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Cancer Research

इस्कीमिया रिपरफ्यूजन चोट की स्थापना में मेटास्टैटिक लिवर ट्यूमर के Murine मॉडल

Published: August 30, 2019 doi: 10.3791/59748
Automatic Translation
1, 1
1Department of Surgery, University of Pittsburgh

Summary

हम विस्तार से एक चिकित्सकीय प्रासंगिक कोलोरेक्टल कैंसर जिगर मेटास्टेसिस (CRLM) ट्यूमर मॉडल और ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस में जिगर ischemia reperfusion के प्रभाव का वर्णन (मैं / इस मॉडल को बेहतर जिगर metastatic विकास के सर्जरी प्रेरित पदोन्नति अंतर्निहित तंत्र को समझने में मदद कर सकते हैं.

Abstract

लिवर इस्किमिया और रिफ्यूजन (आई/आर) चोट, एक आम नैदानिक चुनौती, एक अनिवार्य pathophysiological प्रक्रिया है कि कई ऊतक और अंग क्षति प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है बनी हुई है। हाल ही में प्रगति और चिकित्सीय दृष्टिकोण के बावजूद, समग्र रुग्णता विशेष रूप से अंतर्निहित पैरेन्काइमल असामान्यताओं के साथ रोगियों में असंतोषजनक बनी हुई है। आक्रामक कैंसर के विकास और मेटास्टेसिस के संदर्भ में, शल्य चिकित्सा I/R ट्यूमर पुनरावृत्ति को विनियमित करने के प्रमोटर होने का संदेह है। इस लेख का उद्देश्य यकृत I/R और कोलोरेक्टल यकृत मेटास्टेसिस के नैदानिक रूप से प्रासंगिक murine मॉडल का वर्णन करना है। ऐसा करने में, हम स्थापित करने और उनके नियमित अनुसंधान अभ्यास के लिए इस मॉडल को सही करने में अन्य जांचकर्ताओं की सहायता करने के लिए बेहतर जिगर metastases को बढ़ावा देने पर जिगर I/R के प्रभाव को समझने का लक्ष्य.

Introduction

यकृत मेटास्टैटिक रोग1के विकास के लिए सबसे आम स्थलों में से एक है . मृत्यु लगभग हमेशा जिगर में ट्यूमर के विकास के साथ जुड़े जटिलताओं के कारण है. जिगर में metastatic ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों में, सर्जरी रोग नियंत्रण और एक संभव उपचारात्मक दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण हस्तक्षेप बनी हुई है. तथापि, अधिकांश रोगी अंततः आवर्तक रोग के साथ उपस्थित होते हैं , मुख्य रूप से यकृत2,3में . यकृत सर्जरी के दौरान, intraoperative खून बह रहा है आम है, अक्सर रक्त आधान और रक्त स्रावन के नियंत्रण के लिए विभिन्न तकनीकी दृष्टिकोण की आवश्यकता, संवहनी clamping तरीकों सहित. तथापि, ऐसे उपाययकृत इस्कीमिया/रिफ्यूजन (आई/आर) यकृत ऊतक के लिए कारण होते हैं। hepatocellular समारोह पर I/R के प्रतिकूल प्रभाव अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है. जिगर मैं / आर अपमान भड़काऊ रास्ते4के माध्यम से रक्त के प्रवाह की बहाली के दौरान भड़काऊ cascades प्रज्वलित . न केवल जिगर I/R चोट जिगर की विफलता के लिए योगदान करता है, लेकिन वर्तमान सबूत भी पता चलता है कि मैं / हम पहले की सूचना दी है कि शल्य तनाव प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो न केवल प्राथमिक ट्यूमर के विकास में मदद करता है के सक्रियण लाती है, लेकिन यह भी परिसंचरण के भीतर कैंसर की कोशिकाओं पर कब्जा करके metastases की सुविधा6.

