Summary
نحن نصف بالتفصيل نموذج ورم سرطان القولون والمستقيم (CRLM) تأثير إعادة إقفاريالكبد (I/R) في نمو الورم والانبثاث. هذا النموذج يمكن أن تساعد على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء الجراحة الناجمة عن تعزيز نمو الكبد النقيلي.
Abstract
لا يزال نقص تروية الكبد وإصابة التسريب (I/R)، وهو تحد سريري شائع، عملية باثوفسيولوجية لا مفر منها وقد ثبت أنها تسبب تلفًا متعددًا في الأنسجة والأعضاء. وعلى الرغم من أوجه التقدم الأخيرة والنهج العلاجية، ظلت الاعتلالات العامة غير مرضية خاصة في المرضى الذين يعانون من تشوهات في البُرَيِّة الكامنة. في سياق نمو السرطان العدواني وورم خبيث، يشتبه في أن الإدخال/الإعادة إلى الدخول الجراحي هو المروج الذي ينظم تكرار الورم. تهدف هذه المقالة إلى وصف نموذج المورين ذات الصلة سريريا من الكبد I / R وورم الكبد القولون والمستقيم. في القيام بذلك, ونحن نهدف إلى مساعدة المحققين الآخرين في إنشاء واتقان هذا النموذج لممارسة البحوث الروتينية لفهم أفضل لآثار الكبد I/ R على تعزيز الانبثاث الكبد.
Introduction
الكبد هو واحد من المواقع الأكثر شيوعا لتطوير المرض النقيلي1. الوفيات هي دائما تقريبا تعزى إلى المضاعفات المرتبطة بنمو الورم في الكبد. في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة النقيلية في الكبد، لا تزال الجراحة تدخلًا حاسمًا لمكافحة المرض والنهج العلاجي المحتمل. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من المرضى موجودة في نهاية المطاف مع المرض المتكرر، في الغالب في الكبد2،3. خلال الجراحة الكبدية، النزيف أثناء الجراحة شائع، وغالباً ما يتطلب نقل الدم والنهج التقنية المختلفة للسيطرة على النزيف، بما في ذلك أساليب لقط الأوعية الدموية. ومع ذلك، تسبب هذه التدابير نقص التروية الكبدية / التسريب (I/R) إلى أنسجة الكبد. وقد تم توثيق الآثار السلبية للآي /ر على وظيفة الخلايا الكبدية بشكل جيد. الكبد I / R إهانة يشعل الشلالات الالتهابية أثناء استعادة تدفق الدم عن طريق مسارات التهابية4. ليس فقط إصابة الكبد I / R تسهم في فشل الكبد، ولكن الأدلة الحالية تبين أيضا أن إصابة الآي / ر يحفز التصاق الخلايا السرطانية، ويعزز حدوث تشكيل الانبثاث ونمو مرض micrometastatic القائمة5. وقد سبق لنا أن أبلغنا أن الإجهاد الجراحي يحفز تنشيط الخلايا المناعية التي لا تساعد فقط في نمو الورم الأولي، ولكن أيضا يسهل الانبثاث عن طريق التقاط الخلايا السرطانية داخل الدورة الدموية6.
هنا نقوم بوصف بالتفصيل تقنية لإنشاء نموذج ورم الماوس ورم ورم الانبثاث الكبدي. في هذا النموذج، ونحن نقدم أيضا طريقة للحث على إصابة نقص التروية الكبدية التي تعمل كبديل للإجهاد الجراحي الحالي سريريا خلال استئصال الكبد. الطرق مجتمعة من حقن السرطان والكبد I / R يمكن أن تفسر بنجاح تطور CRLM في المرضى الذين خضعوا لاستئصال الورم الأولي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتم الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها وتلتزم بالمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). تم تعقيم الأدوات المستخدمة في أي إجراء جراحي تماما.
