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Chemistry

Préparation de cellules liquides Microwell soutenues par le graphène pour la microscopie électronique de transmission in situ

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59751
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1,2,4
1Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), 3Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 4Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole pour la préparation des cellules liquides microwell supportées par le graphène pour la microscopie électronique in situ des nanocristaux d'or de la solution précurseur de HAuCl4 est présenté. De plus, une routine d'analyse est présentée pour quantifier la gravure et la dynamique de croissance observées.

Abstract

La fabrication et la préparation de cellules liquides micropuits soutenues par le graphène (GSMLCs) pour la microscopie électronique in situ sont présentées dans un protocole stepwise. La polyvalence des GSMLC est démontrée dans le cadre d'une étude sur la gravure et la dynamique de croissance des nanostructures d'or à partir d'une solution précurseur HAuCl 4. Les GSMLC combinent les avantages des cellules liquides conventionnelles à base de silicium et de graphène en offrant des profondeurs de puits reproductibles ainsi que la fabrication et la manipulation faciles du spécimen à l'étude. Les GSMLC sont fabriqués sur un seul substrat de silicium qui réduit considérablement la complexité du processus de fabrication par rapport à la conception de cellules liquides à deux gaufrettes. En l'espèce, aucune étape de liaison ou de processus d'alignement n'est requise. En outre, le volume liquide fermé peut être adapté aux exigences expérimentales respectives en ajustant simplement l'épaisseur d'une couche de nitride de silicium. Cela permet une réduction significative de la fenêtre bombée dans le vide du microscope électronique. Enfin, une évaluation quantitative de pointe du suivi des particules uniques et de la formation de dendrite dans les expériences de cellules liquides utilisant uniquement un logiciel open source est présentée.

Introduction

La science moderne des matériaux, la chimie et la biologie cellulaire exigent une compréhension approfondie des processus et des effets dynamiques sous-jacents à l'échelle du sous-micron. Malgré la puissance des techniques avancées de microscopie optique telles que la microscopie à la fluorescence à émission stimulée1, les techniques d'imagerie directe pour accéder à des morphologies détaillées nécessitent une microscopie électronique. En particulier, la microscopie électronique de transmission in situ (scannage) (S) tem a été montrée pour éclairer des informations précieuses dans la dynamique de processus en encapsulant des liquides dans des cellules dédiées et étanches au vide2. Diverses expériences telles que des études quantitatives de la cinétique de formation de nanostructure et de la thermodynamique3,4,5,6, imagerie des spécimens biologiques7, 8 Annonces , 9 (en) , 10 et études des mécanismes liés au stockage d'énergie11,12 avec des études complètes de la dynamique des processus de corrosion13 ou nanobulle physique14,15, 16 ont démêlé de nombreux phénomènes à l'aide (S)TEM qui n'étaient pas accessibles à l'aide de techniques standard de microscopie.

Au cours de la dernière décennie, deux approches majeures pour réaliser le TEM de cellules liquides in situ (LCTEM) ont été établies. Dans la première approche, le liquide est encapsulé dans une cavité entre deux membranes Si3N4 produites par la technologie de procédé Si17, tandis que dans la seconde, de petites poches liquides sont formées entre deux feuilles de graphène ou d'oxyde de graphène 10,18. La manipulation des cellules liquides à base de silicium (SiLC) et des cellules liquides à base de graphène (GLC) a été démontrée19,20,21. Bien que les deux approches ont subi des améliorations significatives22,23,24,25, ils manquent encore dans la combinaison des avantages respectifs. En général, il existe un compromis entre l'encapsulation de l'échantillon dans des poches de graphène souvent indéfinies avec un petit volume liquide qui permet une imagerie à haute résolution18, et des volumes cellulaires bien définis entraînant des membranes plus épaisses et des couches liquides, qui offrent un environnement plus proche de la situation naturelle en vrac liquide26 au détriment de la résolution2. En outre, certaines expériences dépendent d'un flux liquide26,27 qui n'a été réalisé que dans les architectures SiLC et nécessite un titulaire de TEM dédié28.

