Summary
אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.
Abstract
איסכמיה של הכבד ו reperfusion (I/R) פציעה, אתגר קליני נפוץ, נשאר תהליך פתופסולוגי בלתי נמנע אשר הוכח לגרום לנזק רקמות מרובות איברים. למרות ההתקדמות האחרונה ואת הגישות הטיפוליות, התחלואה הכללית נותרה משביעת רצון במיוחד בחולים עם מומים מסוימים המשמשים כבסיס. בהקשר של גידול סרטן אגרסיבי גרורות, כירורגי I/R הוא חשוד להיות היזם ויסות הישנות הגידול. מאמר זה מטרתו לתאר מודל מורטין רלוונטי קלינית של כבד I/R ו גרורות בכבד המעי הגס. בלעשות זאת, אנו מכוונים לסייע לחוקרים אחרים בהקמה ושיפור מודל זה עבור מחקר שגרתיות שלהם בתחום המחקר כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של הכבד I/R על קידום גרורות בכבד.
Introduction
הכבד הוא אחד האתרים הנפוצים ביותר לפיתוח מחלה גרורתית1. התמותה כמעט תמיד המיוחס סיבוכים הקשורים לגידול בכבד. בחולים עם גידולים מוצק גרורתי בכבד, הניתוח נשאר התערבות קריטית לבקרת מחלות וגישה מרפא אפשרי. עם זאת, הרוב המכריע של חולים בסופו של דבר להציג עם מחלה חוזרות, בעיקר בכבד2,3. במהלך ניתוח הכבד, דימום פנימי הוא נפוץ, לעתים קרובות המחייב עירוי דם וגישות טכניות שונות לשליטה על דימום, כולל שיטות לולאה כלי דם. עם זאת, צעדים כאלה לגרום איסכמיה הכבד/reperfusion (I/R) לרקמת הכבד. תופעות לוואי של I/R על הפונקציה hepatocellular תועדו היטב. הכבד I/R העלבון מדליקה מפלים דלקתיים במהלך השיקום של זרימת הדם באמצעות מסלולים דלקתיים4. לא רק הכבד הפציעה I/R לתרום לקריסת הכבד, אבל הראיות הנוכחיות מראה גם כי פציעה I/R מעוררת הדבקה תא הגידול, ומקדמת את השכיחות של היווצרות גרורות ואת הצמיחה של מחלת המיקרוסטטי הקיים5. בעבר דיווחו כי לחץ כירורגי גורם הפעלה של תאים חיסוניים אשר לא רק מסייע בצמיחה של הגידול העיקרי, אלא גם מקלה גרורות על ידי לכידת תאים סרטניים בתוך המחזור6.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה להקמת מודל הגידול גרורות בכבד העכבר. במודל זה, אנו גם להציג שיטה לגרום איסכמיה הכבד reperfusion פציעה אשר מעשים כתחליף ללחץ כירורגי הנוכחי קלינית במהלך הניתוח. השיטות המשולבות של הזרקת סרטן הכבד I/R יכול לפרש בהצלחה את ההתפתחות של CRLM בחולים שעברו כריתת הגידול העיקרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשתמש בהנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). כלים המשמשים עבור כל הליך כירורגי היו מעוקר ביסודיות.
1. הכנה ראשונית
- לפני הזרקת תאים סרטניים לתוך הטחול העכבר, לחיטוי ולעקר את כל המכשירים כדי לשמש במהלך ההליך.
- חטא ו/או אוטוקלב כרית חימום, כפפות כירורגי, גזה, זוגות של מספריים, מלחציים קטנים, כלי הקיבול, מלקחיים כירורגי, ומחזיק מחט.
- הכינו משכך כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine) שניתן לערוך לאחר כריתת טחול ובכל 12 שעות במשך יומיים.
2. תרבית תאים
- ודא כי התאים הסרטניים חופשיים מזיהום mycoplasma באמצעות ערכה mycoplasma אליסה.
- הכנת פתרון 500 mL של מדיום הנשר של Dulbecco (DMEM) culturing בינוני ב 4 ° c עבור התרבות של תאים מורטין סרטן המעי הגס (MC38). התקשורת culturing צריך להיות שיושלם עם 10% חום העובר בלתי מופעל סרום (FBS), 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL של סטרפטומיצין, 15 מ"מ של HEPES ו 200 mM של L-גלוטמין.
