Summary
La tomographie calculée par rayons X micro est efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles à partir de spécimens humains intacts, mais a un succès limité dans l'observation des tissus mous. L'utilisation de l'agent de contraste d'acide phosphotungstic peut résoudre ce problème. Nous avons mis en œuvre cet agent de contraste pour examiner les tissus fibromusculaires fragiles humains (le ligament de maintien de l'orbicularis).
Abstract
La dissection manuelle et l'observation histologique sont des méthodes courantes utilisées pour étudier les tissus humains. Cependant, la dissection manuelle peut endommager les structures délicates, tandis que le traitement et l'observation histologique fournissent l'information limitée par l'imagerie transversale. La micro-radiographie de la tomographie calculée (microCT) est un outil efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles sans endommager les spécimens. Cependant, il montre une efficacité limitée dans la différencié des parties des tissus mous. L'utilisation d'agents améliorant le contraste, comme l'acide phosphotungstic (PTA), peut résoudre ce problème en améliorant le contraste des tissus mous. Nous avons mis en œuvre le microCT avec PTA pour étudier le ligament de retenue d'orbicularis humain (ORL), qui est une structure délicate dans la zone orbitale. Dans cette méthode, les spécimens récoltés sont fixés en formaline, déshydratés dans des solutions d'éthanol en série, et tachés d'une solution PTA. Après coloration, balayage de microCT, reconstruction 3D, et analyse sont exécutés. La peau, les ligaments et les muscles peuvent être clairement visualisés à l'aide de cette méthode. La taille du spécimen et la durée de la coloration sont des caractéristiques essentielles de la méthode. L'épaisseur appropriée du spécimen était d'environ 5 à 7 mm, au-dessus de laquelle le processus a été ralenti, et la durée optimale était de 5 à 7 jours, en dessous duquel un trou vide dans la zone centrale s'est produit occasionnellement. Pour maintenir l'emplacement et la direction des petits morceaux pendant la coupe, il est recommandé de coudre sur la même région de chaque pièce. En outre, des analyses préliminaires de la structure anatomique sont nécessaires pour identifier correctement chaque pièce. Le parafilm peut être utilisé pour prévenir le séchage, mais il faut prendre soin d'éviter la distorsion des spécimens. Notre observation multidirectionnelle a montré que l'ORL est composé d'un maillage multicouches de plaques continues, plutôt que de fibres fil-like, comme rapporté précédemment. Ces résultats suggèrent que le balayage de microCT avec PTA soit utile pour examiner des compartiments spécifiques dans les structures complexes du tissu humain. Il peut être utile dans les analyses des tissus cancéreux, des tissus nerveux, et divers organes, comme le cœur et le foie.
Introduction
La dissection manuelle et l'observation histologique sont généralement utilisées pour examiner les tissus humains, tels que les muscles et les tissus conjonctifs. Cependant, la dissection manuelle peut facilement endommager les structures délicates, et l'observation histologique fournit des informations limitées sur les surfaces transversales plates1,2. Par conséquent, des méthodes améliorées sont nécessaires pour examiner les tissus plus précisément et efficacement.
La tomographie calculée conventionnelle (CT) est généralement utilisée dans la pratique clinique, mais elle n'a pas la capacité de distinguer les petites structures2,3. Micro X-ray CT (microCT) est un outil efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles (3D) de petites structures à partir de spécimens, sans les détruire. Cependant, le microCT a des applications limitées parce que seuls les tissus denses peuvent être visualisés clairement ; il ne peut pas être utilisé pour différencier les tissus mous. Pour surmonter cette limitation, des agents de coloration peuvent être utilisés. Les agents d'amélioration du contraste, comme l'acide phosphotungstic (PTA), l'acide phosphomolybdique, et l'iode de Lugol, améliorent le taux de contraste de tissu mou pendant le balayage4,5. Plusieurs études comparant ces agents suggèrent que PTA démontre de bonnes performances et est facile à gérer6,7,8.
Le ligament de retenue orbicularis (ORL) est une structure délicate autour de l'orbite, qui peut être facilement endommagée lors de l'observation conventionnelle9. Nous avons examiné et récupéré avec succès l'information 3D sur cette structure utilisant le microCT avec PTA comme agent de contraste. Cette méthode peut être appliquée à des études sur d'autres tissus humains, tels que le cœur et le foie, avec des modifications appropriées10,11,12.
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Protocol
Tous les cadavres utilisés dans cette étude ont été légalement donnés au Centre d'éducation en anatomie chirurgicale du Yonsei University College of Medicine.
1. Obtenir des échantillons
- Dessiner une ligne d'incision sur le cadavre avec un crayon de couleur pour indiquer la zone de coupe pour la récolte de l'échantillon. Vérifiez que la ligne d'incision tracée s'étend médialement à un canthus médial, latéralement à un canthus latéral, supérieure à une bordure supérieure de la paupière inférieure, et inférieure à 1 cm au-dessous de la ligne de la jante orbitale.
REMARQUE : Considérez la taille de l'échantillon en fonction de la taille maximale de balayage de l'équipement micro-CT (notre équipement pourrait acquérir une image avec une dimension d'objet maximale de 7 à 7 cm). Ici, un échantillon d'environ 1 cm de largeur, 3 cm de longueur et 1,25 g de poids a été récolté dans la région de l'ORL. - Couper les tissus faciaux suivant la ligne d'incision avec une lame. Assurez-vous que la coupe est profonde de telle sorte que la pointe de la lame touche l'os. L'échantillon doit inclure la peau, les tissus sous-cutanés, les muscles, les graisses et le périosteum.
- Fixer l'échantillon dans 10 % de formaline immédiatement et le conserver pendant 5 à 7 jours à température ambiante (figure 1A).
REMARQUE : Les cadavres embaumés et frais peuvent être utilisés pour cette étude. Cependant, la solution de fixation pour les cadavres peut différer légèrement de la solution utilisée dans une expérience biologique. Par conséquent, nous suggérons de fixer l'échantillon avec 10% de formaline à nouveau, même après avoir obtenu l'échantillon de cadavres embaumés.
2. Préparation à la coloration
- Après fixation, couper l'échantillon en 3 morceaux (5 à 7 mm d'épaisseur). Ne perdez pas l'emplacement et la direction de chaque pièce au cours de ce processus.
REMARQUE : Le scanner microCT que nous utilisons peut couvrir une taille maximale de 7 cm3, mais la solution PTA ne peut pas pénétrer avec succès l'échantillon s'il est trop épais. - Coudre le côté superolatéral de chaque pièce à l'aide d'une aiguille et d'un fil noir de sorte que la direction de l'échantillon puisse être vérifiée plus tard.
- Déshydratez l'échantillon dans une série de solutions d'éthanol de 30 %, 50 % et 70 % pour 1 jour chacune.
- Placer l'échantillon dans 70 % d'éthanol jusqu'à ce qu'il soit taché.
3. Préparation DE la PTA
- Commencez le processus de coloration PTA 1 semaine avant que la numérisation microCT soit prévue.
- Préparez 210 ml de solution d'éthanol à 70 % et ajoutez 2,1 g de puissance PTA. Bien mélanger à l'aide d'un shaker à 55-60 tr/min.
REMARQUE : La concentration de la solution PTA devrait être de 1 % en éthanol. - Préparer trois contenants en plastique de 70 ml pour chaque pièce tranchée. Remplissez les conteneurs avec la solution PTA. Tremper les spécimens dans les récipients et les placer sur un shaker pour une pénétration efficace. Laisser les échantillons pendant 5 à 7 jours(figure 1B).
- Lorsque la coloration est terminée, entreposez l'échantillon dans 70 % d'éthanol pour vous préparer à la numérisation.
REMARQUE : Les échantillons tachés peuvent être conservés pendant plusieurs mois, mais il est recommandé de les scanner le plus tôt possible afin d'assurer une coloration complète.
4. Numérisation MicroCT
- Envelopper l'échantillon de parafilm pour éviter le séchage. Ne pas envelopper les échantillons trop serrés, car cela peut conduire à une déformation.
- Ouvrez le scanner et placez l'échantillon sur le plateau (Figure 2).
- Définissez les paramètres de numérisation comme suit : tension source (kV) 70, courant source (A) 114, filtre Al 0,5 mm, taille du pixel d'image (m2) - 20, pixels 2240 à 2240, exposition (ms) 500, étape de rotation (deg) 0,3.
REMARQUE : Les paramètres peuvent être modifiés en fonction des échantillons et/ou des scanners utilisés. - Commencez à numériser.
REMARQUE : La numérisation prend de 30 à 60 minutes selon la résolution prévue et la vitesse du scanner.
5. Reconstruction et optimisation des données
- Exécutez le logiciel de reconstruction. Sélectionnez open Dataset dans le menu Actions pour lancer les fichiers numérisés.
- Sélectionnez l'onglet Paramètres sur la fenêtre Reconstruction. Définiz les paramètres comme suit : Réduction d'artefacts d'anneau 7, correction de faisceau-durcissant (%) 40.
REMARQUE : Les paramètres peuvent être modifiés en fonction de l'échantillon. - Commencez la reconstruction en sélectionnant l'onglet Démarrer sur le début. Les données finales seront stockées dans le dossier désigné.
- Exécutez le logiciel de redimensionnement de fichiers. Sélectionnez l'ensemble de données Source pour lancer les fichiers reconstruits.
- Sélectionnez jpg sur l'onglet Ensemble de données Destination.
- Choisissez l'option Redimensionnement 1/2 avec une option qualité de non-interpolation (rapide).
- Ajustez la barre de diapositives à 100 (la plus haute) dans l'onglet De compression d'image. Commencez à convertir.
REMARQUE : L'option de redimensionnement est d'éviter de ralentir la vitesse de l'ordinateur lorsque la 3D est rendue; cependant, il peut avoir comme conséquence la résolution inférieure une fois redimensionné intensivement. Nous suggérons de redimensionner de moitié pour une résolution acceptable avec une meilleure manipulation.
6. Reconstruction 3D
- Exécutez le logiciel de rendu de volume 3D.
- Sélectionnez Les actions et les données de volume de chargement pour lancer le jeu de données.
- Ajustez la luminosité et le niveau de contraste en modifiant la fonction de transfert de forme dans l'histogramme dans l'onglet Transfer Function Editor.
- Sélectionnez Options 'gt; Éclairage.
- Sélectionnez les icônes Ombres et Éclairage de surface. Ces effets fournissent un ton de modélisation réaliste.
- Trouvez la meilleure vue en déplaçant (cliquez et faites glisser), en tournant(clic droit et glisser),et en zoomant dans ou hors de (faire défiler) le modèle.
- Faites glisser le plan(décaler et glisser dans la direction intérieure) pour afficher les images sectionnelles (figure 3).
- Allumez l'icône Lumière. Ajustez la barre d'indication d'éclairage et trouvez le meilleur éclairage pour l'affichage. Ensuite, éteignez l'icône et fermez l'onglet Éclairage.
- Sélectionnez Options 'gt; Afficher 'gt; Clipping Box pour cacher la boîte pour l'image finale.
- Sélectionnez Actions 'gt; Enregistrer l'image pour stocker l'image.
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Representative Results
La reconstruction détaillée de l'ORL a été réalisée par microCT avec préparation PTA (Figure 4). La structure fibromusculaire ligamentaire s'étendant obliquement entre le derme et le périosteum a été distinctement observée (figure 4A). Dans la vue coronale (Figure 4B), la quantité et la complexité des fibres ont augmenté latéralement. Dans la vue horizontale (figure 4C), un maillage élaboré avec une formation arborisée a été observé. Nous avons observé une forme caractérisée par des plaques continues, plutôt que des fibres fil-like, comme rapporté précédemment. Dans la vue sagittale (Figure 4D), les épaisseurs des fibres ORL ont diminué de façon inférieure. Dans l'ensemble, cette observation multidirectionnelle a prouvé que l'ORL est composé d'un maillage multicouches de plaques continues avec une variation du nombre et de l'épaisseur selon l'emplacement.
Figure 1. Des échantillons ont été récoltés puis tachés avec la solution PTA.
(A). Les échantillons ont été fixés en formaline de 10 % après la récolte. (B). Les échantillons ont été coupés en morceaux plus minces pour améliorer la pénétration, puis placés dans la solution PTA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Le scanner microCT.
La flèche indique le plateau où le spécimen est placé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Reconstruction 3D.
Faites glisser le plan dans la direction intérieure pour afficher les images sectionnelles à l'intérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Images 3D de l'ORL.
(A). L'image globale de l'ORL. (B). Vue coronale. (C). Vue horizontale. (D). Vue sagittale. S, supérieur; A, antérieur; L, latérale; P, postérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Structures analysées de l'ORL.
Jaune, rouge et vert indiquent respectivement la peau, le muscle et le ligament. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. Comparaison entre les images 3D et 2D. (A). Volume rendu image 3D. (B). Image transversale 2D. Barre d'échelle de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger la figure.
Figure supplémentaire 2. Emballage et fixation du parafilm. (A). Envelopper le parafilm sur l'ensemble de l'échantillon pour éviter le dessèchement. (B). Parafilm aide à fixer l'échantillon fermement sur le scanner. (C). Le parafilm n'est pas visible sur le balayage microCT et pourrait être soustrait facilement. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.
Figure supplémentaire 3. Coloration insuffisante de PTA. Un espace creux au centre montre où la solution PTA n'a pas suffisamment pénétré. (A). Volume rendu image 3D. (B). Image transversale 2D. Barre d'échelle de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger la figure.
Figure supplémentaire 4. Comparaison entre les cadavres frais et embaumés. Aucune différence n'a été constatée entre les cadavres frais et embaumés pour appliquer le protocole. L'image montre une autre fonctionnalité pourrait être prise par la même méthode ainsi. (A). Le BDL obtenu à partir d'un cadavre frais. (B). Le pli nasolabial obtenu à partir d'un cadavre embaumé. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger le chiffre.
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Discussion
Nous avons mis en œuvre le microCT avec la préparation de PTA dans l'examen des tissus mous humains. En bref, les spécimens sont récoltés et fixés en formaline pendant quelques jours, suivis d'une déshydratation dans des solutions d'éthanol en série. Placer l'échantillon dans la solution PTA directement après fixation formaline peut entraîner une certaine fissuration des tissus en raison de la déshydratation rapide. Par conséquent, la déshydratation en série est nécessaire avant la coloration PTA. Ensuite, les échantillons sont tachés à l'aide de la solution PTA pendant environ une semaine. La numérisation microCT, la reconstruction 3D et l'analyse peuvent alors être effectuées. Notre objectif était d'observer l'ORL et les structures adjacentes à l'aide de cette méthode. Nous avons présenté avec succès le tissu comme modèle 3D. La peau, les ligaments et les muscles ont été nettement visualisés (Figure 5).
Plusieurs points doivent être pris en considération lors du traitement des échantillons. La taille d'un spécimen et la durée de la coloration sont les principales préoccupations. Après plusieurs études pilotes, nous avons constaté que l'épaisseur appropriée d'un spécimen est d'environ 5 à 7 mm et que la durée appropriée de la coloration est de 5 à 7 jours. Dans ces conditions, la solution PTA pénètre le spécimen à une vitesse d'environ 1 mm/jour. Si l'épaisseur dépasse 7 mm, le temps de traitement augmente. Lorsque la durée de la coloration est insuffisante par rapport au volume d'un spécimen, l'image finale peut inclure un trou vide dans la zone centrale du spécimen. Cela se produit souvent, en particulier au niveau de la peau, et enlever la peau inutile peut améliorer l'efficacité de coloration. Lorsque la durée est trop longue, le spécimen entier sera surpeuplé, ce qui rend difficile l'identification de chaque compartiment. Une étude plus approfondie sur la durée optimale pour la coloration de spécimens plus grands pourrait s'avérer utile.
Habituellement, le spécimen est divisé en morceaux pour améliorer la pénétration; il est important de se rappeler l'emplacement et la direction de chaque spécimen au cours de ce processus. Pour conserver cette information, il est recommandé de coudre sur la même région de chaque partie. Le fil sera vu dans l'image finale, et il faut faire attention que le fil n'interfère pas avec la zone principale. Par exemple, la couture sur la région superolatérale de chaque pièce peut être utile. En outre, des analyses préliminaires d'une structure anatomique sont nécessaires pour reconnaître chaque partie tissulaire en raison de leur complexité.
Le parafilm et d'autres matériaux sont utilisés pour empêcher les spécimens de se dessécher. Cependant, de légères déformations peuvent se produire lors de l'emballage des spécimens. Il est important de préserver la forme originale dans la mesure du possible. Parfois, un tube liquide est utilisé, au lieu de parafilm. Cependant, même le moindre tremblement d'une machine a le potentiel d'affecter le tube pendant la numérisation et pourrait réduire la clarté de l'image finale.
Cette approche limite plusieurs. Tout d'abord, ce protocole ne peut pas être fait avec un objet vivant. En outre, la taille de l'échantillon est limitée par la taille maximale de balayage du scanner microCT. Il pourrait y avoir des erreurs lors de l'analyse de l'image rendue à l'œil nu; par conséquent, d'autres expériences histologiques peuvent être nécessaires pour confirmer les résultats. Il peut y avoir une légère distorsion dimensionnelle pendant la préparation; cependant, nous croyons que cela n'affecte pas de façon significative le résultat de l'étude.
La numérisation microCT avec préparation PTA est avantageuse pour examiner des compartiments spécifiques au sein d'une structure complexe. Cette étude s'est concentrée sur le développement d'une méthode pour augmenter le taux de contraste utilisant la préparation de PTA, et d'autres dispositifs, comme la numérisation et les processus de reconstruction, ont été indiqués brièvement. Cependant, les lecteurs devraient être en mesure d'obtenir le même résultat s'ils utilisent des scanners microCT contemporains et des programmes d'analyse d'images après le processus de coloration. Cette méthode pourrait s'avérer utile dans les analyses des tissus et des structures cancéreuses, la contribution des nerfs dans des domaines spécifiques, et les structures anatomiques à haute résolution des organes, tels que le cœur et le foie13,14,15.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche du yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Les auteurs remercient les personnes qui ont généreusement donné leur corps au Yonsei University College of Medicine. Nous sommes reconnaissants à Jun Ho Kim et Jong Ho Bang pour leur soutien technique (membres du personnel du Centre d'éducation en anatomie chirurgicale du Yonsei University College of Medicine). Nous sommes également reconnaissants à Genoss Co., Ltd. pour le système de balayage microCT de haute qualité utilisé dans cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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