Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Generering af alpha-Synuclein præformerede Fibrils fra monomerer og brug in vivo

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/59758
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 4, 5, 1, 1,3,6
1Department of Translational Science and Molecular Medicine, Michigan State University, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Neuroscience Program, Michigan State University, 4Center for Neurodegenerative Disease Research, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 5Center for Neurodegeneration and Experimental Therapeutics, University of Alabama at Birmingham, 6Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center

Summary

Målet med denne artikel er at skitsere de nødvendige skridt til generering af fibriller fra monomerisk Alpha-synuclein, efterfølgende kvalitetskontrol, og brug af de præformerede fibriller in vivo.

Abstract

Brug af in vivo Alpha-synuclein præformeret atrieflimren (α-syn PFF) model af synucleinopati er stigende popularitet blandt forskere med henblik på at modellere Parkinsons sygdom synucleinopati og nigrostriatal degeneration. Standardisering af α-syn PFF generation og in vivo ansøgning er afgørende for at sikre en konsekvent, robust α-syn patologi. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for generering af fibriller fra monomere α-syn, post-fibrilization kvalitetskontrol trin, og foreslåede parametre for vellykket Neurokirurgisk injektion af α-syn pffs i rotter eller mus. Begyndende med monomere α-syn, fibrilization forekommer over en 7-dages inkubationsperiode, mens ryste på optimale buffer betingelser, koncentration, og temperatur. Post-fibrilization kvalitetskontrol vurderes ved tilstedeværelsen af pelletabel fibriller via bundfældning assay, dannelsen af amyloid kropsbygning i fibriller med en thioflavin T-assay, og elektron mikroskopisk visualisering af fibriller. En vellykket validering ved hjælp af disse analyser er nødvendig for at opnå succes, men de er ikke tilstrækkelige til at garantere, at PFFs vil frø α-syn-indeslutninger i neuroner, da en sådan aggregerings aktivitet for hver PFF-batch bør testes i cellekultur eller i pilot dyre kohorter. Før brug skal pffs sonikeres under nøje standardiserede forhold, efterfulgt af undersøgelse ved hjælp af elektronmikroskopi eller dynamisk lysspredning for at bekræfte, at atrieflimren længder er inden for det optimale størrelsesinterval med en gennemsnitlig længde på 50 nm. PFFs kan derefter tilsættes til cellekultur medier eller anvendes i dyr. Patologi detekterbart ved immunofarvning for phosphoryleret α-syn (psyn; Serin 129) er tilsyneladende dage eller uger senere i cellekultur og gnaver modeller.

Introduction

Parkinsons sygdom (PD) er primært karakteriseret post mortem af to store patologiske egenskaber: udbredt og progressiv Alpha-synuclein (α-syn) patologi, og nigrostriatal degeneration. Efter injektion i dværg-mus eller-rotter inducerer α-syn-præformerede fibriller (pffs) progressiv akkumulering af patologisk α-syn, hvilket kan resultere i langvarig degeneration af substantia nigra pars Compacta (snpc) dopamin neuroner i løbet af mange måneder, samt sensorimotoriske underskud1,2,3,4,5,6. Neuroner er udsat for α-syn fibrils, enten via direkte intracerebralt injektion eller tilsættes til medierne af kulturperler neuroner. Når pffs er taget ind i neuroner, pffs handle til "frø" dannelsen af indeslutninger gennem templating, og ophobning af endogene α-syn i fosforylerede indeslutninger1,7,8, 9. det er Inklusioner deler lignende egenskaber med Lewy kroppe: indeholdende α-syn fosforyleret ved Serin 129 (pSyn), ubiquitin og p62; besidder amyloid kvaternære strukturer som vist med positiv thioflavin farvning; og er modstandsdygtige over for proteinase K fordøjelse1,3,5,7,8,9,10,11, 12. i. PFF eksponering fører til α-syn inklusion dannelse i primær og nogle udødeliggjort neuroner i kultur, samt mus, rotter, og ikke-menneskelige primater in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det er vigtigt at bemærke, at PFFs ikke vil føre til α-syn inklusion dannelse i alle cellekultur modeller og nogle kultiverede neuroner vil frø bedre end andre.

