Brug af mikro røntgen-computertomografi med Phosphotungstic syre præparat til at visualisere humant Fibromuskulær væv

Summary

Micro X-ray computertomografi er effektiv til at opnå tredimensionelle oplysninger fra ubeskadigede humane prøver, men har begrænset succes med at observere bløde væv. Brugen af wolframphosphorsyre syre kontrastmiddel kan løse dette problem. Vi implementerede denne kontrastmiddel til at undersøge humant delikat fibromuskulære væv (musculus fastholdelse ligament).

Abstract

Manuel dissektion og histologisk observation er almindelige metoder, der anvendes til at undersøge humane væv. Men manuel dissektion kan beskadige sarte strukturer, mens behandling og histologisk observation giver begrænset information gennem tværsnits dannelse. Micro X-ray computertomografi (microCT) er et effektivt værktøj til at opnå tredimensionelle oplysninger uden at beskadige prøver. Det viser imidlertid begrænset effektivitet i differentiering af bløddels dele. Brug af kontrast-styrke agenter, ligesom wolframphosphorsyre syre (PTA), kan løse dette problem ved at forbedre blødt væv kontrast. Vi implementerede microct med PTA til at undersøge den menneskelige musculus fastholdelse ligament (ORL), som er en delikat struktur i kredsløb område. I denne metode er høstet prøver fastgjort i formalin, dehydreret i serielle ethanol løsninger, og farvet med en PTA opløsning. Efter farvning, microCT scanning, 3D rekonstruktion, og analyse udføres. Hud, ledbånd, og muskler kan tydeligt visualiseret ved hjælp af denne metode. Prøvestørrelsen og varigheden af farvning er væsentlige træk ved metoden. Den egnede prøve tykkelse var omkring 5 – 7 mm, over hvilken processen blev bremset, og den optimale varighed var 5 – 7 dage, hvorunder et tomt hul i det centrale område lejlighedsvis opstod. For at bevare placeringen og retningen af små stykker under skæring anbefales det at sy på samme område i hver del. Desuden er der behov for indledende analyser af den anatomiske struktur for at identificere hvert stykke korrekt. Parafilm kan bruges til at forhindre tørring, men der skal udvises forsigtighed for at forhindre præparat forvrængning. Vores multidirectional,, observation viste, at ORL er sammensat af et flerlaget meshwork af kontinuerlige plader, snarere end tråd-lignende fibre, som rapporteret tidligere. Disse resultater tyder på, at microCT scanning med PTA er nyttig til at undersøge specifikke rum inden for komplekse strukturer af humant væv. Det kan være nyttigt i analyserne af kræft væv, nerve væv, og forskellige organer, ligesom hjertet og leveren.

Introduction

Manuel dissektion og histologisk observation anvendes typisk til at undersøge humane væv, såsom muskler og bindevæv. Men manuel dissektion kan nemt beskadige sarte strukturer, og histologisk observation giver begrænset information om flade tværsnits flader^1,2. Derfor er der behov for forbedrede metoder til at undersøge væv mere præcist og effektivt.

Konventionel computertomografi (CT) er generelt anvendes i klinisk praksis, men det mangler evnen til at skelne små strukturer^2,3. Micro X-ray CT (microCT) er et effektivt værktøj til opnåelse af tredimensionelle (3D) oplysninger om små strukturer fra enheder, uden at ødelægge dem. Men, microCT har begrænsede applikationer, fordi kun tætte væv kan visualiseres klart; Det kan ikke bruges til at differentiere bløde væv. For at overvinde denne begrænsning kan farvnings midler anvendes. Kontrast fremmende stoffer, som wolframphosphorsyre syre (PTA), phosphomolybdic syre, og Lugol jod, forbedre blødt væv kontrast sats under scanning^4,5. Flere undersøgelser, der sammenligner disse agenter tyder på, at PTA demonstrerer god ydeevne og er let at håndtere^6,7,8.

Musculus fastholdelse ligament (ORL) er en delikat struktur omkring kredsløb, som let kan beskadiges under konventionel observation⁹. Vi undersøgte og med held hentet 3D-oplysninger om denne struktur ved hjælp af microCT med PTA som et kontrastmiddel. Denne metode kan anvendes til undersøgelser af andre humane væv, såsom hjerte og lever, med passende modifikationer^10,11,12.

Protocol

Alle de kadaveres, der blev udnyttet i denne undersøgelse, blev legalt doneret til Operations centret på Yonsei University College of Medicine.

1. indhentning af prøver

1. Tegn en indsnit linje på Kadaver med en farvet blyant for at angive skæreområdet for prøve høst. Kontroller, at indsnit linjen trukket strækker medielt til en mediale canthus, sideværts til en lateral canthus, overlegent til en overlegen grænse af det nedre øjenlåg, og inferiorly til 1 cm under linjen fra orbital fælgen.
   Bemærk: Overvej stikprøvestørrelsen baseret på den maksimale scanningsstørrelse på mikro-CT-udstyret (vores udstyr kunne erhverve et billede med en maksimal objekt dimension på 7 × 7 cm). Her blev der høstet en prøve på ca. 1 cm i bredden, 3 cm i længden og 1,25 g vægt fra ORL-regionen.
2. Skær ansigtet væv efter indsnit linje med en klinge. Sørg for, at snittet er dybt, så spidsen af klingen rører knoglen. Prøven skal omfatte hud, subkutant væv, muskler, fedt og periosteum.
3. Prøven fastsættes straks i 10% formalin, og den bevares i 5 til 7 dage ved stuetemperatur (figur 1a).
   Bemærk: både balsame og friske Kadaverer kan bruges til denne undersøgelse. Fikserings opløsningen for Kadaverer kan dog afvige en anelse fra den opløsning, der anvendes i et biologisk eksperiment. Derfor foreslår vi at fastsætte prøven med 10% formalin igen, selv efter at have udtaget prøven fra balsammede Kadaverer.

2. forberedelse til farvning

1. Efter fastgørelse, skær prøven i 3 stykker (5 – 7 mm i tykkelse). Du må ikke miste placeringen og retningen af hvert stykke under denne proces.
   Bemærk: den microCT-scanner, vi bruger, kan dække en maksimal størrelse på 7 cm³, men PTA-opløsningen kan ikke trænge igennem prøven med succes, hvis den er for tyk.
2. Sy den superolaterale side af hvert stykke ved hjælp af en nål og sort tråd, således at retningen af prøven kan kontrolleres senere.
3. Dehydrat prøven i en serie på 30%, 50%, og 70% ethanol opløsninger for 1 dag hver.
4. Prøven placeres i 70% ethanol indtil farvning.

3. forberedelse af PTA

1. Begynd PTA-farvningsprocessen 1 uge før Mikroct-scanning er planlagt.
2. Forbered 210 mL 70% ethanol opløsning og tilsæt 2,1 g PTA magt til det. Bland godt ved hjælp af en shaker på 55-60 rpm.
   Bemærk: koncentrationen af PTA-opløsningen bør være 1% i ethanol.
3. Forbered 3 70 mL plastikbeholdere til hvert skiveskåret stykke. Fyld beholderne med PTA-opløsningen. Sug prøverne ind i beholderne, og Placer dem på en shaker for effektiv penetration. Lad prøverne stå i 5 – 7 dage (figur 1b).
4. Når farvningen er færdig, opbevares prøven i 70% ethanol for at forberede scanningen.
   Bemærk: de farvede prøver kan vedligeholdes i flere måneder, men det anbefales, at prøverne scannes så hurtigt som muligt for at sikre fuld farvning.

4. Mikroct-scanning

1. Prøven ompakkes med parafilm for at undgå tørring. Prøverne må ikke pakkes for stramt, da det kan føre til deformation.
2. Åbn scanneren, og Placer prøven på bakken (figur 2).
3. Indstil scannings parametrene på følgende måde: kilde spænding (kV) = 70, kildestrøm (μA) = 114, al filter = 0,5 mm, billedpixel størrelse (μm ²) = 20, pixels = 2240 × 2240, eksponering (MS) = 500, rotations trin (deg) = 0,3.
   Bemærk: parametrene kan ændres i henhold til de anvendte prøver og/eller scannere.
4. Start scanningen.
   Bemærk: scanningen tager 30 til 60 min afhængigt af den tilsigtede opløsning og hastigheden af scanneren.

