Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Användning av Micro röntgen datortomografi med Phosphotungstic syra förberedelse för att visualisera mänskliga Fibromuskulära vävnad

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59752

Summary

Micro röntgen datortomografi är effektivt för att få tredimensionell information från oskadade mänskliga exemplar men har begränsad framgång i observation av mjuk vävnad. Användningen av fosfotungstic Acid kontrastmedel kan lösa detta problem. Vi genomfört detta kontrastmedel för att undersöka mänskliga känsliga fibromuskulära vävnader (den orbicularis behålla ligament).

Abstract

Manuell dissektion och histologisk observation är vanliga metoder som används för att undersöka mänskliga vävnader. Manuell dissektion kan dock skada ömtåliga strukturer, medan bearbetning och histologisk observation ger begränsad information genom tvärsnitts avbildning. Micro X-ray datortomografi (microCT) är ett effektivt verktyg för att få tredimensionell information utan att skada prover. Emellertid, det visar begränsad effektivitet i att differentiera mjukdelar. Användning av kontrasthöjande medel, som fosfotungstic syra (PTA), kan lösa detta problem genom att förbättra mjuk vävnad kontrast. Vi genomförde microCT med PTA för att undersöka den mänskliga orbicularis behålla ligament (ORL), som är en känslig struktur i omloppsbana området. I denna metod är skördade exemplar fixerade i formalin, uttorkad i seriella etanol lösningar och färgas med en PTA-lösning. Efter färgning, microCT skanning, 3D rekonstruktion, och analys utförs. Hud, ligament, och muskler kan vara tydligt visualiseras med denna metod. Provstorleken och infärgnings tiden är viktiga egenskaper hos metoden. Den lämpliga preparat tjockleken var ca 5 – 7 mm, över vilken processen bromsades, och den optimala varaktigheten var 5 – 7 dagar, under vilken ett tomt hål i det centrala området emellanåt inträffade. För att bibehålla placeringen och riktningen av små bitar under skärning, rekommenderas sömnad på samma region i varje del. Dessutom behövs preliminära analyser av den anatomiska strukturen för att korrekt identifiera varje del. Parafilm kan användas för att förhindra torkning, men försiktighet bör iakttas för att förhindra prov förvrängning. Vår multidirektionell observation visade att ORL består av en flerskiktade meshwork av kontinuerliga plattor, snarare än tråd-liknande fibrer, som rapporterats tidigare. Dessa resultat tyder på att microCT scanning med PTA är användbart för att undersöka specifika avdelningar inom komplexa strukturer av mänsklig vävnad. Det kan vara till hjälp i analyserna av cancer vävnader, nerv vävnader, och olika organ, som hjärtat och levern.

Introduction

Manuell dissektion och histologisk observation används vanligtvis för att undersöka mänskliga vävnader, såsom muskler och bindväv. Manuell dissektion kan dock lätt skada ömtåliga strukturer, och histologisk observation ger begränsad information om plana tvärsnittsytor1,2. Därför behövs förbättrade metoder för att undersöka vävnader mer exakt och effektivt.

Konventionell datortomografi (CT) används i allmänhet i klinisk praxis, men det saknar förmågan att skilja små strukturer2,3. Micro X-ray CT (microCT) är ett effektivt verktyg för att få tredimensionell (3D) information av små strukturer från prover, utan att förstöra dem. Men microCT har begränsade tillämpningar eftersom endast täta vävnader kan visualiseras tydligt; Det kan inte användas för att differentiera mjuk vävnad. För att övervinna denna begränsning kan infärgnings medel användas. Kontrast-höjande medel, som fosfotungstic syra (PTA), phosphomolybdic syra, och Lugols jod, förbättra mjuk vävnad kontrast hastighet under skanning4,5. Flera studier som jämförde dessa substanser tyder på att PTA uppvisar goda resultat och är lätt att hantera6,7,8.

Den orbicularis behålla ligament (ORL) är en känslig struktur runt omloppsbana, som lätt kan skadas under konventionell observation9. Vi granskade och framgångsrikt hämtade 3D-information om denna struktur med hjälp av microCT med PTA som kontrastmedel. Denna metod kan tillämpas på studier på andra mänskliga vävnader, såsom hjärta och lever, med lämpliga modifieringar10,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla kadaver utnyttjas i denna studie var lagligt donerats till kirurgisk anatomi Education Centre vid Yonsei University College of Medicine.

