Vi presenterar ett protokoll för att studera distributionen av mitokonlikers och endoplasmatiska Retikulum i hela celler efter genetisk modifiering med hjälp av korrelat ljus och volymelektronmikroskopi inklusive askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidasfärgning, seriell snittning av celler med och utan målgenen i samma sektion, och seriell avbildning via elektronmikroskopi.
Cellulära organeller, såsom mitokona och endoplasmatiska Retikulum (ER), skapa ett nätverk för att utföra en mängd olika funktioner. Dessa mycket böjda strukturer viks in i olika former för att bilda ett dynamiskt nätverk beroende på cell förhållandena. Visualisering av detta nätverk mellan mitokona och ER har försökt använda super-resolution fluorescens Imaging och ljus mikroskopi; den begränsade upplösningen är dock otillräcklig för att iaktta membranen mellan mitokonnorna och ER i detalj. Transmission elektronmikroskopi ger bra membran kontrast och nanometer-skala upplösning för observation av cellulära organeller; Det är dock exceptionellt tidskrävande när man bedömer den tredimensionella (3D) strukturen av högt böjda organeller. Därför observerade vi morfologin av mitokona och ER via korrelat ljus-elektronmikroskopi (CLEM) och volym elektronmikroskopi tekniker med hjälp av förstärkt askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidas färgning. En Bloc-färgningsmetod, ultratunna Serial snittning (array tomography) och volymelektronmikroskopi tillämpades för att observera 3D-strukturen. I detta protokoll föreslår vi en kombination av CLEM och 3D elektronmikroskopi för att utföra detaljerade strukturella studier av mitokona och ER.
Mitokonboen och endoplasmatiska Retikulum (ER) är membranbundna cellulära organeller. Deras anslutning är nödvändig för deras funktion, och proteiner relaterade till deras nätverk har beskrivits1. Avståndet mellan mitokontroen och ER har rapporterats som ca 100 nm med hjälp av ljusmikroskopi2; emellertid, senaste super-resolution mikroskopi3 och elektronmikroskopi (EM)4 studier har visat att det är betydligt mindre, vid cirka 10-25 nm. Den upplösning som uppnås i super-resolution mikroskopi är lägre än EM, och specifik märkning är nödvändig. EM är en lämplig teknik för att uppnå en tillräckligt högupplöst kontrast för strukturella studier av kopplingarna mellan mitokona och ER. En nackdel är dock den begränsade z-axelinformationen eftersom de tunna sektionerna måste vara ca 60 nm eller tunnare för konventionell transmissionselektronmikroskopi (TEM). För tillräcklig EM z-Axis Imaging, tredimensionell elektronmikroskopi (3DEM) kan användas5. Men detta innebär att förbereda hundratals tunna seriella delar av hela celler, vilket är mycket knepigt arbete som bara ett fåtal skickliga teknologer behärskar. Dessa tunna sektioner samlas på bräckliga formvar filmdragerade ett hål TEM galler. Om filma bryter på en GIRD, är seriell avbildning och volym rekonstruktion inte möjligheten. Serial block-Face scanning elektronmikroskopi (SBEM) är en populär teknik för 3DEM som använder destruktiva en Bloc snittning inuti scanning Electron Mikroskop (SEM) vakuumkammare med antingen en diamantkniv (Dik-SBEM) eller en fokuserad jonstråle (FIB-SEM) 6. men eftersom dessa tekniker inte är tillgängliga på alla anläggningar, föreslår vi array datortomografi7 med seriell snittning och SEM. I array-tomografi överförs serie sektioner med en ultramicrotome till ett glastäckslip istället för ett TEM-rutnät och visualiseras via ljusmikroskopi och SEM8. För att förbättra signalen för avbildning av Backscatter Electron (BSE) utnyttjade vi ett block EM-FÄRGNINGSPROTOKOLL som använde osmium tetroxid (OsO4)-fasta celler med osmiophilic thiocarbohydrazid (TCH)9, vilket gjorde det möjligt för oss att få bilder utan dubbel färgning efter inbäddning.
Dessutom, den mitokondriella markör SCO1 (cytokrom c oxidas Assembly protein 1) – askorbat peroxidas 2 (APEX2)10 molekylär tagg användes för att visualisera mitokondrier på EM-nivå. APEX2 är ungefär 28 kDa och härstammar från sojabönor askorbat peroxidas11. Det utvecklades för att visa den detaljerade placeringen av specifika proteiner på EM-nivå på samma sätt som grönt fluorescerande proteinmärkt protein används i ljusmikroskop. APEX2 omvandlar 3, 3 ‘-Diaminobenzidin (DAB) till en olöslig osmiophilic polymer på platsen för taggen i närvaro av kofaktor väteperoxid (H2O2). APEX2 kan användas som ett alternativ till traditionell antikropps märkning i EM, med en protein lokalisering genom hela djupet av hela cellen. Med andra ord, den APEX2-märkt protein kan visualiseras av specifika osmication11 utan immunogold märkning och depolarisering efter Ultra-kryosnittning. Pepparrot peroxidas (HRP) är också en känslig tagg som katalyserar H2O2-beroende polymerisation av DAB till en lokaliserad fällning, vilket ger EM-kontrast efter behandling med OSO4. ER Target peptid sekvens HRP-KDEL (Lys-ASP-GLU-Leu)12 applicerades för att visualisera er i en hel cell. För att utvärdera vårt protokoll att utnyttja genetiska Taggar och en Bloc-färgning med reducerad osmium och TCH (rOTO-metoden), med hjälp av osmication effekt på samma gång, jämförde vi membran kontrasten med och utan användning av varje genetisk tagg i rOTO en Bloc färgning. Även 3DEM med array tomografi och DAB färgning med APEX och HRP har, respektive, utnyttjats för andra ändamål, vårt protokoll är unikt eftersom vi har kombinerat array tomografi för 3DEM och DAB färgning för mitokonboen och ER märkning. Specifikt visade vi fem celler med och utan APEX-märkta gener i samma sektion, som hjälpte till att undersöka effekten av den genetiska modifieringen på celler.
Bestämning av cellernas lokalisering av specifika proteiner vid en nanometerupplösning med EM är avgörande för att förstå proteiners cellulära funktioner. Generellt finns det två tekniker för att studera lokalisering av ett målprotein via EM. En är den immunogold tekniken, som har använts i EM sedan 1960, och den andra är en teknik som använder nyligen utvecklat genetiskt kodade Taggar16. Traditionella immunogold tekniker har använt antikroppskonjugerade guld partiklar eller kvantp…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av KBRI grundläggande forskningsprogram genom Korea Brain Research Institute finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (19-BR-01-08), och National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 och HRP-KDEL plasmider var vänligt tillhandahålls av Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Data förvärvades vid hjärnforskning Core anläggningar i KBRI.
Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
Lead citrate | EMS | 17900 | |
35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
Fugene HD | Promega | E2311 | |
Glycine | SIGMA | G8898 | |
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
Diamond knife | Leica | AT-4 | |
Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |