstremite temas ve Asansör için ayrı olarak döndürüldüğünde bir puan.
- Salıncak hareketi için, ödül bir puan 2 zaman dallı eklemler Swing sırasında uyumlu ve düzenli bir şekilde hareket ve bir puan 1 zaman sarsıntılı veya eklem spazmodik hareketleri salıncak sırasında ortaya çıkar.
- Ekstremite temasa Paw yerleştirme için, dorsal yerleşimler adımların% 50 daha fazla oluştuğunda 0 olarak ekstremite temas pençe yerleştirme eksenel yönünü puan.
- Forelimb-hindekstremite koordinasyonu için, bu parametreyi yalnızca test sırasında 4 ardışık adım oluşursa ve ekstremite aktif olarak vücut ağırlığını destekleyebiliyorsa tamamlayın. Ödül 3 ' ün koordinasyonu tutarlı olduğunda (adımların >% 90), 2 sık (adımların% 50 − 90 ' ı), 1 zaman zaman zaman (<% 50) veya olmadığında 0 (adımların% 0 ' ı).
Not: forelimb-hindekstremite koordinasyonu bir düzenli değişim olarak tanımlanan hindekstremite ve vücudun aynı tarafında forelimb attı olmak arasında adım. - Kuyruk pozisyonu için, lokomotif sırasında (yerden, puan = 1) ya da aşağı (yere dokunmadan, ödül = 0) olarak Kuyruk pozisyonunu değerlendir.
Not: lokomotif sırasında yükseltilmiş bir kuyruk pozisyonu, sıçan içinde gövde istikrarı göstergesidir. Hemiseksiyon sonra, kuyruk normalde yakın veya gövde stabilitesi bozulmuş olarak yere dokunmadan tutulur. - Her bir parametrede, en fazla 20 puanla her bir üst ekstremite toplamını sağlamak için bireysel puanları ekleyin.
Not: 20 puanı normal lokomotor performansını gösterir. Skorlar < 20 lokomotor bozukluğu artan miktarlarda temsil ve 0 puanı ekstremite felç gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hemiseksiyon tekniği ile yüksek derecede tutarlılık ile tekrarlanabilir lezyonlar oluşturulabilir. Deneysel gruplar arasında lezyonların boyutlarını değerlendirmek ve karşılaştırmak için, omuriliğin toplam kesit yüzdesi olarak lezyonun maksimal alanı spinal kord bölümlerin histolojik lekelenmesine kolayca hesaplanabilir. Şekil 1 , sol hemicord 'un temsili bir lezyonu ve çapraz parçalı kordon alanının% 47,3 ±% 4,0 ' inin ortalama lezyonu boyutu olan fareler arasında paylaşılan maksimum lezyon alanının bir kaplamasını gösterir (n = 6).
Resim 1: temsilci spinal lezyonlar. (A) solunda yoğunlaşmış gri ve beyaz madde hasarı gösteren kreil menekşe (hücre organları, mor) ve luxol hızlı mavi (miyelin, mavi) ile lekelenmiş bir hemisected sıçan lezyon Merkez üssü bir koronal spinal bölümün mikrofotoğraf hemicord. D, dorsal; V, ventral; L, sol; R, doğru. Ölçek çubuğu: 1 mm. (B) bir grup sıçan içinde (n = 6) maksimum lezyon alanının paylaşımlı orantının şematik yerleşimi. Sağ tarafta dorsal funiculus içinde kesişen kortikozis yolunun konumu Siyah gölgeli. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Hemiseksiyonun primer sonucu, ilk iki ila üç postoperatif gün boyunca lezyonun yan tarafındaki ilk felç. Daha etkilenen hindekstremite lokomotor performansı yaralanmadan sonra ilk birkaç hafta içinde hemiseksiyon sonra sıçan hızla geliştirir. Zıt bacakta küçük açıkları genellikle daha etkilenen ekstremite için tazminat yansıtabilir hemiseksiyon sonra başlangıçta gözlenen, ya da açıkları postural istikrar eksikliği kaynaklanan, ağırlık desteği, ve tutarlı adım. Zıt ekstremite içinde büyük ve kalıcı bir açık, karşıt hemikord içine uzanan bilateral bir lezyonu gösterir.
Tablo 1 ' de bir numune lokomotor performans Puanlama dereceli Puanlama anahtarı sağlanır.
