Summary
La tomografía computarizada de micro rayos X es eficaz para obtener información tridimensional de muestras humanas no dañadas, pero tiene un éxito limitado en la observación de tejidos blandos. El uso de agente de contraste de ácido fosfotúmético puede resolver este problema. Implementamos este agente de contraste para examinar los tejidos fibromusculares delicados humanos (el ligamento de retención orbicularis).
Abstract
La disección manual y la observación histológica son métodos comunes utilizados para investigar los tejidos humanos. Sin embargo, la disección manual puede dañar estructuras delicadas, mientras que el procesamiento y la observación histológica proporcionan información limitada a través de imágenes transversales. La tomografía computarizada de micro rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional sin dañar las muestras. Sin embargo, muestra una eficiencia limitada en la diferenciación de partes de tejido blando. El uso de agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), puede resolver este problema mejorando el contraste de los tejidos blandos. Implementamos microCT con PTA para investigar el ligamento de retención orbicularis humano (ORL), que es una estructura delicada en el área de la órbita. En este método, los especímenes cosechados se fijan en formalina, se deshidratan en soluciones de etanol en serie y se tiñen con una solución de PTA. Después de la tinción, se realiza la exploración de microCT, la reconstrucción 3D y el análisis. La piel, los ligamentos y los músculos se pueden visualizar claramente utilizando este método. El tamaño de la muestra y la duración de la tinción son características esenciales del método. El espesor adecuado de la muestra fue de unos 5-7 mm, por encima de los cuales el proceso se desaceleró, y la duración óptima fue de 5-7 días, por debajo de los cuales ocasionalmente se producía un agujero vacío en el área central. Para mantener la ubicación y la dirección de las piezas pequeñas durante el corte, se recomienda coser en la misma región de cada pieza. Además, se necesitan análisis preliminares de la estructura anatómica para identificar correctamente cada pieza. El parafilm se puede utilizar para evitar el secado, pero se debe tener cuidado para evitar la distorsión de la muestra. Nuestra observación multidireccional mostró que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas, en lugar de fibras similares a hilos, como se informó anteriormente. Estos resultados sugieren que la exploración por microCT con PTA es útil para examinar compartimentos específicos dentro de estructuras complejas de tejido humano. Puede ser útil en los análisis de tejidos cancerosos, tejidos nerviosos y varios órganos, como el corazón y el hígado.
Introduction
La disección manual y la observación histológica se utilizan normalmente para examinar los tejidos humanos, como los músculos y los tejidos conectivos. Sin embargo, la disección manual puede dañar fácilmente estructuras delicadas, y la observación histológica proporciona información limitada sobre superficies transversales planas1,2. Por lo tanto, se necesitan métodos mejorados para examinar los tejidos de manera más precisa y eficiente.
La tomografía computarizada convencional (TC) se utiliza generalmente en la práctica clínica, pero carece de la capacidad de distinguir estructuras pequeñas2,3. Micro Tc de rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional (3D) de pequeñas estructuras a partir de muestras, sin destruirlas. Sin embargo, la microCT tiene aplicaciones limitadas porque sólo los tejidos densos se pueden visualizar claramente; no se puede utilizar para diferenciar los tejidos blandos. Para superar esta limitación, se pueden utilizar agentes de tinción. Los agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), el ácido fosfomolíbódico y el yodo de Lugol, mejoran la tasa de contraste de los tejidos blandos durante la exploración4,5. Varios estudios que comparan estos agentes sugieren que la PTA demuestra un buen rendimiento y es fácil de manejar6,7,8.
El ligamento de retención orbicular (ORL) es una estructura delicada alrededor de la órbita, que puede dañarse fácilmente durante la observación convencional9. Examinamos y recuperamos con éxito información 3D sobre esta estructura utilizando microCT con PTA como agente de contraste. Este método se puede aplicar a estudios sobre otros tejidos humanos, como el corazón y el hígado, con las modificaciones apropiadas10,11,12.
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Protocol
Todos los cadáveres utilizados en este estudio fueron legalmente donados al Centro de Educación de Anatomía Quirúrgica en la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei.
1. Obtención de muestras
- Dibuje una línea de incisión en el cadáver con un lápiz de color para indicar el área de corte para la cosecha de muestras. Compruebe que la línea de incisión dibujada se extiende medialmente a un canthus medial, lateralmente a un canthus lateral, superiormente a un borde superior del párpado inferior, e inferiormente a 1 cm por debajo de la línea desde el borde orbital.
NOTA: Tenga en cuenta el tamaño de la muestra en función del tamaño máximo de escaneado del equipo de micro-CT (nuestro equipo podría adquirir una imagen con una dimensión máxima del objeto de 7 x 7 cm). Aquí, una muestra de aproximadamente 1 cm de ancho, 3 cm de longitud, y 1,25 g de peso se extrajeron de la región ORL. - Cortar los tejidos faciales siguiendo la línea de incisión con una cuchilla. Asegúrese de que el corte es profundo de tal forma que la punta de la hoja toque el hueso. La muestra debe incluir la piel, el tejido subcutáneo, el músculo, la grasa y el periosteum.
- Fijar la muestra en 10% de formalina inmediatamente y conservarla durante 5 a 7 días a temperatura ambiente(Figura 1A).
NOTA: Para este estudio se pueden utilizar cadáveres embalsamados y frescos. Sin embargo, la solución de fijación para cadáveres puede diferir ligeramente de la solución utilizada en un experimento biológico. Por lo tanto, sugerimos arreglar la muestra con 10% de formalina de nuevo incluso después de obtener la muestra de cadáveres embalsamados.
2. Preparación para la tinción
- Después de la fijación, cortar la muestra en 3 piezas (5-7 mm de espesor). No pierda la ubicación y dirección de cada pieza durante este proceso.
NOTA: El escáner microCT que utilizamos puede cubrir un tamaño máximo de 7 cm3, pero la solución PTA no puede penetrar la muestra con éxito si es demasiado gruesa. - Coser el lado superolateral de cada pieza usando una aguja y un hilo negro de tal forma que la dirección de la muestra se pueda comprobar más adelante.
- Deshidratar la muestra en una serie de soluciones de etanol 30%, 50% y 70% para 1 día cada una.
- Coloque la muestra en 70% de etanol hasta la tinción.
3. Preparación de la PTA
- Comience el proceso de tinción de la PTA 1 semana antes de que se programe la exploración de microCT.
- Prepare 210 ml de solución de etanol al 70% y agregue 2,1 g de potencia de la PTA. Mezcle bien con una coctelera a 55-60 rpm.
NOTA: La concentración de la solución de PTA debe ser del 1% en etanol. - Prepare tres envases de plástico de 70 ml para cada pieza en rodajas. Llene los recipientes con la solución PTA. Remoje las muestras en los recipientes y colóquelas en una coctelera para una penetración efectiva. Deje las muestras durante 5-7 días(Figura 1B).
- Cuando se complete la tinción, almacene la muestra en 70% de etanol para prepararse para el escaneo.
NOTA: Las muestras manchadas se pueden mantener durante varios meses, pero se recomienda escanear las muestras lo antes posible para garantizar la tinción completa.
4. Escaneo de MicroCT
- Envuelva la muestra con parafilm para evitar el secado. No envuelva las muestras demasiado apretadas, ya que eso puede conducir a la deformación.
- Abra el escáner y coloque la muestra en la bandeja(Figura 2).
- Establezca los parámetros de escaneado de la siguiente manera: voltaje de la fuente (kV) a 70, corriente de origen (A) a 114, filtro Al a 0,5 mm, tamaño de píxel de la imagen (m2) a 20, píxeles a 2240 a 2240, exposición (ms) a 500, paso de rotación (deg) a 0,3.
NOTA: Los parámetros pueden modificarse de acuerdo con las muestras y/o escáneres utilizados. - Comience a escanear.
NOTA: El escaneo tarda de 30 a 60 minutos dependiendo de la resolución deseada y la velocidad del escáner.
5. Reconstrucción y optimización de datos
- Ejecute el software de reconstrucción. Seleccione Abrir conjunto de datos en el menú Acciones para iniciar los archivos escaneados.
- Seleccione la pestaña Configuración en la ventana Reconstrucción. Establezca los parámetros de la siguiente manera: Reducción de artefactos de anillo: 7, Corrección de endurecimiento de haz (%) a 40.
NOTA: Los parámetros se pueden modificar según la muestra. - Comience la reconstrucción seleccionando Inicio en la pestaña Inicio. Los datos finales se almacenarán en la carpeta designada.
- Ejecute el software de cambio de tamaño de archivo. Seleccione Conjunto de datos de origen para iniciar los archivos reconstruidos.
- Seleccione jpg en la pestaña Conjunto de datos de destino.