1- الإعداد الأولي
- قبل حقن الخلايا السرطانية في طحال الماوس، الأوتوكلاف وتعقيم جميع الأدوات لاستخدامها أثناء الإجراء.
- تعقيم و / أو الأوتوكلاف وسادة التدفئة، والقفازات الجراحية، والشاش، أزواج من مقص، المشابك الصغيرة، المتوسع السفينة، ملقط الجراحية، وحامل إبرة.
- إعداد مسكن ما بعد الجراحة (0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين) ليتم إدارتها بعد استئصال الطحال وكل 12 ساعة لمدة 2 أيام.
2. خلية ثقافة
- تأكد من خلو الخلايا السرطانية من تلوث الميكوزال باستخدام مجموعة الـ ELISA من الميكوزلا.
- إعداد حل 500 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تربية المتوسطة في 4 درجة مئوية لثقافة الخلايا السرطانية القولون والمستقيم المورين (MC38). وينبغي أن تستكمل وسائل الإعلام زراعة مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 100 U / مل من البنسلين، 100 ميكروغرام / مل من العقديات، 15 مل من HEPES و 200 مل من L-الجلوتامين.
- الخلايا السرطانية الثقافية في قارورة خالية من DNAse وRNAse (75 سم2). احتضان ثقافة الخلية في حاضنة رطبة للخلايا/الأنسجة تحتوي على 5٪ CO 2. الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
- بمجرد أن تصل الخلايا المتكاثرة إلى الملاءمة 90-100%، يستنشق الوسائط القديمة، ويغسل الخلايا بمحلول ملحي واحد بالفوسفات (PBS) ثم يعالجها بـ 1x تريبسين (0.25%). لفصل الخلايا من القارورة.
- جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 × ز.
- يستنشق وسائل الإعلام وغسل مع 1X PBS مرتين عن طريق الطرد المركزي المتكررة.
- المضي قدما لتأكيد صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ الخلايا مع وصمة عار الأزرق تريبان (0.4٪).
- إعادة تعليق الخلايا إلى تركيز 1 × 106 خلايا / 100 درجة مئوية في 1X PBS. خلايا الأنابيب بدقة لتجنب أي كتل. الحفاظ على الخلايا السرطانية على الجليد قبل الحقن.
3. حقن الخلايا السرطانية
- تخدير الفئران الذكور 8-12 الأسبوع (C57BL6) عن طريق إدارة الكيتامين (150 ملغ / كغ) وxylazine (12 ملغ / كغ) داخل اكل 25 غرام (0.5 مم × 16 مم) إبرة.
- انزعي جلد البطن للفئران باستخدام كليبرز لتجنب أي عدوى بعد الجراحة.
- ضع الفئران على نظام التراجع المثبت المغناطيسي. تأكد من أن الفئران هي تماما تحت تأثير التخدير عن طريق الضغط على اصبع القدم أو الذيل.
- إضافة قطرات ملحية في العينين لتجنب الجفاف أثناء الإجراء.
- فرك بوفيدون اليود الحل (7.5٪) إلى جدار البطن الحليق لتطهير الجلد قبل إجراء شق جراحي.
- في البداية رفع الجلد مع ملقط مسننة وجعل شق خط الوسط مع مساعدة من مقص الجراحية. ثم، رفع عضلة البطن والصفاق لخلق شق خط الوسط من طول 3 سم تقريبا (منتصف البطن إلى عملية xiphoid لفضح محتويات البطن. توخي الحذر من تمديد الشق إلى ما بعد عملية xiphoid لتجنب نزيف واسع النطاق.
- ضع الهيموستات على جانبي الشق وتحت عملية xiphoid. تمديد البطن عن طريق سحب الذيل إلى أسفل والتسجيل عليه. استخدم قضيب طرف القطن المعقم 6 بوصة لفصل الطحال وتعريضه من أنسجة الدهون البنكرياسية.
- قبل الحقن في الطحال، دوامة الخلايا السرطانية لتجنب أي كتل الخلايا.
- استخدام 0.5 مل 28 G (0.36 مم × 13 مم) حقنة الأنسولين للحقن. تجنب فقاعات الهواء.
- حقن ببطء وبعناية 100 ميكرولتر من الخلايا في طرف الطحال. ضع طرف القطن وأضف ضغطًا لطيفًا لتجنب التدفق الخلفي إلى منطقة البطن. يمكن ملاحظة حقن ناجحة عن طريق تحديد التغير في لون الكبد أثناء الحقن.
- ترطيب شاش معقم مع 1X PBS ووضعها على المنطقة تشريح.
- نقل الفئران على منصة التدفئة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا السرطانية بالدوران داخل النظام.
- للمتابعة مع نقص التروية الجراحية وإصابة التسريب، اتبع الخطوات 5.3-5.10.
ملاحظة: هذا الإجراء هو لدراسة تأثير إنشاء I /R المستحثة من بؤر النقيلي.
4. استئصال الطحال
- لإجراء استئصال الطحال، استخدم جهاز الكي باليد. رفع الطحال بعناية مع ملقط على نحو سلس والكي الأوعية الدموية الطحال لتجنب النزيف المفرط. إزالة الطحال عن طريق نقل الأوعية في القسم الكي.
- بعد الإجراء مباشرة، أغلق الشق في نمط طبقة مزدوجة عن طريق خياطة طبقة العضلات أولا ثم الجلد. استخدم 4-0 غرز البولي بروبلين لكل من جدار البطن والجلد.
- قبل تكرار الإجراء على آخر الحيوان، تطهير جميع الصكوك إما رش لهم مع isopropanol 70٪ أو إدراجها في حمام حبة.
- وضع الفئران مرة أخرى في أقفاص الأصلي والبحث عن علامات الشدة والألم بعد الجراحة.
- حقن مسكن ما بعد الجراحة (بوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ) كل 12 ساعة لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.
5. إصابة نقص التروية
- في 5 أيام بعد استئصال البطن الأول، تخدير الفئران عن طريق إعطاء الكيتامين (150 ملغ / كغ) وزيلازين (12 ملغ / كغ) داخل اكلوى باستخدام 1 مل 25 غرام (0.5 مم × 16 مم) إبرة. اتبع الخطوات 3.3-3.4.
- فرك بوفيدون اليود الحل (7.5٪) على البطن حلق الماوس لتطهير الجلد وإجراء استئصال البطن خط الوسط كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.6.
- باستخدام اثنين من نصائح القطن مبللة، نقل بلطف الأمعاء من تجويف لفضح الهياكل المرتبطة بها، بما في ذلك الوريد المدخل. تشريح هلوم الكبد خالية من الأنسجة المحيطة بها.
- رفع الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى ضد الحجاب الحاجز. فصل الفص رباعي من الفص الجانبي الأيسر عن طريق تشريح الهالة الكبد مع مقص الربيع باستخدام مجهر التشغيل للسماح رؤية واضحة نحو هيكل الثلاثي المدخل.
- ضع مسحة قطنية رطبة صغيرة بين الفص المتوسط والفص الجانبي الأيمن لخلق مساحة كافية للمشبك. باستخدام ملقط ملقط توسع السفينة، تمرير بعناية 10 سم الموضوع (4.0 خياطة البولي بروبلين) لرفع ثالوث المدخل. Occlude جميع الهياكل في ثالوث المدخل (الشريان الكبدي، الوريد المدخل، والقناة الصفراوية) إلى فصوص الكبد اليسرى والمتوسطعن طريق وضع مشبك الأوعية الدموية الدقيقة باستخدام قضيب المشبك micro-serrefine مع القفل.
- إذا كانت الفصوص لا تظهر ابيضاض كبير، وإعادة تعديل المشبك عن طريق إزالة وإعادة تطبيق.
