Summary
המטרה של מאמר זה היא לתאר את השלבים הדרושים עבור הדור של סיבים אלפא-synuclein, בקרת איכות הבאים, והשימוש של סיבים מראש בvivo.
Abstract
השימוש ב-vivo alpha-syנוקלאוניקיים מראש fibril ריל (α-syn PFF) מודל של syנוקלאונופתיה הוא צובר פופולריות בקרב החוקרים במטרה לדגמן מחלת פרקינסון הניוון והתנוונות. הסטנדרטיזציה של α-syn PFF הדור וביישום vivo הוא קריטי על מנת להבטיח עקבית, בעלי α-syn פתולוגיה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של סיבים מ-monomeric α-syn, לאחר fibriliטיזציה בקרת איכות שלבים, ופרמטרים הציע הזרקת נוירוכירורגית מוצלחת של α-לאחר pffs syn לחולדות או עכברים. החל ב-monomeric α-syn, fibrilization מתרחשת על תקופת דגירה של 7 ימים תוך כדי טלטול על תנאי מאגר אופטימלי, ריכוז, וטמפרטורה. לאחר fibrilization בקרת איכות מוערך על ידי הנוכחות של שולחן סיבים באמצעות שיקוע, היווצרות של מערך עמילואיד ב-סיבים עם מבנה T thioflavin, ו הדמיה אלקטרונים מיקרוסקופיים של סיבים. בעוד אימות מוצלח באמצעות בחני אלה הוא הכרחי להצלחה, הם לא מספיקים כדי להבטיח pffs יהיה זרע α-הכללות syn בנוירונים, כמו פעילות צבירה כגון של כל אצווה pffs צריך להיבדק בתרבות התאים או כנופיית בעלי חיים טייס. לפני השימוש, PFFs חייב להיות sonicated תחת תנאים סטנדרטיים בדיוק, ואחריו בדיקה באמצעות אלקטרון מיקרוסקופ או פיזור אור דינמי כדי לאשר אורכי בריל הם בטווח גודל אופטימלי, עם אורך ממוצע של 50 ננומטר. לאחר מכן ניתן להוסיף PFFs למדיית התרבות של התאים או לשימוש בבעלי חיים. מחלות הזיהוי על-ידי כתמים חיסוני זרחן-syn (psyn; סרין 129) הוא לכאורה ימים או שבועות מאוחר יותר בתרבות התא מודלים מכרסמים, בהתאמה.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) מאופיינת בעיקר לאחר המוות על ידי שני מאפיינים פתולוגיים עיקריים: אלפא-סינוקלינים נפוצים ומתקדמים (α-syn) פתולוגיה, והתנוונות שונות. בעקבות ההזרקה לתוך עכברים ומסוג ובחולדות, α-syn סיבים מראש (pffs) לגרום הצטברות מתקדמת של מהלך פתולוגי-syn, אשר יכול לגרום ניוון ממושך של compacta הכושי pars (snpc) דופמין נוירונים במהלך הרבה חודשים, כמו גם sensorimotor,1,2,3,4,5,6. נוירונים חשופים α-syn fibrils, או באמצעות הזרקה ישירה גרם או הוסיף התקשורת של נוירונים מתורבתים. כאשר ה-pffs נלקחים אל הנוירונים, מפעל ה-pffs כדי "זרע" היווצרות הכללות באמצעות בתבנית, והצטברות של אנדוגני α-syn לתוך הכללות זרחניים1,7,8, . בסדר, תשע הכללות לחלוק מאפיינים דומים לגופי הלוי: המכיל α-syn זרחני ב סרין 129 (pSyn), אוביקווילין, ו p62; בעל מבנים בעלי עמילואיד כמוצג עם הצביעת thioflavin חיובית; והינם עמידים בפני העיכול הפרוטאינאז1,3,5,7,8,9,10,11, . שתיים עשרה חשיפה pff מוביל α-syn הכללה היווצרות בראשי וכמה מונצח נוירונים בתרבות, כמו גם עכברים, חולדות, ופרימטים לא אנושיים ב vivo1,2,3,4, . חמש,שש,שבע,שמונה,תשע,13 חשוב לציין כי PFFs לא יוביל α-הכללה צין היווצרות במודלים כל תרבות התא ומספר נוירונים תרבותיים יהיה זרע טוב יותר מאחרים.
תכונה חשובה נוספת של מודל PFF vivo α-syn הוא השלבים הפתולוגיים ברורים שצצים במשך מספר חודשים. ב מכרסמים, בעקבות הזרקת הפנימי, α-הכללה syn היווצרות בדרך כלל פסגות בתוך SNpc ואזורים קורטיקליים רבים בתוך 1-2 חודשים. שיא זה לאחר מצבור של nigrostriאטאטאל ניוון ≈ 2-4 חודשים מאוחר יותר1,3,5. אלה שלבים פתולוגיים שונים לספק לחוקרים את הפלטפורמה שבה ללמוד ולפתח אסטרטגיות כי 1) ירידה α-מצבור syn, 2) ברור כבר הקימו-הכללות syn, ו/או 3) למנוע ניוון שלאחר מכן. מודל PFF מציע יתרונות וחסרונות ברורים לעומת הנוירוטוקסיונים, הטרנסגניים, ויראלי וקטורי מתווכת α-ביטוי מודלים syn כפי שנבדקו קודם לכן6. הבחירה של איזה מודל או גישה לקחת צריך להיקבע על ידי איזה מודל המתאים ביותר לשאלה שהחוקרים שואלים.
למרות המודל pff כבר מנוצל בהצלחה על ידי מעבדות רבות, יש עדיין קבוצות שחוו חוסר עקביות עם הפקת סיבים והפקה עקבית α-syn פתולוגיה14. דוגמאות של חוסר עקביות נע בין pffs כי לייצר מעט או ללא α-syn פתולוגיה, אצווה כדי זריעה האצווה, ואף הכישלון של סיבים לטופס. כך, את הסטנדרטיזציה של α-syn PFF הדור וביישום vivo הוא קריטי על מנת לאפשר פרשנויות מדויקות לגבי ההשפעה של התערבויות הספר הטיפולית. הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הנדרשים עבור דור PFFs מ-α-מונומרים syn, בקרת איכות מחוץ גופית של PFFs נוצר פעם, sonication ומדידה של PFFs לפני השימוש, והצעות כדי להקל בהזרקה vivo של PFFs לתוך חולדות או עכברים.
Protocol
כל השיטות הכרוכות בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת מישיגן והוועדה השימוש (IACUC).
1. היווצרות α-סינונים מראש בנוי ממונמרים (איור 1)
- הפשרה α-הסירוס ונומרים על הקרח, בעדינות השעיה מחדש על ידי מצליף הצינור, ו צנטריפוגה ב 15,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
הערה: יש לניסח במפורש מונומר של α-syn לפיבריזציה. רקומביננטי ונומרים ניתן לרכוש ממקורות מסחריים או שנוצר על ידי פרוטוקולים באתר4,9,14,15. אם נרכש ממקורות מסחריים, על המוצר לציין כי מונומר-התנועה הסינטטיים במיוחד לדור הפיברילס. ללא קשר אם ונומרים נרכשים או שנוצר באתר, שלבי בקרת איכות המפורטים להלן יש לבצע עם כל אצווה כדי להבטיח סיבים יצרו ויהיה זרע ביעילות לפני השימוש בניסויים. - העברת supernatant לצינור נקי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה ולהקליט את הסכום המועבר.
הערה: היזהרו כדי למנוע את הגלולה, אשר, אם קיים, יהיה קטן. - למדוד את ריכוז החלבון של הסופרנטנט המועבר על ידי שיטת החומציות הסטנדרטית של חומצה (BCA), או מדידת ספיגה ב 280 ננומטר עם ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.
הערה: השיטת BCA אינה מדויקת למדידה הספציפית של α-syn ויכולה להניב תוצאות בהערכת ריכוז החלבון. כתוצאה מכך, מדידת ספיגת ב280 nm היא השיטה המומלצת לקביעת ריכוז החלבון.- כדי למדוד עם הטיפול BCA, בצע את פרוטוקולי BCA סטנדרטיים ולבצע עם שלוש מדלל שונות של α-syn מונומר. הצעות לדילול הן 1:25, 1:50 ו-1:100.
- כדי למדוד עם השיטה A280, ריק את הקורא עם מלוחים באגירה הפוספט של Dulbecco בנפח 1x (dPBS) ללא סידן ומגנזיום, עם ריכוז מלח של כ 100 מ"מ, ו-pH טווח 7.0-7.3 (טבלת חומרים).
- להוסיף 2 μL של דגימת לקורא ולקרוא את ספיגת ב 280 nm.
- השתמש בחוק בירה-למברט. כדי לקבוע ריכוז של המונמרים
הערה: מקדם הכחדה ε עבור האדם α-syn הוא 5,960 m-1ס מ -1 ו עבור העכבר α-synהוא 7,450 M1ס מ -1. Pathlength נמדד ס"מ. משקל מולקולרי של α-syn (14 kDa) מוערך בהנחה 1 Da = 1 g/מול.
- לדלל את המונמרים עם 1x dPBS לריכוז הסופי של 5 מ"ג/mL. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את כמות 1x dPBS שנוספה כדי לדלל את המונמרים.
הערה: כל הריכוזים נמצאים ב-mg/mL, ואמצעי אחסון ב-μL. Monomer יש לבצע עם 1x dPBS. נפח כולל המשמש ליצירת סיבים צריך להיות בין 100 ו 500 μl כדי להשיג תוצאות fibriliטיזציה. - בקצרה מערבולת לערבב, ו צנטריפוגה לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. מונולינים עבור בקרת איכות השוואה עם סיבים כפי שמצוין בשלבים 1.8.1-1.8.4.
- השתמש במנעול צינור או שעווה/פלסטיקהסרט (טבלת חומרים) כדי לאבטח את מכסה צינורית המיקרוצנטריפוגה סגור.
- מניחים את הצינור בthermomixer מסלולית עם מכסה של 7 ימים ב 37 ° c, רועד ב 1,000 RPM (שולחן החומרים).
הערה: בסוף 7 הימים, התכולה של השפופרת אמורה להופיע. הthermomixer חייב להיות מכסה כדי למנוע היווצרות עיבוי על מכסים הצינור. - בעדינות קפיצי את הצינור כדי להשעות את הα-syn של fibrils. המאמר מיועד לשלבים הבאים של בקרת איכות כפי שמצוין בשלבים 1.8.1-1.8.4.
הערה: Fibrils עבור שלבי בקרת איכות ניתן לאחסן ב RT לילה.- המשך 6 μL עבור מועד הסדרת השקעי.
- מפרט 5 μL עבור שיטת הכריכה של האיגוד.
- משדר 2 μL עבור מיקרוסקופ אלקטרוני השידור עבור הדמיה של פיבריריל.
- מחלקים לפחות 10 μL לצורך שיטת האנדוטוקסין.
הערה: לצורך שיטת האנדוטוקסין, משמש Limulus Amebocyte ליפוסט (לל) מסחרי, בעקבות הוראות היצרן (טבלת חומרים). רמות אנדוטוקסין צריך להיות ≤ 0.5 יחידות אנדוטוקסין/mL עבור fibrils. ניתן להשתמש בערכת להסרת אנטוקסין אם קריטריון זה אינו מתקיים.
- . מחלקים את החלקים הנותרים וחנות לאחסון ארוך טווח (12-18 חודשים), להקפיא במהירות על קרח יבש, ולאחסן ב-80 ° c.
הערה: הסכום עד סדרת מחלקים תלוי ביישום הרצוי במורד הזרם. ב vivo השימוש בדרך כלל דורש סיבים יותר בריכוזים גבוהים יותר מאשר בשימוש חוץ גופית, ואמצעי אחסון סדרת מחלקים צריך להיות מתוכנן בהתאם. Fibrils צריך להיות מאוחסן לעבר החלק האחורי של המקפיא כדי למנוע נזק הקפאה/הפשרה פוטנציאליים. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
2. משקעי שקעים
- בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, להוסיף 6 μl של pff כדי 54 μl של dpbs לדלל סיבים 1:10, ו pipet לערבב.