- סרטן תאים סרטניים בבקבוקון DNAse-ו-RNAse-חינם (75 ס מ2). מודטת התרבות התא בתא/רקמה מחולל לחות בחממה המכילה 5% CO2. שמרו על טמפרטורה ב37 ° c.
- לאחר התאים מתרבים להגיע 90-100% השטף, מחית את התקשורת הישנה, לשטוף תאים עם מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) ולאחר מכן לטפל בהם עם 1x טריפסין (0.25%) לנתק את התאים מהבקבוקון.
- לאסוף תאים בצינור 15 mL ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 700 x g.
- מטפי את התקשורת ושוטף עם 1x PBS פעמיים על ידי חוזר צנטריפוגה.
- המשך לאשר את הכדאיות בתאים על-ידי צביעת תאים באמצעות הכתם הכחול (0.4%).
- השהה את התאים מחדש לריכוז של 1 x 106 תאים/100 μl ב-1X PBS. התאים pipet ביסודיות כדי למנוע כל הגושים. לשמור על תאים סרטניים על קרח לפני ההזרקה.
3. הזרקת תאים סרטניים
- מתחת לגיל 8 – 12-שבוע בן זכר (C57BL6) עכברים על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט.
- לגלח את עור הבטן של העכברים באמצעות הקוצץ כדי למנוע זיהומים לאחר הניתוח.
- הניחו עכברים במערכת הנסיגה המגנטית. ודא כי העכברים הם לגמרי תחת השפעת ההרדמה על ידי צובט אצבע או זנב.
- הוסף טיפות מלוחים לתוך העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.
- ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) לקיר הבטן מגולח לחטא את העור לפני ביצוע חתך כירורגי.
- בתחילה להרים את העור עם מלקחיים שיניים ולעשות חתך באמצע קו בעזרת מספריים כירורגי. ואז, להרים את שריר הבטן ואת צפק ליצור חתך באמצע הדרך של כ 3 ס מ אורך (באמצע הבטן לתהליך xiphoid לחשוף את תכולת הבטן. יש להיזהר לא להאריך את החתך מעבר לתהליך xiphoid כדי למנוע דימום מעמיק.
- מניחים את הדימום בשני צידי החתך ומתחת לתהליך xiphoid. מתחו את הבטן על ידי משיכת הזנב כלפי מטה ומקליטים אותו. השימוש המוליך 6 אינץ ' מכותנה סטרילית עצה להפריד לחשוף את הטחול מרקמת שומן הלבלב.
- לפני ההזרקה לתוך הטחול, מערבולת התאים הסרטניים כדי למנוע כל הגושים תאים.
- השתמש 0.5 mL 28 G (0.36 מ"מ x 13 מ"מ) מזרק אינסולין להזרקה. להימנע בועות אוויר.
- לאט ובזהירות להזריק 100 μL של תאים לקצה הטחול. מניחים טיפ כותנה ומוסיפים לחץ עדין כדי למנוע חזרה לתוך אזור הבטן. זריקה מוצלחת ניתן לצפות על ידי זיהוי השינוי בצבע הכבד במהלך הזריקה.
- מויסטן גזה סטרילית עם 1x PBS ומניחים אותו על שטח גזור.
- להעביר את העכברים על משטח חימום עבור 15 דקות כדי לאפשר לתאי סרטן לזרום בתוך המערכת.
- כדי להמשיך עם איסכמיה כירורגית פציעה reperfusion, בצע את השלבים 5.3-5.10.
הערה: הליך זה הוא ללמוד את ההשפעה של הקמת I/R המושרה של foci גרורתי.
4. כריתת טחול
- , כדי לבצע כריתת טחול. השתמש במכשיר הקאטרי שמוחזק ביד הרם בזהירות את הטחול עם מלקחיים חלקים וצרוב את כלי הדם בטחול כדי למנוע דימום מופרז. להסיר את הטחול על ידי הסטת הכלים בסעיף הצרוב.