5. genopbygning og optimering af data

1. Kør genopbygnings softwaren. Vælg Åbn datasæt i menuen handlinger for at starte de scannede filer.
2. Vælg fanen Indstillinger i vinduet rekonstruktion . Indstil parametrene som følger: ring artefakter reduktion = 7, stråle hærdning korrektion (%) = 40.
   Bemærk: parametrene kan ændres i henhold til eksemplet.
3. Begynd genopbygningen ved at vælge Start på fanen Start . De endelige data vil blive lagret i den udpegede mappe.
4. Kør filen resizing software. Vælg kildedata sættet for at starte de rekonstruerede filer.
5. Vælg jpg under fanen destinationsdatasæt .
6. Vælg resizing option 1/2 med en kvalitet mulighed for ingen interpolation (hurtig).
7. Juster slide bjælken til 100 (højest) under fanen billedkomprimering . Begynd at konvertere.
   Bemærk: indstillingen resizing er at undgå at bremse computerens hastighed, når 3D gengives; Det kan dog resultere i lavere opløsning, når størrelsen tilpasses i udstrakt grad. Vi foreslår at ændre størrelsen på halvdelen for acceptabel opløsning med bedre håndtering.

6.3D genopbygning

1. Kør 3D Volume rendering software.
2. Vælg handlinger > indlæse diskenheds data for at starte datasættet.
3. Juster lysstyrken og kontrastniveauet ved at ændre form overførselsfunktionen i histogram på fanen Overfør funktions redigering .
4. Vælg indstillinger > belysning.
5. Vælg skygger og ikoner for Surface-belysning . Disse effekter giver en realistisk modellering tone.
6. Find den bedste visning ved at flytte (Klik og træk), Roter (Højreklik og træk), og zoom ind eller ud af (scroll) modellen.
7. Skub flyet (Shift + Klik og træk i den indvendige retning) for at vise sektionsopdelte billeder (figur 3).
8. Slå lydikon til. Juster belysnings indikator bjælken, og Find den bedste belysning til visning. Sluk derefter for ikonet, og luk fanen belysning .
9. Vælg indstillinger > Vis ≫ fritlægningboks for at skjule boksen for det endelige billede.
10. Vælg handlinger > Gem billede for at gemme billedet.

Representative Results

Den detaljerede rekonstruktion af ORL blev opnået ved hjælp af microCT med PTA præparat (figur 4). Den ligamentøse fibromuskulære struktur, som strækker sig skråt mellem dermis og periosteum, blev tydeligt observeret (figur 4a). I den koronale visning (figur 4b), mængden og kompleksiteten af fibre øget sideværts. I den horisontale visning (figur 4c) blev et omfattende meshværk med en arboriseret dannelse observeret. Vi observerede en form karakteriseret ved kontinuerlige plader, snarere end tråd-lignende fibre, som rapporteret tidligere. I sagittale-visningen (figur 4d) FORMINDSKEDE ORL fibrenes tykkelser inferiorly. Samlet set viste denne multidirektionelle observation, at ORL består af et flerlags mesharbejde af kontinuerlige plader med variation i antallet og tykkelsen afhængigt af placeringen.

Figur 1. Prøverne blev høstet og derefter plettet med PTA opløsning.
(A). prøverne blev fikseret i 10% formalin efter høst. (B). prøverne blev skåret i tyndere stykker for at øge penetrationen og derefter PLACERES i PTA-opløsningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Mikroct-scanneren.
Pil angiver den bakke, hvor prøven er anbragt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. 3D genopbygning.
Skub flyet ind i den indvendige retning for at se sektionsopdelte billeder indeni. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. 3D-billeder af ORL.
(A). det overordnede billede af ORL. (B). koronal visning. (C). horisontal visning. (D). sagittal-visning. S, Superior; A, forreste; L, laterale; P, posterior. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Analyserede strukturer af ORL.
Gul, rød og grøn indikerer henholdsvis hud, muskler og ligament. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Sammenligning mellem 3D-og 2D-billeder. (A). volumen gengivet 3D-billede. (B). tværsnits 2D-billede. Skala bar = 1 mm. venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 2. Indpakning og fastgørelse af parafilm. A)indpakning af parafilm over hele prøven for at undgå udtørring. (B). parafilm hjælper med at fastgøre prøven fast på scanneren. (C). parafilm er ikke synlig på microct scanning og kan trækkes let. Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 3. Utilstrækkelig farvning af PTA. Et hult rum i centrum viser, hvor PTA løsning ikke er trængt tilstrækkeligt. (A). volumen gengivet 3D-billede. (B). tværsnits 2D-billede. Skala bar = 1 mm. venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 4. Sammenligning mellem friske og balsame-Kadaverer. Der blev ikke fundet forskelle mellem friske og balsame-Kadaverer for at anvende protokollen. Billedet viser en anden funktion kunne tages af samme metode som godt. (A). den ORL opnået fra en frisk Kadaver. (B). den nasolabiale krølle opnået fra en balsame Kadaver. Venligst klik her for at downloade figuren.

Discussion

Vi implementerede microCT med PTA forberedelse i undersøgelsen af humant blødt væv. Kort, prøver høstes og fikseret i formalin i et par dage, efterfulgt af dehydrering i serielle ethanolopløsninger. Hvis prøven anbringes i PTA-opløsningen direkte efter formalin fiksation, kan det resultere i revner i væv på grund af hurtig dehydrering. Derfor er seriel dehydrering nødvendig før PTA farvning. Næste, prøverne er plettet ved hjælp af PTA løsning for omkring en uge. Mikroct scanning, 3D rekonstruktion, og analyse kan derefter udføres. Vores mål var at observere ORL og tilstødende strukturer ved hjælp af denne metode. Vi præsenterede med succes vævet som en 3D-model. Hud, ledbånd og muskler blev tydeligt visualiseret (figur 5).

Der bør tages hensyn til flere punkter under behandlingen af prøverne. Størrelsen af en prøve og varigheden af farvning er hoved bekymringerne. Efter flere pilotundersøgelser, fandt vi, at den korrekte tykkelse af en prøve er omkring 5 – 7 mm og den korrekte varighed af farvning er 5 – 7 dage. Under disse forhold trænger PTA opløsningen ind i prøven med en hastighed på ca. 1 mm/dag. Hvis tykkelsen overstiger 7 mm, øges behandlingstiden. Når farvnings varigheden er utilstrækkelig i forhold til prøvevolumenet, kan det endelige billede omfatte et tomt hul i prøvens centrale område. Dette sker ofte, især på huden niveau, og fjerne unødvendig hud kan forbedre farvning effektivitet. Når varigheden er for lang, vil hele prøven være over farves, hvilket gør det vanskeligt at identificere hvert rum. Yderligere undersøgelse af den optimale varighed for farvning af større prøver kan vise sig nyttig.

Normalt er prøven opdelt i stykker for at øge penetration; Det er vigtigt at huske placeringen og retningen af hver prøve i løbet af denne proces. For at vedligeholde disse oplysninger anbefales det at sy på samme område i hver del. Tråden vil blive set i det endelige billede, og man skal passe på, at tråden ikke forstyrrer det vigtigste område. For eksempel kan syning på den superolaterale region af hvert stykke være nyttigt. Desuden er der behov for indledende analyser af en anatomisk struktur for at genkende hver vævs del på grund af deres kompleksitet.

Parafilm og andre materialer anvendes til at forhindre, at prøver tørrer ud. Der kan dog forekomme små deformiteter ved indpakning af prøver. Det er vigtigt at bevare den oprindelige form i videst muligt omfang. Sommetider anvendes et flydende rør, i stedet for parafilm. Men selv den mindste skælvende af en maskine har potentialet til at påvirke røret under scanningen og kan reducere klarheden af det endelige billede.

Der er flere begrænsninger i denne fremgangsmåde. For det første kan denne protokol ikke gøres med et levende objekt. Desuden er stikprøvestørrelsen begrænset af den maksimale scanningsstørrelse for microCT-scanneren. Der kan være fejl under analyse af det gengivne billede med det blotte øje; der kan derfor være behov for yderligere histologiske eksperimenter for at bekræfte resultaterne. Der kan være en svag dimensionel forvrængning under tilberedningen; Vi mener dog, at dette ikke i væsentlig grad påvirker undersøgelsens resultat.

MicroCT scanning med PTA forberedelse er fordelagtigt for at undersøge specifikke rum i en kompleks struktur. Denne undersøgelse fokuserede på udviklingen af en metode til at øge kontrasten sats ved hjælp af PTA forberedelse, og andre funktioner, ligesom scanning og genopbygning processer, blev indikeret kort. Men, læsere bør være i stand til at få det samme resultat, hvis de bruger moderne microCT scannere og billed-analyseprogrammer efter farvningsprocessen. Denne metode kan vise sig nyttigt i analyserne af kræft væv og strukturer, nerve bidrag i specifikke områder, og høj opløsning anatomiske strukturer af organer, såsom hjertet og leveren^13,14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid	Junsei	84220-0410	PTA powder
CTvox	Bruker	ver 2.7	3D recon software
Nrecon	Bruker	ver 1.7.0.4	Reconstruction software
Skyscan	Bruker	1173	MicroCT scanner
Tconv	Bruker	ver 2.0	File resizing software