Ici, nous présentons la fabrication et la manipulation d'une approche de cellules liquides pour l'in situ lCTEM de haute performance par l'intermédiaire des cellules liquides statiques de micropuits supportées par le graphène (GSMLCs) pour des analyses de TEM. Une esquisse du GSMLC est présentée à la figure 1. Les GSMLC se sont avérés capables d'activer in situ les résultats de la microscopie électronique à transmission à haute résolution (HRTEM)6 et sont également réalisables pour la microscopie électronique à balayage in situ 29. Leur cadre basé sur la technologie Si permet la production en masse de cellules de forme reproductible avec une épaisseur liquide sur mesure et des membranes extra-minces à partir d'une seule plaquette. La membrane de graphène couvrant ces cellules atténue également les perturbations induites par le faisceau électronique8,30,31 puisque le faisceau d'électrons passe par la membrane supérieure de graphène d'abord. La topographie plate des cellules permet des méthodes d'analyse complémentaires telles que la spectroscopie à rayons X dispersive (EDXS)6 sans aucun effet d'ombre provenant de la cellule liquide elle-même, permettant une variété de haute qualité in situ expériences de microscopie électronique à cellules liquides.

Protocol

1. Fabrication de modèles de cellules liquides à base de micropuits

  1. Enlever les résidus organiques et les couches d'oxyde indigènes d'une plaquette de silicium de 175 m d'épaisseur, cristalline unique, dopé de bore (1 à 30) cm, 100 mm de diamètre (100) de silicium. Appliquez une étape d'oxydation avec H2O2 et TMAH, suivie d'un plongeon HF dans une solution HF de 1 à 5 %.
  2. Oxyder thermiquement la plaquette dans une atmosphère d'oxygène sèche à 800 oC pour faire pousser une couche d'oxyde d'une épaisseur de 11 nm (Figure 2a). 3% Dichloréthène (DCE) est utilisé pour lier la contamination métallique.
  3. Déposez une couche stoichiométrique Si3N4 par dépôt de vapeur chimique à basse pression (LPCVD). L'épaisseur de la couche Si3N4 définit la profondeur du puits. Choisissez une valeur adaptée à l'expérience planifiée (p. ex., 500 nm) (Figure 2b).
  4. Définir la géométrie latérale du puits en structurant la face avant par photolithographie et gravure réactive aux ions (RIE) (Figure 2c). Les dimensions appropriées sont par exemple des structures circulaires avec un rayon de 2,5 m disposés dans des tableaux hexagonaux. Choisissez soigneusement la distance de puits (par exemple, 5 m), pour éviter les instabilités dans la structure.
  5. Dépôt de 20 nm de stoichiométrique Si3N4 par LPCVD, qui forme la membrane inférieure de la cellule liquide (Figure 2d). Suivez la procédure décrite ci-dessus (voir l'étape 1.3).
  6. Utilisez une deuxième étape photolithographie/RIE pour structurer l'arrière qui définit plus tard les dimensions géométriques du cadre LC et de ses fenêtres TEM (Figure 2e) (diamètre du cadre : 3 mm).
  7. Par micromachinage en vrac à 20 % de KOH à 60 oC, retirez le Si dans la zone prédéfinie et créez une membrane autonome Si3N4 (Figure 2f).
  8. Enlever les ions métalliques résiduels dans une dernière étape de nettoyage avec une solution HCl de 10 % et de l'eau déionisée (DI).

2. Transfert de graphène sur les grilles TEM

  1. Mouillez le tissu sur lequel le peu de couches (6 à 8) de la VD-graphene acquise commercialement sur la PMMA est placé. Immerger le graphène enduit de PMMA dans un plat Petri rempli d'eau DI (Figure 3a).
    REMARQUE: Le nombre de couches de graphène peut être déterminé à l'aide de techniques réalisables32,33.
  2. Placez la couche de graphène sur un papier filtre et coupez-la en morceaux appropriés pour couvrir tous les puits fabriqués (p. ex., 4 mm2) (Figure 3b).
  3. Re-immergeles les morceaux coupés dans le plat Petri (Figure 3c).
  4. Utilisez une grille TEM recouverte d'une couche de carbone troué pour pêcher les morceaux produits hors de l'eau DI. Pour ce faire, plongez soigneusement la grille dans l'eau et attrapez le graphène flottant à la surface. Tenez la grille avec des pinces anti-capillaires (Figure 3d,e).
    REMARQUE : Veillez à ce que le site de graphène de la pile graphène-PMMA reste sur le dessus pendant toute la procédure. Dans le cas contraire, l'enlèvement ultérieur de la PMMA décollera la couche de graphène.
  5. Laisser sécher les feuilles pendant quelques heures.
  6. Retirez la couche de protection PMMA dans un bain d'acétone pendant 30 min et ajoutez consécutivement d'autres étapes de nettoyage en plongeant dans l'éthanol et l'eau DI sans sécher l'échantillon entre les deux. Utilisez un récipient plat (p. ex., un plat Petri) pour simplifier le transfert du spécimen par la suite.
  7. Séchez l'échantillon ensuite pendant 30 minutes dans des conditions ambiantes.

3. Préparation de spécimen

  1. Préparer le spécimen pour l'incorporation dans le GSMLC. Pour ce faire, préparez une solution de stock de 1 mM en résolvant 196,915 mg de cristaux HAuCl4à 3H2O dans 0,5 L d'eau DI.
  2. Prenez la quantité désirée de spécimen de la solution de stock. Ici, 0,5 L est appliqué. Cela peut être fait à l'aide d'une seringue ou d'une pipette Eppendorf.

4. Chargement GSMLC

  1. Rincer le modèle de cellules liquides fabriquée avec de l'acétone et de l'éthanol.
  2. Appliquer un O2/N2 ambiant (20%/80%) plasma pendant 5 min pour améliorer la mouillabilité de la membrane.
  3. Distribuer 0,5 L de solution de spécimen sur le modèle ou la couche de graphène. Assurer une procédure de travail en douceur pour minimiser les changements de concentration dus à l'évaporation.
  4. Placez la grille TEM sur la couche Si3N4 micro-modelée avec le graphène face au modèle. Appuyez sur la grille TEM recouverte de graphène sur le modèle. Veillez à ne pas détruire la membrane inférieure Si3N4.
  5. Enlever l'excès de solution avec un tissu pour accélérer le séchage cellulaire et ainsi atténuer les changements de concentration (Figure 4a). Après environ 2 à 3 min, l'interaction entre le graphèneEte3N4 van-der-Waals scelle suffisamment la cellule liquide (Figure 4b). Sinon, laissez la cellule sécher complètement sans enlever l'excédent de solution. Ce dernier offre un taux de réussite plus élevé dans le traitement cellulaire. Cependant, on s'attend à ce que les changements de concentration basés sur l'évaporation dans la solution de spécimen soient plus graves en utilisant cette approche.
    REMARQUE : Le processus de séchage réussi peut être vérifié avec un changement de contraste dans la périphérie (comparez la figure 4a,b).
  6. Retirez soigneusement la grille TEM à l'aide d'une pince à épiler en poussant une pince à épiler entre la grille et le cadre GSMLC.
    REMARQUE : Les mouvements d'éruption peuvent briser la membrane sous-jacente. Pour réduire les dommages causés par la force de cisaillement, commencez à partir du site de la grille parallèlement au bord de la fenêtre plus petit.
  7. Vérifier si au moins une membrane du GSMLC est encore intacte par microscopie optique (figure 4c). Si toutes les membranes étaient cassées, LCTEM serait impossible.

5. Tem Imagerie et analyse vidéo

  1. Chargez l'échantillon à un (S)TEM directement après la préparation à l'aide d'un support TEM standard.
    REMARQUE : Comme il est rapporté pour gLCs19,GSMLCs peuvent sécher au fil du temps. Par conséquent, le temps entre le chargement et l'imagerie doit être réduit au minimum.
  2. Imagez l'échantillon avec une technique d'imagerie appropriée, selon l'échantillon et le microscope. Ici, un dispositif (S)TEM fonctionnant à une tension d'accélération de 300 kV est utilisé. Utilisez une faible dose pour minimiser les artefacts induits par les faisceaux et un court temps d'exposition pour éviter le flou lié au mouvement34. En cas d'expériences à long terme, bloquez le faisceau pour réduire les dommages causés par les radiations.
    REMARQUE : En raison d'une meilleure résolution temporelle, TEM doit être préféré au STEM pour des analyses cinétiques34 et la réduction réduite d'ion35. STEM, cependant, est préféré pour l'investigation sur les couches liquides épaisses et les éléments à haute z en raison de sa résolution spatiale plus élevée dans les spécimens épais34,35.
  3. Méthode de segmentation de l'image
    1. Utilisez une plate-forme de traitement d'image appropriée pour extraire les fonctionnalités d'intérêt. Pour le suivi et l'analyse des particules, utilisez l'image source openImage-distribution FIJI36.
    2. Utilisez la fonction Analyse des particules pour obtenir des informations précises (zone projetée, barycenter) de chaque particule dans chaque image.
      REMARQUE: Cette fonction nécessite des images binaires.
    3. Connectez les particules entre les cadres à l'aide du plugin TrackMate37. Par défaut, TrackMate est à la recherche de particules brillantes sur un fond sombre, afin d'inverser les images (dans le cas de BF-TEM) avant de commencer TrackMate.
    4. Combinez les résultats de TrackMate et Analyze Particles avec un script approprié en utilisant l'écosystème open source basé sur Python SciPy38,39.
    5. Utilisez FIJI pour extraire les contours précis de structures plus complexes telles que les dendrites. Ici, les particules d'analyse peuvent être appliquées, aussi bien (voir l'enset de la figure 6a).
      REMARQUE : Il peut être possible d'analyser manuellement les entités d'intérêt.

Representative Results

Après le chargement de la cellule, un transfert réussi de graphène est indiqué par un aspect différemment ombragé sur les puits sous un microscope optique. Ceci est visible, par exemple, dans la membrane droite de la figure 3c. Comme mentionné, il est crucial d'enlever soigneusement le TEM-grid afin de ne pas briser la mince couche Si3N4. En cas de membrane cassée, les résidus de lucent et de courbe sont clairement visibles dans le microscope optique, comme le montrent les deux membranes gauches de la figure 3c. En raison des multiples zones d'observation dans la conception utilisée GSMLC, la cellule peut être utilisée aussi longtemps qu'au moins une membrane est intacte. Les membranes brisées peuvent être utilisées pour l'alignement TEM sans exposer le spécimen au faisceau d'électrons.

Une encapsulation réussie de la solution de spécimen peut être vérifiée pendant la microscopie électronique. La figure 5 présente des micrographies individuelles de la vidéo supplémentaire 1, où la dissolution d'un ensemble de nanoparticules et la croissance d'une structure dendritique sont évaluées statistiquement dans un GSMLC. Outre le mouvement induit par la dérive de l'image, des mouvements individuels mineurs de particules orthogonales sont visibles, ce qui indique que des particules en solution sont présentes. En outre, la prévalence de la dissolution des particules prouve qu'une réaction chimique humide est présente, ce qui ne serait pas possible sans une fermeture liquide réussie. D'autres indications typiques pour les liquides fermés sont la formation de bulles induites par le faisceau19 ou le mouvement des particules. La présence de particules Au dans les cellules graphènes seulement n'indique pas de façon concluante un environnement liquide, puisque les particules pourraient également provenir de la réduction induite par le graphène de HAuCl440. Une quantification des pics d'oxygène du liquide clos par spectroscopie de perte d'énergie électronique (EELS) peut également être effectuée pour vérifier un environnement liquide41.

Afin d'obtenir un aperçu de la croissance des particules et de la cinétique de dissolution, il est important d'étudier chaque particule individuellement plutôt que d'analyser le développement des paramètres moyens42. Il est également crucial d'exclure les particules aux bords du cadre qui ne sont que partiellement capturées par la caméra parce que les changements de position liés à l'effet de dérive de ces particules peuvent être confondus comme des processus de croissance ou de dissolution. On croit que l'éteinage est causé par des espèces oxydantes générées par la radiolyse induite par le faisceau d'électrons43. Afin de produire des statistiques suffisantes, le suivi computationnel des particules uniques est nécessaire. En estimant l'exposant de croissance de la variation de rayon équivalente des particules individuelles au fil du temps, l'information de la cinétique de réaction sous-jacente peut être obtenue. Pour ce faire, il est possible d'introduire un rayon équivalent basé sur la zone de particules projetée, même si toutes les particules ne sont pas complètement sphériques6,44. La figure 5b montre le suivi de radii équivalent au fil du temps pour six particules représentatives qui sont mises en évidence dans la figure 5a. La figure 5c montre la distribution de l'activité sur la base de 73 particules dissolvantes de la présente étude. Seules les particules où un modèle allométrique explique la baisse du rayon à au moins 50% (coefficient de détermination ajusté) sont considérées.

En outre, une structure dendrite émerge rapidement après environ 42 s dans le même puits représenté dans la figure 6a. La formation de Dendrite est un autre processus typique et bien documenté dans les cellules liquides45,46. Pour quantifier la croissance du dendrite, les contours structurels (voir l'enset à la figure 6a) sont analysés. L'évolution du rayon de pointe et de la vitesse au fil du temps (voir figure 6b,c) révèle la relation hyperbolique prévue47 (Figure 6d). La croissance de Dendrite est provoquée par la supersaturation locale des Au-ions due à la gravure de particule mentionnée ci-dessus. Dans la figure 5a, il est clairement visible que les particules se dissout encore tandis que le système sursaturé se détend dans la croissance dendrite. Cela peut être causé par des variations de concentration locales dans les Au-ions et les espèces oxydatives en raison de la viscosité élevée du liquide dans le GSMLC qui a été observée avant6. Une discussion détaillée de ce phénomène, cependant, est au-delà de la portée de ce travail.

Figure 1
Figure 1 : Croquis d'un GSMLC : Schémas de la structure d'une cellule liquide micropuits supportée par le graphène. Réimprimé à partir de https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. D'autres autorisations doivent être adressées à l'American Chemical Society (ACS). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Fabrication de cadres GSMLC. Le processus de fabrication des cadres GSMLC est schématiquement esquissé. a) Oxydation de la plaquette Si après le nettoyage. b) LPCVD de Si3N4. c) Côté avant Si3N4 modelage par photolithographie et RIE pour définir le volume cellulaire. d Dépôt de Si3N4 pour former la fenêtre de la cellule inférieure. e) Lithographie arrière et RIE. f Micromachining en vrac avec KOH pour créer une membrane autonome Si3N4 contenant des micropuits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Transfert de peu de couches DEV-graphène avec couche de protection PMMA sur un TEM-grille. Le transfert de peu de couche de graphène CVD sur PMMA sur le dessus d'un trou édulcé en du carbone TEM-grille est affiché. a) Immersion du graphène CVD à quelques couches sur PMMA dans un plat Petri rempli d'eau DI. b) La pile de graphène/PMMA transférée sur un papier filtre est découpée en morceaux appropriés pour couvrir les cadres GSMLC. c) Réimmersion d'une pièce de graphène/PMMA coupée. d Transfert de la couche de graphène/PMMA sur une grille TEM enduite de carbone (e) Graphène/PMMA après un transfert réussi. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Enlèvement de la grille TEM supérieure. Le processus de séchage d'un GSMLC chargé est documenté à l'aide d'un microscope optique. a) Une grille TEM recouverte de graphène est placée au-dessus du GSMLC directement après le chargement. La couche de graphène est visible sous forme de rectangle turquoise couvrant les trois zones d'observation. Ses contours sont grossièrement esquissés par le rectangle noir. b) Une membrane presque entièrement adhérente est visible par le changement de contraste entre l'humide (obscurité, comparer avec (a)) et la zone adhérente (turquoise) après environ deux minutes. c Un GSMLC après le décollage de la grille TEM est montré, révélant deux membranes cassées (gauche et milieu), et une membrane avec des micropuits chargés et scellés avec succès (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Développement représentatif des nanoparticules radii. Le développement du rayon de 183 particules individuelles a été suivi. a) Séquence d'images tirée de la vidéo supplémentaire 1. Six particules représentatives sont mises en évidence. Les cercles colorés correspondent au rayon équivalent obtenu. b) parcelle logarithmique du radii de particule. c L'histogramme de 73 particules où un exposant allométrique négatif a été déterminé à l'aide d'une routine automatisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Dynamique dendrite : Le rayon de pointe de cinq branches dendrite est analysé. Les barres d'erreur expliquent l'écart type respectif. (a) Séquence d'image tirée de la vidéo supplémentaire 1 montrant la dendrite émergente, qui est visible après environ 42 s. L'enset dans la bonne image montre les contours de dendrite en évolution. Ici, les contours roses correspondent à 42,09 s, rouge à 42,7 s, et violet à 43,3 s. (b) Développement du rayon de pointe (moyenne) au fil du temps. c) La vitesse moyenne de pointe tracée au fil du temps. d Le rayon de pointe moyen tracé de façon logarithmatique par rapport à la vitesse moyenne de pointe, révélant une dépendance hyperbolique (courbe orange). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : IMAGE SEM d'un GSMLC chargé : Une image SEM représentative acquise en mode STEM HAADF dans un SEM d'un GSMLC chargé à basse tension d'accélération (29 kV) est affichée. Outre les micropuits de 5 m de large, deux grilles circulaires de carbone troué partiellement superposées (2 m de diamètre) provenant du transfert de graphène élucidé ci-dessus sont visibles. La première grille de carbone découle d'un transfert infructueux de graphène. Il est clairement visible que l'ombrage de la membrane reste la plupart du temps constant sur la région du puits, mais s'assombrit légèrement vers le centre du puits. Cela explique la faiblesse, le gonflement négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo supplémentaire 1 : Vidéo in situ montrant les résultats représentatifs d'une étude TEM de champ lumineux de cellules liquides de la gravure des nanoparticules d'Au et de la croissance suivante d'une structure de dendrite provoquée par la supersaturation de la solution environnante de spécimen. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Contrairement aux cellules liquides disponibles dans le commerce, les GSMLC sur mesure ont l'avantage qu'ils peuvent être conçus pour s'adapter à des supports TEM facilement disponibles et ne nécessitent pas un support de TEM à cellules liquides coûteuses et dédiées.

L'architecture GSMLC démontrée ici combine des aspects de SiLCets et GLCs qui pourraient potentiellement mener à des avantages uniques. D'une part, les SiLC permettent une détermination précise de la position et de la forme des cellules, mais nécessitent des membranes Si3N4 relativement épaisses pour réduire les effets de gonflement tout en réduisant finalement la résolution réalisable. Les GLC, d'autre part, présentent des murs membranaires exceptionnellement minces composés de graphène, mais souffrent de tailles et de positions aléatoires de poche. En combinant ces deux approches membranaires par l'intermédiaire des GSMLC, la limitation de résolution causée par les limites cellulaires35 peut être contournée. Comme la structure du puits est fabriquée directement dans la couche Si3N4, la membrane Réelle Si3N4 peut être construite encore plus petite que dans les SiLC, simplifiant les analyses HRTEM qui ont déjà été démontrées dans les GSMLCs6 . Néanmoins, il convient de noter que HRTEM en général est possible avec SiLCs ainsi48. En outre, de grandes zones d'observation peuvent être réalisées sans renflement de fenêtre sévère en raison des petites zones membranaires des chambres individuelles de spécimen. Par conséquent, l'augmentation de l'épaisseur liée au renflement35 peut être exclue dans une large mesure, comme le montrent Dukes et al.,49. Ceci est démontré dans la figure 7, où une image sTIM représentative du champ noir annulaire à angle élevé (HAADF) de GSMLC chargé est affichée. Cette image a été acquise à l'aide d'un système à faisceau double. Étant donné que la luminosité de l'image acquise dans cette configuration est directement liée à l'épaisseur du spécimen, il est clairement visible que les micropuits scellés ne présentent que de petits gonflements négatifs. Kelly et coll.24 ont démontré que le renflement négatif et le séchage partiel des puits visibles à la figure 7 dépendent du diamètre du puits. La réduction du diamètre du puits est donc une approche réalisable pour homogénéiser encore plus l'épaisseur du liquide.

En raison de la forme de poche d'équilibre des GLC, l'épaisseur liquide est également fortement dépendante du site35. Les SiLC suivent la conception de deux membranes provenant de différentes plaquettes Si. En remplaçant la membrane supérieure Si3N4 par du graphène, la fabrication des cellules liquides est simplifiée. Cela signifie qu'il est possible d'éviter la délamination possible de deux plaquettes Si-wafers collées pendant les étapes de gravure humide subséquentes et d'omettre l'alignement de deux morceaux de plaquettes pendant le chargement cellulaire. La surface plane d'un côté de cette architecture cellulaire permet des méthodes d'analyse in situ complémentaires telles que l'analyse EDXS du spécimen6, qui est limitée dans les architectures Classiques SiLC par des effets d'ombre à des bords Si raides50 .

L'étanchéité des micropuits pré-modèles avec du graphène sur le fond et le haut du puits a été démontré avant24,25. L'application de deux membranes de graphène peut améliorer la résolution réalisable. Un double transfert de graphène, cependant, compliquerait le processus de préparation davantage; d'autant plus que cela s'est avéré être l'étape de préparation la plus sensible (voir ci-dessous). En outre, on s'attend à ce que le renflement discuté ci-dessus de membrane soit encore plus critique dans le cas de deux membranes de graphène, parce que le graphène est beaucoup plus flexible qu'une couche de Si3N4. Dans ces architectures, les micropuits ont été construits à l'aide de faisceaus ioniques séquentiaux concentrés (FIB) fraisage. Bien que cette approche ait prouvé qu'elle donne des résultats de haute qualité, le broyage FIB est une technique de production cellulaire complexe et coûteuse. L'utilisation massivement parallèle de techniques de modelage à un seul coup qui sont déjà standard dans l'industrie des semi-conducteurs d'aujourd'hui, comme le nanoimpression ou la photolithographie, a cependant l'avantage majeur d'être rapide, bon marché et évolutif pour la production de masse.

