Summary

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Published: July 20, 2019
doi:

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att studera distributionen av mitokonlikers och endoplasmatiska Retikulum i hela celler efter genetisk modifiering med hjälp av korrelat ljus och volymelektronmikroskopi inklusive askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidasfärgning, seriell snittning av celler med och utan målgenen i samma sektion, och seriell avbildning via elektronmikroskopi.

Abstract

Cellulära organeller, såsom mitokona och endoplasmatiska Retikulum (ER), skapa ett nätverk för att utföra en mängd olika funktioner. Dessa mycket böjda strukturer viks in i olika former för att bilda ett dynamiskt nätverk beroende på cell förhållandena. Visualisering av detta nätverk mellan mitokona och ER har försökt använda super-resolution fluorescens Imaging och ljus mikroskopi; den begränsade upplösningen är dock otillräcklig för att iaktta membranen mellan mitokonnorna och ER i detalj. Transmission elektronmikroskopi ger bra membran kontrast och nanometer-skala upplösning för observation av cellulära organeller; Det är dock exceptionellt tidskrävande när man bedömer den tredimensionella (3D) strukturen av högt böjda organeller. Därför observerade vi morfologin av mitokona och ER via korrelat ljus-elektronmikroskopi (CLEM) och volym elektronmikroskopi tekniker med hjälp av förstärkt askorbat peroxidas 2 och pepparrotperoxidas färgning. En Bloc-färgningsmetod, ultratunna Serial snittning (array tomography) och volymelektronmikroskopi tillämpades för att observera 3D-strukturen. I detta protokoll föreslår vi en kombination av CLEM och 3D elektronmikroskopi för att utföra detaljerade strukturella studier av mitokona och ER.

Introduction

Mitokonboen och endoplasmatiska Retikulum (ER) är membranbundna cellulära organeller. Deras anslutning är nödvändig för deras funktion, och proteiner relaterade till deras nätverk har beskrivits1. Avståndet mellan mitokontroen och ER har rapporterats som ca 100 nm med hjälp av ljusmikroskopi2; emellertid, senaste super-resolution mikroskopi3 och elektronmikroskopi (EM)4 studier har visat att det är betydligt mindre, vid cirka 10-25 nm. Den upplösning som uppnås i super-resolution mikroskopi är lägre än EM, och specifik märkning är nödvändig. EM är en lämplig teknik för att uppnå en tillräckligt högupplöst kontrast för strukturella studier av kopplingarna mellan mitokona och ER. En nackdel är dock den begränsade z-axelinformationen eftersom de tunna sektionerna måste vara ca 60 nm eller tunnare för konventionell transmissionselektronmikroskopi (TEM). För tillräcklig EM z-Axis Imaging, tredimensionell elektronmikroskopi (3DEM) kan användas5. Men detta innebär att förbereda hundratals tunna seriella delar av hela celler, vilket är mycket knepigt arbete som bara ett fåtal skickliga teknologer behärskar. Dessa tunna sektioner samlas på bräckliga formvar filmdragerade ett hål TEM galler. Om filma bryter på en GIRD, är seriell avbildning och volym rekonstruktion inte möjligheten. Serial block-Face scanning elektronmikroskopi (SBEM) är en populär teknik för 3DEM som använder destruktiva en Bloc snittning inuti scanning Electron Mikroskop (SEM) vakuumkammare med antingen en diamantkniv (Dik-SBEM) eller en fokuserad jonstråle (FIB-SEM) 6. men eftersom dessa tekniker inte är tillgängliga på alla anläggningar, föreslår vi array datortomografi7 med seriell snittning och SEM. I array-tomografi överförs serie sektioner med en ultramicrotome till ett glastäckslip istället för ett TEM-rutnät och visualiseras via ljusmikroskopi och SEM8. För att förbättra signalen för avbildning av Backscatter Electron (BSE) utnyttjade vi ett block EM-FÄRGNINGSPROTOKOLL som använde osmium tetroxid (OsO4)-fasta celler med osmiophilic thiocarbohydrazid (TCH)9, vilket gjorde det möjligt för oss att få bilder utan dubbel färgning efter inbäddning.

