Summary
Micro X-Ray computertomografie is effectief in het verkrijgen van driedimensionale informatie van onbeschadigde menselijke specimens, maar heeft een beperkt succes bij het observeren van zachte weefsels. Het gebruik van phosphotungstic acid contrast agent kan dit probleem oplossen. We implementeerden dit contrastmiddel om menselijke delicate fibromusculaire weefsels (het behoud van het ligament van orbicularis) te onderzoeken.
Abstract
Handmatige dissectie en histologische observatie zijn veelgebruikte methoden die worden gebruikt om menselijke weefsels te onderzoeken. Echter, handmatige dissectie kan gevoelige structuren beschadigen, terwijl de verwerking en histologische observatie beperkte informatie bieden door middel van cross-sectionele beeldvorming. Micro X-Ray computertomografie (microCT) is een effectief hulpmiddel voor het verkrijgen van driedimensionale informatie zonder de specimens te beschadigen. Echter, het toont beperkte efficiëntie in het differentiëren van zachte weefsel delen. Gebruik van contrast-verbeterende agenten, zoals phosphotungstic acid (PTA), dit probleem kan oplossen door het verbeteren van het contrast van zacht weefsel. We implementeerden microCT met PTA om te onderzoeken van de menselijke orbicularis behoud ligament (ORL), dat is een delicate structuur in de baan gebied. Bij deze methode worden geoogste specimens in formaline opgelost, gedehydrateerd in seriële ethanol oplossingen en gekleurd met een PTA-oplossing. Na kleuring worden microCT Scanning, 3D reconstructie en analyse uitgevoerd. Huid, ligamenten, en spieren kunnen duidelijk worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. De monstergrootte en de duur van de kleuring zijn essentiële kenmerken van de methode. De geschikte preparaatdikte was ongeveer 5 – 7 mm, waarboven het proces werd vertraagd, en de optimale duur was 5 – 7 dagen, waarbeneden een leeg gat in het centrale gebied af en toe optrad. Om de locatie en de richting van kleine stukjes tijdens het snijden te behouden, wordt het naaien op hetzelfde gebied van elk onderdeel aanbevolen. Bovendien zijn voorlopige analyses van de anatomische structuur nodig om elk stuk correct te identificeren. Parafilm kan worden gebruikt om uitdroging te voorkomen, maar er moet voor worden gezorgd dat preparaat vervorming wordt voorkomen. Onze multidirectionele observatie toonde aan dat de ORL bestaat uit een meerlaagse gevlochten van doorlopende platen, in plaats van draadachtige vezels, zoals eerder gerapporteerd. Deze resultaten suggereren dat microCT scanning met PTA nuttig is voor het onderzoeken van specifieke compartimenten binnen complexe structuren van menselijk weefsel. Het kan nuttig zijn in de analyses van kanker weefsels, zenuw weefsels, en verschillende organen, zoals het hart en de lever.
Introduction
Handmatige dissectie en histologische observatie worden meestal gebruikt om menselijke weefsels te onderzoeken, zoals spieren en bindweefsels. Echter, handmatige dissectie kan gemakkelijk beschadigen delicate structuren, en histologische observatie biedt beperkte informatie over vlakke dwarsdoorsnede oppervlakken1,2. Daarom zijn betere methoden nodig om de weefsels nauwkeuriger en efficiënter te bestuderen.
Conventionele computertomografie (CT) wordt over het algemeen gebruikt in de klinische praktijk, maar het mist de mogelijkheid om kleine structuren te onderscheiden2,3. Micro X-Ray CT (microCT) is een effectief hulpmiddel voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie van kleine structuren uit specimens, zonder ze te vernietigen. Micro CT heeft echter beperkte toepassingen omdat alleen dichte weefsels duidelijk kunnen worden gevisualiseerd; het kan niet worden gebruikt om te differentiëren zachte weefsels. Om deze beperking te overwinnen, kunnen kleurings middelen worden gebruikt. Contrast-verbeterende agenten, zoals phosphotungstic acid (PTA), foshomolybdic zuur, en Lugol jodium, verbeteren de zachte weefsel contrast snelheid tijdens het scannen van4,5. Verschillende studies vergelijken deze agenten suggereren dat PTA goede prestaties toont en is gemakkelijk te hanteren6,7,8.
De orbicularis met ligament (ORL) is een delicate structuur rond de baan, die gemakkelijk kan worden beschadigd tijdens conventionele observatie9. We onderzochten en met succes opgehaalde 3D-informatie over deze structuur met behulp van microCT met PTA als contrastmiddel. Deze methode kan worden toegepast op studies op andere menselijke weefsels, zoals het hart en de lever, met de juiste wijzigingen10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kadavers die in deze studie werden gebruikt, werden legaal geschonken aan het opleidingscentrum voor chirurgische anatomie aan het Yonsei University College of Medicine.
1. monsters verkrijgen
- Teken een incisie lijn op het kadaver met een gekleurd potlood om het snijgebied voor het oogsten van het monster aan te geven. Controleer of de incisie lijn getrokken strekt zich mediaal naar een mediale Canthus, lateraal aan een laterale Canthus, superieur aan een superieure grens van het onderste ooglid, en ondeugdelijkheid tot 1 cm onder de lijn van de orbitale rand.
Opmerking: Houd rekening met de steekproefgrootte op basis van de maximale scan grootte van de micro-CT-apparatuur (onze apparatuur kan een beeld verkrijgen met een maximale object afmeting van 7 × 7 cm). Hier, een monster ongeveer 1 cm breed, 3 cm lang, en 1,25 g gewicht werd geoogst uit de regio ORL. - Snijd de gelaats weefsels na de incisie lijn met een mes. Zorg ervoor dat de snede diep is, zodat de punt van het blad het bot raakt. Het monster moet de huid, het onderhuidse weefsel, de spier, het vet en het periosteum bevatten.
- Fixeer het monster in 10% formaline onmiddellijk en bewaar het gedurende 5 tot 7 dagen bij kamertemperatuur (Figuur 1a).
Opmerking: zowel gebalsemd als verse kadavers kunnen voor deze studie worden gebruikt. De fixatie oplossing voor kadavers kan echter enigszins afwijken van de oplossing die in een biologisch experiment wordt gebruikt. Daarom stellen we voor om het monster met 10% formaline opnieuw te fixeren, zelfs na het verkrijgen van het monster van gebalsemd cadavers.
2. voorbereiding van de kleuring
- Snijd het monster na bevestiging in 3 stukken (5 – 7 mm dik). Verlies de locatie en richting van elk stuk tijdens dit proces niet.
Opmerking: de microCT-scanner die we gebruiken, kan een maximale grootte van 7 cm³ beslaan, maar de PTA-oplossing kan het monster niet met succes binnendringen als het te dik is. - Naai de superolaterale kant van elk stuk met behulp van een naald en zwarte draad zodat de richting van het monster later kan worden gecontroleerd.
- Dehydraat het monster in een reeks van 30%, 50% en 70% ethanol oplossingen voor 1 dag per stuk.
- Plaats het monster in 70% ethanol tot de kleuring.
3. PTA voorbereiding
- Begin het PTA-kleuringsproces 1 week voordat microCT-scanning is gepland.
- Bereid 210 mL van 70% ethanol oplossing en voeg 2,1 g van PTA macht om het. Meng goed met een shaker bij 55-60 rpm.
Opmerking: de concentratie van de PTA-oplossing moet 1% in ethanol zijn. - Bereid 3 70 mL plastic containers voor elk gesneden stuk. Vul de containers met de PTA-oplossing. Dompel de specimens in de containers en plaats ze op een shaker voor effectieve penetratie. Laat de monsters voor 5 – 7 dagen (Figuur 1b).
- Wanneer de kleuring is voltooid, bewaar het monster in 70% ethanol ter voorbereiding op het scannen.
Opmerking: de bevlekte monsters kunnen enkele maanden worden gehandhaafd, maar het wordt aanbevolen om de monsters zo snel mogelijk te scannen om volledige kleuring te waarborgen.
4. MicroCT Scanning
- Wikkel het monster met Parafilm om uitdroging te voorkomen. Wikkel de monsters niet te strak, omdat dit kan leiden tot vervorming.
- Open de scanner en plaats het monster op de lade (Figuur 2).
- Stel de scanparameters als volgt in: bron spanning (kV) = 70, bron stroom (μA) = 114, al filter = 0,5 mm, beeld pixelgrootte (μm ²) = 20, pixels = 2240 × 2240, belichting (MS) = 500, rotatie stap (DEG) = 0,3.
Opmerking: de parameters kunnen worden aangepast op basis van de gebruikte samples en/of scanners. - Start het scannen.
Opmerking: het scannen duurt 30 tot 60 minuten, afhankelijk van de beoogde resolutie en de snelheid van de scanner.
5. reconstructie en optimalisatie van gegevens
- Voer de reconstructie software uit. Selecteer gegevensset openen in het menu acties om de gescande bestanden te starten.
- Selecteer het tabblad instellingen in het venster reconstructie . Stel de parameters als volgt in: ring artefacten reductie = 7, bundel-verhardings correctie (%) = 40.
Opmerking: de parameters kunnen worden gewijzigd volgens het voorbeeld. - Begin met de wederopbouw door Start te selecteren op het tabblad Start . De uiteindelijke gegevens worden opgeslagen in de daarvoor bestemde map.
- Voer de bestandsgrootte software uit. Selecteer brongegevensset om de gereconstrueerde bestanden te starten.
- Selecteer jpg op het tabblad Destination data set .
- Kies de optie formaat wijzigen 1/2 met een kwaliteits optie zonder interpolatie (snel).
- Pas de schuifbalk aan op 100 (hoogste) in het tabblad afbeeldingscompressie . begin met converteren.
Opmerking: de optie vergroten/verkleinen is om te voorkomen dat de computer snelheid vertraagt wanneer 3D wordt gerenderd; het kan echter resulteren in een lagere resolutie wanneer het formaat uitgebreid wordt aangepast. We raden u aan de grootte in tweeën te wijzigen voor een acceptabele resolutie met betere afhandeling.
6.3D reconstructie
- Voer de 3D-volume rendering-software uit.
- Selecteer acties > volumegegevens laden om de gegevensset te starten.
- Pas de helderheid en het contrastniveau aan door de shape Transfer functie in het histogram te wijzigen op het tabblad overdrachtsfunctie-editor .
- Selecteer opties > verlichting.
- Selecteer schaduwen en pictogrammen voor oppervlakte belichting . Deze effecten bieden een realistische modelleer Toon.
- Zoek de beste weergave door te verplaatsen (klikken en slepen), roteren (Klik met derechtermuisknop en slepen) en in-of uitzoomen (schuiven) van het model.
- Schuif het vlak (Shift + klik en sleep in de binnenste richting) om de sectionele afbeeldingen weer te geven (Figuur 3).
- Schakel het licht pictogram in. Pas de verlichtings indicatiebalk aan en vind de beste belichting om te bekijken. Schakel vervolgens het pictogram uit en sluit het tabblad belichting .
- Selecteer opties ≫ ≫ uitknipvak weer geven om het vak voor de uiteindelijke afbeelding te verbergen.
- Selecteer acties ≫ afbeelding opslaan om de afbeelding op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gedetailleerde reconstructie van de ORL werd bereikt door microCT met de voorbereiding van de PTA (Figuur 4). De ligamenteuze fibromusculaire structuur die schuin tussen de dermis en het periosteum uitstrekte, werd duidelijk waargenomen (figuur 4a). In de coronale weergave (figuur 4b) steeg de hoeveelheid en de complexiteit van de vezels lateraal. In de horizontale weergave (figuur 4c) werd een uitgebreid gevlochten met een arborized formatie waargenomen. We observeerden een vorm gekenmerkt door continue platen, in plaats van draadachtige vezels, zoals eerder gerapporteerd. In de sagittale weergave (figuur 4D) daalden de diktes van de ORL-vezels inferiorly. Over het algemeen bewees deze multidirectionele observatie dat de ORL bestaat uit een meerlaagse gevlochten van doorlopende platen met variatie in het aantal en de dikte, afhankelijk van de locatie.
Figuur 1. Monsters werden geoogst en vervolgens gekleurd met PTA oplossing.
A). de monsters werden na de oogst in 10% formaline vastgesteld. (B). monsters werden in dunnere stukken gesneden om de penetratie te verbeteren en vervolgens in de PTA-oplossing te worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. De microCT-scanner.
Pijl geeft de lade aan waar het preparaat is geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. 3D reconstructie.
Schuif het vlak in de binnenste richting om de sectionele beelden binnen te bekijken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. 3D-beelden van de ORL.
(A). het algehele imago van de ORL. (B). coronal View. (C). horizontale weergave. (D). sagittale weergave. S, superieur; A, anterior; L, laterale; P, posterior. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Geanalyseerde structuren van de ORL.
Geel, rood en groen geven respectievelijk de huid, de spier en het ligament aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1. Vergelijking tussen 3D-en 2D-afbeeldingen. (A). volume gerenderde 3D-afbeelding. (B). Cross sectionele 2D-afbeelding. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om de afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2. Onmiddellijke verpakking en bevestiging van de parafilm. A). de Parafilm over het hele monster wikkelen om uitdroging te voorkomen. (B). Parafilm helpt het monster stevig op de scanner te bevestigen. (C). Parafilm is niet zichtbaar op de microct-scanning en kan gemakkelijk worden afgetrokken. Klik hier om de afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 3. Onvoldoende kleuring van PTA. Een holle ruimte in het midden toont waar de PTA-oplossing niet voldoende is doorgedrongen. (A). volume gerenderde 3D-afbeelding. (B). Cross sectionele 2D-afbeelding. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om de afbeelding te downloaden.
Aanvullend figuur 4. Vergelijking tussen verse en gebalsemd cadavers. Er werden geen verschillen gevonden tussen verse en gebalde kadavers om het protocol toe te passen. De afbeelding toont een andere functie kan worden genomen door dezelfde methode ook. A ). de ORL verkregen uit een vers kadaver. (B). de nasolabiale plooi die is verkregen uit een embalgemed cadaver. Klik hier om de afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We implementeerden microCT met PTA voorbereiding bij het onderzoek van menselijke zachte weefsels. Kort samengevat worden specimens gedurende enkele dagen geoogst en in formaline gefixeerd, gevolgd door uitdroging in seriële ethanol oplossingen. Plaatsen van het monster in de PTA oplossing direct na formaline fixatie kan resulteren in sommige weefsel barsten als gevolg van snelle uitdroging. Daarom is seriële uitdroging nodig voordat de PTA wordt gekleurd. Vervolgens worden de monsters gekleurd met behulp van de PTA-oplossing voor ongeveer een week. MicroCT Scanning, 3D reconstructie en analyse kunnen dan worden uitgevoerd. Ons doel was om de ORL en aangrenzende structuren te observeren met behulp van deze methode. We hebben het weefsel met succes gepresenteerd als een 3D-model. De huid, ligamenten en spieren werden duidelijk gevisualiseerd (Figuur 5).
Bij de verwerking van de monsters moeten verschillende punten worden overwogen. De grootte van een specimen en de duur van de kleuring zijn hoofdpunten van zorg. Na verschillende pilotstudies, vonden we dat de juiste dikte van een specimen is ongeveer 5 – 7 mm en de juiste duur van de kleuring is 5 – 7 dagen. In deze omstandigheden, de PTA oplossing dringt het preparaat met een snelheid van ongeveer 1 mm/dag. Als de dikte groter is dan 7 mm, neemt de verwerkingstijd toe. Wanneer de duur van de kleuring onvoldoende is in vergelijking met het volume van een preparaat, kan het uiteindelijke beeld een leeg gat in het centrale gebied van het preparaat bevatten. Dit komt vaak voor, vooral op huidniveau, en het verwijderen van onnodige huid kan de kleurings efficiëntie verbeteren. Wanneer de duur te lang is, zal het hele preparaat worden overlekt, waardoor het moeilijk is om elk compartiment te identificeren. Verder onderzoek naar de optimale duur voor het vlekken van grotere specimens kan nuttig blijken.
Meestal is het specimen verdeeld in stukken om de penetratie te verbeteren; het is belangrijk om de locatie en richting van elk specimen tijdens dit proces te onthouden. Om deze informatie te behouden, wordt het naaien op hetzelfde gebied van elk onderdeel aanbevolen. De draad zal worden gezien in de uiteindelijke afbeelding, en men moet oppassen dat de draad niet interfereert met het hoofdgebied. Bijvoorbeeld, naaien op de superolaterale regio van elk stuk kan nuttig zijn. Daarnaast zijn voorbereidende analyses van een anatomische structuur nodig om elk weefsel onderdeel te herkennen aan hun complexiteit.
Parafilm en andere materialen worden gebruikt om te voorkomen dat specimens uitdrogen. Er kunnen echter lichte misvormingen optreden bij het verpakken van specimens. Het is belangrijk om de originele vorm zoveel mogelijk te behouden. Soms wordt een vloeibare buis gebruikt, in plaats van parafilm. Zelfs de geringste beven van een machine heeft echter het potentieel om de buis tijdens het scannen te beïnvloeden en kan de helderheid van het uiteindelijke beeld verminderen.
Deze aanpak kent een aantal beperkingen. Ten eerste kan dit protocol niet worden uitgevoerd met een levend voorwerp. Bovendien wordt de steekproefgrootte beperkt door de maximale scan grootte van de microCT-scanner. Er kunnen fouten optreden tijdens het analyseren van het gerenderde beeld door het blote oog; Daarom kunnen aanvullende histologische experimenten nodig zijn om de bevindingen te bevestigen. Er kan een geringe dimensionele vervorming optreden tijdens de bereiding; Wij zijn echter van mening dat dit geen significant effect heeft op het resultaat van de studie.
MicroCT scanning met PTA preparaat is voordelig voor het onderzoeken van specifieke compartimenten binnen een complexe structuur. Deze studie richtte zich op de ontwikkeling van een methode om de contrast ratio met behulp van de voorbereiding van de PTA te verbeteren, en andere functies, zoals scanning en wederopbouw processen, werden kort aangegeven. Lezers moeten echter hetzelfde resultaat kunnen krijgen als ze na het kleuringsproces eigentijdse microCT-scanners en beeldanalyserende Programma's gebruiken. Deze methode kan nuttig blijken in de analyses van kanker weefsels en-structuren, de zenuw bijdrage in specifieke gebieden en hoge-resolutie anatomische structuren van organen, zoals het hart en de lever13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een faculteits onderzoeksbeurs van Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). De auteurs bedanken de mensen die hun lichaam zeer royaal hebben geschonken aan Yonsei University College of Medicine. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Jun Ho Kim en jong Ho bang (medewerkers van het opleidingscentrum voor chirurgische anatomie van het Yonsei University College of Medicine). We zijn ook Genoss co., Ltd. dankbaar voor het hoogwaardige microCT-scansysteem dat in dit onderzoek wordt gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