- Elija la opción Cambiar tamaño 1/2 con una opción Calidad de Sin interpolación (rápida).
- Ajuste la barra deslizante a 100 (más alto) en la pestaña Compresión de imagen.
NOTA: La opción de cambio de tamaño es evitar ralentizar la velocidad del equipo cuando se renderiza en 3D; sin embargo, puede resultar en una resolución más baja cuando se redimensiona ampliamente. Sugerimos cambiar el tamaño por la mitad para una resolución aceptable con un mejor manejo.
6. Reconstrucción 3D
- Ejecute el software de renderizado de volumen 3D.
- Seleccione Acciones > Cargar datos de volumen para iniciar el conjunto de datos.
- Ajuste el brillo y el nivel de contraste modificando la función de transferencia de forma en el histograma en la pestaña Editor de funciones de transferencia.
- Seleccione Opciones > Iluminación.
- Seleccione los iconos Sombras e Iluminación de superficie. Estos efectos proporcionan un tono de modelado realista.
- Encuentre la mejor vista moviendo(haga clic y arrastre),girando (haga clic con elbotón derecho y arrastre)y acerque o aleje(desplace)el modelo.
- Deslice el plano(desplazamiento + clic y arrastre en la dirección interior) para mostrar las imágenes seccionales(Figura 3).
- Activa el icono Luz. Ajuste la barra de indicación de iluminación y encuentre la mejor iluminación para la visualización. A continuación, apague el icono y cierre la pestaña Iluminación.
- Seleccione Opciones > Mostrar > Cuadro de recorte para ocultar el cuadro de la imagen final.
- Seleccione Acciones > Guardar imagen para almacenar la imagen.
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Representative Results
La reconstrucción detallada del ORL se logró mediante microCT con preparación de la PTA(Figura 4). La estructura fibromuscular ligamentosa que se extiende oblicuamente entre la dermis y el periosteum se observó claramente(Figura 4A). En la vista coronal(Figura 4B),la cantidad y complejidad de las fibras aumentó lateralmente. En la vista horizontal(Figura 4C),se observó un elaborado mallado con una formación arborizada. Observamos una forma caracterizada por placas continuas, en lugar de fibras similares a hilos, como se informó anteriormente. En la vista sagital(Figura 4D),los espesores de las fibras ORL disminuyeron de forma inferior. En general, esta observación multidireccional demostró que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas con variación en el número y espesor dependiendo de la ubicación.
Figura 1. Las muestras fueron cosechadas y luego manchadas con solución de PTA.
(A). Las muestras se fijaron en 10% de formalina después de la cosecha. (B). Las muestras se cortaron en trozos más delgados para mejorar la penetración y luego se colocaron en la solución de LA PTA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El escáner microCT.
La flecha indica la bandeja donde se coloca la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Reconstrucción 3D.
Deslice el plano en la dirección interior para ver las imágenes seccionales en su interior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes 3D del ORL.
(A). La imagen general del ORL. (B). Vista coronal. (C). Vista horizontal. (D). Vista sagital. S, superior; A, anterior; L, lateral; P, posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Estructuras analizadas del ORL.
Amarillo, rojo y verde indican la piel, el músculo y el ligamento, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1. Comparación entre imágenes 3D y 2D. (A). Imagen 3D renderizada por volumen. (B). Imagen 2D transversal. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para descargar la figura.
Figura suplementaria 2. Envoltura y fijación del parafilm. (A). Envolver el parafilm sobre toda la muestra para evitar que se seque. (B). El parafilm ayuda a fijar la muestra firmemente en el escáner. (C). El parafilm no es visible en el escaneo microCT y podría restarse fácilmente. Haga clic aquí para descargar la figura.
Figura suplementaria 3. Intinción insuficiente de la PTA. Un espacio hueco en el centro muestra dónde la solución DE PTA no ha penetrado lo suficiente. (A). Imagen 3D renderizada por volumen. (B). Imagen 2D transversal. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para descargar la figura.
Figura suplementaria 4. Comparación entre cadáveres frescos y embalsamados. No se encontraron diferencias entre los cadáveres frescos y embalsamados para aplicar el protocolo. La imagen muestra otra característica podría ser tomada por el mismo método también. (A). El ORL obtenido de un cadáver fresco. (B). El pliegue nasolabial obtenido de un cadáver embalsamado. Haga clic aquí para descargar la figura.
