Summary
Micro X-ray beregnet tomografi er effektiv i å få tredimensjonal informasjon fra uskadet menneskelige prøver, men har begrenset suksess i å observere bløtvev. Bruken av phosphotungstic yre kontrastmiddel kan løse dette problemet. Vi implementerte denne kontrasten agent å undersøke menneskelige delikate fibromuscular vev (orbicularis beholde leddbånd).
Abstract
Manuell disseksjon og histologiske observasjon er vanlige metoder som brukes for å undersøke menneskelig vev. Manuelle disseksjon kan imidlertid skade ømfintlige strukturer, mens behandling og histologiske observasjon gir begrenset informasjon gjennom kryss Seksjons avbildning. Micro X-ray beregnet tomografi (microCT) er et effektivt verktøy for å oppnå tredimensjonal informasjon uten å skade prøvene. Men, det viser begrenset effektivitet i å skille bløtvev deler. Bruk av kontrast fremmende midler, som phosphotungstic acid (PTA), kan løse dette problemet ved å forbedre bløtvev kontrast. Vi implementerte microCT med PTA for å undersøke den menneskelige orbicularis beholde leddbånd (ORL), som er en delikat struktur i baneområdet. I denne metoden, høstes eksemplarer er løst i formalin, dehydrert i seriell etanol løsninger, og beiset med en PTA løsning. Etter farging utføres microCT-skanning, 3D-rekonstruksjon og analyse. Hud, leddbånd, og muskler kan tydelig visualisere ved hjelp av denne metoden. Prøven størrelse og varigheten av farging er vesentlige vise egenskaper av metoden. Den egnede prøven tykkelse var ca 5-7 mm, ovenfor som prosessen ble redusert, og den optimale varigheten var 5-7 dager, under som et tomt hull i det sentrale området av og til skjedde. For å opprettholde plasseringen og retningen av små biter under skjæring, er å sy på samme område av hver del anbefales. Videre er foreløpige analyser av den anatomiske strukturen nødvendig for å korrekt identifisere hver brikke. Parafilm kan brukes for å hindre tørking, men forsiktighet bør utvises for å hindre prøve forvrengning. Vår multidirectional observasjon viste at ORL består av et flerlags meshwork av sammenhengende plater, snarere enn tråd-lignende fibre, som rapportert tidligere. Disse resultatene tyder på at microCT skanning med PTA er nyttig for å undersøke spesifikke avdelinger innenfor komplekse strukturer av menneskelig vev. Det kan være nyttig i analysene av kreft vev, nerve vev, og ulike organer, som hjerte og lever.
Introduction
Manuell disseksjon og histologiske observasjon er vanligvis brukes til å undersøke menneskelig vev, som muskler og bindevev. Manuelle disseksjon kan imidlertid lett skade ømfintlige strukturer, og histologiske observasjon gir begrenset informasjon om flate tverrsnitt overflater1,2. Derfor er forbedrede metoder som trengs for å undersøke vev mer presist og effektivt.
Konvensjonell beregnet tomografi (CT) er vanligvis brukt i klinisk praksis, men det mangler evnen til å skille små strukturer2,3. Micro X-ray CT (microCT) er et effektivt verktøy for å skaffe tre-dimensjonal (3D) informasjon av små strukturer fra prøver, uten å ødelegge dem. Imidlertid har microCT begrenset programmer, fordi bare tette vev kan visualisere tydelig; Det kan ikke brukes til å differensiere bløtvev. For å overkomme denne begrensningen, kan fargestoffer brukes. Kontrast fremmende midler, som phosphotungstic acid (PTA), phosphomolybdic acid, og Lugol er jod, forbedre bløtvevet kontrasten rate under skanning4,5. Flere studier som sammenligner disse agentene tyder på at PTA demonstrerer god ytelse og er lett å håndtere6,7,8.
Orbicularis beholde leddbånd (ORL) er en delikat struktur rundt banen, som lett kan skades under konvensjonell observasjon9. Vi undersøkte og lyktes med å hente 3D-informasjon om denne strukturen ved hjelp av microCT med PTA som kontrastmiddel. Denne metoden kan anvendes på studier på andre menneskelige vev, som hjerte og lever, med passende modifikasjoner10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle levningene benyttet i denne studien ble lovlig donert til Surgical Anatomy Education Centre ved Yonsei University College of Medicine.
1. innhenting av prøver
- Tegn en snitt linje på Cadaver med en farget blyant for å indikere skjæreområdet for prøvetaking høsting. Kontroller at snittlinjen trekkes strekker anteriort til en midtre canthus, sidelengs til en lateral canthus, superiorly til en overlegen grensen av nedre øyelokk, og forsiktig til 1 cm under linjen fra orbital felgen.
Merk: Vurder utvalgsstørrelsen basert på den maksimale skannestørrelsen på Micro-CT-utstyret (utstyret vårt kan anskaffe et bilde med en maksimal objekt dimensjon på 7 × 7 cm). Her, en prøve ca 1 cm i bredde, 3 cm i lengde, og 1,25 g vekt ble høstet fra ORL regionen. - Skjær ansikts vevet etter snittlinjen med et blad. Pass på at snittet er dypt slik at tuppen av bladet berører benet. Prøven må inkludere hud, under Huds vev, muskel, fett og periosteum.
- Fest prøven i 10% formalin umiddelbart og bevare den i 5 til 7 dager ved romtemperatur (figur 1a).
Merk: både balsamert og fersk levningene kan brukes til denne studien. Fikserings løsningen for levningene kan imidlertid avvike noe fra løsningen som brukes i et biologisk eksperiment. Derfor foreslår vi å feste prøven med 10% formalin igjen, selv etter å ha innhentet prøven fra balsamert levningene.
2. forberedelse til farging
- Etter festing skjærer du prøven inn i 3 deler (5 – 7 mm i tykkelse). Ikke mist plasseringen og retningen på hver del under denne prosessen.
Merk: microCT-skanneren vi bruker kan dekke en maksimumsstørrelse på 7 cm ³, men PTA-løsningen kan ikke trenge inn i prøven med hell hvis den er for tykk. - Sy superolateral IDen av hver brikke ved hjelp av en nål og svart tråd slik at retningen av prøven kan sjekkes senere.
- Tørke prøven i en serie på 30%, 50% og 70% etanol løsninger for 1 dag hver.
- Plasser prøven i 70% etanol til farging.
3. akt forberedelse
- Start akt fargeprosessen 1 uke før microCT skanning er planlagt.
- Forbered 210 mL 70% etanol oppløsning og tilsett 2,1 g akt kraft til det. Bland godt med en shaker ved 55-60 RPM.
Merk: konsentrasjonen av PTA-løsningen bør være 1% i etanol. - Forbered 3 70 mL plastbeholdere for hver skiver stykke. Fyll beholderne med PTA-løsningen. Sug prøvene inn i beholderne og legg dem på en shaker for effektiv penetrasjon. La prøvene være i 5 – 7 dager (figur 1B).
- Når farging er fullført, lagre prøven i 70% etanol å forberede for skanning.
Merk: farget prøvene kan opprettholdes i flere måneder, men det anbefales at prøvene skannes så snart som mulig for å sikre full farging.
4. MicroCT skanning
- Pakk prøven med parafilm for å hindre tørking. Ikke Pakk prøvene for stramt, som det kan føre til deformasjon.
- Åpne skanneren og plasser prøven på skuffen (figur 2).
- Angi skanneparametrene på følgende måte: kilde spenning (kV) = 70, kilde strøm (μA) = 114, Al-filter = 0,5 mm, bilde pikselstørrelse (μm ²) = 20, piksler = 2240 × 2240, eksponering (MS) = 500, rotasjons trinn (grader) = 0,3.
Merk: parameterne kan endres i henhold til prøvene og/eller skannere som brukes. - Start skanningen.
Merk: skanningen tar 30 til 60 min, avhengig av den tiltenkte oppløsningen og hastigheten til skanneren.
5. rekonstruksjon og optimalisering av data
- Kjør gjenoppbyggings programvaren. Velg Åpne DataSet på handlinger -menyen for å starte de skannede filene.
- Velg Innstillinger -fanen i gjenoppbyggings vinduet. Angi parametrene som følger: reduksjon av ring artefakter = 7, korrigering av stråle herding (%) = 40.
Merk: parametrene kan endres i henhold til prøven. - Begynn rekonstruksjon ved å velge Start på Start -fanen. De endelige dataene vil bli lagret i den utpekte mappen.
- Kjør filen resizing programvare. Velg kildedata sett for å starte de rekonstruert filene.
- Velg jpg på måldatasettet tab.
- Velg alternativet for størrelsesendring 1/2 med et kvalitets alternativ uten interpolering (rask).
- Juster glidebryteren til 100 (høyest) i kategorien bildekomprimering . Start konvertering.
Merk: alternativet for størrelsesendring er å unngå å senke hastigheten på datamaskinen når 3D gjengis. Det kan imidlertid føre til lavere oppløsning når du endrer størrelse mye. Vi foreslår at du skalerer i to for akseptabel oppløsning med bedre håndtering.
6.3D rekonstruksjon
- Kjør programvaren for gjengivelse av 3D-volum.
- Velg handlinger for ≫ laste inn volumdata for å starte datasettet.
- Juster lysstyrke og kontrastnivå ved å endre form overføringsfunksjonen i histogram i kategorien overførings funksjons redigering .
- Velg alternativer > belysning.
- Velg skygger og Surface Lighting ikoner. Disse effektene gir en realistisk modellering tone.
- Finn den beste visningen ved å flytte (Klikk og dra), rotere (Høyreklikk og dra), og zoome inn eller ut av (Bla) modellen.
- Skyv Planet (Shift + Klikk og dra i den indre retning) for å vise Seksjons bilder (Figur 3).
- Slå på lys -ikonet. Juster lysindikator linjen og Finn den beste belysningen for visning. Deretter slår du av ikonet og lukker kategorien belysning .
- Velg alternativer > Vis > beskjæringsboks for å skjule boksen for det endelige bildet.
- Velg handlinger > lagre bildet for å lagre bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den detaljerte gjenoppbyggingen av ORL ble oppnådd ved microCT med PTA forberedelse (Figur 4). Den ligamentous fibromuscular strukturen som strakte skrått mellom dermis og periosteum ble tydelig observert (figur 4a). I koronale-visningen (figur 4b) økte mengden og kompleksiteten av fibrene sidelengs. I horisontal visning (figur 4c) ble det observert en forseggjort meshwork med en arborized formasjon. Vi observerte en form preget av sammenhengende plater, snarere enn tråd-lignende fibre, som rapportert tidligere. I sagittal-visningen (figur 4d) ble TYKKELSEN på ORL-fibrene redusert forsiktig. Samlet sett viste denne multidirectional observasjonen at ORL består av et flerlags meshwork av sammenhengende plater med variasjon i antall og tykkelse avhengig av plasseringen.
Figur 1. Prøvene ble høstet og flekkete med PTA løsning.
(A). prøvene ble løst i 10% formalin etter høsting. (B). prøvene ble skåret i tynnere biter for å forsterke inntrengning og deretter PLASSERT i akt løsningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. MicroCT-skanneren.
Pilen viser skuffen der prøven er plassert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 3D-rekonstruksjon.
Skyv planet inn i indre retning for å vise Seksjons bildene inni. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. 3D-bilder av ORL.
(A). det generelle bildet av ORL. (B). koronale utsikt. (C). horisontal visning. (D). sagittal utsikt. S, overlegen; A, fremre; L, lateral; P, bakre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Analysert strukturer av ORL.
Gul, rød og grønn indikerer huden, muskelen, og leddbånd, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1. Sammenligning mellom 3D-og 2D-bilder. (A). volum gjengitt 3D-bilde. (B). kryss tverrsnitt 2D-bilde. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.
Supplerende figur 2. Pakking og festing av parafilm. (A). pakking av parafilm over hele prøven for å hindre uttørking. (B). Parafilm bidrar til å fikse prøven godt på skanneren. (C). Parafilm er ikke synlig på microCT skanning og kan trekkes lett. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.
Supplerende figur 3. Utilstrekkelig farging av akt. En hul plass i midten viser hvor PTA løsningen ikke har trengt tilstrekkelig. (A). volum gjengitt 3D-bilde. (B). kryss tverrsnitt 2D-bilde. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.
Supplerende figur 4. Sammenligning mellom friske og balsamert levningene. Det ble ikke funnet noen forskjeller mellom ferske og balsamert levningene for å bruke protokollen. Bildet viser en annen funksjon kan være tatt av den samme metoden også. (A). ORL Hentet fra en fersk Cadaver. (B). nasolabiale krøll som fås fra en balsamert Cadaver. Vennligst klikk her for å laste ned figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi implementerte microCT med PTA forberedelse i behandlingen av menneskelig bløtvev. Kort, prøver er høstet og fast i formalin for et par dager, etterfulgt av dehydrering i seriell etanol løsninger. Å plassere prøven i PTA-løsningen rett etter formalin fiksering kan føre til at noen vev sprekker på grunn av rask dehydrering. Derfor er seriell dehydrering nødvendig før PTA farging. Deretter blir prøvene flekkete ved hjelp av PTA-løsning i omtrent en uke. MicroCT skanning, 3D rekonstruksjon, og analyse kan deretter utføres. Vårt mål var å observere ORL og tilstøtende strukturer ved hjelp av denne metoden. Vi klarte å presentere vevet som en 3D-modell. Hud, leddbånd, og musklene var tydelig visualisere (figur 5).
Flere punkter bør vurderes under behandlingen av prøvene. Størrelsen på en prøve og varigheten av farging er primære bekymringer. Etter flere pilotstudier, fant vi at den riktige tykkelsen på en prøve er ca 5-7 mm og den riktige varigheten av farging er 5-7 dager. Under disse forholdene trenger akt-løsningen inn i prøven med en hastighet på ca. 1 mm/dag. Hvis tykkelsen overstiger 7 mm, øker behandlingstiden. Når varigheten av farging er utilstrekkelig i forhold til volumet på en prøve, kan det endelige bildet inneholde et tomt hull i det sentrale området av prøven. Dette skjer ofte, spesielt på hud nivå, og fjerne unødvendig hud kan forbedre farging effektivitet. Når varigheten er for lang, vil hele prøven bli overstained, noe som gjør det vanskelig å identifisere hvert rom. Videre studier på den optimale varigheten for farging av større eksemplarer kan være nyttig.
Vanligvis er prøven delt inn i biter for å forbedre penetrasjon; Det er viktig å huske plasseringen og retningen for hvert eksemplar i løpet av denne prosessen. For å opprettholde denne informasjonen, anbefales det å sy på samme område av hver del. Tråden vil bli sett i det endelige bildet, og en bør være forsiktig at tråden ikke forstyrrer hovedområdet. For eksempel kan sy på superolateral regionen av hver brikke være nyttig. I tillegg er det nødvendig med Foreløpige analyser av en anatomisk struktur for å gjenkjenne hver vevs del på grunn av deres kompleksitet.
Parafilm og andre materialer brukes for å hindre at prøvene tørker ut. Det kan imidlertid forekomme små misdannelser ved pakking av prøver. Det er viktig å bevare den opprinnelige formen i størst mulig grad. Noen ganger et flytende rør brukes, i stedet for parafilm. Men selv den minste skjelvende av en maskin har potensial til å påvirke røret under skanning og kan redusere klarheten i det endelige bildet.
Det er flere begrensninger på denne tilnærmingen. For det første kan ikke denne protokollen gjøres med et levende objekt. I tillegg begrenses utvalgsstørrelsen av den maksimale skannestørrelsen på microCT-skanneren. Det kan være feil mens analysere gjengitte bildet av det blotte øye; Derfor kan det være nødvendig med flere histologiske eksperimenter for å bekrefte funnene. Det kan være liten dimensjonal forvrengning under forberedelse; Vi tror imidlertid at dette ikke påvirker resultatet av studien i betydelig grad.
MicroCT skanning med PTA forberedelse er fordelaktig for å undersøke spesifikke avdelinger innenfor en kompleks struktur. Denne studien fokuserte på utviklingen av en metode for å forbedre kontrastraten ved hjelp av akt forberedelser, og andre funksjoner, som skanning og gjenoppbyggings prosesser, ble indikert kort. Imidlertid, leserne burde være i stand til få likt resultere hvis de bruk moderne microCT skanner og image-analyserer planer etter det farging forarbeide. Denne metoden kan være nyttig i analysene av kreft vev og strukturer, nerve bidrag i bestemte områder, og høyoppløselige anatomiske strukturer i organer, slik som hjerte og lever13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et fakultet forskningsstipend ved Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Forfatterne takker folk som svært sjenerøst donerte kroppen sin til Yonsei University College of Medicine. Vi er takknemlige for Jun Ho Kim og Jong Ho Bang for deres teknisk støtte (ansatte i Surgical Anatomy Education Centre ved Yonsei University College of Medicine). Vi er også takknemlige for Genoss co., Ltd. for høykvalitets microCT skanning system som brukes i denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