1. erhållande av prover

  1. Rita en snitt linje på kadaver med en färgad penna för att indikera skärområdet för prov skörd. Kontrollera att snittet linjen dras sträcker medialt till en medial canthus, sidled till en lateral canthus, fint till en överlägsen gräns för det undre ögonlocket, och inferiorly till 1 cm under linjen från orbital RIM.
    Observera: Överväg urvalsstorleken baserat på den maximala skanningsstorleken på mikro-CT-utrustningen (vår utrustning kan förvärva en bild med en maximal objekt dimension på 7 × 7 cm). Här, ett prov ca 1 cm i bredd, 3 cm i längd, och 1,25 g vikt skördades från ORL regionen.
  2. Skär ansikts vävnaderna efter snitt linjen med ett blad. Se till att snittet är djupt så att spetsen på bladet vidrör benet. Provet måste omfatta huden, subkutan vävnad, muskler, fett, och periostet.
  3. Fixera provet i 10% formalin omedelbart och bevara det i 5 till 7 dagar i rumstemperatur (figur 1a).
    Obs: både balsamerade och färska kadaver kan användas för denna studie. Fixeringslösningen för kadaver kan dock skilja sig något från den lösning som används i ett biologiskt experiment. Därför föreslår vi att fastställa provet med 10% formalin igen även efter att ha fått provet från balsamerade kadaver.

2. förberedelse för färgning

  1. Efter fixering, skiva provet i 3 stycken (5 – 7 mm i tjocklek). Förlora inte platsen och riktningen för varje del under denna process.
    Obs: microCT Scanner vi använder kan täcka en maximal storlek på 7 cm ³, men PTA lösningen kan inte penetrera provet framgångsrikt om det är för tjockt.
  2. Sy den superolaterala sidan av varje del med hjälp av en nål och svart tråd så att riktningen av provet kan kontrolleras senare.
  3. Torka provet i en serie på 30%, 50% och 70% etanol lösningar för 1 dag vardera.
  4. Placera provet i 70% etanol till färgning.

3. PTA förberedelser

  1. Påbörja PTA-infärgningsprocessen 1 vecka innan microCT-skanning planeras.
  2. Förbered 210 mL av 70% etanollösning och tillsätt 2,1 g PTA ström till den. Blanda väl med en shaker vid 55-60 RPM.
    Obs: koncentrationen av PTA-lösningen bör vara 1% i etanol.
  3. Förbered 3 70 mL plastbehållare för varje skivad bit. Fyll containrarna med PTA-lösningen. Blötlägg proverna i behållarna och placera dem på en shaker för effektiv penetration. Lämna proverna i 5 – 7 dagar (figur 1b).
  4. När infärgning är klar, förvara provet i 70% etanol för att förbereda för skanning.
    Anmärkning: de färgade proverna kan bibehållas i flera månader, men det rekommenderas att proverna skannas så snart som möjligt för att säkerställa full färgning.

4. MicroCT skanning

  1. Linda provet med parafilm för att förhindra torkning. Linda inte proverna för hårt, eftersom det kan leda till deformation.
  2. Öppna skannern och placera provet i facket (bild 2).
  3. Ställ in skannings parametrarna enligt följande: källspänning (kV) = 70, käll ström (μA) = 114, Al-filter = 0,5 mm, bild pixelstorlek (μm ²) = 20, pixlar = 2240 × 2240, exponering (MS) = 500, rotations steg (deg) = 0,3.
    Anm.: parametrarna kan ändras i enlighet med de prover och/eller skannrar som används.
  4. Börja skanna.
    Obs: skanning tar 30 till 60 min beroende på den avsedda upplösningen och skannerns hastighet.

5. rekonstruktion och optimering av data

  1. Kör återuppbyggnadsprogram varan. Välj Öppna datauppsättningåtgärder -menyn för att starta de skannade filerna.
  2. Välj fliken Inställningar i fönstret rekonstruktion . Ställ in parametrarna enligt följande: Ring artefakter minskning = 7, beam-härdning korrigering (%) = 40.
    ANMÄRKNINGAR: parametrarna kan ändras enligt provet.
  3. Påbörja återuppbyggnaden genom att välja Start på fliken Start . De slutliga uppgifterna kommer att lagras i den utsedda mappen.
  4. Kör filen storleksändring programvara. Välj källdatauppsättning för att starta de rekonstruerade filerna.
  5. Välj jpg på fliken mål datauppsättning .
  6. Välj alternativet storleksändring 1/2 med ett kvalitets alternativ för ingen interpolation (snabb).
  7. Justera bildfältet till 100 (högst) på fliken bildkomprimering . börja konvertera.
    ANMÄRKNINGAR: storleksändring alternativet är att undvika att sakta ner datorns hastighet när 3D återges; Det kan dock resultera i lägre upplösning när storleksändras i stor utsträckning. Vi föreslår att du ändrar storlek på hälften för acceptabel upplösning med bättre hantering.

