Summary
Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.
Abstract
L'ischemia e la lesione da reperfusione (I/R) del fegato, una sfida clinica comune, rimane un inevitabile processo patofisiologico che ha dimostrato di indurre danni multipli ai tessuti e agli organi. Nonostante i recenti progressi e gli approcci terapeutici, la morbilità generale è rimasta insoddisfacente soprattutto nei pazienti con anomalie parenchyliche sottostanti. Nel contesto della crescita aggressiva del cancro e della metastasi, si sospetta che l'I/R chirurgico sia il promotore che regola la ricorrenza del tumore. Questo articolo ha lo scopo di descrivere un modello murino clinicamente rilevante di E-R e metastasi epatica del fegato. In tal modo, miriamo ad aiutare altri ricercatori a stabilire e perfezionare questo modello per la loro pratica di ricerca di routine per comprendere meglio gli effetti del fegato I/R sulla promozione delle metastasi epatiche.
Introduction
Il fegato è uno dei siti più comuni per lo sviluppo della malattia metastatica1. La mortalità è quasi invariabilmente attribuibile a complicazioni associate alla crescita del tumore nel fegato. Nei pazienti con tumori solidi metastatici nel fegato, l'intervento chirurgico rimane un intervento cruciale per il controllo della malattia e un possibile approccio curativo. Tuttavia, la stragrande maggioranza dei pazienti in ultima analisi presenta una malattia ricorrente, prevalentemente nel fegato2,3. Durante la chirurgia epatica, il sanguinamento intraoperatorio è comune, spesso richiede la trasfusione di sangue e diversi approcci tecnici per il controllo del sanguinamento, compresi i metodi di bloccaggio vascolare. Tuttavia, tali misure causano ischemia/reperfusione epatica (I/R) al tessuto epatico. Gli effetti negativi dell'I/R sulla funzione epatocellulare sono stati ben documentati. L'insulto I/R del fegato accende le cascate infiammatorie durante il ripristino del flusso sanguigno attraverso vie infiammatorie4. Non solo la lesione epatica da I/R contribuisce all'insufficienza epatica, ma le prove attuali dimostrano anche che la lesione da I/R stimola l'adesione delle cellule tumorali e promuove l'incidenza della formazione di metastasi e la crescita della malattia micrometastatica esistente5. Abbiamo già riferito che lo stress chirurgico induce l'attivazione di cellule immunitarie che non solo aiuta nella crescita del tumore primario, ma facilita anche le metastasi catturando le cellule tumorali all'interno della circolazione6.
Qui descriviamo in dettaglio una tecnica per stabilire un modello di tumore del topo metastasi epatica. In questo modello, presentiamo anche un metodo per indurre lesioni da reperfusione di ischemia epatica che agisce come un surrogato allo stress chirurgico presente clinicamente durante le epatitectomie. I metodi combinati di iniezione del cancro e I/R epatico possono interpretare con successo lo sviluppo del CRLM in pazienti che hanno subito la resezione tumorale primaria.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e aderiti alle Linee guida dei National Institutes of Health (NIH). Gli strumenti utilizzati per qualsiasi procedura chirurgica sono stati accuratamente sterilizzati.
1. Preparazione iniziale
- Prima di iniettare cellule tumorali nella milza del topo, autoclave e sterilizzare tutti gli strumenti da utilizzare durante la procedura.
- Sterilizzare e/o autoclave un pad di riscaldamento, guanti chirurgici, garza, coppie di forbici, piccoli morsetti, dilatatore del vaso, pinze chirurgiche e un supporto per aghi.
- Preparare l'analgesico post-operatorio (0,1 mg/kg di buprenorphina) da somministrare dopo la splenectomia e ogni 12 h per 2 giorni.
2. Cultura cellulare
- Assicurarsi che le cellule tumorali siano esenti da contaminazione da micoplasma utilizzando un kit micoplasma ELISA.
- Preparare una soluzione da 500 mL del mezzo di coltura DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco a 4 gradi centigradi per la coltura delle cellule tumorali del colore colorettale murine (MC38). I mezzi di coltura devono essere integrati con il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 g/mL di streptomicina, 15 mM di HEPES e 200 mM di l-glutamina.
- Cellule tumorali di coltura in un flacone privo di dNAe e RNAse (75 cm2). Incubare la coltura cellulare in un'incubatrice civetta cellulare/tessuto contenente il 5% di CO2. Mantenere la temperatura a 37 gradi centigradi.
- Una volta che le cellule proliferatiste raggiungono il 90-100% di confluenza, aspirate i vecchi supporti, lavare le cellule con 1x salina tamponata da fosfati (PBS) e poi trattarle con 1x trypsin (0,25%) per staccare le cellule dal pallone.
- Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL e centrifugare per 5 min a 700 x g.
- Aspirare il supporto e lavare con 1x PBS due volte con una centricazione ripetuta.
- Procedere per confermare la vitalità cellulare colorando le cellule con la macchia blu trypan (0,4%).
- Risospendere le cellule a una concentrazione di 1 x 106 cellule/100 -L in 1x PBS. Pipet cellule accuratamente per evitare eventuali grumi. Mantenere le cellule tumorali sul ghiaccio prima dell'iniezione.
3. Iniezione di cellule tumorali
- Anestesizzai i topi maschi di età 8-12 settimane (C57BL6) somministrando ketamina (150 mg/kg) e xylazina (12 mg/kg) intraperitonealmente utilizzando un ago da 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm).
- Rasare la pelle addominale dei topi utilizzando clipperper per evitare eventuali infezioni postoperatorie.
- Posizionare i topi sul sistema di retrazione del fissatore magnetico. Confermare che i topi sono completamente sotto l'effetto dell'anestesia pizzicando un dito o la coda.
- Aggiungere gocce saline negli occhi per evitare la secchezza durante la procedura.
- Soluzione Scrub povidone-iodio (7,5%) alla parete addominale rasata per disinfettare la pelle prima di fare un'incisione chirurgica.
- Inizialmente sollevare la pelle con le pinze dentate e fare un'incisione mediana con l'aiuto di forbici chirurgiche. Quindi, sollevare il muscolo addominale e peritoneo per creare un'incisione mediana di circa 3 cm di lunghezza (processo da midabdominal a xifipo per esporre il contenuto addominale. Prestare attenzione a non estendere l'incisione oltre il processo xifoide per evitare sanguinamento esteso.
- Posizionare l'emocula su entrambi i lati dell'incisione e sotto il processo xifoideo. Estendere l'addome tirando la coda verso il basso e toccandola. Utilizzare l'applicatore di punta di cotone sterile da 6 pollici per separare ed esporre la milza dal tessuto adiposo pancreatico.
- Prima dell'iniezione nella milza, vortice le cellule tumorali per evitare eventuali grumi cellulari.
- Utilizzare una siringa di insulina da 0,5 mL 28 G (0,36 mm x 13 mm) per l'iniezione. Evitare le bolle d'aria.
- Iniettare lentamente e con cura 100 l di cellule nella punta della milza. Posizionare una punta di cotone e aggiungere una leggera pressione per evitare il riflusso nella regione addominale. Un'iniezione di successo può essere osservata identificando il cambiamento nel colore del fegato durante l'iniezione.
- Inumidire una garza sterile con 1x PBS e posizionarla sopra l'area sezionata.
- Trasferire i topi su una piastra di riscaldamento per 15 min per consentire alle cellule tumorali di circolare all'interno del sistema.
- Per procedere con l'ischemia chirurgica e la lesione da reperfusione, seguire i passaggi 5.3-5.10.
NOTA: Questa procedura consiste nello studiare l'effetto dell'indatazione I/R di foci metastatici.
4. Splenectomia
- Per eseguire una splenectomia, utilizzare un dispositivo di cautery portatile. Sollevare con attenzione la milza con pinze lisce e cauterizzare i vasi sanguigni splenici per evitare eccessivi emorragici. Rimuovere la milza trascinando i vasi nella sezione cauterizzata.
- Subito dopo la procedura, chiudere l'incisione in un modello a doppio strato suturando prima lo strato muscolare e poi la pelle. Utilizzare suture in polipropilene 4-0 sia per la parete addominale che per la pelle.
- Prima di ripetere la procedura su un altro animale, disinfettare tutti gli strumenti spruzzandoli con il 70% di isopropanolo o inserendoli in un bagno di perline.
- Riporre i topi in gabbie originali e cercare segni di angoscia e dolore post-chirurgico.
- Iniettare analgesico post-operatorio (Buprenorphine 0,1 mg/kg) ogni 12 h per 2 giorni per evitare dolore post-chirurgico.
5. Lesione da reperfusione di ischemia
- A 5 giorni dopo la prima laparotomia, i topi anestesizzanti somministrando la chetamina (150 mg/kg) e la xylazina (12 mg/kg) intraperitonealmente utilizzando un ago da 1 mL 25 G (0,5 mm x 16 mm). Seguire i passaggi da 3.3–3.4.
- Soluzione Scrub povidone-iodio (7,5%) sull'addome rasato del topo per disinfettare la pelle ed eseguire una laparotomia mediana come descritto sopra al punto 3.6.
- Utilizzando due punte di cotone inumidito, spostare delicatamente l'intestino dalla cavità per esporre le strutture associate, compresa la vena del portale. Sezionare l'hilum del fegato libero dal tessuto circostante.
- Sollevare la mediana e i lobi laterali a sinistra contro il diaframma. Separare il lobo quadrate dal lobo laterale sinistro sezionando l'hilum del fegato con le forbici a molla utilizzando un microscopio operativo per consentire una chiara visibilità verso la struttura della triade del portale.
- Posizionare un piccolo tampone di cotone umido tra il lobo mediano e il lobo laterale destro per creare spazio sufficiente per il bloccaggio. Utilizzando le pinze del dilatatore del recipiente, passare con attenzione il filo di 10 cm (4.0 di sutura di polipropilene) per sollevare la triade del portale. Occludono tutte le strutture della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) a sinistra e nei lobi epatici mediani posizionando un morsetto microvascolare utilizzando un applicatore micro-serrefine con serratura.
- Se i lobi non mostrano sbiancamento significativo, riregolare il morsetto rimuovendo e riapplicando.
NOTA: Se l'immediato sbiancamento del fegato non si verifica anche dopo aver riregolato il morsetto, valutare attentamente se procedere o meno con l'I/R. - Rimuovere il piccolo tampone di cotone posto tra i lobi laterali medici e destro. Sostituire delicatamente l'intestino nella cavità addominale. Coprire la parete addominale con una garza umida (imbevuta di 1x PBS) e coprire con un involucro di plastica per ridurre al minimo la perdita evaporativa.
- Posizionare il mouse sul pad di riscaldamento e applicare il morsetto per un periodo di 60 min.
- Durante l'intervallo ischemico, cercare prove di lesioni ischemia visualizzando la sbiancamento pallido dei lobi mediali e laterali mediali e mediali di sinistra destra.
- Avviare la reperfusione rimuovendo i morsetti dopo il periodo di 60 min.
NOTA: La prova della riperfusione può essere osservata da un cambio di colore immediato dei lobi laterali mediani e sinistri. - Subito dopo la reperfusione, chiudere l'incisione con un modello di sutura a doppio strato suturando prima lo strato muscolare e poi la pelle. Utilizzare la sutura in polipropilene 4-0 con l'aiuto di un supporto ad ago per chiudere la parete addominale e la pelle.
- Prima di ripetere la procedura su un altro animale, disinfettare tutti gli strumenti spruzzandoli con il 70% di isopropanolo o inserendoli in un bagno di perline riscaldato.
- Riporre i topi in gabbie originali e cercare segni di angoscia e dolore post-chirurgico.
- Iniettare analgesico post-operatorio (0,1 mg/kg di buprenorphina) ogni 12 h per 2 giorni per evitare dolore post-chirurgico.
- Per i topi della fedina problemiali epatici, eseguire laparotomia, dissezione dell'hilum e suture addominali.
NOT: Il ruolo dello stress chirurgico che influenza l'istituzione di metastasi epatiche può essere studiato attraverso due diversi progetti sperimentali. Il protocollo di cui sopra (Model-1) viene utilizzato per stabilire la malattia micrometastatica del fegato e studiare l'effetto dell'I/R epatica sulla loro crescita (Figura 1A). In alternativa, l'i/r e l'iniezione tumorale possono essere eseguite contemporaneamente (Modello-2) per studiare l'effetto della lesione i/r nella creazione di nuovi foci metastatici (Figura 1B). Per fare questo, iniettare le cellule tumorali nella milza come descritto sopra e consentire loro di circolare per 15 min. Eseguire epatica I/R o finzione chirurgia dopo il periodo circolante per 60 min. Eseguire la splenectomia laterale 60 min più tardi, quindi chiudere l'incisione laparotomia.
