Summary
Die Mikro-Röntgen-Computertomographie ist wirksam bei der Beschaffung dreidimensionaler Informationen von unbeschädigten menschlichen Proben, hat aber nur begrenzten Erfolg bei der Beobachtung von Weichgeweben. Die Verwendung von Phosphotungstiksäure Kontrastmittel kann dieses Problem lösen. Wir implementierten dieses Kontrastmittel, um menschliche empfindliche fibromuskuläre Gewebe (das Orbicularis-Rückhalteband) zu untersuchen.
Abstract
Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung sind gängige Methoden zur Untersuchung menschlichen Gewebes. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen beschädigen, während Verarbeitung und histologische Beobachtung nur begrenzte Informationen durch Querschnittsbildung liefern. Die Mikro-Röntgen-Computertomographie (microCT) ist ein wirksames Werkzeug, um dreidimensionale Informationen zu erhalten, ohne Proben zu beschädigen. Es zeigt jedoch eine begrenzte Effizienz bei der Differenzierung von Weichteilteilen. Die Verwendung von kontrastverstärkenden Wirkstoffen, wie Phosphotungstiksäure (PTA), kann dieses Problem lösen, indem der Weichteilkontrast verbessert wird. Wir implementierten microCT mit PTA, um das humane Orbicularis-Retaining-Band (ORL) zu untersuchen, das eine empfindliche Struktur im Orbitbereich ist. Bei diesem Verfahren werden geerntete Proben in Formalin fixiert, in seriellen Ethanollösungen dehydriert und mit einer PTA-Lösung gebeizt. Nach der Färbung werden MicroCT-Scans, 3D-Rekonstruktionen und Analysen durchgeführt. Haut, Bänder und Muskeln können mit dieser Methode klar visualisiert werden. Die Probengröße und die Dauer der Färbung sind wesentliche Merkmale des Verfahrens. Die geeignete Probendicke betrug etwa 5–7 mm, oberhalb derer der Prozess verlangsamt wurde, und die optimale Dauer betrug 5–7 Tage, unter denen gelegentlich ein leeres Loch im zentralen Bereich auftrat. Um die Position und Richtung der kleinen Stücke während des Schneidens zu erhalten, wird das Nähen auf der gleichen Region jedes Teils empfohlen. Darüber hinaus sind vorläufige Analysen der anatomischen Struktur erforderlich, um jedes Stück korrekt zu identifizieren. Parafilm kann verwendet werden, um das Trocknen zu verhindern, aber es sollte darauf geachtet werden, Probenverzerrungen zu vermeiden. Unsere multidirektionale Beobachtung zeigte, dass der ORL aus einem mehrschichtigen Netz aus kontinuierlichen Platten besteht und nicht aus fadenähnlichen Fasern, wie bereits berichtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MikroCT-Scanning mit PTA nützlich ist, um bestimmte Abteilungen innerhalb komplexer Strukturen menschlichen Gewebes zu untersuchen. Es kann bei der Analyse von Krebsgeweben, Nervengeweben und verschiedenen Organen, wie Herz und Leber, hilfreich sein.
Introduction
Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung werden in der Regel verwendet, um menschliche Gewebe zu untersuchen, wie Muskeln und Bindegewebe. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen leicht beschädigen, und die histologische Beobachtung liefert nur begrenzte Informationen über flache Querschnittsflächen1,2. Daher sind verbesserte Methoden erforderlich, um Gewebe genauer und effizienter zu untersuchen.
Konventionelle Computertomographie (CT) wird in der Regel in der klinischen Praxis verwendet, aber es fehlt die Fähigkeit, kleine Strukturen zu unterscheiden2,3. Micro-Röntgen-CT (microCT) ist ein effektives Werkzeug, um dreidimensionale (3D) Informationen über kleine Strukturen von Proben zu erhalten, ohne sie zu zerstören. MicroCT hat jedoch nur begrenzte Anwendungen, da nur dichtes Gewebe klar visualisiert werden kann; es kann nicht verwendet werden, um Weichgewebe zu unterscheiden. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Färbemittel verwendet werden. Kontrastverstärkende Wirkstoffe wie Phosphotungssäure (PTA), Phosphomolybdidsäure und Lugols Jod verbessern die Weichteilkontrastrate beim Scannen4,5. Mehrere Studien, die diese Agenten vergleichen, deuten darauf hin, dass PTA eine gute Leistung zeigt und leicht zu handhaben ist6,7,8.
Das Orbicularis-Retainband (ORL) ist eine empfindliche Struktur um die Umlaufbahn, die bei konventioneller Beobachtung leicht beschädigt werden kann9. Wir haben 3D-Informationen zu dieser Struktur unter Verwendung von microCT mit PTA als Kontrastmittel untersucht und erfolgreich abgerufen. Diese Methode kann auf Studien an anderen menschlichen Geweben, wie Herz und Leber, mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden10,11,12.
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Protocol
Alle in dieser Studie verwendeten Kadaver wurden legal an das Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine gespendet.
1. Beschaffung von Proben
- Zeichnen Sie eine Schnittlinie auf dem Kadaver mit einem Buntstift, um die Schnittfläche für die Probenernte anzuzeigen. Prüfen Sie, ob sich die gezogene Schnittlinie medial zu einem medialen Canthus, seitlich zu einem seitlichen Canthus, überlegen zu einem oberen Rand des unteren Augenlids und unter der Linie vom Orbitalrand her erstreckt.
HINWEIS: Betrachten Sie die Stichprobengröße basierend auf der maximalen Scangröße der Mikro-CT-Ausrüstung (unsere Geräte können ein Bild mit einer maximalen Objektabmessung von 7 x 7 cm erfassen). Hierbei wurde eine etwa 1 cm große, 3 cm lange und 1,25 g schwere Probe aus dem ORL-Bereich geerntet. - Schneiden Sie das Gesichtsgewebe nach der Schnittlinie mit einer Klinge. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt so tief ist, dass die Spitze der Klinge den Knochen berührt. Die Probe muss die Haut, das Unterhautgewebe, den Muskel, das Fett und das Periost enthalten.
- Fixieren Sie die Probe sofort in 10% Formalin und bewahren Sie sie 5 bis 7 Tage bei Raumtemperatur auf (Abbildung 1A).
HINWEIS: Für diese Studie können sowohl einbalsamierte als auch frische Kadaver verwendet werden. Die Fixierungslösung für Kadaver kann sich jedoch geringfügig von der lösungsweise unterscheiden, die in einem biologischen Experiment verwendet wird. Daher schlagen wir vor, die Probe auch nach Erhalt der Probe von einbalsamierten Kadavern wieder mit 10% Formalin zu fixieren.
2. Vorbereitung auf die Färbung
- Nach der Fixierung die Probe in 3 Teile (5–7 mm Dicke) schneiden. Verlieren Sie während dieses Vorgangs nicht die Position und Richtung jedes Stücks.
HINWEIS: Der von uns verwendende MicroCT-Scanner kann eine maximale Größe von 7 cm3 abdecken, aber die PTA-Lösung kann die Probe nicht erfolgreich durchdringen, wenn sie zu dick ist. - Nähen Sie die superolaterale Seite jedes Stückes mit einer Nadel und einem schwarzen Faden, so dass die Richtung der Probe später überprüft werden kann.
- Dehydrieren Sie die Probe in einer Reihe von 30%, 50% und 70% Ethanol-Lösungen für 1 Tag pro Tag.
- Die Probe bis zur Färbung in 70% Ethanol geben.
3. PTA-Vorbereitung
- Beginnen Sie den PTA-Färbungsprozess 1 Woche vor dem geplanten MicroCT-Scannen.
- Bereiten Sie 210 ml 70% Ethanollösung vor und fügen Sie 2,1 g PTA-Leistung hinzu. Mit einem Shaker bei 55-60 Rpm gut mischen.
HINWEIS: Die Konzentration der PTA-Lösung sollte 1% in Ethanol betragen. - Bereiten Sie drei 70 ml Kunststoffbehälter für jedes geschnittene Stück vor. Füllen Sie die Behälter mit der PTA-Lösung. Die Proben in die Behälter einweichen und für ein effektives Eindringen auf einen Shaker legen. Lassen Sie die Proben für 5–7 Tage(Abbildung 1B).
- Wenn die Färbung abgeschlossen ist, lagern Sie die Probe in 70% Ethanol, um sich auf das Scannen vorzubereiten.
HINWEIS: Die gefärbten Proben können für mehrere Monate aufbewahrt werden, aber es wird empfohlen, die Proben so schnell wie möglich zu scannen, um eine vollständige Färbung zu gewährleisten.
4. MicroCT-Scannen
- Wickeln Sie die Probe mit Parafilm, um ein Trocknen zu verhindern. Wickeln Sie die Proben nicht zu eng, da dies zu Verformungen führen kann.
- Öffnen Sie den Scanner, und legen Sie das Muster auf das Fach (Abbildung 2).
- Stellen Sie die Scanparameter wie folgt ein: Ausgangsspannung (kV) = 70, Quellstrom (A) = 114, Al-Filter = 0,5 mm, Bildpixelgröße (m2) = 20, Pixel = 2240 x 2240, Belichtung (ms) = 500, Rotationsschritt (deg) = 0,3.
HINWEIS: Die Parameter können entsprechend den verwendeten Proben und/oder Scannern geändert werden. - Starten Sie den Scanvorgang.
HINWEIS: Das Scannen dauert je nach auflösung und Geschwindigkeit des Scanners 30 bis 60 min.
5. Rekonstruktion und Optimierung von Daten
- Führen Sie die Rekonstruktionssoftware aus. Wählen Sie Dataset öffnen im Menü Aktionen aus, um die gescannten Dateien zu starten.
- Wählen Sie die Registerkarte Einstellungen im Fenster Rekonstruktion aus. Legen Sie die Parameter wie folgt fest: Ringartefakte Reduktion = 7, Strahlhärtekorrektur (%) = 40.
HINWEIS: Die Parameter können entsprechend der Stichprobe geändert werden. - Beginnen Sie mit der Rekonstruktion, indem Sie auf der Registerkarte Start die Option Start auswählen. Die endgültigen Daten werden im angegebenen Ordner gespeichert.
- Führen Sie die Dateigrößenänderungssoftware aus. Wählen Sie Quelldatensatz aus, um die rekonstruierten Dateien zu starten.
- Wählen Sie jpg auf der Registerkarte Zieldatensatz aus.
- Wählen Sie die Größenänderungsoption 1/2 mit der Option Qualität "Keine Interpolation" (schnell).
- Passen Sie die Schiebeleiste auf 100 (höchste) in der Registerkarte Bildkomprimierung an. Beginnen Sie mit der Konvertierung.
HINWEIS: Die Größenänderungsoption besteht darin, eine Verlangsamung der Computergeschwindigkeit beim Gerendern von 3D zu vermeiden. Es kann jedoch zu einer niedrigeren Auflösung führen, wenn die Größe der Größe ausgiebig geändert wird. Wir schlagen vor, die Größenänderung für eine akzeptable Auflösung mit besserer Handhabung in der Hälfte zu verkleinern.
6. 3D-Rekonstruktion
- Führen Sie die 3D-Volume-Rendering-Software aus.
- Wählen Sie Aktionen > Volumedaten laden aus, um das Dataset zu starten.
- Passen Sie die Helligkeits- und Kontraststufe an, indem Sie die Formübertragungsfunktion im Histogramm auf der Registerkarte Übertragungsfunktions-Editor ändern.
- Wählen Sie Optionen > Beleuchtung.
- Wählen Sie Schatten- und Flächenbeleuchtungssymbole aus. Diese Effekte bieten einen realistischen Modellierungston.
- Finden Sie die beste Ansicht, indem Sie(klicken und ziehen), drehen (Rechtsklick und Ziehen), und Zoomen in oder aus (scrollen) das Modell.
- Schieben Sie die Ebene (Verschieben + Klicken und Ziehen in die innere Richtung), um die Schnittbilder anzuzeigen ( Abbildung3).
- Aktivieren Sie das Lichtsymbol. Passen Sie die Lichtanzeigeleiste an und finden Sie die beste Beleuchtung für die Anzeige. Deaktivieren Sie dann das Symbol, und schließen Sie die Registerkarte Beleuchtung.
- Wählen Sie Optionen > Anzeigen > Clipping Box aus, um das Feld für das endgültige Bild auszublenden.
- Wählen Sie Aktionen > Bild speichern, um das Bild zu speichern.
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Representative Results
Die detaillierte Rekonstruktion des ORL wurde durch microCT mit PTA-Präparation erreicht (Abbildung 4). Die kreuzbandige fibromuskuläre Struktur, die sich schräg zwischen der Dermis und dem Periost eitel ausdehnt, wurde deutlich beobachtet (Abbildung 4A). In der koronalen Ansicht (Abbildung 4B) nahmen die Menge und Komplexität der Fasern seitlich zu. In der horizontalen Ansicht (Abbildung 4C) wurde ein aufwendiges Netz mit einer arborisierten Formation beobachtet. Wir beobachteten eine Form, die durch kontinuierliche Platten gekennzeichnet ist, anstatt fadenartige Fasern, wie zuvor berichtet. In der sagittalen Ansicht (Abbildung 4D) verringerten sich die Dicken der ORL-Fasern schlechter. Insgesamt bewies diese multidirektionale Beobachtung, dass der ORL aus einem mehrschichtigen Netz aus kontinuierlichen Platten mit Variationen in Anzahl und Dicke je nach Position besteht.
Abbildung 1. Die Proben wurden geerntet und dann mit PTA-Lösung gebeizt.
(A). Die Proben wurden nach der Ernte in 10 % formalin festgesetzt. (B). Proben wurden in dünnere Stücke geschnitten, um die Penetration zu verbessern, und dann in die PTA-Lösung gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Der microCT-Scanner.
Pfeil zeigt das Fach an, in dem die Probe platziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. 3D-Rekonstruktion.
Schieben Sie die Ebene in die innere Richtung, um die Schnittbilder im Inneren anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. 3D-Bilder des ORL.
(A). Das Gesamtbild des ORL. (B). Koronale Ansicht. (C). Horizontale Ansicht. (D). Sagittal-Ansicht. S, überlegen; A, anterior; L, seitlich; P, hinter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Analysierte Strukturen des ORL.
Gelb, Rot und Grün zeigen die Haut, den Muskel und das Band an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. Vergleich zwischen 3D- und 2D-Bildern. (A). Volumen gerendert 3D-Bild. (B). Querschnittsbild 2D. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2. Umhüllung und Befestigung des Parafilms. (A). Den Parafilm über die gesamte Probe wickeln, um ein Austrocknen zu verhindern. (B). Parafilm hilft, die Probe fest am Scanner zu fixieren. (C). Parafilm ist beim MicroCT-Scannen nicht sichtbar und könnte leicht subtrahiert werden. Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3. Unzureichende Färbung von PTA. Ein Hohlraum in der Mitte zeigt, wo die PTA-Lösung nicht ausreichend eingedrungen ist. (A). Volumen gerendert 3D-Bild. (B). Querschnittsbild 2D. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4. Vergleich zwischen frischen und einbalsamierten Kadavern. Es wurden keine Unterschiede zwischen frischen und einbalsamierten Kadavern gefunden, um das Protokoll anzuwenden. Das Bild zeigt, dass ein anderes Feature ebenfalls von der gleichen Methode übernommen werden könnte. (A). Der ORL aus einem frischen Kadaver. (B). Die nasolabiale Falte, die aus einem einbalsamierten Kadaver gewonnen wird. Bitte klicken Sie hier, um die Figur herunterzuladen.
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Discussion
Wir implementierten microCT mit PTA-Präparat bei der Untersuchung menschlicher Weichgewebe. Kurz gesagt, Proben werden geerntet und in Formalin für ein paar Tage fixiert, gefolgt von Dehydrierung in seriellen Ethanol-Lösungen. Das Platzieren der Probe in die PTA-Lösung direkt nach der Formalinfixierung kann zu einigen Geweberissen aufgrund einer schnellen Dehydrierung führen. Daher ist eine serielle Dehydrierung vor der PTA-Färbung erforderlich. Als nächstes werden die Proben mit PTA-Lösung für etwa eine Woche gefärbt. MicroCT-Scans, 3D-Rekonstruktionen und Analysen können dann durchgeführt werden. Unser Ziel war es, die ORL und angrenzende Strukturen mit dieser Methode zu beobachten. Wir haben das Gewebe erfolgreich als 3D-Modell präsentiert. Haut, Bänder und Muskeln wurden deutlich visualisiert (Abbildung 5).
Bei der Verarbeitung der Proben sollten mehrere Punkte berücksichtigt werden. Die Größe eines Exemplars und die Dauer der Färbung sind Hauptsorgen. Nach mehreren Pilotstudien fanden wir heraus, dass die richtige Dicke einer Probe etwa 5–7 mm beträgt und die richtige Dauer der Färbung 5–7 Tage beträgt. Unter diesen Bedingungen dringt die PTA-Lösung mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 mm/Tag in die Probe ein. Wenn die Dicke 7 mm überschreitet, erhöht sich die Bearbeitungszeit. Wenn die Dauer der Färbung im Vergleich zum Volumen einer Probe nicht ausreicht, kann das endgültige Bild ein leeres Loch im zentralen Bereich der Probe enthalten. Dies tritt häufig auf, vor allem auf hautebene, und das Entfernen unnötiger Haut kann die Färbungseffizienz verbessern. Wenn die Dauer zu lang ist, wird das gesamte Exemplar überbefleckt, was es schwierig macht, jedes Fach zu identifizieren. Weitere Untersuchungen über die optimale Dauer für die Färbung größerer Proben könnten sich als nützlich erweisen.
In der Regel wird die Probe in Stücke unterteilt, um die Penetration zu verbessern; es ist wichtig, sich während dieses Prozesses an den Ort und die Richtung jedes Exemplars zu erinnern. Um diese Informationen zu erhalten, wird das Nähen auf der gleichen Region jedes Teils empfohlen. Der Thread wird im endgültigen Bild angezeigt, und man sollte darauf achten, dass der Thread den Hauptbereich nicht beeinträchtigt. Beispielsweise kann das Nähen auf dem superolateralen Bereich jedes Stückes hilfreich sein. Zusätzlich sind vorläufige Analysen einer anatomischen Struktur erforderlich, um jedes Gewebeteil aufgrund seiner Komplexität zu erkennen.
Parafilm und andere Materialien werden verwendet, um das Austrocknen von Proben zu verhindern. Beim Umwickeln von Proben können jedoch leichte Missbildungen auftreten. Es ist wichtig, die ursprüngliche Form so weit wie möglich zu erhalten. Manchmal wird ein flüssiges Rohr anstelle von Parafilm verwendet. Aber auch das geringste Zittern einer Maschine hat das Potenzial, die Röhre beim Scannen zu beeinflussen und die Klarheit des endgültigen Bildes zu verringern.
Dieser Ansatz hat mehrere Einschränkungen. Erstens kann dieses Protokoll nicht mit einem lebenden Objekt durchgeführt werden. Darüber hinaus wird die Stichprobengröße durch die maximale Scangröße des MicroCT-Scanners eingeschränkt. Es kann Fehler bei der Analyse des gerenderten Bildes mit dem bloßen Auge geben; daher können zusätzliche histologische Experimente erforderlich sein, um die Ergebnisse zu bestätigen. Während der Vorbereitung kann es zu leichten Formverzerrungen führen; Wir sind jedoch der Meinung, dass dies das Ergebnis der Studie nicht wesentlich beeinflusst.
MicroCT-Scanning mit PTA-Präparation ist vorteilhaft für die Untersuchung bestimmter Fächer innerhalb einer komplexen Struktur. Diese Studie konzentrierte sich auf die Entwicklung einer Methode zur Verbesserung der Kontrastrate mit PTA-Präparation, und andere Merkmale, wie Scan- und Rekonstruktionsprozesse, wurden kurz angedeutet. Leser sollten jedoch in der Lage sein, das gleiche Ergebnis zu erzielen, wenn sie nach dem Färbevorgang moderne MikroCT-Scanner und bildanalysierende Programme verwenden. Diese Methode könnte sich bei der Analyse von Krebsgeweben und -strukturen, bei nervenaufreibenden Erkrankungen in bestimmten Bereichen und bei hochauflösenden anatomischen Strukturen von Organen wie Herz und Leber13,14,15als hilfreich erweisen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der Fakultät des Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099) unterstützt. Die Autoren danken den Menschen, die ihre Körper sehr großzügig an das Yonsei University College of Medicine gespendet haben. Wir danken Jun Ho Kim und Jong Ho Bang für ihre technische Unterstützung (Mitarbeiter im Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine). Wir danken auch Der Genoss Co., Ltd. für das hochwertige MicroCT-Scansystem, das in dieser Forschung zum Einsatz kommen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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