6.3D-rekonstruktion

  1. Kör programvaran för 3D-volymrendering.
  2. Välj åtgärderläsa in volymdata för att starta datauppsättningen.
  3. Justera nivån för ljusstyrka och kontrast genom att ändra funktionen för form överföring i histogram på fliken Överföringsfunktionseditor .
  4. Välj alternativ > belysning.
  5. Välj skuggor och ytljusikoner . Dessa effekter ger en realistisk modellerings ton.
  6. Hitta den bästa vyn genom att flytta (Klicka och dra), rotera (högerklicka och dra) och zooma in eller ut (Bläddra) modellen.
  7. Skjut planet (Skift + klicka och dra i den inre riktningen) för att Visa sektions bilderna (figur 3).
  8. Aktivera ljus ikonen. Justera belysningen indikerings listen och hitta den bästa belysningen för visning. Stäng sedan av ikonen och Stäng fliken belysning .
  9. Välj alternativ > Visa > urklipps ruta för att dölja rutan för den slutliga bilden.
  10. Välj åtgärder > Spara bilden för att lagra bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den detaljerade återuppbyggnaden av ORL uppnåddes genom microCT med PTA preparat (figur 4). Den ligamentösa fibromuskulära struktur som sträcker sig snett mellan dermis och periostet observerades tydligt (figur 4a). I den koronala vyn (figur 4b) ökade fibrernas mängd och komplexitet lateralt. I den horisontella vyn (figur 4c) observerades en utarbetad meshwork med en arboriserad formation. Vi observerade en form som kännetecknas av kontinuerliga plattor, snarare än tråd-liknande fibrer, som rapporterats tidigare. I sagittal Visa (figur 4D), tjocklekar av ORL fibrerna minskade inferiorly. Sammantaget visade denna multiriktade observation att ORL består av en flerskiktade meshwork av kontinuerliga plattor med variation i antal och tjocklek beroende på plats.

Figure 1
Figur 1. Proverna skördades och sedan färgas med PTA lösning.
A)proverna fastställdes i 10% formalin efter skörd. (B). proverna kapades i tunnare bitar för att öka penetrationen och placerades sedan i PTA-lösningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. MicroCT-skannern.
Pilen indikerar det magasin där preparatet är placerat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. 3D-rekonstruktion.
Skjut in planet i den inre riktningen för att Visa sektions bilderna inuti. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. 3D-bilder av ORL.
(A). den övergripande bilden av ORL. (B). Koronal vy. (C). horisontell vy. (D)sagittal beskådar. S, överlägsen; A, anterior; L, lateral; P, posterior. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Analyserade strukturerna i ORL.
Gult, rött och grönt indikerar huden, muskeln, och ligament, respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1. Jämförelse mellan 3D-och 2D-bilder. (A). volym renderad 3D-bild. (B). tvärsnitts 2D-bild. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande figur 2. Inslagning och fixering av parafilm. (A). inslagning av parafilm över hela provet för att förhindra uttorkning. (B). parafilm hjälper till att fixera provet ordentligt på skannern. (C). parafilm är inte synlig på MicroCT skanning och kan subtrapareras lätt. Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande figur 3. Otillräcklig färgning av PTA. En ihålig plats i mitten visar var PTA lösningen inte har trängt tillräckligt. (A). volym renderad 3D-bild. (B). tvärsnitts 2D-bild. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande figur 4. Jämförelse mellan färska och balsamerade kadaver. Inga skillnader konstaterades mellan färska och balsamerade kadaver för att tillämpa protokollet. Bilden visar en annan funktion kan tas med samma metod också. A )den ORL som erhålls från en ny kadaver. (B). nasolabiala veck erhålls från en balsamerad kadaver. Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi genomförde microCT med PTA förberedelse vid undersökning av mänskliga mjukdelar. Kort, prover skördas och fixeras i formalin för ett par dagar, följt av uttorkning i seriella etanol lösningar. Att placera provet i PTA-lösningen direkt efter formalin fixering kan resultera i vissa vävnads sprickor på grund av snabb uttorkning. Därför, seriell dehydrering behövs innan PTA färgning. Därefter färgas proverna med PTA-lösningen i ungefär en vecka. MicroCT scanning, 3D rekonstruktion, och analys kan sedan utföras. Vårt mål var att iaktta ORL och angränsande strukturer med denna metod. Vi presenterade framgångsrikt vävnaden som en 3D-modell. Hud, ligament och muskler var tydligt visualiseras (figur 5).