यहाँ हम विस्तार से एक तकनीक का वर्णन करने के लिए एक जिगर metastasis माउस ट्यूमर मॉडल स्थापित. इस मॉडल में, हम हेपेटिक इस्किमिया रिपरफ्यूजन चोट को प्रेरित करने के लिए एक विधि भी प्रस्तुत करते हैं जो हेपेटेक्टोमी के दौरान नैदानिक रूप से मौजूद सर्जिकल तनाव के लिए एक किराए के रूप में कार्य करता है। कैंसर इंजेक्शन और यकृत I/R के संयुक्त तरीकों को सफलतापूर्वक प्राथमिक ट्यूमर लकीर आया है, जो रोगियों में CRLM के विकास की व्याख्या कर सकते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल ों में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए जाते हैं और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों का पालन करते हैं। किसी भी शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण ों का अच्छी तरह से बंध्याकरण किया गया।

1. प्रारंभिक तैयारी

  1. माउस तिल्ली में कैंसर कोशिकाओं इंजेक्शन से पहले, autoclave और प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जा करने के लिए सभी उपकरणों बाँझ.
  2. स्टरलाइज़ और / या autoclave एक हीटिंग पैड, शल्य दस्ताने, धुंध, कैंची के जोड़े, छोटे clamps, पोत विस्फारक, शल्य संदंश, और एक सुई धारक.
  3. स्प्लेनेक्टॉमी के बाद और 2 दिनों के लिए हर 12 एच के बाद ऑपरेटिव एनाल्जेसिक (0.1 मिलीग्राम/किलोग्राम ब्यूप्रेनोर्फिन) तैयार करें।

2. सेल संस्कृति

  1. सुनिश्चित करें कि कैंसर कोशिकाओं को एक माइकोप्लाज्मा एलिसा किट का उपयोग करके माइकोप्लाज्मा संदूषण से मुक्त हैं।
  2. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के एक 500 एमएल समाधान तैयार murine कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं (MC38) की संस्कृति के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम culturing. culturing मीडिया के साथ पूरक किया जाना चाहिए 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन के 100 U/mL, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 डिग्री/
  3. एक DNAse में संस्कृति कैंसर कोशिकाओं- और RNAse मुक्त फ्लास्क (75 सेमी2). 5% सीओ2वाले सेल/ऊतक आर्द्र इनक्यूबीकृत इनक्यूबेटर में कोशिका संस्कृति को इनक्यूबेट करें। तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  4. एक बार proliferating कोशिकाओं 90-100% संगम तक पहुँचने, पुराने मीडिया aspirate, 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोने और फिर उन्हें 1x trypsin (0.25%) के साथ इलाज फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करना।
  5. 15 एमएल शंकु नली में कोशिकाओं को एकत्र करें और 700 x छपर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र .
  6. मीडिया को प्रेरित करें और बार-बार अपकेंद्रण द्वारा 1x पीबीएस के साथ धो एंबर।
  7. trypan नीले दाग (0.4%) के साथ कोशिकाओं को धुंधला करके सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए आगे बढ़ें।
  8. 1x पीबीएस में 1 x 106 कोशिकाओं/ 100 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता के लिए कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। किसी भी झुरमुट से बचने के लिए पाइप कोशिकाओं को अच्छी तरह से। इंजेक्शन से पहले बर्फ पर कैंसर की कोशिकाओं रखें.

3. ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्शन

  1. एनेस्थेटाइज 8-12-सप्ताह पुराने पुरुष (C57BL6) चूहों केटेमिन (150 मिलीग्राम/kg) और xylazine (12 मिलीग्राम/kg) इंट्रापरीटोनली का उपयोग करके एक 1 एमएल 25 जी (0.5 मिमी x 16 मिमी) सुई का उपयोग कर।
  2. किसी भी पश्चात संक्रमण से बचने के लिए क्लिपर का उपयोग कर चूहों के पेट की त्वचा दाढ़ी.
  3. चूहों को चुंबकीय फिक्सेटर प्रत्याकर्षण प्रणाली पर रखें। पुष्टि करें कि चूहों एक अंगुली या पूंछ pinching द्वारा संज्ञाहरण के प्रभाव के तहत पूरी तरह से कर रहे हैं.
  4. प्रक्रिया के दौरान सूखापन से बचने के लिए आंखों में नमकीन बूँदें जोड़ें।
  5. स्क्रब पॉविडोन-आयोडीन समाधान (7.5%) एक शल्य चीरा बनाने से पहले त्वचा कीटाणुरहित करने के लिए मुंडा पेट की दीवार के लिए।
  6. शुरू में दांतेदार संदंश के साथ त्वचा उठा और शल्य कैंची की मदद से एक midline चीरा बनाते हैं. फिर, लगभग 3 सेमी लंबाई के एक मिडलाइन चीरा बनाने के लिए पेट की मांसपेशियों और पेरिटोनम को उठाएं (पेट की सामग्री को उजागर करने के लिए मध्य पेट। व्यापक रक्तस्राव से बचने के लिए xiphoid प्रक्रिया से परे चीरा का विस्तार नहीं करने के लिए सावधानी बरतें।
  7. चीरा के दोनों ओर और xiphoid प्रक्रिया के तहत hemostat रखें. पूंछ को नीचे की ओर खींचकर और टेप करके पेट को बढ़ाएं। अग्नाशयी वसा ऊतक से तिल्ली को अलग और बेनकाब करने के लिए 6 इंच बाँझ कपास टिप applicator का प्रयोग करें.
  8. तिल्ली में इंजेक्शन से पहले, किसी भी सेल clumps से बचने के लिए कैंसर की कोशिकाओं भंवर.
  9. इंजेक्शन के लिए 0.5 एमएल 28 जी (0.36 मिमी x 13 मिमी) इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। हवा के बुलबुले से बचें।
  10. धीरे-धीरे और ध्यान से तिल्ली की नोक में कोशिकाओं के 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट. एक कपास टिप प्लेस और पेट क्षेत्र में backflow से बचने के लिए कोमल दबाव जोड़ें. इंजेक्शन के दौरान जिगर के रंग में परिवर्तन की पहचान करके एक सफल इंजेक्शन मनाया जा सकता है।
  11. 1x पीबीएस के साथ एक बाँझ धुंध नम और विच्छेदन क्षेत्र पर जगह है।
  12. कैंसर कोशिकाओं को सिस्टम के भीतर प्रसारित करने की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए एक हीटिंग पैड पर चूहों स्थानांतरण.
  13. सर्जिकल इस्किमिया और रिपरफ्यूजन चोट के साथ आगे बढ़ने के लिए, चरण 5-3-5.10 का पालन करें।
    नोट: इस प्रक्रिया मेटास्टैटिक foci के I/R प्रेरित स्थापना के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए है।

4. स्प्लेनेक्टॉमी

  1. एक splenectomy प्रदर्शन करने के लिए, एक हाथ से आयोजित कॉटरी डिवाइस का उपयोग करें. सावधानी से चिकनी संदंश के साथ तिल्ली उठा और अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए प्लीहा रक्त वाहिकाओं cauterize। कॉटरीकृत अनुभाग में जहाजों को ट्रांसेक्ट करके तिल्ली निकालें।
  2. प्रक्रिया के तुरंत बाद, पहले मांसपेशियों की परत और फिर त्वचा suturing द्वारा एक डबल परत पैटर्न में चीरा बंद करें. पेट की दीवार और त्वचा दोनों के लिए 4-0 पॉलीप्रोपीलीन टांके का उपयोग करें।
  3. एक और जानवर पर प्रक्रिया दोहराने से पहले, या तो उन्हें 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ छिड़काव या उन्हें एक मनका स्नान में डालने से सभी उपकरणों कीटाणुरहित.
  4. चूहों को वापस मूल पिंजरों में रखें और संकट और शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के लक्षण ों की तलाश करें।
  5. शल्य चिकित्सा के बाद दर्द से बचने के लिए 2 दिनों के लिए हर 12 एच में पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक (Buprenorphine 0.1 mg/kg) इंजेक्शन।

5. इस्किमिया रिपरफ्यूजन चोट

  1. पहले लैपरोटोमी के 5 दिनों के बाद, केटामाइन (150 मिलीग्राम/किग्रा) और जाइलेज़ीन (12 मिलीग्राम/किग्रा) इंट्रापर्टोनली का उपयोग करके चूहों को 1 एमएल 25 जी (0.5 मिमी x 16 मिमी) सुई का उपयोग करके एनेस्थेटाइज करें। 3.3-3.4 चरणों का पालन करें.
  2. स्क्रब पॉविडोन-आयोडीन समाधान (7.5%) माउस के मुंडा पेट पर त्वचा कीटाणुरहित और एक midline laparotomy प्रदर्शन के रूप में कदम 3.6 में ऊपर वर्णित है.
  3. दो गीला कपास सुझावों का उपयोग करना, धीरे गुहा से आंत ले जाने के लिए पोर्टल नस सहित जुड़े संरचनाओं का पर्दाफाश. आसपास के ऊतकों से मुक्त जिगर हिलम को दूर करें।
  4. मध्याह्न ताको को ऊपर उठाएं और डायफ्राम के विरुद्ध पार्श्व पालिको छोड़ दिया है. पोर्टल त्रय संरचना की ओर स्पष्ट दृश्यता की अनुमति देने के लिए एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वसंत कैंची के साथ जिगर hilum विच्छेदन द्वारा बाएं पार्श्व पालि से अलग।
  5. clamping के लिए पर्याप्त स्थान बनाने के लिए मध्य पालि और सही पार्श्व पालि के बीच एक छोटे से नम कपास झाड़ू प्लेस. पोत विस्फारक बलप्स का उपयोग करके, पोर्टल त्रय को उठाने के लिए ध्यान से 10 सेमी धागा (4.0 पॉलीप्रोपीलीन सीवन) पास करें। पोर्टल triad में सभी संरचनाओं occlude (हेपेटिक धमनी, पोर्टल नस, और पित्त नली) ताला के साथ एक माइक्रो-सेरेफिन क्लैम्प applicator का उपयोग कर एक माइक्रोवास्कुलर दबाना रखकर एक माइक्रोवास्कुलर क्लैम्प रखकर छोड़ दिया और मध्यम जिगर lobes करने के लिए।
  6. यदि खण्ड महत्वपूर्ण ब्लैंचिंग नहीं दिखाते हैं, तो हटाने और फिर से लागू करके क्लैम्प को फिर से समायोजित करें।
    नोट: यदि जिगर के तत्काल blanching भी clamp को पुनर्समायोजित करने के बाद नहीं होता है, ध्यान से विचार करें कि क्या या नहीं i/R के साथ आगे बढ़ना है.
  7. मध्यम और दाएँ पार्श्व पालि के बीच रखा छोटे कपास झाड़ू निकालें. आंत को धीरे से पेट की गुहा में बदलें। एक नम धुंध के साथ पेट की दीवार को कवर (1x PBS के साथ भिगो) और वाष्पीकरण हानि को कम करने के लिए एक प्लास्टिक की चादर के साथ कवर.
  8. हीटिंग पैड पर माउस प्लेस और 60 मिनट की अवधि के लिए दबाना लागू होते हैं.
  9. इस्कीमिक अंतराल के दौरान, सही मध्यस्थ और बाएं मध्यस्थ और पार्श्व लोब के पीला ब्लैंचिंग visualizing द्वारा इस्किमिया चोट के सबूत की तलाश.
  10. 60 मिनट की अवधि के बाद clamps को हटाने के द्वारा रिफ्यूजन शुरू करें।
    नोट: reperfusion के सबूत औसत और बाएँ पार्श्व lobes के एक तत्काल रंग परिवर्तन द्वारा देखा जा सकता है.
  11. रिफ्यूजन के तुरंत बाद, पहले मांसपेशियों की परत और फिर त्वचा suturing द्वारा एक डबल परत सीवन पैटर्न के साथ चीरा बंद करें। पेट की दीवार और त्वचा को बंद करने के लिए सुई धारक की मदद से 4-0 पॉलीप्रोपीलीन सीवन का उपयोग करें।
  12. एक और जानवर पर प्रक्रिया दोहराने से पहले, या तो उन्हें 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ छिड़काव या उन्हें एक गर्म मनका स्नान में डालने से सभी उपकरणों कीटाणुरहित.
  13. चूहों को वापस मूल पिंजरों में रखें और संकट और शल्य चिकित्सा के बाद दर्द के लक्षण ों की तलाश करें।
  14. इंजेक्शन पोस्ट ऑपरेटिव एनाल्जेसिक (0.1 मिलीग्राम/किलोग्राम buprenorphine) हर 12 एच के लिए 2 दिनों के लिए शल्य चिकित्सा के बाद दर्द से बचने के लिए।
  15. जिगर I/R शर्म चूहों के लिए, laparotomy प्रदर्शन, हिलम विच्छेदन और पेट टांके.
    नोट: जिगर metastases की स्थापना को प्रभावित शल्य चिकित्सा तनाव की भूमिका दो अलग प्रयोगात्मक डिजाइन के माध्यम से जांच की जा सकती है. उपर्युक्त प्रोटोकॉल (मॉडल-1) का प्रयोग माइक्रोमेटास्टैटिक यकृत रोग की स्थापना करने और उनके विकास पर यकृत I/R के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है (चित्र 1क). वैकल्पिक रूप से, जिगर I/R और ट्यूमर इंजेक्शन एक साथ प्रदर्शन किया जा सकता है (मॉडल-2) नए मेटास्टैटिक फॉसी की स्थापना में I/R चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए (चित्र 1B)। ऐसा करने के लिए, कैंसर कोशिकाओं को ऊपर वर्णित तिल्ली में इंजेक्ट करें और उन्हें 15 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें। 60 मिनट के लिए परिसंचरण अवधि के बाद यकृत I/R या शम सर्जरी करें। पार्श्व स्प्लेनेक्टॉमी 60 मिनट बाद में करें, और फिर लैपरोटोमी चीरा बंद करें।

6. संचालित चूहों का आकलन

  1. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान यह सुनिश्चित करें कि चूहों चरण III संज्ञाहरण और कॉर्निया प्रतिवर्त परीक्षण प्रदर्शन करके संज्ञाहरण के प्रभाव में हैं। अतिरिक्त संवेदनाहारी खुराक सजगता के संकेत पर दिया जाना चाहिए.
  2. सर्जरी के ठीक बाद पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक (Buprenorphine 0.1mg/kg) प्रदान करें और पोस्ट सर्जिकल दर्द से बचने के लिए 2 दिनों के लिए हर 12h।
  3. संज्ञाहरण से वसूली समय के चूहों 30-60 मिनट की अनुमति दें. लगातार चूहों की निगरानी और पूरी वसूली तक उन्हें उपेक्षित मत छोड़ो.
  4. इस तरह के hunched वापस के रूप में संकट के संकेत के लिए देखो, बंद आँखें, धीमी गति से आंदोलन, और दूल्हे के लिए विफलता. तदनुसार इलाज जब तक चूहों को अपने सामान्य गतिविधि के लिए वापस.
  5. तरल पदार्थ, गर्मी, xylazine के लिए Yohimbine उत्क्रमण एजेंट सहित आपूर्ति देखभाल, नरम कागज तौलिया बिस्तर (आकांक्षा से बचने के लिए) वसूली की अवधि में सुधार करने के लिए सर्जरी के बाद प्रदान किया जाना चाहिए.

7. जिगर ischemia reperfusion चोट का आकलन

  1. क्लैम्प लगाने के तुरंत बाद, सुनिश्चित करें कि मध्य और बाएं पार्श्व पालि का पीला ब्लैंचिंग पुच्छ और चतुष्क खण्ड ों की तुलना में होता है।
  2. सीरम ऐलेनिन ट्रांसामिनेस (एसएएलटी), सीरम एस्पार्टेट ट्रांसामिनेस (एसएसटी) और सीरम लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एसएलडीएच) के स्तर को मापने के द्वारा यकृत इस्किमिया चोट का आकलन करें। रक्त चेहरे की नस से तैयार किया जा सकता है reperfusion की दीक्षा के बाद सीरम 3-6 एच निकालने के लिए. यकृत ऊतक विज्ञान प्रदर्शन इस्कीमिक पालि के भीतर प्रतिशत ट्यूमर क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए।

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Representative Results

सभी wildtype (C57BL6) चूहों (एन $ 20) जिगर metastases मॉडल के अधीन थे ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर. सभी इंजेक्शन चूहों के साथ या बिना इस्किमिया reperfusion चोट बलिदान की तारीख तक बच गया. एक कैंसर इंजेक्शन जिगर के योजनाबद्ध आरेख चित्र 1A पोर्टल triad (हेपेटिक धमनी, पोर्टल नस, और पित्त नली) जो एक आंशिक जिगर इस्कीमिक (70%) लाती है की clamping दिखाता है मध्य और बाएँ पार्श्व पालियों के प्रति अपमान. जिगर मेटास्टेसिस की संख्या में वृद्धि 2-3 सप्ताह के भीतर देखा जा सकता है इस्किमिया रिफ्यूजन चोट के बाद. MC38 कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन चूहे बेतरतीब ढंग से शर्म और मैं / जैसा कि चित्र 1 खमें दिखाया गया है , चूहों के पहले समूह ने कैंसर इंजेक्शन के बाद 15 मिनट स्प्लेनेक्टॉमी की। लीवर इस्किमिया रिपरफ्यूजन सर्जरी इंजेक्शन के 5 दिनों के बाद किया गया था। इस मॉडल के अंगों के भीतर स्थापित करने के लिए घूम कैंसर कोशिकाओं (सीसी) की अनुमति देता है. चित्रा 2A से पता चलता है कि शल्य चिकित्सा तनाव काफी जिगर के भीतर पूर्व स्थापित micrometastases की मात्रा में वृद्धि हुई. दूसरे समूह (चित्र 1 सी) कैंसर इंजेक्शन के बाद शल्य चिकित्सा I/ रिपारफ्यूजन आवेदन के बाद माइक्रोवास्कुलर दबाना 60 मिनट को हटाने के द्वारा प्रेरित किया गया था। शल्य तनाव के समवर्ती प्रभाव की ओर जाता है (चित्र 2B) जिगर के भीतर हाल ही में इंजेक्शन कैंसर कोशिकाओं को पकड़ने के लिए एक micrometastatic foci की स्थापना. यह काफी जिगर में मेटास्टैटिक नोड्यूल की संख्या में वृद्धि हुई.

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक डिजाइन का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (ए) कैंसर इंजेक्ट किए गए यकृत का योजनाबद्ध आरेख पोर्टल ट्राइड (हेपेटिक धमनी, पोर्टल नस, और पित्त नली) के क्लैम्पिंग को दर्शाता है जो आंशिक (70%) को प्रेरित करता है जिगर मध्य और बाएँ पार्श्व lobes की ओर इस्कीमिक अपमान. जिगर मेटास्टेस की संख्या में वृद्धि reperfusion के बाद 2-3 सप्ताह के भीतर इस्कीमिक lobes में देखा जा सकता है. शुरू में, चूहों दोनों ट्यूमर पर कब्जा (बी) और ट्यूमर विकास (सी) मॉडल में MC38 कोलोरेक्टल कैंसर के intrasplenic इंजेक्शन के अधीन थे. शाम चूहों को भी microvascular clamps के आवेदन के बिना laparotomy के अधीन थे. I/R के दो-तीन सप्ताह बाद चूहों का बलिदान किया गया और यकृत ऊतक काटा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: murine कैंसर के साथ इंजेक्शन चूहों के प्रतिनिधि छवियों. (ए) एक ट्यूमर विकास मॉडल (मॉडल-1) के प्रतिनिधि जिगर मेटास्टेसिस छवि गैर-I/R समूह की तुलना में यकृत I/R को प्रेरित करने के बाद जिगर की सतह पर सकल ट्यूमर नोड्यूल में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखा। (बी) इसी प्रकार, ट्यूमर कैप्चर मॉडल (मॉडल-2) की स्थापना में, यकृत I/R ने गैर-I/R समूह की तुलना में 2 सप्ताह बाद ट्यूमर नोड्यूल में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई। *, पी एंड एलटी; 0.05. परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - मानक विचलन. समूह तुलना एँ छात्र की t परीक्षण (n ] 5/समूह) का उपयोग करके की गई थीं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित पशु मॉडल दो प्रमुख दृष्टिकोण पर आधारित है। पहले कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को पहचान करने के लिए स्थानीय और जिगर lobes में proliferate है. दूसरा ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस को प्रभावित करने वाले हेपेटिक इस्किमिया रिफ्यूजन चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए है। इस मॉडल एक प्रतिरक्षा योग्य माउस में माध्यमिक मेटास्टेसिस की अनुपस्थिति में जिगर metastases के प्रासंगिक अध्ययन की अनुमति देता है. मॉडल इस तरह के सेल अस्तित्व extravasations और प्रसार के रूप में metastatic दक्षता, के सवालों को संबोधित करने में उपयोगी है।