Tablo 1: örnek Puanlama sayfası. Örnek lokomotor performans Puanlama derecelendirme. Her parametre için olası puanlar parantez içinde belirtilir. Ben, iç; E, dış; P, paralel; FL-HL, forelimb-bacaksiz. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Farklı sıçan gruplarında (n = 6 grup) sol yan hemiseksiyondan sonra ilk beş hafta içerisinde lokomotor performansında temsil edilen zaman dersi, Şekil 2' de yansıtıldı.
Şekil 2: Sol taraftaki torasik hemiseksiyondan sonra beş hafta boyunca, açık alanda, arka ekstremite lokomotor performansında değişikliklerin temsili zaman dersi. Sol baş ekstremite (A) performansı, hemiseksiyondan sonra ilk üç hafta boyunca bozulmamış değerlerden ve hemiseksiyondan sonra ilk hafta boyunca sağ baş ekstremite (B) önemli ölçüde bozulmaktadır. Veri grup ortalaması olarak çizilir ± standart sapma (SD; n = 6 grup başına). Zaman noktaları arasındaki grup farklılıkları değerlendirmek için Dunn 'ın birden fazla karşılaştırma testleri ile desteklenmektedir Kruskal-Wallis parametrik olmayan testler ile istatistiksel analizler yapıldı. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemiseksiyon tekniğinin büyük bir gücü, hayvanlar arasındaki histolojik ve davranışsal fenotiplerde azaltılmış değişkenliğe yol açan lezyonun seçicilik ve yeniden üretilebilirliği olan25. Uygun omurilik seviyesinde tek taraflı bir lezyonun sağlanması için, hem uygun vertebral segment hem de omurilik orta hattının doğru tespiti önemlidir. Hemiseksiyon işlemi sırasında kesme yönünde döndürmek için omurilik için bir eğilim olabilir gibi, bu prosedür sırasında her iki tarafında yerleştirilen ince forseps ile hassas kablo stabilize etmek için yararlı olabilir. Sıçan bir stereotaktik çerçevede yavaşça ışık gerilimi altında bantlanmış kuyruğu ile yerleştirilmesi kararlılık ve uygun vertebral hizalama prosedürü sırasında yardımcı olabilir. Stereotaktik çerçeveye bağlı bir spinal kelepçe ve spinöz bir süreç de vertebral kolon istikrarı artırmak için kullanılabilir, ama biz onun varlığı cerrahi aletler ile kabloya erişimi kısıtlayabilir ve sırasında garip yaklaşım açıları gerektirir bulmak Cerrahi. Aynı zamanda, kabloya istenmeyen kompresyon yaralanmasına neden olabilecek ve ikincil hasarı teşvik ettikleri için, omurga kanalındaki herhangi bir kemik parçasını laminektomi işleminden çıkarmak da önemlidir.
Sıçan, cerrahi sırasında çekirdek sıcaklığı ve nefes alma gibi gerekli hayati belirtileri izlemek için sürekli olarak gözlemlenmelidir, çünkü hipotermi, anestezi yönetimi sırasında ve ameliyat sonrası ilk ölüm nedenidir. Bir rektal prob ve geri besleme kontrollü ısıtma yastığı ile çekirdek vücut sıcaklığının düzenlenmesi sıcaklık komplikasyonlarından büyük ölçüde kaçınabilir. Bir Nabız oksimetre de anestezi derinliği düzenleyen kan oksijasyonu ve kalp hızı izlemek için kullanılabilir. Biz bu sıvı yenileme hemen lakdamak zil çözümü ile ameliyat sonrası vücut sıcaklığı sonuçları için daha hızlı bir iyileşme zaman sıçan için ameliyat sonra uyandırmak için ısıtılmış bulmak, vücut sıcaklığının otonjik kontrol yeniden, ve içmek ve yemek mümkün.
