Summary

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Published: December 13, 2019
doi:

Summary

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Abstract

Glioblastoma é um dos cânceres humanos mais agressivos devido à extensa heterogeneidade celular e as propriedades migratórias dos hGCs. A fim de entender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à migração de células glioma, a capacidade de estudar a interação entre hGCs e axônios dentro do microambiente tumoral é essencial. A fim modelar esta interação celular, nós desenvolvemos um sistema misturado da cultura que consiste em hGCs e em gânglios dorsais da raiz (DRG) co-culturas do axon-oligodendrocyte. As culturas drg foram selecionadas porque podem ser isoladas de forma eficiente e podem formar as projeções longas e extensas que são ideais para estudos migratórios dessa natureza. Oligodendrócitos de rato purificados foram então adicionados em axônios drg de rato purificados e induzidos a mielinate. Depois de confirmar a formação de mielina compacta, hGCs foram finalmente adicionados à co-cultura e suas interações com axônios DRG e oligodendrócitos foi monitorado em tempo real usando microscopia time-lapse. Nessas condições, os hGCs formam estruturas agregadas semelhantes a tumores que expressam GFAP e Ki67, migram ao longo de faixas axonais mielinadas e não mielinadas e interagem com esses axônios através da formação de pseudopodia. Nosso sistema de cocultura ex vivo pode ser usado para identificar novos mecanismos celulares e moleculares da migração de hGC e poderia potencialmente ser usado para testes de eficácia in vitro de medicamentos.

Introduction

Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos e letais do cérebro humano. O padrão atual de atendimento inclui ressecção cirúrgica do tumor seguida de radiação1 mais administração concomitante e adjuvante de temozolomida2. Mesmo com esta abordagem multi-terapêutica, a recorrência tumoral é inevitável3. Isto é em parte devido à natureza migratória extensiva das pilhas do tumor, que invadem o parenchyma do cérebro que cria projeções finger-like múltiplas dentro do cérebro4 que fazem a ressecção completa improvável.

Nos últimos anos, tornou-se evidente que a agressividade do glioblastoma se deve, em parte, à presença de uma população de células-tronco cancerosas dentro da massa tumoral5,6, que apresentam alto potencial migratório7,8, resistência à quimioterapia e radiação9,10 e a capacidade de formar tumores secundários11. GSCs são capazes de recapitular tumores policlonais originais quando xenoenxertou a ratos nus5.

Apesar da riqueza de conhecimentos sobre o contexto genético dos glioblastomas, os estudos sobre a migração de células glioma (GC) são atualmente prejudicados pela falta de modelos eficientes de migração in vitro ou in vivo. Notavelmente, enquanto as interações glioma célula-axonal moduladas por fatores celulares e ambientais são um componente central da invasão de glioma, ao nosso conhecimento não há atualmente nenhum sistema experimental com a capacidade de modelar essas interações12,13,14. Para resolver essa deficiência, desenvolvemos um sistema de cultura ex vivo de hGCs primários co-cultivados com axon-oligodendrócitos drg purificados que resultam em expressão elevada de marcadores tumorais diferenciados, bem como extensa migração e interação de hGCs com fibras mielinadas e não-mielinadas. Esta plataforma ex vivo, devido ao seu layout compartimentado, é adequada para testar os efeitos de novas terapêuticas sobre os padrões de migração do hGC.,

Protocol

Os protocolos de coleta, isolamento e propagação de células de glioma humanas derivadas do paciente foram aprovados pelo comitê do IRB do Rhode Island Hospital. Todos os animais foram mantidos de acordo com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os protocolos de uso animal foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee do Rhode Island Hospital. 1. Media e preparações tampão Prepare 50 mL of Neurosphere Media: 1x Neuronal basal mediu…

Representative Results

Para estudar a interação de hGCs com axônios, geramos axônios drg purificados como descrito anteriormente15,16,17,18. Esses axônios drg purificados foram então semeados com hGCs, que formaram estruturas semelhantes a tumores GFAP+/Ki67+ integradas dentro da rede axonal, enquanto hGCs individuais migraram em associação ou entre os axônios (Figura 2). Para determinar com…

Discussion

Estudos de migração para hGCs podem ser realizados usando sistemas de câmara Boyden ou ensaios de arranhões. No entanto, enquanto esses experimentos não dão qualquer informação sobre as interações das células tumorais com outros tecidos circundantes, o sistema atual pode recapitular as interações GC com fibras mielinadas e não-mielinadas. Além disso, para estudar a formação de tumores e a migração de ponto final, culturas organotípicas do cérebro de roedores ou implantação in vivo de células de gl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por fundos internos do Departamento de Neurocirurgia, Universidade Brown para N.T.

Materials

100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

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Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

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