- בצינור נפרד, להוסיף 6 μl של מונומר ל 54 μl של dpbs כפקד נוסף.
- דגימות צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 דקות at RT ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
- הוסף 60 μL של dPBS לגלולה הנותרים ומערבולת כדי להשעות מחדש.
- הוסף 30 μL של מאגר לדוגמה 3x (140 μL של 50% גליצרול/0.1% ברומרופנול כחול, 40 μL של 10% SDS, ו 20 μL של β-mercaptoethanol) לכל צינור ומערבולת לערבב.
- מודטה דגימות ב 100 ° c עבור 10 דקות ולאפשר קריר עבור 5 דקות על הקרח.
- השתמש בתקן נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל (SDS-PAGE) פרוטוקול כדי להפריד חלבון באמצעות מסה. השתמש סולם חלבון עם מגוון הכולל 14 kDa (הלהקה גודל צפוי עבור monomeric α-syn).
- להעביר את הג לתוך צלחת מכתים ולכסות את ג'ל עם כתם כחול Coomassie (0.1% Coomassie כחול מבריק, 20% מתנול על ידי נפח, ו 10% חומצה אצטית על ידי נפח ב ddH2O). דגירה עבור 3 h ב RT בעת הרעד.
- יוצקים את הכתם כחול Coomassie ולהוסיף מספיק destain (50% מתנול על ידי נפח, ו 10% חומצה אצטית ידי נפח ב ddH2O) כדי לכסות את ג'ל. מודטה עבור 30 דקות ב-RT בעת הטלטול.
- יוצקים את הכתם וחזרו על הצעד הדתמים עד שהג ברור ולהקות גלויות.
- לשטוף את ג'ל 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד על ידי טלטול ב ddH2O ו התמונה ג'ל.
3. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור להדמיה בריל
- שוקלים 20 מ ג אצטט uranyl בצינור מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 1 מ ל ddH2O כדי לבצע 2% פתרון מימית. מערבולת עד האצטט uranyl הוא בפתרון, ולאפשר לשבת בלילה.
הערה: האצטט Uranyl צריך להתבצע יום לפני הכנת דגימות עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ. חשיפה לאור או עצבנות יכול לגרום אצטט uranyl לזרז, ככזה, את הצינור המכיל את הפתרון אצטט uranyl צריך להיות מכוסה רדיד אלומיניום, נשמר במקום חשוך, ולא מזועזעת לאחר אצטט uranyl הוא בפתרון. - להוסיף 2 μl של pff כדי 98 μl של dpbs כדי לדלל סיבים 1:50, ולאחר מכן pipet לערבב.
- הכנת שעווה נקייה/סרט פלסטיק (טבלה של חומרים) משטח מכוסה (כ 50 מ"מ x 50 מ"מ) על הספסל. על שעווה נקייה/סרט פלסטיק (טבלה של חומרים), להוסיף את הבאים (איור 2).
- הוסף 4 x 10 μL טיפות של ddH2O.
- הוסף 1 x 10 μL של שחרור מדולל בדגימת פיבריס או מונומר.
- הוסף 2 x 10 μL טיפות של 2% uranyl אצטט.
- השתמש מלקחיים משובח כדי להרים formvar/פחמן מצופה, רשת שידור נחושת רשת מיקרוסקופ אלקטרון (טבלת חומרים).
הערה: הקפד להרים את הרשת באמצעות הקצה, הימנעות מחלק הרשת במרכז (איור 2א). אם הלקחיים לגעת הרשת, את הסרט formvar/מצופה פחמן יהיה ניזוק, הפיכת הדמיה באזור זה של הרשת בלתי אפשרי. - הציפה את formvar/פחמן מצופה צד (הצד המבריק) למטה על הטיפה הראשונה של ddH2O. בעדינות להשתמש מלקחיים להחזיק את הרשת ולדחוף למטה כדי להבטיח את משטח מצופה כולו הוא במגע עם ddh2O. . תן לרשת לצוף לדקה
- להרים את הרשת, ומבלי לגעת החלק הרשת של הרשת, הפתיל משם את ddH2O עם נייר סינון.
- הציפה את הרשת לעיל על הטיפה השנייה של ddH2O עבור 1 דקות והפתיל משם ddh2o.
- לצוף את הרשת על הירידה של סיבים מדולל עבור 1 דקות והפתיל משם את עודפי כמו מעל.
- הציפה את הרשת על הטיפה הראשונה של אצטט uranyl עבור 1 דקות והפתיל משם את עודפי.
- הציפה את הרשת על הטיפה השנייה של אצטט uranyl עבור 1 דקות, הפתיל משם את עודפי.
- הציפה את הרשת כמעל הטיפה השלישית של ddH2o בקצרה והפתיל משם ddh2o.
- הציפה את הרשת לעיל על הירידה הרביעית של ddH2O בקצרה והפתיל משם ddh2o, להיות בטוח להסיר כמו הרבה ddh2o ככל האפשר.
- העבר לתיבת רשת לאחסון עד לדימות.
הערה: רשתות אמורות להתייבש לפחות 5 דקות לפני הדמיה. רשתות יכולות להיות בתמונה לפחות שנה לאחר ההכנה ויש לשמור אותן בסביבה יבשה.
4. שיטת תיפלוט
- בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, להוסיף 5 μl של pff כדי 245 μl של dpbs לדלל סיבים 1:50, ו pipet לערבב.
- הוסף 250 μL של dPBS לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד כדי לשמש כפקד שלילי.
- הוסף 5 μl של מונומר ל 245 μl של dpbs כדי לשמש כבקרת המונומר.
- הוסף 250 μL של thioflavin T בתוך מאגר גליצין (25 μM thioflavin T, 100 מ"מ גליצין, 1% טריטון X-100, pH 8.5) לכל מדגם ולערבב בעדינות.