6. Valutazione dei topi azionati
- Durante la procedura chirurgica assicurarsi che i topi sono sotto l'influenza di anestesia stadio III eseguendo test di riflesso palpebrale e corneale. Ulteriori dosi anestetiche devono essere somministrate sui segni dei riflessi.
- Fornire analgesico post-operatorio (Buprenorphine 0.1mg/kg) subito dopo l'intervento chirurgico e ogni 12h per 2 giorni per evitare dolore post chirurgico.
- Lasciare i topi 30-60 min di tempo di recupero dall'anestesia. Monitorare costantemente i topi e non lasciarli incustoditi fino al completo recupero.
- Cerca segni di disagio come schiena, occhi chiusi, movimento lento e mancato sposo. Trattare di conseguenza fino a quando i topi tornano alla loro normale attività.
- La cura supplimentale tra cui fluidi, calore, agente di inversione Yohimbina per xilosina, biancheria da letto asciugamano di carta morbida (per evitare l'aspirazione) dovrebbe essere fornita dopo l'intervento chirurgico per migliorare il periodo di recupero.
7. Valutazione della lesione da reperfusione di ischemia epatica
- Immediatamente dopo aver applicato il morsetto, assicurarsi che la sbiancatura pallida dei lobi laterali mediani e sinistri si verifichi rispetto ai lobi caudati e quadrante.
- Valutare la lesione dell'ischemia epatica misurando i livelli di transainasi da siero alaninese (sALT), il siero aspartatra transaminasi (sAST) e la diciasi del siero lattato (sLDH). Il sangue può essere prelevato dalla vena facciale per estrarre il siero 3–6 h dopo l'avvio della reperfusione. Eseguire istologia epatica per analizzare l'area tumorale percentuale all'interno del lobo ischemico.
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Representative Results
Tutti i topi wildtype (C57BL6) (n - 20) sono stati sottoposti al modello delle metastasi epatiche utilizzando il protocollo descritto sopra. Tutti i topi iniettati con o senza lesioni da reperfusione di ischemia sono sopravvissuti fino alla data del sacrificio. Il diagramma schematico Figura 1A di un fegato iniettato dal cancro illustra il bloccaggio della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) che induce un'ischemia epatica parziale (70%) insulto verso la mediana e i lobi laterali sinistri. Un aumento del numero di metastasi epatiche può essere osservato entro 2-3 settimane post lesione da reperfusione di ischemia. I topi iniettati con cellule tumorali MC38 sono stati suddivisi casualmente in gruppi di farsa e I/R. Come mostrato nella Figura 1B, il primo gruppo di topi ha subito la splenectomia 15 min dopo l'iniezione di cancro. Chirurgia di reperfusione di ischemia del fegato è stata eseguita 5 giorni dopo l'iniezione. Questo modello consente alle cellule tumorali circolanti (CC) di stabilirsi all'interno degli organi. Figura 2A mostra che lo stress chirurgico ha aumentato significativamente la quantità di micrometastasi prestabilite all'interno del fegato. Il secondo gruppo (Figura 1C) è stato sottoposto a i/o min chirurgico I/R 15 min dopo l'iniezione di cancro. Il reperfusione è stato indotto rimuovendo il morsetto microvascolare 60 min dopo l'applicazione. L'influenza simultanea dello stress chirurgico porta (Figura 2B) alla cattura di cellule tumorali recentemente iniettate all'interno del fegato stabilendo un foci micrometastatico. Questo ha aumentato significativamente il numero di noduli metastatici nel fegato.