ملاحظة: إذا لم يحدث الغسل الفوري للكبد حتى بعد إعادة ضبط المشبك، فكر بعناية في ما إذا كان سيتم المضي قدماً في إدخال/إعادة النظر أم لا. - إزالة مسحة القطن الصغيرة وضعت بين الفصوص الجانبية المتوسطة واليمنى. استبدل الأمعاء بلطف في تجويف البطن. غطي جدار البطن بالشاش الرطب (المنقوع بـ 1x PBS) وغطيه بغلاف بلاستيكي لتقليل فقدان التبخر.
- وضع الماوس على لوحة التدفئة وتطبيق المشبك لمدة 60 دقيقة.
- طوال الفترة الإقفارية، ابحث عن أدلة على إصابة نقص التروية من خلال تصور الغسل الشاحب للفصوص الوسيطة اليسرى والجانبية اليسرى.
- بدء التسريب عن طريق إزالة المشابك بعد فترة 60 دقيقة.
ملاحظة: يمكن ملاحظة دليل على التسريب عن طريق تغيير فوري في لون الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى. - مباشرة بعد إعادة التسريب، أغلق الشق مع نمط خياطة طبقة مزدوجة عن طريق خياطة أولا طبقة العضلات ومن ثم الجلد. استخدم خياطة البولي بروبلين 4-0 بمساعدة حامل إبرة لإغلاق جدار البطن والجلد.
- قبل تكرار الإجراء على آخر الحيوان، تطهير جميع الصكوك إما عن طريق رش لهم مع isopropanol 70٪ أو إدراجها في حمام حبة ساخنة.
- وضع الفئران مرة أخرى في أقفاص الأصلي والبحث عن علامات الشدة والألم بعد الجراحة.
- حقن مسكن بعد الجراحة (0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين) كل 12 ساعة لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.
- بالنسبة للفئران الشام ية للكبد، قم بإجراء استئصال البطن وتشريح الهيلوم وغرز البطن.
ملاحظة: يمكن التحقيق في دور الإجهاد الجراحي الذي يؤثر على إنشاء الانبثاث الكبدي من خلال اثنين من التصاميم التجريبية المختلفة. يستخدم البروتوكول أعلاه (نموذج -1) لإنشاء مرض الكبد الميكروميتاستاتيكي ودراسة تأثير الكبد I / R على نموها (الشكل 1A). بدلا من ذلك، يمكن إجراء الكبد I / R وحقن الورم في وقت واحد (نموذج-2)لدراسة تأثير إصابة الآي / ر في إنشاء بؤر النقيلي الجديد (الشكل1B). للقيام بذلك، حقن الخلايا السرطانية في الطحال كما هو موضح أعلاه والسماح لهم بالدوران لمدة 15 دقيقة.
6- تقييم الفئران العاملة
- خلال العملية الجراحية ضمان أن الفئران تحت تأثير المرحلة الثالثة التخدير عن طريق إجراء اختبار رد الفعل بالببرال والقرنية. يجب إعطاء جرعة مخدرة إضافية على علامات ردود الفعل.
- توفير مسكن ما بعد الجراحة (بوبرينورفين 0.1mg/kg) مباشرة بعد الجراحة وكل 12h لمدة 2 أيام لتجنب الألم بعد الجراحة.
- السماح للفئران 30-60 دقيقة من وقت الانتعاش من التخدير. مراقبة الفئران باستمرار ولا تتركلهم دون مراقبة حتى الانتعاش الكامل.
- ابحث عن علامات الاستغاثة مثل الظهر الحدس، عيون مغلقة، وبطء الحركة، والفشل في العريس. علاج وفقا لذلك حتى الفئران العودة إلى نشاطها الطبيعي.
- الرعاية المرنة بما في ذلك السوائل، والحرارة، وكيل عكس Yohimbine لxylazine، وينبغي توفير الفراش لينة منشفة ورقية (لتجنب الطموح) بعد الجراحة لتحسين فترة الانتعاش.