- מיד לאחר ההליך, לסגור את החתך בתבנית שכבה כפולה על ידי הראשון שכבת שריר ולאחר מכן את העור. השתמש בתפרים 4-0 פוליפרופילן לקיר הבטן ולעור.
- לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים.
- מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
- הזרקת כאבים שלאחר הניתוח (בופרימטין 0.1 מ"ג/ק"ג) כל 12 שעות במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.
5. איסכמיה reperfusion פציעה
- ב 5 ימים לאחר כריתת האונה הראשונה, העכברים מורדם על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט. בצע את השלבים 3.3 – 3.4.
- ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) על הבטן מגולח של העכבר כדי לחטא את העור ולבצע כריתת באמצע הדרך כמתואר לעיל בשלב 3.6.
- באמצעות שתי עצות כותנה לחלח, הזיזו בעדינות את המעיים מהחלל כדי לחשוף את המבנים המשויכים, כולל הווריד השער. . לנתח את הכבד מרקמת הסביבה
- הרם את האונות הצדדיים שמאל נגד הסרעפת. הפרד את האונה מרובע האונה השמאלית על ידי מנתח את hilum הכבד עם מספריים האביב באמצעות מיקרוסקופ הפעלה כדי לאפשר ניראות ברורה לכיוון המבנה שילוש הפורטל.
- מניחים משטח כותנה קטן לחות בין האונה החציוני והאונה הצדדית הימנית כדי ליצור מקום מספיק להדית. באמצעות מלקחיים כלי הקיבול, בזהירות לעבור את 10 ס מ חוט (4.0 פוליפרופילן תפר) כדי להרים את שילוש הפורטל. סגר את כל המבנים שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, ואת צינור המרה) לאונות הכבד החציוני שמאל על ידי הצבת מהדק מיקרוכלי דם באמצעות מיקרו-serrefine המוליך מהדק עם נעל.
- אם האונות לא להראות שחיקת משמעותי, לקרוא רק את המלחציים על ידי הסרת והחלה.
הערה: אם הקושי המיידי של הכבד אינו מתרחש גם לאחר הקראת התפס, שקול בזהירות אם להמשיך עם ה-I/R. - להסיר את הספוגית כותנה קטנה ממוקם בין האונות לרוחב החציוני הימני. החליפו בעדינות את המעיים בחלל הבטן. לכסות את קיר הבטן עם גזה לח (ספוגה עם 1x PBS) ולכסות עם עטיפת פלסטיק כדי למזער את אובדן הסלע העצמי.
- מניחים את העכבר על כרית החימום ומחילים את המלחציים לתקופה של 60 דקות.
- במהלך מרווח האיסכמי, מחפשים ראיות של פציעה איסכמיה על ידי המחשה של החיוור האמצעי של ימין המדיאלי הימני האמצעי ואת האונות הצדדיים.
- התחל reperfusion על ידי הסרת התפסים לאחר 60 דקות.
הערה: ראיות של reperfusion ניתן לצפות על ידי שינוי צבע מיידי של האונות הרוחבי השמאלית לרוחב. - מיד לאחר reperfusion, לסגור את החתך עם דפוס כפול תפר על ידי הראשון תפירה את שכבת השריר ולאחר מכן את העור. השימוש 4-0 פוליפרופילן תפר בעזרת מחזיק מחט לסגור את קיר הבטן ואת העור.
- לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים מחומם.
- מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
- להזריק כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק ג של buprenorphine) כל 12 h במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.
- עבור עכברים בעלי/R בעלי הכבד, בצע ניתוח לפני, היליום ותפרים בבטן.
הערה: התפקיד של לחץ כירורגי המשפיעים על הקמתה של גרורות בכבד ניתן לחקור באמצעות שני עיצובים ניסיוניים שונים. הפרוטוקול הנ ל (דגם -1) משמש להקמת מחלת כבד מיקרומטר וללמוד את ההשפעה של הכבד I/R על התפתחותם (איור 1a). לחילופין, הכבד I/R והזרקת הגידול ניתן לבצע במקביל (דגם -2) כדי ללמוד את ההשפעה של פציעה I/R בהקמת וקדי גרורתי חדש (איור 1b). כדי לעשות זאת, להזריק תאים סרטניים לתוך הטחול כמתואר לעיל ולאפשר להם להסתובב עבור 15 דקות. לבצע ניתוח I/R הכבד או לאחר תקופת המחזור עבור 60 דקות. בצע כריתת טחול לרוחב 60 דקות מאוחר יותר, ולאחר מכן לסגור את החתך לתוך האונה.