- Pipet 2 משכפל, 200 μL כל אחד, לתוך שחור 96 צלחת הבאר. לשמור על הצלחת בחושך כדי למנוע הלבנה.
- דגירה עבור 1 h ב RT ולקרוא את הצלחת באמצעות עירור של 450 ננומטר ופליטה של 510 nm.
הערה: הקריאות של טיאופלאבין. י, לאורך זמן יש לקרוא דגימות באותו זמן דגירה. במידת הצורך, ניתן לקחת קריאות מרובות במהלך הדגירה של שעה ולהתוות לאורך זמן.
5. הSonication של α-סינונוקלאואין בנוי מראש
התראה: הsonicator וכל השלבים הsonication מבוצעים במכסה התרבות כדי למנוע חשיפה לפיבריס שעשויה להיות ניקה במהלך sonication. אנשי הצוות המבצעים את הצעדים הsonication צריכים לענוד ציוד הגנה אישי, כולל כפפות, הגנת בגדים בצורת מעיל מעבדה, ומגן פנים בעוד sonicating. הסיכון של חשיפה fibril ריל יכול להיות מופחת על ידי sonicating עם sonicator הצופר הספל, המאפשר את הצינור המכיל סיבים להישאר סגור במהלך sonication.
הערה: פרמטרים sonication אופטימליים של סיבים תלויים במודל של sonicator בשימוש. מסיבה זו, מיטוב מסוים יהיה צורך לבצע כדי להבטיח סיבים הם בגודל הנכון. הsonicator בשימוש ניתן למצוא בטבלת החומרים ואת הפרמטרים המתוארים מבוססים על תוצאות קודמות עם מודל זה של sonicator. הפרמטרים להלן יפעלו עבור 2-4 μg/μL של PFFs ב 200-400 μL של פתרון. מבחן sonication עם המכשיר צריך להתבצע ו סיבים ניתח כדי להבטיח את התוצאות הרצויות מושגת לפני שימוש pffs בניסויים.
- לצרף בקוטר 3.2 מ"מ (טבלת חומרים) לממיר, ולהגדיר את הפרמטרים sonicator כאמור להלן בשלב 5.1.1-5.1.3.
- הגדר משרעת ל -30%.
- הגדר את הדופק ל-01 01 (1 s on; 1 ביטול).
- . הגדר את השעה ל0:01:00
הערה: 1 דקות של פעימות שווה ל-60 פולסים, ודגם זה של sonicator (טבלת חומרים) יפסיק באופן אוטומטי. עם דגמים sonicator אחרים, יש לספור את מספר הפולסים.
- הפשרת סיבים ב RT ולדלל עם dpbs סטרילי בשכונה תרבות.
הערה: ברור 0.6 mL מיקרוצנטריפוגה צינור עובד הטוב ביותר עבור sonication ואת הריכוז fibril ריל הסופי תלוי בשימוש מיועד. תוצאות הנציג המוצג הם מתוך ריכוז fibril ריל הסופי של 4 μg/μL. - נגב את המקדח של הsonicator עם רקמת מעבדה לחה עם 70% אתנול כדי לנקות את הגשוש. לטבול את הקצה של החללית ב ddH2O ו הדופק 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש, ולאחר מכן ניגוב יבש עם רקמת המעבדה.
- מניחים את העצה במכשיר לתוך הצינור של fibrils מדולל, ולמקם את הקצה בתחתית הצינור.
- Sonicate עבור 60 פולסים (1 s on; 1 ביטול). להעביר את המקדח למעלה ולמטה במהלך כל הדופק כדי להבטיח את כל סיבים בנוזל הם sonicated. ונקי.
- לאחר 60 פולסים, להסיר את המקדח מן pffs, ולהוסיף 2 μl של pffs כדי 98 μl של dpbs בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי לדלל סיבים 1:50 עבור sonicated fiבריל מדידה על ידי אלקטרון מיקרוסקופ.
הערה: באופן אידיאלי, קבוצת משנה קטנה של סיבים יש למדוד לפני בהזרקה vivo ומדידה מקיפה יותר של סיבים להתבצע בעת היתרי הזמן. - לאחר sonication, בקצרה צנטריפוגה PFFs עבור 1 s ב 2,000 x g כדי לאסוף את כל הנוזלים מצדי הצינור.
התראה: אם הצינור הופך חם למגע, להפסיק sonicating אחרי 30 פולסים, לחכות 1 דקות, ו sonicate עבור 30 הפולסים הסופיים.
הערה: בזמן שsonicating, השאר את קצה המכשיר לקראת החלק התחתון של הנוזל בתחילת כל פעימה, קרוב מדי לראש הנוזל יגרום לאובדן דגימה. - לטבול את הטיפ בדיקה 1% SDS ואת הדופק 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש. הסר את העצה מ-SDS, הטבול ב-ddH2O ודופק 10 פעמים.
- לנגב את המקדח עם רקמת מעבדה להתייבש עם 70% אתנול, ואז לנגב את המקדח עם רקמת מעבדה יבשה. נתק את הגשוש מהממיר והחנות.
- נגב את כל המשטחים במכסה המנוע עם 1% SDS, ואחריו 70% אתנול.
הערה: 1% sds פתרון משמש לנתק סיבים ומשטחים נקיים וציוד16.
6. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור למדידת sonicated פיבריס
הערה: אם מיקרוסקופ אלקטרוני אינו ניתן לביצוע, והוא משמש כאמצעי עקיף לפיזור האור הדינמי וניתן להשתמש בו כאמצעים עקיפים לזריעת היעילות והנפח4,14.
- הכינו דגימות באמצעות הפרוטוקול מתוך הסעיף "מיקרוסקופ אלקטרוני להדמיה בריל".
- השתמש במיקרוסקופ אלקטרון שידור לקחת תמונה של סיבים מ 6 כדי 10 פתחי רשת שונים.
הערה: התמונות צריכות להיות הגדלה מספיק גבוהה כדי למדוד את סיבים, אבל מספיק נמוך כדי לדמיין מספר מועט בו. הגדלה סופית של כ 75, 000x צריך להספיק. - למדוד את אורך של תת קבוצה קטנה של לפחות 25 סיבים לפני שימוש סיבים בניסוי.