Dessutom, den mitokondriella markör SCO1 (cytokrom c oxidas Assembly protein 1) – askorbat peroxidas 2 (APEX2)10 molekylär tagg användes för att visualisera mitokondrier på EM-nivå. APEX2 är ungefär 28 kDa och härstammar från sojabönor askorbat peroxidas11. Det utvecklades för att visa den detaljerade placeringen av specifika proteiner på EM-nivå på samma sätt som grönt fluorescerande proteinmärkt protein används i ljusmikroskop. APEX2 omvandlar 3, 3 ‘-Diaminobenzidin (DAB) till en olöslig osmiophilic polymer på platsen för taggen i närvaro av kofaktor väteperoxid (H2O2). APEX2 kan användas som ett alternativ till traditionell antikropps märkning i EM, med en protein lokalisering genom hela djupet av hela cellen. Med andra ord, den APEX2-märkt protein kan visualiseras av specifika osmication11 utan immunogold märkning och depolarisering efter Ultra-kryosnittning. Pepparrot peroxidas (HRP) är också en känslig tagg som katalyserar H2O2-beroende polymerisation av DAB till en lokaliserad fällning, vilket ger EM-kontrast efter behandling med OSO4. ER Target peptid sekvens HRP-KDEL (Lys-ASP-GLU-Leu)12 applicerades för att visualisera er i en hel cell. För att utvärdera vårt protokoll att utnyttja genetiska Taggar och en Bloc-färgning med reducerad osmium och TCH (rOTO-metoden), med hjälp av osmication effekt på samma gång, jämförde vi membran kontrasten med och utan användning av varje genetisk tagg i rOTO en Bloc färgning. Även 3DEM med array tomografi och DAB färgning med APEX och HRP har, respektive, utnyttjats för andra ändamål, vårt protokoll är unikt eftersom vi har kombinerat array tomografi för 3DEM och DAB färgning för mitokonboen och ER märkning. Specifikt visade vi fem celler med och utan APEX-märkta gener i samma sektion, som hjälpte till att undersöka effekten av den genetiska modifieringen på celler.

Protocol

1. cellkultur med mönstrade rutnät kultur skålen och cell transfektion med SCO1-APEX2 och HRP-KDEL plasmid vektor Utsäde 1 x 105 HEK293T celler genom att placera dem i 35-mm glas Grid-bottnade kultur rätter i en fuktad atmosfär som innehåller 5% Co2 vid 37 ° c i Dulbecco modifierade Eagle ‘ s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum, 100 U/ml penicillin och 100 U/mL streptomycin. Dagen efter seedning cellerna, när de har vuxit till 50%-60% confluency, infö…

Representative Results

I bild 1 beskrivs schemat och arbetsflödet för det här protokollet. Protokollet kräver 7 dagar; beroende på den tid som tillbringas på SEM-avbildning kan detta dock öka. För cell transfektion, sammanlänkning av cellerna bör kontrolleras så att den inte täcker botten av hela rutnäts plattan (figur 1a). En hög celltäthet kan förhindra identifieringen av cellen av intresse under ljusmikroskop och EM observation. Vi använde genetiskt märkta plasmider som uttryckte APEX2 och…

Discussion

Bestämning av cellernas lokalisering av specifika proteiner vid en nanometerupplösning med EM är avgörande för att förstå proteiners cellulära funktioner. Generellt finns det två tekniker för att studera lokalisering av ett målprotein via EM. En är den immunogold tekniken, som har använts i EM sedan 1960, och den andra är en teknik som använder nyligen utvecklat genetiskt kodade Taggar16. Traditionella immunogold tekniker har använt antikroppskonjugerade guld partiklar eller kvantp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av KBRI grundläggande forskningsprogram genom Korea Brain Research Institute finansieras av ministeriet för vetenskap och IKT (19-BR-01-08), och National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 och HRP-KDEL plasmider var vänligt tillhandahålls av Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Data förvärvades vid hjärnforskning Core anläggningar i KBRI.

Materials

Glutaraldehyde EMS 16200 Use only in fume hood
Paraformaldehyde EMS 19210 Use only in fume hood
Sodium cacodylate EMS 12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution EMS 16320 Use only in fume hood
Epon 812 EMS 14120 EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D Leica ARTOS 3D
Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
Lead citrate EMS 17900
35mm Gridded coverslip dish Mattek P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger Pelco easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid Ted Pella 01805-F
Hydrochloric acid SIGMA 258148
Fugene HD Promega E2311
Glycine SIGMA G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) SIGMA D8001 Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution Merck 107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate SIGMA P3289
0.22 um syringe filter Sartorius 16534
Thiocarbonyldihydrazide SIGMA 223220 Use only in fume hood
Potassium hydroxide Fluka 10193426
L-aspartic acid SIGMA A9256
Ethanol Merck 100983
Transmission electron microscopy FEI Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips SPI 06489-AB fragil glass
Isopropanol Fisher Bioreagents BP2618-1
Diamond knife Leica AT-4
Inveted light microscopy Nikon ECLipse TS100
Scanning electron microscopy Zeiss Auriga

References

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

Play Video

Cite This Article
Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59750, doi:10.3791/59750 (2019).

View Video