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Discussion
Implementamos microCT con preparación de LA PTA en el examen de los tejidos blandos humanos. Brevemente, los especímenes se cosechan y fijan en formalina durante unos días, seguidos de la deshidratación en soluciones de etanol en serie. Colocar la muestra en la solución de la PTA directamente después de la fijación de la formalina puede resultar en algunos agrietamiento del tejido debido a la rápida deshidratación. Por lo tanto, se necesita deshidratación en serie antes de la tinción de la PTA. A continuación, las muestras se tiñen utilizando la solución de LA PTA durante aproximadamente una semana. A continuación, se puede realizar el escaneo microCT, la reconstrucción 3D y el análisis. Nuestro objetivo era observar el ORL y las estructuras adyacentes utilizando este método. Presentamos con éxito el tejido como un modelo 3D. La piel, los ligamentos y los músculos se visualizaron claramente(Figura 5).
Se deben tener en cuenta varios puntos durante el procesamiento de las muestras. El tamaño de un espécimen y la duración de la tinción son las principales preocupaciones. Después de varios estudios piloto, encontramos que el espesor adecuado de una muestra es de aproximadamente 5-7 mm y la duración adecuada de la tinción es de 5-7 días. En estas condiciones, la solución de PTA penetra en la muestra a una velocidad de aproximadamente 1 mm/día. Si el espesor supera los 7 mm, el tiempo de procesamiento aumenta. Cuando la duración de la tinción es insuficiente en comparación con el volumen de una muestra, la imagen final puede incluir un agujero vacío en el área central de la muestra. Esto a menudo ocurre, especialmente a nivel de la piel, y la eliminación de la piel innecesaria puede mejorar la eficiencia de las manchas. Cuando la duración es demasiado larga, todo el espécimen estará sobremanchado, lo que dificultará la identificación de cada compartimiento. Un estudio más profundo sobre la duración óptima para la tinción de especímenes más grandes podría resultar útil.
Por lo general, el espécimen se divide en piezas para mejorar la penetración; es importante recordar la ubicación y dirección de cada espécimen durante este proceso. Para mantener esta información, se recomienda coser en la misma región de cada parte. El hilo se verá en la imagen final, y uno debe tener cuidado de que el hilo no interfiera con el área principal. Por ejemplo, coser en la región superolateral de cada pieza podría ser útil. Además, se necesitan análisis preliminares de una estructura anatómica para reconocer cada parte del tejido debido a su complejidad.
El parafilm y otros materiales se utilizan para evitar que las muestras se sequen. Sin embargo, pueden producirse ligeras deformidades al envolver muestras. Es importante preservar la forma original en la mayor medida posible. A veces se utiliza un tubo líquido, en lugar de un parafilm. Sin embargo, incluso el más mínimo temblor de una máquina tiene el potencial de afectar el tubo durante el escaneo y podría reducir la claridad de la imagen final.
Hay varias limitaciones en este enfoque. En primer lugar, este protocolo no se puede hacer con un objeto vivo. Además, el tamaño de la muestra está restringido por el tamaño máximo de escaneado del escáner microCT. Podría haber errores al analizar la imagen renderizada a simple vista; por lo tanto, pueden ser necesarios experimentos histológicos adicionales para confirmar los hallazgos. Puede haber una ligera distorsión dimensional durante la preparación; sin embargo, creemos que esto no afecta significativamente el resultado del estudio.
El escaneo microCT con preparación de PTA es ventajoso para examinar compartimentos específicos dentro de una estructura compleja. Este estudio se centró en el desarrollo de un método para mejorar la tasa de contraste utilizando la preparación de la PTA, y otras características, como los procesos de escaneo y reconstrucción, se indicaron brevemente. Sin embargo, los lectores deben ser capaces de obtener el mismo resultado si utilizan escáneres microCT contemporáneos y programas de análisis de imágenes después del proceso de tinción. Este método podría resultar útil en los análisis de tejidos y estructuras cancerosas, la contribución nerviosa en áreas específicas y las estructuras anatómicas de alta resolución de órganos, como el corazón y el hígado13,14,15.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei (6-2018-0099). Los autores agradecen a las personas que generosamente donaron sus cuerpos a la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei. Agradecemos a Jun Ho Kim y Jong Ho Bang por su apoyo técnico (miembros del personal del Centro de Educación en Anatomía Quirúrgica del Colegio de Medicina de la Universidad de Yonsei). También estamos agradecidos a Genoss Co., Ltd. por el sistema de escaneo de microCT de alta calidad utilizado en esta investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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