Figura 1: Una rappresentazione schematica del progetto sperimentale. (A) Il diagramma schematico di un fegato iniettato dal cancro illustra il bloccaggio della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) che induce un parziale (70%) epatico insulto ischemico verso la mediana e lobi laterali sinistra. Un aumento del numero di metastasi epatiche può essere osservato nei lobi ischemici entro 2-3 settimane dopo la riperfusione. Inizialmente, i topi sono stati sottoposti a iniezione intrasplessa di cancro colorettale MC38 sia nella cattura tumorale (B) che nella crescita tumorale (C). I topi di Sham sono stati anche sottoposti a laparotomia senza l'applicazione di morsetti microvascolari. Due-tre settimane dopo l'I/R, i topi sono stati sacrificati e il tessuto epatico è stato raccolto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di topi iniettati con cancro murno. (A) Immagine rappresentativa delle metastasi epatiche di un modello di crescita tumorale (Modello 1) che mostra un aumento significativo dei noduli tumorali grossolani sulla superficie del fegato dopo aver industato l'i/R epatico rispetto al gruppo non I/R. (B) Allo stesso modo, nell'impostazione del modello di cattura del tumore (Modello-2), l'I/R del fegato ha mostrato un aumento significativo dei noduli tumorali 2 settimane dopo I/R rispetto al gruppo non I/R. P < 0,05. I risultati sono espressi come la media e la deviazione standard. I confronti di gruppo sono stati eseguiti utilizzando il test t di Student (n : 5/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello animale descritto in questo manoscritto si basa su due approcci principali. Il primo è quello di riconoscere la capacità delle cellule tumorali di localizzare e proliferare nei lobi del fegato. Il secondo è quello di studiare l'effetto della lesione di reperfusione ischemia epatica che influenza la crescita del tumore e le metastasi. Questo modello consente lo studio pertinente delle metastasi epatiche in assenza di metastasi secondarie in un topo immunocompetente. Il modello è utile per affrontare le questioni dell'efficienza metastatica, come le stradiazioni di sopravvivenza delle cellule e la proliferazione.
Nel primo modello, le cellule tumorali vengono iniettate per prime e la malattia micrometastatica è autorizzata a formarsi. Successivamente, l'I/R del fegato viene eseguito 5 giorni dopo. Questo modello è importante quando si studia l'effetto della chirurgia sulla malattia micrometastatica già stabilita. Anche se l'imaging è notevolmente migliorato nell'ultimo decennio, c'è ancora la possibilità della presenza di malattia micrometastatica che potrebbe non essere rilevata mediante imaging e viene lasciata dopo una resezione epatica pianificata con l'intento di curare. Questa malattia microscopica residua è influenzata dai cambiamenti infiammatori che accompagnano la chirurgia, in particolare il fegato I/R, e la crescita è aumentata esponenzialmente. D'altra parte, nel secondo modello l'I/R e l'iniezione di tumore vengono eseguite contemporaneamente. Questo modello si concentra sugli effetti dell'I/R epatica sulle cellule tumorali circolanti e sulla creazione di nuovi foci metastatici. Durante l'intervento chirurgico al fegato, la manipolazione del tumore rilascia le cellule tumorali in circolazione. Anche se la maggior parte delle cellule circolanti sono curate dalla sorveglianza immunitaria dell'ospite, un certo numero di cellule può stabilire foci metastatici. Questo secondo modello è progettato per studiare questo fenomeno.
I modelli animali, come l'iniezione ortotopica del fegato7 e l'iniezione della vena della coda8, potrebbero non essere anatomicamente fattibili per tali studi. È stato dimostrato che l'iniezione di vena della coda di solito si traduce in una metastasi aumentata del polmone rispetto al fegato. Il modello di cancro a iniezione ortotopica ha un aumentato rischio di lesioni epatiche che influenzano il microambiente per il tumore a crescere. In alternativa all'iniezione di milza di tumori, la vena del portale può anche essere utilizzata. L'iniezione di vena portale è stato un modello metastatico ben consolidato nello studio delle metastasi epatiche9,10,11. L'iniezione di cellule tumorali attraverso la vena del portale non compromette la rimozione della milza rispetto al modello sopra descritto. Questo infatti eviterà le conseguenze immunitarie. Tuttavia, l'iniezione di vena del portale ha un aumentato rischio di sanguinamento eccessivo dovuto lacrimazione venosa (nel sito di iniezione) e trombosi durante o dopo l'applicazione del morsetto microvascolare alla triade del portale. Questi rischi sono aumentati esponenzialmente quando sia l'iniezione tumorale e la serraggio sono fatte lo stesso giorno. Il nostro gruppo ha eseguito entrambi i metodi e abbiamo ottenuto risultati simili9,12. Riconosciamo che l'iniezione di vena del portale richiede competenze tecniche più elevate quando fatto allo stesso tempo come il bloccaggio ed è associato a complicazioni più elevate. Entrambi i metodi sono validi per studiare le metastasi epatiche.
Ci sono numerosi aspetti importanti che devono essere considerati prima e durante l'intera procedura. L'uso di cellule tumorali specificamente con lo stesso background di specie è ripreso prima dell'iniezione. Il numero di cellule è anche importante considerare in questo studio, come piccolo numero di cellule potrebbe non essere sufficiente per completare lo studio in un breve periodo di tempo (3 settimane). Aumentare il numero di cellule tumorali dovrebbe essere evitato in quanto può causare un effetto di embolia che porta alla trombosi e la morte del roditore. Il modello descritto in questo manoscritto con concentrazione cellulare di 1 x 106 è specifico per la linea cellulare MC38 e ci ha permesso di osservare una differenza significativa nella crescita tumorale stimolata dall'effetto della lesione chirurgica di reperfusione di ischemia. Si consiglia vivamente di provare diverse concentrazioni di cellule tumorali a seconda dell'esperimento specifico con la linea di interesse cellulare del cancro desiderato. Allo stesso modo, l'etichettatura delle cellule tumorali potrebbe essere molto utile in molti studi di metastasi. Questo fornirebbe un'idea per quanto riguarda la percentuale di cellule che sono in grado di seme e proliferare. Inoltre, una corretta applicazione del morsetto del portale per indurre lesioni ischemia epatica è molto importante in questo modello. L'incapacità di bloccare completamente il flusso sanguigno può portare a un impatto minore o nullo sulle cellule tumorali. Come descritto nei metodi, è importante assicurarsi che la sbiancamento dei lobi epatici si verifichi dopo l'applicazione dei morsetti microvascali. Infine, la corretta coagulazione dei vasi tramite cautery è fondamentale per evitare il sanguinamento interno. Nella nostra esperienza, soprattutto con l'uso di elettrocauterio, il sanguinamento dal letto splenico è estremamente raro e poiché eseguiamo una laparotomia ripetuta solo 5 giorni dopo la prima operazione, la quantità di adere è minima. Tuttavia, se si incontra sanguinamento, questo può rappresentare una seconda operazione più difficile. Se il sanguinamento si verifica dopo la splenectomia, questo può indicare che le cellule tumorali circolanti possono anche aver impiantato nella cavità peritoneale e quindi possono influenzare i risultati degli esperimenti. Si consiglia di prestare attenzione durante la gestione di questo problema, perché può influenzare gli esperimenti e risultati. Bisogna riflettere attentamente per determinare se procedere o meno con I/R in questi topi.
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Disclosures
Gli autori non rivelano conflitti di interesse che riguardano quest'opera.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Sara Minemyer e Alexander Comerci per la revisione linguistica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 900-108 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-081 | |
| Penicilin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | SH3023701 | |
| Trypsin | Hyclone | sh30042.02 | |
| Cell culture Flask 75cm | 5 Cells Star | 658170 | |
| 15ml PP Conical Tubes | BioExcell | 41021037 | |
| Trypan Blue Stain | Giibco | 15250-061 | |
| Gauze | Fisherbrand | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| Microvascular clamp | Finescience tools | 18055-03 | |
| Micro-Serrefine clamp applicator with lock | Fine science toosl | FST-18056-14 | |
| Spring scissor | Fine science toosl | FST-15021-15 | |
| Vessel Dilator | Fine science toosl | FST-00276-13 | |
| Magnetic fixator Retraction system | Fine science toosl | FST-18200020 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11019-12 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine science toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 polypropylene suture | Ethicon | K881H | |
| Needle holder | Harvard Apparatus | 72-8826 | |
| Heating Pad | Fisher scientific | 1443915 | |
| Clipper | Oster | 559A | |
| Povidone-Iodine solution | Medline | MDS093945 | |
| Syringe 1ml 25G | BD safety Glide | 305903 | |
| Insulin syringe 0.5 ml | BD insulin Syringes | 32946 | |
| Cotton -Tipped Applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Surgical Microscope | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| ALT strip | Heska | 15809554 | |
| AST strip | Heska | 15809542 | |
| LDH strip | Heska | 15809607 |
References
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