הערה: ניתן לבצע בדרך כלל מדידות אלה באמצעות תוכנת הדימות המשויכת למיקרוסקופ. עבור האימות המהיר, מדידת האדם צריכה לבחור מייצג מייצגים ולחשב את הגודל הממוצע. אורך fibril ריל צריך ממוצע סביב 50 ננומטר או פחות, עם מדידה מדויקת יותר לעקוב. - למדוד את האורכים של 500 + סיבים לקבלת תוצאות מקיפות יותר.
הערה: תוכנת הדמיה המשויכת למיקרוסקופ ניתן להשתמש עבור מדידות fibril ריל. לחילופין, תמונות ניתן לפתוח סיבים נמדד עם תוכנה עיבוד תמונה, באמצעות סרגל קנה המידה המשויך כל תמונה כהפניה גודל שבו כדי להשוות את אורכי בריל.
7. הכנת מזרקים מותאמים אישית להכנת זכוכית לזריקות סטריאוטקטיקה (איור 3)
- להוסיף כ 10 מ ל של סיליטיזציה מגיב (לוח חומרים) כדי לנקות גביע 50 mL.
- מניחים צינורות קפילר זכוכית (אורך של 54 מ"מ; קוטר החיצוני: 0.86 מ"מ; קוטר פנימי 0.59 מ"מ) אנכית בגביע הסיליקוזציה ומאפשרים פעולת קפילר כדי למשוך את הסיליקון מגיב במעלה הצינורית דרך פתח הצינור התחתון שקוע ב . מגיב בשיטת הטבק
- מגיב באופן מוסף לפתח הצינור העליון שאינו מתמלא בסיליזזציה כדי למלא לחלוטין את צינור נימי הזכוכית.
- הסירו את הצינורות הקפילר מהסיליקון המתכלה וכבו את הקצוות הפתוחים של הצינורות על מגבת נייר כדי להסיר את הסיליקוני בצינורות. אפשר לצינורות קפילר להתייבש לפחות 8 שעות.
- מניחים צינור נימי זכוכית בסיליזזציה בתוך מחטים מזכוכית (שולחן חומרים).
- הפעל את אלמנט החימום והרשה למשקולות המצורפות למתוח את צינור נימי הזכוכית המחומם.
- חותכים את שפופרת נימי הזכוכית הנמשכת עם מספריים בנקודה הדק ביותר באמצע ולהסיר את מחט הזכוכית של פולר מחט זכוכית.
הערה: המחט משכה הפנימי ואת הקוטר החיצוני צריך להיות כ 80 ו 100 μm, בהתאמה. מחטי זכוכית מרובים ניתן לעשות בבת אחת ומאוחסן עד מוכן לצרף למזרק זכוכית עם מחט מתכת מחוברת (שולחן חומרים). - חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.021 "ועובי הקיר הממוצע 0.001") כדי כ 40 מ"מ עם מספריים. החלק את עטיפת הכיווץ מעל מחט המתכת של מזרק משופע של 10 μL (טבלת חומרים).
- השתמש להבה פתוחה חום לדבוק הכיווץ לעטוף את המחט תוך סיבוב המחט כדי להחיל חום שווה.
- החלק את הקצה הגדול יותר של מחט זכוכית משכה בזהירות על מחט מתכת של המזרק.
- חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.036 "ועובי הקיר הממוצע 0.005") כדי כ 40 מ"מ עם מספריים ושקופית בקפידה על מחט זכוכית חופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט המתכת של המזרק (שולחן של חומרים). השתמש להבה פתוחה כדי לחמם את הכיווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט זכוכית מחט מתכת.
- הוסף שכבה נוספת של כווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט הזכוכית. חותכים אורך של צינורות לעטוף כיווץ (קוטר הפנימי הממוצע 0.044 "ועובי הקיר הממוצע 0.005") כדי כ 40 מ"מ עם מספריים ושקופית בקפידה על מחט זכוכית חופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט המתכת של המזרק (שולחן של חומרים). השתמש להבה פתוחה כדי לחמם את הכיווץ לעטוף כדי לאבטח את מחט זכוכית מחט מתכת.
- חתוך את מחט הזכוכית עם מספריים כך הטיפ הוא כ 8 מ"מ ארוך.
הערה: המחט צריכה להיות ארוכה מספיק כדי למקד את אזורי המוח הרצויים (האורך הנדרש תלוי בנקודות הציון האלה). - השתמש בצעדים 7.14.1-7.14.3 כדי לבדוק את המחט כדי להבטיח שאין דליפות ויש זרימה נאותה הן בנסיגה לחילוק נוזל ממחט זכוכית.
- מלאו מזרק בקוטר 1 מ ל עם מחט מחוברת של 26 מנות עם dH2O.
- הסר את הבוכנה מתכת מן המחט מותאם אישית מזרק זכוכית ולהכניס את המחט של dH2O ממולא מזרק לתוך בסיס של המזרק. הפעילו לחץ כדי לוותר על dH2O ממחט הזכוכית. בדוק את הממשק של מחט הזכוכית ואת המחט מתכת עבור דליפות ולאשר יציב dH2O זרימה.
הערה: במידת הצורך, את המחט זכוכית ניתן לגזוז כדי להגביר את קלות הזרימה ושכבות נוספות של לכווץ לעטוף הוסיף לתקן כל דליפות מהבסיס של מחט זכוכית. - תמלא צינור מיקרוצנטריפוגה. עם dH2o השתמש מזרק מותאם אישית מחט זכוכית לצייר dH2o. בדוק את המחט כדי לאשר נוזל נלקח לתוך המזרק וכי אין בועות.
הערה: אם יש בועות או dH2O אינו נשאב לתוך המחט, זמירה את המחט יכול לעזור להקל על הלחץ.
- בזהירות חנות מזרק עם מחטים זכוכית מוצמד בתיבות מזרק עד הצורך ניתוחים.
- השתמש בשיטות של ניתוח סטריאוטקמית סטנדרטיות למסירה של PFFs בקואורדינטות ממוטבות בעכברים (אתר אחד: AP + 0.2 מ"מ ו-ML + 2.0 מ"מ מברגמה, DV-2.6 מ"מ מ-דורא) או בחולדות (שני אתרים: AP + 1.6 מ"מ ו-ML + 2.0 מ"מ מברגמה, DV-4.0 מדורא; AP + 0.1 מ"מ ו-ML + 4.2 מ"מ מברגמה, DV-5.0 מדורא)1,14,17.
הערה: קואורדינטות אלה שימשו בעכברים C57BL6/C3H ו פישר 344 חולדות. כאשר משתמשים זנים אחרים, קואורדינטות צריך להיות ממוטב.
Representative Results
דור של סיבים מ α-מונמרים syn מתחיל בקביעת ריכוז של המונמרים. ניתן להשתמש הן בשיטת BCA והן במדידה של ספיגת ב280 ננומטר (A280) כדי למדוד את תוכן החלבון; עם זאת, תוצאות המתודה של BCA הציעו ריכוז גבוה יותר מהשיטה A280. PFFs נגזר העכבר α-מונומר syn היה ערך BCA של 14.05 ± 0.22 ו A280 של 8.05 ± 0.03 μg/μL (איור 1). כמו כן, PFFs נגזר האדם α-מונומר syn גם נראה להיות בריכוז גבוה יותר, עם ערך BCA של 12.95 ± 0.38 ו A280 של 7.83 ± 0.05 μg/μL (איור 1). מדידות A280 הם ספציפיים α-syn מבוסס על הכללת מקדמי הכחדה ואת התוצאות הללו שימשו כדי לדלל את המונמרים לפני הדגירה 7 ימים.
לפני דגירה, הנוזל המכיל את המונמרים הסינטטיים היה ברור, אבל צריך להופיע לאחר היווצרות fibril ריל. בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרוני שידור אישר נוכחות של fibrils ארוכים, מדידת 10-20 ננומטר רחב (איור 4). בהשוואה, α-המונמרים הסינטטיים היו בקושי גלויים ללא צורה ניכרת לעין (איור 4). עם אישור חזותי של מבנים fibrillar, היווצרות עמילואיד של סיבים היא התכונה הבאה של pffs כי יש אישור באמצעות thioflavin T שיטת. Thioflavin ' T מציג פלואורסצנטית משופרת כאשר קשירה ל עמילואיד; כך, אות פלורסנט מוגברת מן הדגימות מעיד על נוכחות של עמילואיד. לדוגמה, thioflavin ב dPBS הפיק אות של 3,287 ± 580 יחידות פלורסנט יחסית (RFU), עכבר α-מונומר syn הפיק אות של 4,174 ± 158 RFU, ו PFFs העכבר הפיק אות של 59,754 ± 6,224 RFU (איור 5). לעומת זאת, האדם α-מונומר syn הפיק אות דומה של 4,158 ± 105 rfu לעכבר מונומר, ו pffs האדם הפיק אות גבוה יותר של 1,235,967 ± 113,747 rfu לעומת pffs העכבר (איור 5). כדי להעריך את הנוכחות של הפלשולחן fibrils, בוצע שיקוע. . פיבריס יגלולה עם צנטריפוגה בשני העכברים ודגימות PFF אנושי, שבר supernatant צריך יותר חלבון בגלולה מאשר supernatant (איור 6). לעומת זאת, רוב החלבון מהעכבר והמונמרים האנושיים נכחו בסופרנטאנט, עם מתנה קטנה בתוך הגלולה (איור 6). כאשר ה-PFFs נוכח באופן בלתי-מידי אלקטרון מיקרוסקופ, מבני עמילואיד בהווה, ו-pbrils שולחן, העברת הכול בשלבי בקרת איכות חוץ גופית.
שני העכברים והעכבר האנושיים הsonicated לייצר פפס באורכים מתאימים לזריעת הכללות-syn4,18. PFFs היו מדולל לריכוז הרצוי של 4 μg/μL ו sonicated. באופן מיידי לפני הניתוח, 25 ברילס מייצגים שנוצרו על ידי אלקטרון מיקרוסקופ ונמדד למקום לבדוק את גודל fiבריל. PFFs sonicated העכבר נמדד 48.8 ± 3.1 nm, ואילו PFFs האדם נמדד 52.1 ± 4.4 ננומטר באורך; PFFs של שני המינים היו אפוא האורך המתאים (50 ננומטר או פחות) כדי לגרום לזריעה פעילות. בדיקה מקיפה יותר של כ 500 סיבים חשף את אורך התפלגות האורך הממוצע של סיבים העכבר הsonicated. האורך הממוצע היה 44.4 ± 0.6 nm, עם 86.6% של PFFs מדידה 60 ננומטר או פחות (איור 4). לעומת זאת, PFFs האדם בממוצע 55.9 ± 1.1 nm עם 69.6% של PFFs מדידה 60 nm או פחות (איור 4).
בעקבות הזרקה של sonicated עכבר pffs לתוך חולדות כפי שתוארה בעבר3,5, סדרה של מקטעי רקמות עובדו ב 2 חודשים לאחר ניתוח, כאשר מספר הכללה המכילה נוירונים ידוע לשיא ב ה-SNpc, לקבלת אישור של הכללות זאילות-syn5. הכללת נושא הנוירונים, כפי שמצוין על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיה עבור pSyn (נוגדן בטבלה של חומרים) נמצאים בתוך Snpc (איור 7), כמו גם אזורים אחרים ברחבי המוח אשר innervate הסטריאטום (קדמי גרעין הריח, מנוע, cingulate, פיריפורם, פרלימלי, סוחושי, אנורהיאל, ומבודדים קורמיתיים, אמיגדלה, סטריאטום,1,3,4,5,19. הכללות אלה חולקים מאפיינים דומים עם גופי לולי, כגון מחייב thioflavin S, והתנגדות של סך α-צין כדי פרוטאינאז K (איור 7), כפי שמוצג על ידי מכתים אימונוהיסטוכימיה (נוגדן פרוטטינואז k בטבלה של חומרים) . אישור של זריעה בתוך המוח מצביע על בקרת איכות vivo כבר עבר, ו-ali, ts של PFFs הוקפאו בעבר ונשמר מאותה אצווה יכול להיות sonicated תחת פרמטרים זהים, עם אורך מאומת, בניסויים גדולים יותר.
איור 1 . שיטות לדור של α-הפיבריס. מתאר את הצעדים הדרושים להפקת סיבים מ α-מונומרים syn. Monomers הם centrifuged עבור 10 דקות (15,000 x g, ב 4 ° c). הסופרנטאנט מועבר לצינור נקי וריכוז החלבון נקבע על ידי הספיגה ב-280 ננומטר, או שיטת BCA. גרף מראה ריכוזים של. עמודות מציינות את המשמעות של הקבוצה, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ± 1 של הממוצע. לאחר ריכוז החלבון נקבע, α-ונומרים syn מדולל, לזמן קצר ומלא מופרית ו מודבטים עבור 37 ° c עבור 7 ימים, תוך כדי טלטול על מערבל מסלולית להגדיר ב 1,000 RPM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 . צביעת שיטות עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ. דיאגרמת כתמים שליליים למיקרוסקופיה אלקטרונית. A) תמונות המתארות את רשתות הדגימה של המיקרוסקופיה אלקטרונים. לרשת יש צד עמום או בהיר ומבריק או אפל. הצד המבריק/אפל מצופה בסרט התומך formvar/פחמן. ב) איור של הליך כתמים. הרשת היא צפה מבריק/צד כהה על הטיפה הראשונה של ddH2O עבור 1 דקות ואת עודף הוא מרושע משם עם נייר סינון. התהליך חוזר על עצמו עם הטיפה השנייה של ddH2O, pffs מדולל או monomers, שתי טיפות של אצטט uranyl, ושתי טיפות נוספות של ddh2o. רשתות עשוי להיות מאוחסן בתיבת רשת עד ליצירת תמונה. סרגל בקנה מידה = 3 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 . הרכבה של מזרקים מותאמים אישית זכוכית מחטים. תרשים של הצעדים הנדרשים להרכיב מחט זכוכית מוצמד מזרקים. צינורות הזכוכית הניסטריזציה משכו וחותכים באמצע כדי לייצר מחטי זכוכית. מכווץ לעטוף אבובים משמש להכנת מחט מתכת טופס חותם פנימי כאשר מחט זכוכית מחליקה על מחט מתכת. שתי שכבות נוספות של הכיווץ לעטוף אבובים החופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט מתכת הוסיף ברציפות וחום מוחל כדי לאבטח את המחט זכוכית טופס חותם הדוק מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 . ויזואליזציה של α-מונמרים סינטטיים והα-syn סיבים באמצעות שידור אלקטרון מיקרוסקופ. מיקרוגרפים מייצגים של α-מונמרים סינטטיים ופיברינים. לוחות העליון: העכבר והאדם α-מונומר syn. לוחות הביניים: עכבר באורך מלא ו-האדם α-שצין. לוחות התחתון: העכבר והאדם α-לאחר sonication. הגרף התחתון: הפצת העכבר sonicated ו-האדם α-syn PFF אורכי. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 . אישור של מבני עמילואיד על ידי שיטת thioflavin. מדידה של אות פלורסנט מעכבר ו-האדם α-מונומר syn ו PFF דגימות. שמאל: תוצאות מהעכבר-מונומרים סינטטיים ו-α-הפפס syn. מימין: תוצאות של מונמרים מבוססי-האדם-syn והα. שליטה שלילית של dPBS מוצגת בכל גרף. כל המדידות מבוטנות כיחידות פלורסנט יחסיות (RFU). עמודות מציינות את המשמעות של הקבוצה, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ± 1 של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 . משקעי שאיפה לפלטלשולחן α-syn. תמונות מ-coomassie ג'לים ויטראז '. להקות המוצגות הן בערך 14 kDa בהתבסס על סולם החלבון. משמאל: עכבר מונומר ו PFFs. מימין: מונמרים ומבני אדם. עבור כל דגימות מונומר ו PFF, את הגלולה מושעה (P) ו supernatant (S) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7 . תכונות של הכללות במודל חולדה מאשרת α-syn פתולוגיה. מיקרוגרפים מייצגים של החומר. בתוך 2 חודשים לאחר ההזרקה שמאל: נוירונים המכילים pSyn ומוכתם נגד cresyl סגול. באמצע: הנוירונים החיוביים של Thioflavin. מימין: α-syn-המכיל הכללות עמידים פרוטאינאז K. סרגל סרגל = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפקה של α-פפס syn מסוגל לזריעה נוירונים והמוביל הגוף ההכללות כמו לולי הוא תלוי בגורמים מרובים ומדרגות. גורם קריטי הוא כי ונומרים המשמש ליצירת סיבים צריך להיות מגובש במיוחד עבור fibriliטיזציה4,9,14,15. אם ונומרים אינם מנוסחים עבור fibrilization, סיבים לא יכול להיווצר או סיבים שעושים טופס לא יכול לייצר α-syn פתולוגיה. כמו כן, המאגר שהמונומרים משפיעים גם על הפיבריזציה. ככזה, עבור התוצאות הטובות ביותר, ריכוז המלח צריך להיות כ 100 מ"מ ו-pH בין 7.0 ו 7.3. השלב ההתחלתי המציג את השונות היא השיטה שבה נקבעת תוכן החלבון ההתחלתי, עם המדידה ב-A280, העשויה להפיק תוצאות מדויקות יותר ולכן היא השיטה המועדפת. הפער בריכוז חלבונים יכול להקטין את היעילות של תהליך fibrilization, כמו גם לשנות את הריכוז PFF הניח בשימוש ניסויים. שניהם יכולים לגרום ירידה בזריעת יעילות והשתנות האצווה בין ניסויים.
שלבי בקרת איכות התחלתיים יאשרו תכונות קריטיות של PFFs, במיוחד כי יש להם conbrillary (המיקרוסקופיה אלקטרונים), מכילים מבני עמילואיד (thioflavin T שיטת), ו-הם הפלטטבלה (שיקוע שיטת). חשוב לציין כי התוצאות של שיטת thioflavin T להשתנות עם הזמן הם לא מדד ישיר של כמות מבני עמילואיד להציג, במקום, את התשובה thioflavin צריך לשמש רק כאינדיקטור של נוכחות מבני עמילואיד בתוך הדגימה. Thioflavin T הוא בדרך כלל בשימוש בתוך מבחנה מחוץ לספר, כמו הדבר האמור לעיל להראות את סיבים מכילים מבני עמילואיד. לחילופין, thioflavin S משמש ברקמה כדי לזהות מבני עמילואיד, כפי שמוצג באיור 7. בנוגע לבחינת השאיפה, התוצאות מראות רק כי PFFs נמצאים בעיקר בשבריר שולחן. כמו הדגימות מופעל בתנאים המבודדים, להקה בולטת אחת של כ 14 kDa, הגודל של α-monomers syn, נמצא על ג'לים. הדבר אינו דומה ללהקות המרובות הקיימות במשקולות מולקולריות גבוהות יותר, שצפויות בשימוש ב-PFFs אם נעשה שימוש בג'ל מקורי או בלתי מבוקר. לבסוף, העברת מוצלח של כל הצעדים הראשוניים הללו בקרת איכות אינה מבטיחה α-הכללת הכללה syn פעילות. מסיבה זו, יש להשתמש בניסויים בתרבות התא או בקבוצה קטנה של חיות מוזרקים בניתוח כדי לבדוק את יעילותם של PFFs לפני השימוש בניסויים גדולים יותר.
Sonication הוא צעד מכריע בתהליך ופרמטרים יהיה שונה בהתאם למודל של sonicator בשימוש. יש להחיל את הפרמטרים Sonication ולוודא שקטעים קצרים של PFF הופקו. גודל fibril ריל יש הנושאת על הזריעה, עם סיבים קצר זריעה יותר ביעילות. למרות זרעי סיבים קצר יותר ביעילות רבה יותר, אפקט זה ברמות ואת אורך pff אופטימלית הוא כ 50 ננומטר4,18. חשוב גם לא לsonicate מחדש את הדגימות ולחשוף את PFFs לחום מוגזם, כי זה עלול להפחית את היעילות לזריעה. Sonicated PFFs אלה צריך להיבדק עבור יעילות בתרבות התא קטן או בניסויים vivo לפני השימוש בניסויים בקנה מידה גדול יותר. כמו הפעלות sonication שונות יש את הפוטנציאל להציג את השונות, קבוצות הטיפול הניסיוני צריך להיות מתוכנן בהתאם.
בעת אספקת pffs ב vivo, לוקליזציה של אתר ההזרקה (s) ואת pffs הסכום הכולל שימוש יכול להשפיע על מספר הנוירונים שיפתחו הכללות, כמו גם את היקף ניוון נוירואני7,14. הקואורדינטות בפרוטוקול לספק מקום להתחיל, אבל יש לבדוק בתוך המעבדה כדי להבטיח את אזור היעד הרצוי מפתחת α-syn פתולוגיה לפני שימוש בניסויים בקנה מידה גדול. במקרה הצורך, ניתן להשתמש בחרוזי צבע מעקב או בצבעי פלורסנט כדרך לבדיקת המיקוד האזורי לפני השימוש ב-PFFs. כמות pffs המשמש ב-vivo משתנה בין קבוצות, עם רוב הקבוצות באמצעות סך של 5 עד 20 μg של pffs אחד או מחולק בין שני אתרי הזרקה1,2,3,4,5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , 14. כמספר אתרי הזרקה, מיקום אתרי הזרקה, וכמות pffs מוזרק יכול להשפיע על תוצאות והתקדמות של synucleinopathy, את תוצאות הזרם של הפרמטרים המשמשים צריך להיות מאופיין לפני באמצעות המודל כדי ל בדוק התערבויות פוטנציאליות או בחינת תכונות הזמני של המודל.
בעת בחירת מודל לשימוש עבור בדיקות therapeutics או לימוד התקדמות המחלה, המודל המשמש יש לבחור כדי לענות במידה הטובה ביותר את השאלה שנשאלה. לא כל הדגמים יהיו בעלי תכונות מחלות מסוימות של PD, או להציע את פרק הזמן הדרוש כדי לבדוק התערבויות פוטנציאליות. מודל PFF מסכם את תכונות המפתח של PD, כגון α-syn פתולוגיה וניוון שולי, והוא יכול להוביל ליקויים מוטוריים צנוע. המודל מציע קורס זמן צפוי וממושך, שבו הכללות הטופס חודשים לפני ניוון שונות. זה מאפשר לחוקרים לבחון ולנצל את השלבים השונים במהלך ההתקדמות הממושכת של הסיננופתיה. השימוש הנוכחי והעתידי של המודל הכולל צפוי להיות מועיל במחקר של התקדמות המחלה ופיתוח של טיפולים חדשניים.
Disclosures
ג'וזף פטרסון, קלווין לוק, ו Caryl Sortwell בכן מעורבים כיום בהסדרים חוזיים עם קרן מייקל ג'יי פוקס לבקרת איכות α-חומר syn שנוצר על ידי פרוטנוס, Inc. Coauthor חבר ניקול פולינסקי, הוא עובד של מייקל ג'יי פוקס קרן, אשר נדבק פרוטאוס, Inc. כדי לייצר α-syn מונומר. כותבי מייגן דאפי, לורה וולפיטלי-דיילי, וניקולס קנאן אין להם מה לגלות.
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים הקרן מייקל ג'יי פוקס, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NS099416) ואת מכון המוח ווסטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
| Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
| Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
| Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
| Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
| Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
| Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
| Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
| Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
| Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
| Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
| Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
| ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
| Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
- Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
- Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).
- Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
- Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
- Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
- Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
- Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
- Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
- Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
- Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
- Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).