Farenin cerrahi sonrası izlenmesi, özellikle uygunsuz mikturasyon, ağrı, enfeksiyon, kilo kaybı, yara iyileşmesi ile ilgili sorunlar veya autophagia belirtileri için hemiseksiyon ameliyatından sonra esastır. Cerrahi sonrası komplikasyonlar durumlarında veteriner kadrosuyla değerlendirme ve tedavi konusunda danışmalar önemlidir. Özellikle akut spinal şok ya da istenmeyen bilateral lezyonlar, ölümcül enfeksiyonlara yol açabilecek mikturisite engel olabilir. Dikkatli bir şekilde ameliyat sonrası sıçan mesane izlemek ve elle, mesane ventral tarafındaki yumuşak basınç ile tam olarak günde üç kez boşalan caudally inen. Biz erkek daha kısa ve daha düz üretra bir otomatik idrar kesesi, daha kolay mikturition ve daha düşük oranlar idrar yolu enfeksiyonları2daha hızlı başlangıcına yol açar gibi kadın Long-Evans fareler kullanın. Ağırlıkları da izlenmesi gereken ve bir kayıp > 20% temel garanti gıda ve su alımı içine soruşturma. Dişler maloklüzyonu, ileus için karın ve hidrojel veya sıvı diyet gibi uygun ek sıvılar ve beslenme verilen fareler için kontrol edilmelidir. Bir kist, veteriner personeline danışarak komplikasyonsuz bir şırınga ile güvenli bir şekilde boşaltılabilir kesi sitesi altında nadiren oluşabilir.
Martinez açık alan lokomotor değerlendirme prosedürü herhangi bir özel ekipman gerektirmeyen basit bir teknik sağlar, preoperatif eğitim, veya hayvan gıda yoksunluğu gerçekleştirmek için. Değerlendirme hayvan anestezi kurtarır ve uygun kurtarma endeksleri için hayvanlar ekran için kullanılabilir (örneğin, vücut ağırlığı desteği kurtarma) daha titiz ve spesifik lokomotor test gibi takviye edilebilir erken yapılabilir koşu bandı lokomotinin29,30,31,32, ızgara sırasında üstü lokomotl26,27,28, kinematik analizler otomatik yürüyüş değerlendirmesi yürüyüş33, ve merdiven basamağı yürüyüş9,34. En önemlisi, BBB ölçeği puanları belirli değerlerin etrafında küme eğilimindedir gibi lokomotor kurtarma ile doğrusal olmadığı gösterilmiştir iken19, Martinez açık alan lokomotor değerlendirme kurtarma sürecinde doğrusal bir Puanlama profili sağlar 10. güvenilir davranışsal verilerin sağlanması için test ve analiz sırasında karıştırıcıların sayısını en aza indirmek önemlidir. Test sırasında değişkenliği azaltmaya yardımcı olmak için, oturumlar günün aynı saatinde, aynı odada ve aynı deneylerde gerçekleşmelidir. Açık alan değerlendirmesi, tekrarlanan oturumlar9,10,11,12,23üzerinden güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir, ancak Rats üzerinde çevreye yaşam zaman ve analiz için lokomotor nöbetleri yetersiz miktarda sonuçlanan test sırasında etkinliğini azaltmak. Test sırasında hareketsizlik üstesinden gelmek için, 20 saniyeden uzun süre sabit kalan fareler, lokomotif teşvik etmek için arenanın merkezinde yer alır ve değiştirilir. Ayrıca, teşhis için işaretlenmiş test sırasında arenada bir conspecific dahil olmak üzere test sıçan lokomotor etkinliğini teşvik yardımcı olabilir. Lokomotor 'da güvenilirlik sağlamak için, tercihen kör olan iki puan, daha önce açıklandığı gibi analizleri gerçekleştirmelidir10.
Sonuç olarak, sıçan içinde torasik omurilik hemiseksiyon yapmak ve bir açık alan arenada spontan hindekstremite lokomotor performansını değerlendirmek için yöntemleri tarif ediyoruz. Lateral hemisections yürütmek için bir prosedür tarif edildi rağmen, tekniği kolayca dorsal hemisections35gerçekleştirmek için adapte edilebilir, alternatif hemisections36,37, veya tam işlemler sendeleyerek 38 istenilen lezyon konumuna ve Supraspinal orijinli innervasyon inen kaçınılmayacak miktara bağlı olarak. Daha da önemlisi, teknik aynı zamanda kediler39,40,41 ve insan olmayan primatlar dahil olmak üzere büyük hayvan modellerinde kullanılabilir6,42 karşılaştırılabilir açıkları ile küçük arasında gözlenen ve büyük hayvanlar, hem şifa nörobiyolojik mekanizmaları ve preklinik terapötik testler için araştırma için yararlı hale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri tarafından destekleniyordu (CIHR; MOP-142288) için m. m. Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS) bir maaş Ödülü tarafından desteklenen ve A. R. B FRQS bir burs tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