7. تقييم إصابة نقص تروية الكبد
- مباشرة بعد تطبيق المشبك، تأكد من أن الغسل الشاحب للفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى يحدث بالمقارنة مع الفصوص الكاوية ورباعية.
- تقييم إصابة نقص تروية الكبد عن طريق قياس مستويات مصل ألانين ترانساميناز (sALT)، ومصل الترانساميناز (sAST) ومصل اللاكتات dehydrogenase (sLDH). يمكن سحب الدم من والوريد الوجه لاستخراج المصل 3-6 ح بعد بدء التسريب. إجراء الأنسجة الكبد لتحليل منطقة الورم في المئة داخل الفص الإقفاري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد خضعت جميع الفئران البرية (C57BL6) (n = 20) لنموذج الانبثاث الكبد باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه. جميع الفئران المحقونة مع أو بدون إصابة نقص التروية التسريب نجا حتى تاريخ التضحية. الرسم التخطيطي الشكل 1A من الكبد حقن السرطان يوضح لقط من ثالوث المدخل (الشريان الكبدي، الوريد المدخل، والقناة الصفراوية) الذي يحفز نقص الكبد الجزئي (70٪) إهانة نحو الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى. يمكن ملاحظة زيادة في عدد الانبثاث الكبد في غضون 2-3 أسابيع بعد إصابة نقص التروية. تم تقسيم الفئران التي تم حقنها بالخلايا السرطانية MC38 بشكل عشوائي إلى مجموعات وهمية ومجموعات I/R. كما هو مبين في الشكل 1B، خضعت المجموعة الأولى من الفئران لاستئصال الطحال بعد 15 دقيقة من حقن السرطان. أجريت جراحة نقص التروية الكبد 5 أيام بعد الحقن. يسمح هذا النموذج للخلايا السرطانية المتداولة (CCs) لإنشاء داخل الأجهزة. ويبين الشكل 2A أن الإجهاد الجراحي زاد بشكل كبير من كمية micrometastases المنشأة مسبقا داخل الكبد. خضعت المجموعة الثانية (الشكل1C)لعملية جراحية بعد 15 دقيقة من حقن السرطان. وقد تسبب التسريب عن طريق إزالة المشبك الأوعية الدموية الدقيقة 60 دقيقة بعد التطبيق. يؤدي التأثير المتزامن للإجهاد الجراحي (الشكل2B)إلى القبض على الخلايا السرطانية التي تم حقنها مؤخرًا داخل الكبد لإنشاء بؤر ميكروميتاستاتيك. هذا زيادة كبيرة في عدد العقيدات النقيلية في الكبد.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للتصميم التجريبي. (أ) الرسم التخطيطي للكبد المحقون للسرطان يوضح لقط ثالوث المدخل (الشريان الكبدي، والوريد المدخل، والقناة الصفراوية) الذي يحفز على الجزئي (70٪) الكبد إهانة نقص الكبد تجاه الفصوص الجانبية المتوسطة واليسرى. يمكن ملاحظة زيادة في عدد الانبثاث الكبد في الفصوص الإقفارية في غضون 2-3 أسابيع بعد التسريب. في البداية، تعرضت الفئران لحقن داخل الجنب من سرطان القولون والمستقيم MC38 في كل من التقاط الورم (B) ونمو الورم (C) نموذج. كما تعرضت فئران الشام لاستئصال البطن دون تطبيق المشابك الأوعية الدموية الدقيقة. بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع من الآي/آر، تم التضحية بالفئران، وتم حصاد أنسجة الكبد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور التمثيلية للفئران التي حقنت بسرطان المورين. (أ) صورة ورم الكبد التمثيلي لنموذج نمو الورم (نموذج-1) تظهر زيادة كبيرة في العقيدات الورم ية الإجمالية على سطح الكبد بعد تحفيز I/R الكبدي مقارنة بمجموعة غير I/R. (ب) وبالمثل، في وضع نموذج التقاط الورم (نموذج-2)، أظهر I/R الكبد زيادة كبيرة في العقيدات الورم 2 أسابيع بعد I / R مقارنة مع مجموعة غير I / R. *، P < 0.05. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± الانحراف المعياري. تم إجراء مقارنات المجموعة باستخدام اختبار t للطالب (n = 5/group). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويستند النموذج الحيواني الموصوف في هذه المخطوطة إلى نهجين رئيسيين. الأول هو الاعتراف بقدرة الخلايا السرطانية على توطين وانتشار في فصوص الكبد. والثاني هو دراسة تأثير إصابة نقص التروية الكبدية التي تؤثر على نمو الورم والانبثاث. يسمح هذا النموذج بالدراسة ذات الصلة من الانبثاث الكبد في غياب الانبثاث الثانوي في الماوس المناعي. والنموذج مفيد في معالجة مسائل الكفاءة النقيلية، مثل عمليات البقاء على قيد الخلية والانتشار.
في النموذج الأول، يتم حقن الخلايا السرطانية أولا ويسمح للمرض الميكروميتاستاتيكي لتشكيل. في وقت لاحق، يتم إجراء الكبد / R 5 أيام في وقت لاحق. هذا النموذج مهم عند دراسة تأثير الجراحة على مرض micrometastatic المنشأة بالفعل. على الرغم من أن التصوير قد تحسن بشكل ملحوظ في العقد الماضي، لا يزال هناك إمكانية وجود مرض ميكروميتاستاتيك التي قد لا يتم الكشف عنها عن طريق التصوير وتترك وراءها بعد استئصال الكبد المخطط لها بقصد العلاج. يتأثر هذا المرض المجهري المتبقي بالتغيرات الالتهابية المصاحبة للجراحة، وعلى وجه التحديد الكبد I/R، ويزداد النمو بشكل كبير. من ناحية أخرى, في النموذج الثاني الكبد I/R ويتم إجراء حقن الورم في نفس الوقت. يركز هذا النموذج على آثار I/R الكبد على الخلايا السرطانية المتداولة وإنشاء بؤر النقيلي الجديد. خلال جراحة الكبد ، فإن التلاعب بالورم يطلق الخلايا السرطانية في الدورة الدموية. على الرغم من أن معظم الخلايا المتداولة يتم الاعتناء بها من قبل المراقبة المناعية للمضيف، يمكن لعدد من الخلايا إنشاء بؤر خبيثة. ويهدف هذا النموذج الثاني إلى دراسة هذه الظاهرة.
النماذج الحيوانية, مثل حقن الكبد التقويمي7 وحقن الوريد الذيل8, قد لا تكون ممكنة تشريحيا لمثل هذه الدراسات. وقد تبين أن حقن الوريد الذيل عادة ما يؤدي إلى زيادة الانبثاث في الرئة مقارنة بالكبد. نموذج السرطان عن طريق الحقن تقويم الأسنان لديه خطر متزايد من إصابة الكبد التي تؤثر على البيئة الدقيقة للورم أن تنمو. كبديل لحقن الطحال من الأورام، ويمكن أيضا استخدام الوريد المدخل. وقد تم حقن الوريد البوابة نموذج النقيلي راسخة في دراسة الانبثاث الكبد9,10,11. حقن الخلايا السرطانية من خلال الوريد المدخل لا يضر إزالة الطحال مقارنة مع النموذج الموصوف أعلاه. وهذا في الواقع سوف تجنب العواقب المناعية. ومع ذلك، حقن الوريد المدخل لديه خطر متزايد من النزيف المفرط بسبب تمزق وريدي (في موقع الحقن) وتجلط الدم أثناء أو بعد تطبيق المشبك الأوعية الدموية الدقيقة في ثالوث البوابة. وتزداد هذه المخاطر بشكل كبير عندما يتم كل من حقن الورم ولقط في نفس اليوم. وقد قامت مجموعتنا بكلتا الطريقتين وحصلنا على نتائج مماثلة9و12. ونحن نعترف بأن حقن الوريد البوابة يتطلب مهارات تقنية أعلى عند القيام به في نفس الوقت كما لقط ويرتبط مع مضاعفات أعلى. كلا الأسلوبين صالحة لدراسة الانبثاث الكبد.