Et andet vigtigt træk ved in vivo α-syn PFF model er de forskellige sekventielle patologiske faser, der opstår over flere måneder. I gnavere, efter intrastriatal injektion, α-syn inklusion dannelse generelt toppe inden for SNpc og mange kortikale regioner inden for 1-2 måneder. Denne aggregerings peak efterfølges af nigrostriatal degeneration ≈ 2-4 måneder senere1,3,5. Disse forskellige patologiske stadier giver forskerne den platform, hvormed man kan studere og udvikle strategier, der 1) mindske α-syn aggregering, 2) klar allerede dannet α-syn indeslutninger, og/eller 3) forhindre efterfølgende neurodegeneration. PFF-modellen giver klare fordele og ulemper i forhold til neurotoksisk, transgene og viral vektor medierede α-syn overekspression modeller som tidligere anmeldt6. Valget af, hvilken model eller tilgang til at tage bør afgøres af, hvilken model passer bedst til det spørgsmål, som efterforskerne spørger.

Selv om PFF-modellen er blevet udnyttet med succes af mange laboratorier, er der stadig grupper, der har oplevet uoverensstemmelser med at generere fibriller og producerer konsekvent α-syn patologi14. Eksempler på uoverensstemmelser spænder fra pffs, der producerer lidt eller ingen α-syn patologi, batch til batch såning effektivitet, og selv svigt af fibriller at danne. Således er standardiseringen af α-syn PFF generation og in vivo ansøgning kritisk for at give mulighed for præcise fortolkninger af virkningen af nye terapeutiske interventioner. Følgende protokol skitserer de trin, der kræves for generering af PFFs fra α-syn monomerer, in vitro kvalitetskontrol af PFFs en gang dannet, sonikering og måling af PFFs før brug, og forslag til at lette en vellykket in vivo injektion af PFFs til rotter eller mus.

Protocol

Alle metoder, der involverer dyr er blevet godkendt af Michigan State University institutionelle dyrepleje og brug udvalg (IACUC).

1. dannelse af α-synuclein præformerede fibriller fra monomerer (figur 1)

  1. Optø α-synuklein monomerer på is, resuspension forsigtigt ved at flimere røret og centrifugeres ved 15.000 x g i 10 min ved 4 °c.
    Bemærk: α-syn monomer skal være specielt formuleret til fibrilization. Rekombinante monomerer kan købes fra kommercielle kilder eller genereres af protokoller på stedet4,9,14,15. Hvis produktet købes fra kommercielle kilder, skal det angive, at α-syn monomer er specifikt til generering af fibrils. Uanset om monomerer købes eller genereres på stedet, skal kvalitetskontrol trinene skitseret nedenfor udføres med hver batch for at sikre fibriller har dannet og vil frø effektivt før brug i eksperimenter.
  2. Overfør supernatanten til et rent 1,5 mL mikrocentrifugerør, og registrer det overførte beløb.
    Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå den pellet, som, hvis den findes, vil være lille.
  3. Proteinkoncentrationen af den overførte supernatanten måles ved hjælp af enten en standard bicinchoninsyre Acid assay (BCA) eller måling af absorbans ved 280 Nm med et mikrovolumen Spektrofotometer.
    Bemærk: BCA-analysen er ikke så nøjagtig for den specifikke måling af α-syn og kan give resultater, der overvurderer proteinkoncentrationen. Som et resultat, måling af absorbans ved 280 Nm er den anbefalede metode til bestemmelse af proteinkoncentrationen.
    1. For at måle med BCA assay, Følg standard BCA protokoller og udføre med tre forskellige fortyndinger af α-syn monomer. Foreslåede fortyndinger er 1:25, 1:50 og 1:100.
    2. For at måle med metoden A280, skal læseren være tom med steril 1x Dulbeccos fosfat bufferet saltvand (dPBS) uden calcium og magnesium, med en saltkoncentration på ca. 100 mM NaCl og pH-område 7.0-7.3 (tabel over materialer).
    3. Der tilsættes 2 μL prøve til læseren, og absorbansen aflæses ved 280 Nm.
    4. Brug Beer-Lambert lov til at bestemme koncentrationen af monomerer.
      Equation 1
      Bemærk: ekstinktionskoefficienten ε for humant α-syn er 5.960 M-1cm-1 og for mus α-syn er 7.450 m1cm-1. Kurve længde måles i cm. molekylvægt af α-syn (14 kDa) skønnes at antage 1 da = 1 g/mol.
  4. Monomererne fortyndes med 1x dPBS til en slutkoncentration på 5 mg/mL. Brug ligningen nedenfor til at beregne mængden af 1x dPBS tilsat for at fortynde monomererne.
    Equation 2
    Bemærk: alle koncentrationer er i mg/mL og volumener i μL. monomer fortyndinger skal udføres med 1x Dpb'er. