Summary
Микрорентгенй компьютерной томографии эффективен в получении трехмерной информации от неповрежденных образцов человека, но имеет ограниченный успех в наблюдении мягких тканей. Использование фосхотунгстовой кислоты контрастный агент может решить эту проблему. Мы внедрили этот контрастный агент для изучения тонких фибромышечных тканей человека (орбикулярная сохранительная связка).
Abstract
Ручное вскрытие и гистологическое наблюдение являются распространенными методами, используемыми для исследования тканей человека. Однако ручное вскрытие может повредить хрупкие структуры, в то время как обработка и гистологическое наблюдение предоставляют ограниченную информацию посредством поперечного сечения. Микрорентгенй компьютерной томографии (microCT) является эффективным инструментом для получения трехмерной информации без повреждения образцов. Тем не менее, он показывает ограниченную эффективность в дифференциировании мягких частей ткани. Использование контрастно-улучшающих агентов, таких как фосхотунгстовая кислота (ПТА), может решить эту проблему путем улучшения контраста мягких тканей. Мы внедрили микроКТ с PTA для исследования человеческой orbicularis сохраняя связки (ORL), которая является деликатной структурой в области орбиты. В этом методе собранные образцы фиксируются в формалине, обезвоживаются в серийных растворах этанола и окрашиваются раствором PTA. После окрашивания проводится микрокт-сканирование, 3D-реконструкция и анализ. Кожа, связки и мышцы могут быть четко визуализированы с помощью этого метода. Размер образца и продолжительность окрашивания являются существенными особенностями метода. Толщина подходящего образца составляла около 5-7 мм, выше которых процесс замедлился, а оптимальная продолжительность составляла 5-7 дней, ниже которых время от времени происходило пустое отверстие в центральной части. Для поддержания расположения и направления мелких кусочков во время резки рекомендуется шитье на одной и той же области каждой части. Кроме того, для правильной идентификации каждой части необходим предварительный анализ анатомической структуры. Parafilm может быть использован для предотвращения сушки, но следует позаботиться о предотвращении искажения образца. Наше многонаправленное наблюдение показало, что ORL состоит из многослойной сетки непрерывных пластин, а не нитевидных волокон, как сообщалось ранее. Эти результаты свидетельствуют о том, что микрокТ-сканирование с помощью ПТА полезно для изучения конкретных отсеков в сложных структурах тканей человека. Это может быть полезно в анализе раковых тканей, нервных тканей и различных органов, как сердце и печень.
Introduction
Ручное вскрытие и гистологическое наблюдение обычно используются для изучения тканей человека, таких как мышцы и соединительные ткани. Тем не менее, ручное вскрытие может легко повредить деликатные структуры, и гистологическое наблюдение предоставляет ограниченную информацию о плоских поперечных поверхностях1,2. Поэтому необходимы усовершенствованные методы для более точного и эффективного изучения тканей.
Обычная компьютерная томография (КТ) обычно используется в клинической практике, но ей не хватает способности различать небольшие структуры2,3. Микрорентгеновская КТ (микроКТ) является эффективным инструментом для получения трехмерной (3D) информации о мелких структурах из образцов, не разрушая их. Тем не менее, microCT имеет ограниченное применение, потому что только плотные ткани могут быть визуализированы четко; он не может быть использован для дифференциации мягких тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивающие агенты могут быть использованы. Контрастно-улучшающие агенты, такие как фосхотунгстовая кислота (ПТА), фосфомоллипидная кислота и йод Лугола, улучшают скорость контрастности мягких тканей при сканировании4,5. Несколько исследований, сравнивая эти агенты показывают, что PTA демонстрирует хорошую производительность и легко обрабатывать6,7,8.
Orbicularis сохраняя связки (ORL) является деликатной структурой вокруг орбиты, которые могут быть легко повреждены во время обычного наблюдения9. Мы изучили и успешно извлекли 3D-информацию об этой структуре с помощью микроКТ с PTA в качестве контрастного агента. Этот метод может быть применен к исследованиям на других человеческих тканях, таких как сердце и печень, с соответствующими изменениями10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все трупы, использованные в этом исследовании, были юридически пожертвованы В Центре образования хирургической анатомии в Медицинском колледже Университета Yonsei.
1. Получение образцов
- Нарисуйте линию разреза на трупе цветным карандашом, чтобы указать область резки для сбора проб. Убедитесь, что линия разреза обращается медиально до медиальной кантоны, боковой к боковой canthus, в высшей степени к верхней границе нижнего века, и неполноценно 1 см ниже линии от орбитального обода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим размер выборки на основе максимального размера сканирования микро-КТ оборудования (наше оборудование может приобрести изображение с максимальным размером объекта 7 и 7 см). Здесь образец шириной около 1 см, длиной 3 см и весом 1,25 г был собран из региона ORL. - Вырезать ткани лица после разреза линии с лезвием. Убедитесь, что разрез глубокий, так что кончик лезвия касается кости. Образец должен включать кожу, подкожную ткань, мышцы, жир и периостеум.
- Исправить образец в 10% формалин сразу и сохранить его в течение 5 до 7 дней при комнатной температуре(рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как забальзамированы и свежие трупы могут быть использованы для этого исследования. Тем не менее, решение фиксации для трупов может немного отличаться от раствора, используемого в биологическом эксперименте. Поэтому мы предлагаем исправить образец с 10% формалин снова даже после получения образца из забальзамированного трупов.
2. Подготовка к окрашиванию
- После фиксации нарежьте образец на 3 части (толщиной 5-7 мм). Не теряйте расположение и направление каждой части во время этого процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ: МикрокТ сканер мы используем может охватывать максимальный размер 7 см3, но решение PTA не может проникнуть в образец успешно, если он слишком толстый. - Sew суперосторонней стороне каждой части с помощью иглы и черной нити, так что направление образца могут быть проверены позже.
- Обезвождение образца в серии 30%, 50%, и 70% этанола решений в течение 1 дня каждый.
- Поместите образец в 70% этанола до окрашивания.
3. Подготовка ПТА
- Начните процесс окрашивания PTA за 1 неделю до запланированного сканирования микроКТ.
- Приготовьте 210 мл 70% раствора этанола и добавьте к нему 2,1 г мощности ПТА. Хорошо перемешать с помощью шейкера при 55-60 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация раствора ЗПТ должна быть 1% в этаноле. - Подготовьте три пластиковых контейнера 70 мл для каждого нарезанного кусочка. Заполните контейнеры раствором PTA. Замочите образцы в контейнерах и поместите их на шейкер для эффективного проникновения. Оставьте образцы на 5-7 дней(рисунок 1B).
- Когда окрашивание будет завершено, храните образец в 70% этанола для подготовки к сканированию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы могут поддерживаться в течение нескольких месяцев, но рекомендуется, чтобы образцы были отсканированы как можно скорее, чтобы обеспечить полное окрашивание.
4. Сканирование микроКТ
- Оберните образец с parafilm для предотвращения сушки. Не оберните образцы слишком плотно, так как это может привести к деформации.
- Откройте сканер и поместите образец на лоток(рисунок 2).
- Установите параметры сканирования следующим образом: исходное напряжение (кВ) - 70, исходный ток (КА) - 114, фильтр Al - 0,5 мм, размер пикселей изображения (мкм2) - 20, пиксели - 2240 - 2240, экспозиция (мс) - 500, шаг вращения (дег) - 0,3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут быть изменены в соответствии с используемыми образцами и/или сканерами. - Начните сканирование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование занимает от 30 до 60 минут в зависимости от предполагаемого разрешения и скорости сканера.
5. Реконструкция и оптимизация данных
- Запустите программное обеспечение для реконструкции. Выберите открытый набор данных в меню «Действия» для запуска отсканированных файлов.
- Выберите вкладку «Настройки» на окне реконструкции. Установите параметры следующим образом: Уменьшение артефактов кольца No 7, коррекция затвердевания луча (%)
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут быть изменены в соответствии с образцом. - Начните реконструкцию, выбрав вкладку «Старт». Окончательные данные будут храниться в указанной папке.
- Выполнить программное обеспечение для оптимизации размера файлов. Выберите набор исходных данных для запуска реконструированных файлов.
- Выберите jpg на вкладке набора данных destination.
- Выберите вариант «Изменение размера» 1/2 с опцией «Качество» «Нет интерполяции» (быстро).
- Отрегулируйте панель слайда до 100 (самая высокая) во вкладке сжатия изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение размера вариант, чтобы избежать замедления скорости компьютера при 3D-рендере; однако, это может привести к более низкому разрешению при капитальном наклоне. Мы предлагаем изогнать размер пополам для приемлемого разрешения с лучшей обработкой.
6. 3D реконструкция
- Запустите программное обеспечение для рендеринга 3D-тома.
- Выберите Действия (gt; данные об объеме нагрузки) для запуска набора данных.
- Отрегулируйте уровень яркости и контрастности, изменив функцию передачи формы в гистограмме во вкладке редактора функции передачи.
- Выберите варианты (gt; Освещение.
- Выберите значки «Тени» и «Поверхностное освещение». Эти эффекты обеспечивают реалистичный тон моделирования.
- Найти лучший вид, перемещая(нажмите и перетащите),вращаясь(правый клик и перетащите),и масштабирование в или из (прокрутка) модели.
- Слайд плоскости(сдвиг и нажмите и перетащите во внутреннем направлении), чтобы показать секционные изображения(рисунок 3).
- Включите значок Света. Отрегулируйте панель индикатора освещения и найдите самое лучшее освещение для просмотра. Затем выключите значок и закройте вкладку Lighting.
- Выберите варианты ,gt; Показать , чтобы показать, чтобы скрыть коробку для окончательного изображения.
- Выберите Действия (ru) : Сохранить изображение для хранения изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Детальная реконструкция ORL была достигнута с помощью микроКТ с помощью препарата ПТА(рисунок 4). Четко наблюдалась фибромышечная структура связок, косо между дермы и периостеем(рисунок 4A). В корональном представлении(рисунок 4B),количество и сложность волокон увеличились боково. В горизонтальном представлении(рисунок 4C),была замечена сложная сетка с сварливой формой. Мы наблюдали форму, характеризующуюся непрерывными пластинами, а не нитями, как сообщалось ранее. В сагитальном представлении(рисунок 4D),толщина волокон ORL уменьшилась неполноценно. В целом, это многонаправленное наблюдение доказало, что ORL состоит из многослойной сетки непрерывных пластин с изменением количества и толщины в зависимости от местоположения.
Рисунок 1. Образцы были собраны, а затем окрашены с помощью решения PTA.
(A). Образцы были зафиксированы в 10% формалина после сбора урожая. (B). Образцы были разрезаны на более тонкие части для повышения проникновения, а затем помещены в решение PTA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Сканер микрокТ.
Стрелка указывает на лоток, где находится образец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. 3D-реконструкция.
Сдвиньте плоскость во внутреннее направление, чтобы просмотреть секционные изображения внутри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. 3D-изображения ORL.
(A). Общий образ ORL. (B). Корональная зрения. (C). Горизонтальный вид. (D). Сагиттальный вид. S, начальник; A, передняя; L, боковой; P, задний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Анализирует структуры ORL.
желтый, красный и зеленый указывают на кожу, мышцы и связки, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1. Сравнение 3D и 2D-изображений. (A). Объем отображаемого 3D-изображения. (B). Крестсекционный 2D изображение. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить фигуру.
Дополнительная рисунок 2. Упаковка и фиксация парафильма. (A). Обертывание парафильма по всему образцу, чтобы предотвратить высыхание. (B). Parafilm помогает закрепить образец твердо на сканере. (C). Parafilm не виден на микрокт-сканировании и может быть вычтена легко. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить фигуру.
Дополнительная рисунок 3. Недостаточное окрашивание ЗПТ. Полый пространство в центре показывает, где решение PTA не проникли достаточно. (A). Объем отображаемого 3D-изображения. (B). Крестсекционный 2D изображение. Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить фигуру.
Дополнительная рисунок 4. Сравнение свежих и забальзамемых трупов. Не было обнаружено различий между свежими и забальзамированы трупы для применения протокола. На рисунке показана другая функция, которая может быть сделана тем же методом. (A)ORL получен из свежего трупа. (B). Носогубная складка, полученная из забальзамированного трупа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить фигуру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы внедрили микроКТ с препаратом ПТА при изучении мягких тканей человека. Вкратце, образцы собирают и фиксируют в формалине в течение нескольких дней, а затем обезвоживание в серийных растворах этанола. Размещение образца в раствор PTA непосредственно после фиксации формалина может привести к некоторому растрескиванию тканей из-за быстрого обезвоживания. Таким образом, серийное обезвоживание необходимо до ОКрапования ПТА. Далее, образцы окрашены с помощью решения PTA в течение недели. Затем можно проводить микрокт-сканирование, 3D-реконструкцию и анализ. Нашей целью было наблюдать за ORL и прилегающими структурами с помощью этого метода. Мы успешно представили ткани в качестве 3D-модели. Кожа, связки и мышцы были отчетливо визуализированы(рисунок 5).
При обработке образцов следует учитывать несколько пунктов. Размер образца и продолжительность окрашивания являются основными проблемами. После нескольких экспериментальных исследований, мы обнаружили, что надлежащая толщина образца составляет около 5-7 мм, а надлежащая продолжительность окрашивания составляет 5-7 дней. В этих условиях раствор PTA проникает в образец со скоростью около 1 мм/сутки. Если толщина превышает 7 мм, время обработки увеличивается. Когда продолжительность окрашивания недостаточна по сравнению с объемом образца, окончательное изображение может включать пустое отверстие в центральной области образца. Это часто происходит, особенно на уровне кожи, и удаление ненужной кожи может улучшить эффективность окрашивания. Когда продолжительность слишком длинная, весь образец будет перекраен, что затрудняет идентификацию каждого отсека. Дальнейшее изучение оптимальной продолжительности окрашивания более крупных образцов может оказаться полезным.
Как правило, образец делится на части для повышения проникновения; важно помнить расположение и направление каждого образца во время этого процесса. Для поддержания этой информации рекомендуется шитье на одной и той же области каждой части. Поток будет виден на конечном изображении, и следует быть осторожным, чтобы поток не мешал основной области. Например, шитье на суперосторонней области каждой части может быть полезным. Кроме того, предварительный анализ анатомической структуры необходимы для распознавания каждой части ткани в силу их сложности.
Parafilm и другие материалы используются для предотвращения высыхания образцов. Тем не менее, небольшие деформации могут возникнуть при упаковке образцов. Важно максимально сохранить исходную форму. Иногда используется жидкая трубка, а не парафильм. Тем не менее, даже малейшее дрожь машины имеет потенциал, чтобы повлиять на трубку во время сканирования и может уменьшить четкость окончательного изображения.
Этот подход имеет ряд ограничений. Во-первых, этот протокол не может быть выполнен с живым объектом. Кроме того, размер выборки ограничен максимальным размером сканирования сканера microCT. При анализе отрисованные изображения невооруженным глазом могут быть ошибки; поэтому для подтверждения полученных результатов могут потребоваться дополнительные гистологические эксперименты. При подготовке могут быть небольшие мерные искажения; однако мы считаем, что это не оказывает существенного влияния на результаты исследования.
Сканирование микроКТ с помощью препарата ПТА выгодно для изучения конкретных отсеков в сложной структуре. В этом исследовании основное внимание уделялось разработке метода повышения контрастности с помощью подготовки к ЗПТ, и были кратко отмечены другие функции, такие как процессы сканирования и реконструкции. Тем не менее, читатели должны быть в состоянии получить тот же результат, если они используют современные сканеры microCT и программы анализа изображений после процесса окрашивания. Этот метод может оказаться полезным в анализе раковых тканей и структур, нервного вклада в конкретных областях, и с высоким разрешением анатомических структур органов, таких как сердце и печень13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано профессорско-преподавательским составом Медицинского колледжа Университета Yonsei (6-2018-0099). Авторы благодарят людей, которые очень щедро пожертвовали свои тела в Медицинский колледж Университета Yonsei. Мы благодарны Чжун Хо Киму и Чон Хо Бангу за их техническую поддержку (сотрудники Центра обучения хирургической анатомии в Медицинском колледже Университета Енсея). Мы также благодарны Genoss Co., Ltd. за высококачественную систему микрокт-сканирования, используемую в этом исследовании.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