Il convient de noter que l'approche présentée ici ne permet pas le fonctionnement du flux liquide, ce qui est réalisable par d'autres conceptions28. Étant donné que le volume de chargement et de liquide est comparable pour les GSMLC et les GLC, une contamination du vide élevé due à la rupture de la membrane peut être évitée19. Cela élimine la nécessité d'une vérification des joints encombrants. Bien que les avantages des SiLC et des GLC aient été combinés, les inconvénients des deux approches sont toujours présents dans les GSMLC. La fabrication des cellules nécessite une infrastructure de pièce propre pour la technologie de silicium, qui n'est pas nécessairement présente dans les laboratoires TEM. En outre, la charge liquide n'est pas anodine. Il nécessite une formation dédiée, similaire aux cellules de graphène. Cela, cependant, est également vrai pour les systèmes disponibles dans le commerce. Ici, l'étape de préparation la plus sensible est l'élimination du TEM-grille après le transfert de graphène parce que les mouvements d'éruption cutanée ou de nervosité est susceptible de briser la couche Si3N4. Les fenêtres membranaires redondantes, cependant, augmentent les chances de préserver au moins une zone de membrane. En conséquence, le rendement (quantité de puces GSMLC opérables) atteint par un expérimentateur formé est de trois sur quatre6, et dépasse ainsi celui réalisé avec des cellules à base de graphène (un à deux sur quatre)19.

Comme pour les GLC, l'encapsulation liquide dans les GSMLCs est basée sur les interactions van-der-Waals18. Par conséquent, la contamination de l'interface pourrait réduirele taux de réussite dans le traitement des GSMLC19 . En outre, selon la constante Hamaker de la phase liquide à être-encapsulée, les caractéristiques de mouillage au cours de la procédure de chargement (et donc le rendement réalisable) peuvent différer51 et donc la préparation peut être compliquée. Notre expérience montre que c'est le cas si, par exemple, des espèces amphiphiles sont présentes.

L'architecture GSMLC permet une configuration flexible des profondeurs, permettant l'adaptation à diverses conditions préalables expérimentales. En outre, l'architecture convient aux études de tomographie électronique sur une large plage d'angle d'inclinaison de 75 euros, ce qui permettrait également une tomographie électronique in situ 52. Par conséquent, la tomographie in situ et post mortem de spécimen dans le liquide pourrait également être établie avec Des GSMLCs.

Disclosures

Nous n'avons rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Tilo Schmutzler pour la préparation de la solution HAuCl 4. En outre, nous remercions R. Christian Martens pour la lecture de la preuve. Soutien financier de la Fondation allemande de recherche (DFG) via le groupe de formation à la recherche GRK 1896 « Microscopiein situ avec électrons, rayons X et sondes de balayage » et par l'intermédiaire du Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM "Engineering of Advanced Materials" est reconnaissants reconnus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals 50488858 VLSI
Deionized water own production
Dumont Anti-Capillary tweezers Carl Roth GmbH + Co. KG LH72.1 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed
Ethanol VWR Chemicals 85651.360 VLSI
FIJI Is Just ImageJ FIJI.sc Version 1.51
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids Plano GmbH S173-8 R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl4 · 3 H2O crystal Alfa Aesar 36400.06 5 g
Jupyter Notebook Project Jupyter Version 5.7.2
Matplotlib-Package John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team Version 3.0.2
NumPy-Package NumPy developers Version 1.15.4
Pandas-Package AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team Version 0.23.4
Python Python Software Foundation Version 3.7
Scipy-Package SciPy developers Version 1.1.0
Seaborn-Package Michael Waskom Version 0.9.0
Si wafer Siegert Wafer GmbH Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished
single tilt TEM holder Philips Ensure that cell fits
Transmission Electron Microscope Philips CM 30 (S)TEM 300 kV
Trivial Transfer Graphene ACS Material TTG60011 PMMA-covered, 6 -- 8 MLs

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References

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Chimie Numéro 149 cellule liquide TEM in situ nanoparticules synthèse gravure croissance or cinétique graphène dendrite suivi des particules uniques
Préparation de cellules liquides Microwell soutenues par le graphène pour la microscopie électronique de transmission <em>in situ</em>
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Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M.… More

Hutzler, A., Fritsch, B., Jank, M. P. M., Branscheid, R., Spiecker, E., März, M. Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (149), e59751, doi:10.3791/59751 (2019).

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