وهناك العديد من الجوانب الهامة التي تحتاج إلى النظر فيها قبل الإجراء بأكمله وأثناءه. يتم استئناف استخدام الخلايا السرطانية على وجه التحديد مع نفس خلفية الأنواع قبل الحقن. عدد الخلايا مهم أيضا للنظر في هذه الدراسة، كما أن عدد قليل من الخلايا قد لا تكون كافية لإكمال الدراسة في فترة قصيرة من الزمن (3 أسابيع). وينبغي تجنب زيادة عدد الخلايا السرطانية لأنها قد تسبب تأثير الانصمام مما يؤدي إلى تجلط الدم ووفاة القوارض. النموذج الموصوف في هذه المخطوطة مع تركيز الخلية من 1 × 106 هو محدد لخط الخلية MC38 وسمح لنا أن نلاحظ فرقا كبيرا في نمو الورم التي تحفزها تأثير إصابة نقص التروية الجراحية. ونحن نوصي بشدة محاولة تركيزات مختلفة من الخلايا السرطانية اعتمادا على تجربة محددة مع خط الخلية السرطان المطلوب من الاهتمام. وبالمثل، يمكن وضع العلامات على الخلايا السرطانية تكون مفيدة جدا في العديد من دراسات الانبثاث. وهذا من شأنه أن يوفر فكرة عن النسبة المئوية للخلايا القادرة على البذور والتكاثر. وعلاوة على ذلك، التطبيق السليم للمشبك المدخل للحث على إصابة نقص تروية الكبد مهم جدا في هذا النموذج. عدم القدرة على منع تدفق الدم تماما قد يؤدي إلى تأثير أقل أو لا شيء على الخلايا السرطانية. كما هو موضح في الأساليب ، من المهم التأكد من أن ابيضاض فصوص الكبد يحدث بعد تطبيق المشابك الأوعية الدموية الدقيقة. وأخيرا، تخثر الأوعية بشكل صحيح عن طريق الكي أمر بالغ الأهمية لتجنب النزيف الداخلي. في تجربتنا، وخاصة مع استخدام الكي الكهربائي، والنزيف من السرير الطحال غير شائع للغاية، وبما أننا إجراء تكرار استئصال البطن بعد 5 أيام فقط من العملية الأولى، وكمية الالتصاقات هو الحد الأدنى. ومع ذلك، إذا واجه نزيف، وهذا قد يشكل عملية ثانية أكثر صعوبة. إذا حدث نزيف بعد استئصال الطحال، قد يشير هذا إلى أن الخلايا السرطانية المتداولة قد تكون قد زرعت أيضا في تجويف العضد وبالتالي قد تؤثر على نتائج التجارب. ينصح بتوخي الحذر عند معالجة هذه المشكلة، لأنها قد تؤثر على التجارب والنتائج. يجب التفكير بعناية لتحديد ما إذا كان أو لا المضي قدما في الآي /ر في هذه الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يكشف أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح يتعلق بهذا العمل.
Acknowledgments
يشكر المؤلفات [سرا] [مينمير] وإسكندر [كمّرسي] للمراجعات لغويّة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
| Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
| Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
| 15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
| Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
| Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
| Clipper | Oster | 559A | |
| Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
| Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
| Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
| Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
References
- Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765 (2016).
- Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
- Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484 (2007).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29 (2009).
- Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).