पहले मॉडल में, कैंसर कोशिकाओं को पहले इंजेक्शन दिया जाता है और माइक्रोमेटास्टैटिक बीमारी को बनाने की अनुमति दी जाती है। इसके बाद, जिगर I/R 5 दिन बाद किया जाता है। इस मॉडल महत्वपूर्ण है जब पहले से ही स्थापित micrometastatic रोग पर सर्जरी के प्रभाव का अध्ययन. हालांकि इमेजिंग काफी पिछले दशक में सुधार हुआ है, वहाँ अभी भी micrometastatic रोग है कि इमेजिंग द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है की उपस्थिति की संभावना है और इलाज के इरादे के साथ एक योजना बनाई जिगर लकीर के बाद पीछे छोड़ दिया है. इस अवशिष्ट सूक्ष्म रोग सर्जरी के साथ भड़काऊ परिवर्तन से प्रभावित है, विशेष रूप से जिगर मैं / दूसरी ओर, दूसरे मॉडल जिगर में मैं / इस मॉडल के घूम कैंसर कोशिकाओं पर जिगर I/R के प्रभाव और नए metastatic foci की स्थापना पर केंद्रित है. जिगर की सर्जरी के दौरान, ट्यूमर के हेरफेर परिसंचरण में ट्यूमर कोशिकाओं विज्ञप्ति. हालांकि घूम कोशिकाओं के अधिकांश मेजबान की प्रतिरक्षा निगरानी द्वारा का ख्याल रखा जाता है, कोशिकाओं की एक संख्या metastatic foci स्थापित कर सकते हैं. यह दूसरा मॉडल इस घटना का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

पशु मॉडल, जैसे ऑर्थोटोपिक लिवर इंजेक्शन7 और पूंछ नस इंजेक्शन8,ऐसे अध्ययनों के लिए शारीरिक रूप से संभव नहीं हो सकता है। यह दिखाया गया है कि पूंछ नस इंजेक्शन आमतौर पर जिगर की तुलना में फेफड़ों की वृद्धि हुई मेटास्टेसिस में परिणाम है। ऑर्थोटोपिली इंजेक्शन कैंसर मॉडल में ट्यूमर के बढ़ने के लिए माइक्रोएनवायरनमेंट को प्रभावित करने वाले यकृत की चोट का खतरा बढ़ जाता है। ट्यूमर के स्प्लेनिक इंजेक्शन के लिए एक विकल्प के रूप में, पोर्टल नस भी उपयोग किया जा सकता है. पोर्टल नस इंजेक्शन जिगर मेटास्टेसिस9,10,11के अध्ययन में एक अच्छी तरह से स्थापित मेटास्टैटिक मॉडल रहा है। पोर्टल नस के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन ऊपर वर्णित मॉडल की तुलना में तिल्ली को हटाने से समझौता नहीं करता है। यह वास्तव में प्रतिरक्षा परिणामों से बचना होगा. हालांकि, पोर्टल नस इंजेक्शन के दौरान या पोर्टल triad पर microvascular दबाना के आवेदन के बाद अत्यधिक रक्तस्राव कारण शिरापरक फाड़ (इंजेक्शन के स्थल पर) और घनास्त्रता का खतरा बढ़ गया है। इन जोखिमों को तेजी से बढ़ रहे हैं जब दोनों ट्यूमर इंजेक्शन और clamping एक ही दिन पर किया जाता है. हमारे समूह ने दोनों विधियों का प्रदर्शन किया है और हमने इसी प्रकार के परिणाम प्राप्त किएहैं. हम स्वीकार करते हैं कि पोर्टल नस इंजेक्शन उच्च तकनीकी कौशल की मांग जब clamping के रूप में एक ही समय में किया है और उच्च जटिलताओं के साथ जुड़ा हुआ है. दोनों तरीकों जिगर metastases का अध्ययन करने के लिए मान्य हैं.

वहाँ कई महत्वपूर्ण पहलुओं है कि पहले और पूरी प्रक्रिया के दौरान विचार करने की आवश्यकता है. एक ही प्रजाति पृष्ठभूमि के साथ विशेष रूप से कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग इंजेक्शन से पहले recommenced है. सेल संख्या भी इस अध्ययन में विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में कोशिकाओं की छोटी संख्या समय की एक छोटी अवधि में अध्ययन पूरा करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है (3 सप्ताह). कैंसर कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह एक एम्बोलिज्म प्रभाव का कारण बन सकता है जिससे घनास्त्रता और कृंतक की मौत हो सकती है। 1 x 106 की सेल एकाग्रता के साथ इस पांडुलिपि में वर्णित मॉडल MC38 सेल लाइन के लिए विशिष्ट है और हमें शल्य इस्किमिया reperfusion चोट के प्रभाव से प्रेरित ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण अंतर का निरीक्षण करने की अनुमति दी है. हम अत्यधिक ब्याज की वांछित कैंसर सेल लाइन के साथ विशिष्ट प्रयोग के आधार पर कैंसर की कोशिकाओं के विभिन्न सांद्रता की कोशिश कर की सिफारिश. इसी तरह, कैंसर कोशिकाओं की लेबलिंग कई मेटास्टेसिस अध्ययनों में बहुत उपयोगी हो सकती है। यह कोशिकाओं है कि बीज और proliferate करने में सक्षम हैं के प्रतिशत के बारे में एक विचार प्रदान करेगा. इसके अलावा, हेपेटिक इस्किमिया चोट प्रेरित करने के लिए पोर्टल क्लैम्प का उचित आवेदन इस मॉडल में बहुत महत्वपूर्ण है। पूरी तरह से रक्त प्रवाह को ब्लॉक करने में असमर्थता कैंसर कोशिकाओं पर कम या कोई प्रभाव नहीं हो सकता है. के रूप में तरीकों में वर्णित है, यह सुनिश्चित करें कि जिगर lobes के blanching microvascular clamps लागू करने के बाद होता है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है. अंत में, आंतरिक रक्तस्राव से बचने के लिए उचित रूप से काउटरी के माध्यम से जहाजों को जमाव करना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, विशेष रूप से इलेक्ट्रोकाउटरी के उपयोग के साथ, प्लीहा बिस्तर से खून बह रहा है बेहद असामान्य है और जब से हम पहले ऑपरेशन के केवल 5 दिनों के बाद एक दोहराने laparotomy प्रदर्शन, आसंजन की मात्रा कम से कम है। हालांकि, अगर खून बह रहा है, यह एक और अधिक कठिन दूसरा ऑपरेशन पैदा हो सकता है. यदि खून बह रहा splenectomy के बाद होता है, यह संकेत हो सकता है कि घूम कैंसर कोशिकाओं को भी peritoneal गुहा में प्रत्यारोपित किया है और इस तरह प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है हो सकता है. इस समस्या को प्रबंधित करते समय सावधानी का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है, क्योंकि यह प्रयोगों और परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इन चूहों में आई/आर के साथ आगे बढ़ना है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए सावधानी से सोचा जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखक इस काम से संबंधित हितों के कोई संघर्ष का खुलासा करते हैं।

Acknowledgments

लेखक भाषाई संशोधन के लिए सारा Minemyer और अलेक्जेंडर Comerci धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Lonza 12-614F
Fetal Bovine Serum Lonza 900-108
L-Glutamin Gibco 25030-081
Penicilin Fisher scientific 15-140-122
Stretomysin Fisher scientific 15-140-122
HEPES Fisher Scientific SH3023701
Trypsin Hyclone sh30042.02
Cell culture Flask 75cm 5 Cells Star 658170
15ml PP Conical Tubes BioExcell 41021037
Trypan Blue Stain Giibco 15250-061
Gauze Fisherbrand 1376152
Cautry Bovie AA01
Microvascular clamp Finescience tools 18055-03
Micro-Serrefine clamp applicator with lock Fine science toosl FST-18056-14
Spring scissor Fine science toosl FST-15021-15
Vessel Dilator Fine science toosl FST-00276-13
Magnetic fixator Retraction system Fine science toosl FST-18200020
Micro-Adson Forceps Fine science toosl FST-11019-12
Micro-Adson Forceps Fine science toosl FST-11018-12
4-0 polypropylene suture Ethicon K881H
Needle holder Harvard Apparatus 72-8826
Heating Pad Fisher scientific 1443915
Clipper Oster 559A
Povidone-Iodine solution Medline MDS093945
Syringe 1ml 25G BD safety Glide 305903
Insulin syringe 0.5 ml BD insulin Syringes 32946
Cotton -Tipped Applicator Fisher Scientific 23-400-101
Surgical Microscope Leica LR92240
Mycoplasma Elisa Kit Roche 11663925910
Ketamine Putney #056344
Xylazine NADA #139-236
ALT strip Heska 15809554
AST strip Heska 15809542
LDH strip Heska 15809607

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 जिगर मेटास्टेसिस जिगर इस्कीमिया-रिपरफ्यूजन लैपरोटोमी स्प्लेनेक्टॉमी murine कोलोरेक्टल कैंसर यकृत चोट माउस मॉडल
इस्कीमिया रिपरफ्यूजन चोट की स्थापना में मेटास्टैटिक लिवर ट्यूमर के Murine मॉडल
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Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine… More

Yazdani, H. O., Tohme, S. Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury. J. Vis. Exp. (150), e59748, doi:10.3791/59748 (2019).

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