Flera punkter bör övervägas när proverna bearbetas. Storleken på ett provexemplar och varaktigheten av färgning är huvudsakliga oro. Efter flera pilotstudier fann vi att den korrekta tjockleken på ett preparat är ca 5 – 7 mm och att Färgnings tiden är 5 – 7 dagar. I dessa tillstånd penetrera PTA-lösningen preparatet med en hastighet av cirka 1 mm/dag. Om tjockleken överskrider 7 mm ökar bearbetningstiden. När infärgnings tiden är otillräcklig jämfört med provexemplarets volym, kan den slutliga bilden innehålla ett tomt hål i provexemplarets centrala del. Detta inträffar ofta, särskilt på hud nivå, och ta bort onödig hud kan förbättra färgning effektivitet. När varaktigheten är för lång, kommer hela provet att överfärgas, vilket gör det svårt att identifiera varje fack. Mer ytterligare studie på den optimala varaktigheten för att infärgning större prov kunde bevisa användbart.

Vanligtvis är preparatet uppdelad i bitar för att öka penetration; Det är viktigt att komma ihåg placeringen och riktningen för varje preparat under denna process. För att bibehålla denna information, rekommenderas sömnad på samma region i varje del. Tråden kommer att ses i den slutliga bilden, och man bör vara försiktig så att tråden inte stör huvudområdet. Till exempel kan sömnad på den superolaterala regionen i varje del vara till hjälp. Dessutom behövs preliminära analyser av en anatomisk struktur för att känna igen varje vävnads del på grund av deras komplexitet.

Parafilm och andra material används för att förhindra att proverna torkar ut. Små missbildningar kan dock förekomma vid inslagning av preparat. Det är viktigt att bevara den ursprungliga formen i största möjliga utsträckning. Ibland används ett flytande rör, i stället för parafilm. Men även den minsta darrande av en maskin har potential att påverka röret under skanning och kan minska tydligheten i den slutliga bilden.

Det finns flera begränsningar i detta tillvägagångssätt. För det första kan detta protokoll inte göras med ett levande objekt. Dessutom begränsas urvalsstorleken av microCT-skannerns maximala skanningsstorlek. Det kan finnas fel vid analys av den renderade bilden av blotta ögat; Därför kan ytterligare histologiska experiment behövas för att bekräfta resultaten. Det kan finnas liten dimensionell förvrängning under beredningen; Vi anser dock att detta inte påtagligt påverkar resultatet av studien.

MicroCT scanning med PTA förberedelse är fördelaktigt för att undersöka specifika avdelningar inom en komplex struktur. Denna studie fokuserade på utvecklingen av en metod för att öka kontrasten hastighet med hjälp av PTA förberedelse, och andra funktioner, som skanning och rekonstruktion processer, angavs kortfattat. Dock bör läsarna kunna få samma resultat om de använder samtida microCT skannrar och bild-analysera program efter färgning processen. Denna metod kan vara till hjälp i analyserna av cancer vävnader och strukturer, nerv bidrag i specifika områden, och högupplöst anatomiska strukturer av organ, såsom hjärtat och levern13,14,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Studien stöddes av ett fakultets forskningsanslag från Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Författarna tackar de människor som mycket generöst donerade sina kroppar till Yonsei University College of Medicine. Vi är tacksamma till jun Ho Kim och Jong Ho Bang för deras tekniska stöd (personal i kirurgisk anatomi Education Centre vid Yonsei University College of Medicine). Vi är också tacksamma mot Genoss co., Ltd. för högkvalitativa microCT scanning system som används i denna forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate
Phosphotungstic acid
Junsei 84220-0410 PTA powder
CTvox Bruker ver 2.7 3D recon software
Nrecon Bruker ver 1.7.0.4 Reconstruction software
Skyscan Bruker 1173 MicroCT scanner
Tconv Bruker ver 2.0 File resizing software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

Tags

Bioteknik Micro röntgen-datortomografi phosphotungstic syra mänsklig vävnad fibromuskulära vävnad 3D anatomi kontrastmedel
Användning av Micro röntgen datortomografi med Phosphotungstic syra förberedelse för att visualisera mänskliga Fibromuskulära vävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O, J., Kwon, H. J., Kim, S. H., Cho, More

O, J., Kwon, H. J., Kim, S. H., Cho, T. H., Yang, H. M. Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue. J. Vis. Exp. (151), e59752, doi:10.3791/59752 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter