Summary
マイクロX線コンピュータ断層撮影は、損傷を受けていないヒト標本から3次元情報を得る上で有効であるが、軟部組織の観察に限られた成功を収めている。ホスホトン酸造影剤の使用は、この問題を解決することができます。この造影剤を実装し、ヒトの繊細な線維筋組織(靭帯を保持する内巣)を調べた。
Abstract
手動解剖および組織学的観察は人間の組織を調査するために使用される一般的な方法である。しかし、手動解剖は繊細な構造を損傷する可能性があり、処理および組織学的観察は断面イメージングを通じて限られた情報を提供する。マイクロX線コンピュータ断層撮影(microCT)は、標本を傷つけずに3次元情報を得るための効果的なツールです。しかしながら、軟部組織部の分化においては限られた効率を示す。リントンスチン酸(PTA)のようなコントラスト増強剤の使用は、軟部組織コントラストを改善することによってこの問題を解決することができます。我々は、軌道領域の繊細な構造であるヒトオービキュラ保持靭帯(ORL)を調べるためにPTAとマイクロCTを実施した。この方法では、収穫された試料をホルマリンで固定し、シリアルエタノール溶液で脱水し、PTA溶液で染色する。染色後、マイクロCT走査、3D再構成、解析を行います。皮膚、靭帯、筋肉は、この方法を使用して明確に視覚化することができます。試料の大きさと染色期間は、この方法の重要な特徴です。適切な標本の厚さは約5~7mmで、その上にプロセスが遅くなり、最適な持続時間は5~7日であり、その下に中央部に空の穴が時折発生した。切断中に小片の位置と方向を維持するために、各部品の同じ領域で縫製することをお勧めします。さらに、各部分を正しく識別するためには、解剖構造の予備的な分析が必要です。パラフィルムは乾燥を防ぐために使用することができますが、試料の歪みを防ぐために注意する必要があります。我々の多方向観測は、ORLが以前に報告したように、糸状の繊維ではなく、連続プレートの多層メッシュワークで構成であることを示した。これらの結果は、PTAによるマイクロCTスキャンが、ヒト組織の複雑な構造内の特定の区画を調べるのに有用であることを示唆している。がん組織、神経組織、心臓や肝臓などの様々な臓器の分析に役立つ場合があります。
Introduction
手動解剖および組織学的観察は、通常、筋肉や結合組織などのヒト組織を調べるために使用される。しかし、手動解剖は繊細な構造を容易に損傷する可能性があり、組織学的観察は平らな断面面1、2に関する限られた情報を提供する。したがって、組織をより正確かつ効率的に検査するために改善された方法が必要である。
従来のコンピュータ断層撮影(CT)は、一般的に臨床現場で使用されるが、それは小さな構造2、3を区別する能力を欠いている。マイクロX線CT(マイクロCT)は、小さな構造物の3次元(3D)情報を破壊することなく、標本から得るための効果的なツールです。しかし、microCTは、高密度の組織だけが明確に視覚化することができるので、限られたアプリケーションを持っています。軟部組織の区別には使用できません。この制限を克服するために、染色剤を使用することができる。コントラスト増強剤は、ホスホトンスチン酸(PTA)、ホスホモリブジン酸、およびルゴルのヨウ素のような、走査時の軟部組織コントラスト率を向上させる4,5である。これらのエージェントを比較するいくつかの研究は、PTAが良好なパフォーマンスを示し、6、7、8を扱いやすいことを示唆しています。
オービキュラリスタリテイリング靭帯(ORL)は、軌道の周りの繊細な構造であり、従来の観察9の間に容易に損傷を受けることができる。この構造に関する3D情報を、PTAを造影剤として用いて調べ、正常に取得した。この方法は、心臓や肝臓などの他のヒト組織に関する研究に適用することができ、適切な修飾10、11、12を用いて適用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究で利用されたすべての死体は、延世大学医学部の外科解剖学教育センターに合法的に寄付されました。
1. サンプルの取得
- サンプル収穫のための切断領域を示すために、色鉛筆で死体に切開線を描きます。描かれた切開線が中間のカンサスに中間的に伸び、横に横に、下まぶたの優れた境界線に優れ、軌道縁から線の下1cmに劣っていることを確認する。
注:マイクロCT機器の最大スキャンサイズに基づいてサンプルサイズを検討してください(当社の機器は、7×7センチメートルの最大オブジェクト寸法の画像を取得することができます)。ここでは、ORL領域から幅約1cm、長さ3cm、重さ1.25gの試料を採取した。 - 切開ラインに従って顔のティッシュを刃で切る。刃先が骨に触れるように、切り傷が深いことを確認します。サンプルには、皮膚、皮下組織、筋肉、脂肪、および骨膜が含まれている必要があります。
- サンプルを直ちに10%ホルマリンで固定し、室温で5~7日間保存します(図1A)。
注:エンバードとフレッシュな死体の両方がこの研究に使用できます。ただし、死体の固定ソリューションは、生物学的実験で使用されるソリューションとは若干異なる場合があります。したがって、エンバード死体からサンプルを得た後でも、再び10%ホルマリンでサンプルを固定することをお勧めします。
2. 染色の準備
- 固定した後、サンプルを3個(厚さ5~7mm)にスライスします。このプロセス中に各ピースの位置と方向を失わなさ。
注:私たちが使用するmicroCTスキャナは、7 cm³の最大サイズをカバーすることができますが、PTAソリューションは、それが厚すぎる場合、サンプルに正常に浸透することはできません。 - サンプルの方向を後で確認できるように、針と黒い糸を使用して各部分の上側を縫います。
- 1日30%、50%、70%のエタノール溶液でサンプルを脱水します。
- 染色するまで70%エタノールにサンプルを入れる。
3. PTAの準備
- マイクロCTスキャンがスケジュールされる1週間前にPTA染色プロセスを開始します。
- 70%エタノール溶液の210 mLを準備し、それにPTA電力の2.1グラムを追加します。55-60 rpmでシェーカーを使用してよく混ぜます。
注:PTA溶液の濃度は、エタノール中の1%でなければなりません。 - スライスした各部分に3つの70 mLプラスチック容器を準備します。PTA ソリューションを使用してコンテナーを埋めます。容器に標本を浸し、効果的な浸透のためにシェーカーに置きます。サンプルは5~7日間放置します(図1B)。
- 染色が完了したら、70%エタノールでサンプルを保存し、スキャンの準備をします。
注:染色されたサンプルは数ヶ月間維持することができますが、完全な染色を確実にするために、できるだけ早くサンプルをスキャンすることをお勧めします。
4. マイクロCTスキャン
- 乾燥を防ぐためにパラフィルムでサンプルを包みます。変形を引き起こす可能性があるため、サンプルをきつく包みすぎないようにしてください。
- スキャナを開き、サンプルをトレイに置きます(図2)。
- ソース電圧(kV)=70、ソース電流(μA)=114、Alフィルタ=0.5mm、画像ピクセルサイズ(μm²)=20、ピクセル=2240×2240、露出(ms)=500、回転ステップ(deg)=0.3)
注: パラメータは、使用するサンプルやスキャナに従って変更できます。 - スキャンを開始します。
注:スキャンは、意図した解像度とスキャナの速度に応じて30~60分かかります。
5. データの再構築と最適化
- 再構築ソフトウェアを実行します。スキャンしたファイルを起動するには、[アクション]メニューで [データセットを開く]を選択します。
- [再構築]ウィンドウの[設定]タブを選択します。次のようにパラメータを設定します: リングアーティファクト削減 = 7、ビーム硬化補正(%) = 40。
注: パラメータはサンプルに従って変更できます。 - [スタート]タブで [開始]タブを選択して、再構築を開始します。最終的なデータは、指定されたフォルダに格納されます。
- ファイルサイズ変更ソフトウェアを実行します。再構築されたファイルを起動するには、[ソース データ セット]を選択します。
- [宛先データ セット]タブでjpgを選択します。
- [サイズ変更]オプション1/2を選択し、[品質]オプションを[補間なし(高速)]オプション)を選択します。
- スライド バーを[画像圧縮]タブで100 (最高)に調整します。
注: サイズ変更オプションは、3D レンダリング時にコンピュータの速度が低下しないようにすることです。ただし、広範囲にサイズ変更すると解像度が低下する可能性があります。処理が改善された許容可能な解像度を実現するために、半分にサイズ変更することをお勧めします。
6. 3D再構成
- 3D ボリューム レンダリング ソフトウェアを実行します。
- データセットを起動するには、[アクション>ボリューム データを読み込む]を選択します。
- [転送機能エディタ]タブのヒストグラムの形状転送機能を変更して、明るさとコントラストレベルを調整します。
- [オプション>照明]を選択します。
- [シャドウ]アイコンと[サーフェス ライティング]アイコンを選択します。これらの効果は、現実的なモデリングトーンを提供します。
- モデルを移動 (クリックアンドドラッグ)、回転 (右クリックとドラッグ)、およびモデルを拡大または縮小して最適なビューを見つけます。
- 平面をスライド(shift キーを押しながら内側の方向にドラッグ) をクリックすると、断面イメージが表示されます (図 3)。
- ライトアイコンをオンにします。照明表示バーを調整し、表示に最適な照明を見つけます。次に、アイコンをオフにして[照明]タブを閉じます。
- [オプション]を選択し、[クリッピング ボックスを表示]を選択して、最終的なイメージのボックスを非表示にします。
- [アクション>画像を保存する] を選択してイメージを保存します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ORLの詳細な再構成は、PTA調製によるマイクロCTによって達成された(図4)。真皮と骨膜の間に斜めに延びる靭帯線維筋構造が明らかに観察された(図4A)。コロナビュー(図4B)では、繊維の量と複雑さが横に増加した。水平図(図4C)では、樹木化された形成を伴う精巧なメッシュワークが観察された。先に報告したように、糸状の繊維ではなく、連続プレートを特徴とする形状を観察した。矢状図(図4D)では、ORL繊維の厚さが劣って減少した。全体として、この多方向観測は、ORLが位置に応じて数と厚さの変化を持つ連続プレートの多層メッシュワークで構成されていることを証明しました。
図 1.試料を採取し、PTA溶液で染色した。
(A). 試料を収穫後10%ホルマリンで固定した。(B). 試料を薄く切り分け、浸透性を高め、次いでPTA溶液に入れた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.マイクロCTスキャナ。
矢印は、標本が配置されているトレイを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.3D再構成。
平面を内側の方向にスライドさせて、内側の断面画像を表示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.ORLの3D画像。
(A)ORLの全体像。(B). コロナビュー。(C)水平方向のビュー。(D). 矢状図。S, 優れた;A, 前;L, 横;P、後部。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.ORLの構造を分析した。
黄色、赤、緑は、それぞれ皮膚、筋肉、靭帯を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 1.3D と 2D イメージの比較。(A)ボリュームレンダリングされた 3D イメージ。(B). 断面2D画像。スケールバー = 1 mm.図をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図 2.パラフィルムのラッピングと固定。(A). パラフィルムをサンプル全体に包み、乾燥を防ぎます。(B). パラフィルムは、サンプルをスキャナにしっかりと固定するのに役立ちます。(C). パラフィルムはmicroCTスキャンでは見えなくなり、簡単に減算できます。図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図 3.PTAの染色が不十分です。中央の中空空間は、PTA溶液が十分に浸透していない場所を示しています。(A)ボリュームレンダリングされた 3D イメージ。(B). 断面2D画像。スケールバー = 1 mm.図をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図 4.新鮮な死体とエンバードの死体の比較。プロトコルを適用するために、新鮮な死体とエンバードの死体の間に違いは見つかりませんでした。写真は、同じ方法で撮影できる別の機能を示しています。(A). 新鮮な死体から得られたORL。(B). エンバード死体から得られたナソラビアの折り目。図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒト軟部組織の検査においてPTA調製によるマイクロCTを実施した。簡単に言えば、標本は数日間ホルマリンで収穫され、固定され、続いてシリアルエタノール溶液中で脱水する。ホルマリン固定の直後にサンプルをPTA溶液に入れることで、急速な脱水による組織割れが生じる可能性があります。そのため、PTA染色の前に連続脱水が必要です。次に、試料を約1週間PTA溶液を用いて染色する。マイクロCTスキャン、3D再構成、解析を行うことができます。私たちの目標は、この方法を使用してORLと隣接する構造を観察することでした。我々は3Dモデルとして組織をうまく提示した。皮膚、靭帯、筋肉をはっきりと可視化した(図5)。
サンプルの処理中に、いくつかの点を考慮する必要があります。標本の大きさと染色の持続時間が主な懸念事項です。いくつかのパイロット研究の後、我々は、標本の適切な厚さが約5-7ミリメートルであり、染色の適切な持続時間が5-7日であることがわかりました。このような条件では、PTA溶液は約1mm/日の速度で試料を貫通する。厚さが7mmを超えると処理時間が大きくなります。染色の持続時間が検体の体積に比べて不十分な場合、最終画像は、試料の中央領域に空の穴を含みてもよい。これは、特に皮膚レベルでしばしば発生し、不要な皮膚を除去すると、染色効率を向上させることができます。持続時間が長すぎると、試料全体がオーバーステインし、各コンパートメントを識別することが困難になります。より大きな標本を染色するための最適な持続時間に関するさらなる研究は有用であることが証明できる。
通常、標本は浸透を高めるために部分に分けられます。このプロセス中に各試料の位置と方向を覚えておくことは重要です。この情報を維持するには、各部品の同じ領域で縫製することをお勧めします。スレッドは最終的なイメージに見られ、スレッドがメイン領域に干渉しないように注意する必要があります。たとえば、各部分の上方の領域で縫製すると便利です。さらに、解剖学的構造の予備的な分析は、その複雑さのために各組織部分を認識するために必要とされる。
パラフィルムやその他の材料は、試料が乾燥するのを防ぐために使用されます。ただし、試料を包む場合はわずかな変形が発生する可能性があります。元の形状を可能な限り保持することが重要です。パラフィルムの代わりに液体チューブが使用されることがあります。しかし、機械のわずかな震えであっても、スキャン中にチューブに影響を与える可能性があり、最終的な画像の明瞭さを低下させる可能性があります。
この方法にはいくつかの制限があります。まず、このプロトコルは生きているオブジェクトでは実行できません。さらに、サンプルサイズは、microCTスキャナの最大スキャンサイズによって制限されます。肉眼でレンダリングされたイメージを分析する際にエラーが発生する可能性があります。したがって、結果を確認するために追加の組織学的実験が必要な場合があります。準備中にわずかな寸法歪みがある場合があります。しかし、これは研究の結果に大きな影響を与えないと考えています。
PTA調製によるMicroCTスキャンは、複雑な構造内の特定のコンパートメントを調べる場合に有利です。本研究では、PTA調製を用いてコントラスト率を高める方法の開発に焦点を当て、スキャンや再構成プロセスなどのその他の特徴を簡単に示した。ただし、染色プロセスの後に、現代の microCT スキャナと画像解析プログラムを使用する場合、読者は同じ結果を得ることができるはずです。この方法は、癌組織および構造の分析、特定の領域における神経寄与、および心臓および肝臓13、14、15などの臓器の高解像度解剖学的構造の分析に役立つ可能性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は延世大学医学部の教員研究助成金(6-2018-0099)の支援を受けた。著者らは、延世大学医学部に自分の体を非常に寛大に寄付した人々に感謝します。私たちは、彼らの技術サポート(延世大学医学部外科解剖学教育センターのスタッフ)に対して、キム・ジュンホとチョン・ホー・バンに感謝しています。また、本研究で使用される高品質のマイクロCTスキャンシステムに対しても、株式会社ジェノスに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
