Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.
Glioblastoma é um dos cânceres humanos mais agressivos devido à extensa heterogeneidade celular e as propriedades migratórias dos hGCs. A fim de entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à migração de células glioma, a capacidade de estudar a interação entre hGCs e axônios dentro do microambiente tumoral é essencial. A fim modelar esta interação celular, nós desenvolvemos um sistema misturado da cultura que consiste em hGCs e em gânglios dorsais da raiz (DRG) co-culturas do axon-oligodendrocyte. As culturas drg foram selecionadas porque podem ser isoladas de forma eficiente e podem formar as projeções longas e extensas que são ideais para estudos migratórios dessa natureza. Oligodendrócitos de rato purificados foram então adicionados em axônios drg de rato purificados e induzidos a mielinate. Depois de confirmar a formação de mielina compacta, hGCs foram finalmente adicionados à co-cultura e suas interações com axônios DRG e oligodendrócitos foi monitorado em tempo real usando microscopia time-lapse. Nessas condições, os hGCs formam estruturas agregadas semelhantes a tumores que expressam GFAP e Ki67, migram ao longo de faixas axonais mielinadas e não mielinadas e interagem com esses axônios através da formação de pseudopodia. Nosso sistema de cocultura ex vivo pode ser usado para identificar novos mecanismos celulares e moleculares da migração de hGC e poderia potencialmente ser usado para testes de eficácia in vitro de medicamentos.
Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos e letais do cérebro humano. O padrão atual de atendimento inclui ressecção cirúrgica do tumor seguida de radiação1 mais administração concomitante e adjuvante de temozolomida2. Mesmo com esta abordagem multi-terapêutica, a recorrência tumoral é inevitável3. Isto é em parte devido à natureza migratória extensiva das pilhas do tumor, que invadem o parenchyma do cérebro que cria projeções finger-like múltiplas dentro do cérebro4 que fazem a ressecção completa improvável.
Nos últimos anos, tornou-se evidente que a agressividade do glioblastoma se deve, em parte, à presença de uma população de células-tronco cancerosas dentro da massa tumoral5,6, que apresentam alto potencial migratório7,8, resistência à quimioterapia e radiação9,10 e a capacidade de formar tumores secundários11. GSCs são capazes de recapitular tumores policlonais originais quando xenoenxertou a ratos nus5.
Apesar da riqueza de conhecimentos sobre o contexto genético dos glioblastomas, os estudos sobre a migração de células glioma (GC) são atualmente prejudicados pela falta de modelos eficientes de migração in vitro ou in vivo. Notavelmente, enquanto as interações glioma célula-axonal moduladas por fatores celulares e ambientais são um componente central da invasão de glioma, ao nosso conhecimento não há atualmente nenhum sistema experimental com a capacidade de modelar essas interações12,13,14. Para resolver essa deficiência, desenvolvemos um sistema de cultura ex vivo de hGCs primários co-cultivados com axon-oligodendrócitos drg purificados que resultam em expressão elevada de marcadores tumorais diferenciados, bem como extensa migração e interação de hGCs com fibras mielinadas e não-mielinadas. Esta plataforma ex vivo, devido ao seu layout compartimentado, é adequada para testar os efeitos de novas terapêuticas sobre os padrões de migração do hGC.,
Estudos de migração para hGCs podem ser realizados usando sistemas de câmara Boyden ou ensaios de arranhões. No entanto, enquanto esses experimentos não dão qualquer informação sobre as interações das células tumorais com outros tecidos circundantes, o sistema atual pode recapitular as interações GC com fibras mielinadas e não-mielinadas. Além disso, para estudar a formação de tumores e a migração de ponto final, culturas organotípicas do cérebro de roedores ou implantação in vivo de células de gl…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por fundos internos do Departamento de Neurocirurgia, Universidade Brown para N.T.
100 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430591 | |
2.5S NGF | ENVIGO | B.5025 | |
60 mm Suspension Culture Dish | Corning | 430589 | |
ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher | A1049201 | |
Ammonium Hydroxide Solution | Fisher Scientific | A669-500 | Concentrated |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | AF-100-18B | |
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec | 130-093-392 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher | 15240062 | |
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
B27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher | 12587001 | |
Bacteriological Plate | BD Falcon | 351029 | |
Biotin | Sigma | B4639 | |
BSA | Sigma | A9418 | |
Campenot Chamber | Tyler Research | CAMP-10 | |
Cell Culture Dish | Corning | 430165 | 35mm X 10mm |
Cell Strainer | BD Falcon | 352350 | 70 uM, Nylon |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | 30 uM, Nylon |
Collagenase/Dispase | Roche | 11097113001 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
D-Glucose | Sigma | G5146 | |
DMEM | Thermo Fisher | 10313021 | |
DNase I | Sigma | D7291 | |
Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5045 | |
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat | |||
EBSS | Sigma | E7510 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
FBS | Hyclone | SH30070.02 | |
FUDR | Sigma | F0503 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher | 11765054 | |
HBSS | Thermo Fisher | 14175095 | |
Hemostatic Forceps | Roboz | RS-7035 | |
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS | Stem Cell Technologies | 07980 | |
Hypodermic Needle, 18G | BD | 511097 | |
Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher | 41400045 | |
L-Cysteine | Sigma | C7477 | |
L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MEM | Thermo Fisher | 1190081 | |
Mg2SO4 | Sigma | M2643 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
MS Columns plus tubes | Miltenyi Biotec | 130-041-301 | |
NAC | Sigma | A8199 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher | 10888022 | |
Ordinary forceps | |||
P2 Sprague Dawley Rat Pups | |||
Papain | Worthington | LS003126 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140148 | |
Pin Rake | Tyler Research | CAMP-PR | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | A1110501 | |
Syrine Grease Applicator | Tyler Research | CAMP-GLSS | |
Transferrin | Sigma | T2036 | |
Uridine | Sigma | U3003 |