6. הערכת עכברים מופעלים
- במהלך ההליך הכירורגי להבטיח כי העכברים נמצאים תחת השפעת הרדמה בשלב III על ידי ביצוע בדיקת רפלקס palpebral והקרנית. מינון נוסף של הרדמה חייב להינתן על סימני רפלקסים.
- לספק כאבים שלאחר הניתוח (Buprenorphine 0.1 מ"ג/ק"ג) מיד לאחר הניתוח וכל 12h במשך יומיים כדי למנוע כאבים פוסט כירורגי.
- אפשר לעכברים 30 – 60 דקות של זמן ההחלמה מהרדמה. כל הזמן לפקח על עכברים ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד התאוששות מלאה.
- חפשו סימני מצוקה כגון: גב מסוגר, עיניים עצומות, תנועה איטית וכישלון החתן. התייחס בהתאם עד שעכברים יחזרו לפעילותם הרגילה.
- טיפול מספק כולל נוזלים, חום, Yo, היפוך הסוכן מאפשר xylazine, נייר רך מגבת מצעים (כדי למנוע שאיפה) צריך להינתן לאחר הניתוח כדי לשפר את תקופת ההחלמה.
7. הערכה של איסכמיה של הכבד reperfusion פציעה
- מיד לאחר החלת המלחציים, לוודא את הציפוי החיוור של החציון ואת האונות לרוחב השמאלי מתרחשת לעומת מזונבת ואת האונות לבני.
- הערכת פגיעה איסכמיה של הכבד על ידי מדידת סרום אלטין טרנסאמיאז (מלח), סרום אספאנאז (sAST) ו סרום לקטט דהידרוגנאז (sLDH) רמות. הדם יכול להיגרר מווריד הפנים כדי לחלץ סרום 3 – 6 h לאחר החניכה של reperfusion. לבצע היסטולוגיה הכבד כדי לנתח את האזור הגידול אחוז בתוך האונה האיסכמי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כל סוג wildtype C57BL6) עכברים (n = 20) היו חשופים המודל גרורות בכבד באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. כל העכברים המוזרקים עם או ללא פציעה reperfusion איסכמיה שרדו עד לתאריך ההקרבה. התרשים הסכמטי באיור 1A של הכבד מוזרק סרטן ממחיש את הפקקת של שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, וצינור המרה) אשר משרה איסכמי כבד חלקי (70%) עלבון כלפי החציון והאונות הרוחבי השמאלית. גידול במספר גרורות בכבד ניתן להבחין בתוך 2-3 שבועות שלאחר איסכמיה reperfusion פציעה. עכברים שהוחדרו עם תאים MC38 סרטניים חולקו באופן אקראי לקבוצות בעלי/R. כפי שמוצג באיור 1B, הקבוצה הראשונה של העכברים עברו כריתת טחול 15 דקות לאחר הזרקת הסרטן. איסכמיה של הכבד reperfusion ניתוח בוצע 5 ימים לאחר ההזרקה. מודל זה מאפשר את התאים הסרטניים במחזור (סמ ק) כדי להקים בתוך האיברים. איור 2A מראה כי הלחץ הכירורגי הגביר באופן משמעותי את כמות הmicrometastases מראש בתוך הכבד. הקבוצה השנייה (איור 1C) עברה כירורגית I/R 15 דקות לאחר הזרקת הסרטן. Reperfusion הנגרמת על ידי הסרת מהדק מיקרוכלי דם 60 דקות לאחר היישום. ההשפעה הזמנית של הלחץ כירורגי מוביל (איור 2B) ללכידת תאים סרטניים לאחרונה מוזרק בתוך הכבד הקמת מיקרוסטטי foci. זה הגביר באופן משמעותי את מספר גושים גרורתי בכבד.
איור 1: ייצוג סכמטי של התכנון הניסיוני. (א) התרשים הסכמטי של הכבד מוזרק סרטן ממחיש את הדאתה של שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, וצינור המרה) אשר משרה חלקי (70%) איסכמי כבד להעליב כלפי חציון האונות הצדדיים שמאל. גידול במספר גרורות בכבד ניתן לצפות האונות איסכמי בתוך 2-3 שבועות לאחר reperfusion. בתחילה, עכברים היו חשופים הזרקה תוך הטחול של סרטן המעי הגס MC38 הן לכידת הגידול (ב) ואת גידול בצמיחה (C) מודל. עכברים גם היו חשופים לניתוח לפני הניתוח ללא הגשת מלחציים מיקרוכלי דם. שניים-שלושה שבועות אחרי ההאני/ר, עכברים הוקרבו, ורקמת הכבד נקצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של עכברים שהוחדרו עם סרטן מורין. (A) הכבד הנציג גרורות תמונה של מודל גידול הגידול (דגם -1) מראה עלייה משמעותית גושים הגידול הגולמי על פני השטח של הכבד לאחר גרימת הכבד I/r לעומת קבוצה לא-I/r. (ב) באופן דומה, בקביעת מודל לכידת הגידול (דגם -2), הכבד I/r הראה עלייה משמעותית גושים בגידול 2 שבועות לאחר I/r לעומת קבוצה לא-I/r. *, P < 0.05. התוצאות מתבטאות בתור סטיית התקן הממוצע ±. השוואות קבוצתיות בוצעו באמצעות מבחן t של הסטודנט (n = 5/קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל החי המתואר בכתב יד זה מתבסס על שתי גישות עיקריות. הראשון הוא להכיר את היכולת של תאים סרטניים לוקליזציה ומתרבים באונות הכבד. השני הוא ללמוד את ההשפעה של איסכמיה הכבד reperfusion פציעה השפעה על צמיחת הגידול גרורות. מודל זה מתיר את המחקר הרלוונטי של גרורות בכבד בהעדר גרורות משניות בעכבר חיסוני. המודל שימושי לטיפול בשאלות של יעילות גרורתית, כגון הישרדות והתפשטות תאים.
במודל הראשון, התאים הסרטניים מוזרק ראשון ו-micrometastatic מחלה מותר לטופס. לאחר מכן, מבוצע מבצע בכבד I/R 5 ימים לאחר מכן. מודל זה חשוב כאשר לומד את ההשפעה של ניתוח על מחלת מיקרוסטטי כבר הוקמה. למרות הדמיה השתפר באופן משמעותי בעשור האחרון, יש עדיין את האפשרות של נוכחות של מחלות micrometastatic כי לא ניתן לזהות על ידי הדמיה והוא נשאר מאחור לאחר כריתת כבד מתוכננת עם כוונה של ריפוי. מחלה שיורית זו מושפעת מהשינויים הדלקתיים הנלווים לניתוח, במיוחד בכבד שאני/R, והגדילה גדלה באופן אקספוננציאלי. מצד שני, בכבד מודל השני I/R והזרקת הגידול מבוצעים באותו זמן. מודל זה מתמקד בהשפעות של הכבד I/R על מחזורי תאים סרטניים והקמת foci גרורתי חדש. במהלך ניתוח הכבד, מניפולציה של הגידול משחרר את תאי הגידול לתוך המחזור. למרות שרוב התאים במחזור הם טיפל על ידי מעקב החיסונית של המארח, מספר תאים יכולים ליצור foci גרורתי. הדגם השני מיועד לחקר תופעה זו.
מודלים בעלי חיים, כגון הזרקת הכבד אורתוטופית7 והזרקת הזנב8, לא יכול להיות מבחינה אנטומית עבור מחקרים כאלה. הוכח כי הזרקת וריד הזנב בדרך כלל גורמת גרורות מוגברת של הריאה בהשוואה לכבד. המודל סרטן אורתולמריחה על הגוף יש סיכון מוגבר של פציעה בכבד השפעה על מיקרוסביבה עבור הגידול לצמוח. כחלופה הזרקת הטחול של גידולים, וריד הפורטל יכול גם להיות מנוצל. הזרקת וריד השער כבר הוקמה מודל גרורתי היטב במחקר גרורות בכבד9,10,11. ההזרקה של תאים סרטניים דרך וריד הפורטל לא להתפשר על הסרת הטחול בהשוואה למודל המתואר לעיל. זה אכן ימנע את ההשלכות החיסונית. עם זאת, הזרקת וריד הפורטל יש סיכון מוגבר של דימום מופרז עקב ורידי ורידים (באתר ההזרקה) ו פקקת במהלך או לאחר היישום של מהדק מיקרוכלי דם בטריאד הפורטל. הסיכונים הללו מוגברים באופן אקספוננציאלי כאשר הזרקת הגידול וההסדר נעשים באותו יום. הקבוצה שלנו ביצעה את שתי השיטות ואנחנו השיגו תוצאות דומות9,12. אנו מכירים כי הזרקת הווריד הפורטל דורש מיומנויות טכניות גבוהה יותר כאשר נעשה באותו זמן כמו להרטוט והוא קשור עם סיבוכים גבוהים יותר. שתי השיטות חוקיות כדי ללמוד גרורות בכבד.
ישנם היבטים חשובים רבים שצריך להיחשב לפני ובמהלך ההליך כולו. השימוש בתאים סרטניים במיוחד עם אותו רקע מינים ממליץ לפני ההזרקה. מספר התא חשוב גם לשקול במחקר זה, כמספר קטן של תאים לא יכול להיות מספיק כדי להשלים את המחקר בפרק זמן קצר (3 שבועות). הגדלת מספר התאים הסרטניים יש להימנע מאז זה עלול לגרום לאפקט התסחיף המוביל פקקת ומוות של מכרסם. המודל המתואר בכתב יד זה עם ריכוז התא של 1 x 106 הוא ספציפי לקו התא MC38 ואיפשר לנו לצפות בהבדל משמעותי בגידול הגידול מגורה על ידי השפעת איסכמיה כירורגית reperfusion פציעה. אנו ממליצים מאוד לנסות ריכוזים שונים של תאים סרטניים בהתאם לניסוי הספציפי עם קו הסרטן הרצוי התאים של העניין. באופן דומה, התוויות של תאים סרטניים יכול להיות מאוד שימושי במחקרים גרורות רבות. זה יספק רעיון לגבי אחוז התאים המסוגלים זרע ומתרבים. יתר על כן, היישום הנכון של קלאמפ הפורטל כדי לגרום לפציעה איסכמיה הכבד הוא מאוד חשוב במודל זה. חוסר יכולת לחסום לחלוטין את זרימת הדם עלול להוביל פחות או לא השפעה על התאים הסרטניים. כפי שמתואר בשיטות, חשוב לוודא כי שטיפת האונות של הכבד מתרחשת לאחר החלת מלחציים מיקרוכלי דם. לבסוף, כלי קרוש כראוי דרך הקאטרי הוא חיוני כדי למנוע דימום פנימי. בניסיון שלנו, במיוחד עם השימוש באלקטרוקבית, דימום ממיטת הטחול הוא נדיר מאוד, ומאחר שאנו מבצעים חזרה לפני הניתוח רק 5 ימים לאחר המבצע הראשון, כמות ההדיסיות היא מינימלית. עם זאת, אם נתקלת בדימום, הדבר עלול להוות פעולה קשה יותר לשניה. אם הדימום מתרחש לאחר כריתת הטחול, זה עשוי להעיד כי במחזור תאים סרטניים עשוי גם להיות מושתל בחלל הצפק ובכך עשוי להשפיע על תוצאות הניסויים. מומלץ לנקוט זהירות בעת טיפול בבעיה זו, משום שהיא עלולה להשפיע על הניסויים והתוצאות. מחשבה זהירה חייב להינתן כדי לקבוע אם להמשיך עם I/R בעכברים האלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מוסרים קונפליקטים של עניין הקשורים לעבודה זו.
Acknowledgments
המחברים מודים לשרה מינמייר ולאלכסנדר קומיצ לתיקון השפה הלשונית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
| Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
| Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
| 15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
| Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
| Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
| Clipper | Oster | 559A | |
| Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
| Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
| Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
| Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
References
- Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765 (2016).
- Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
- Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484 (2007).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29 (2009).
- Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).
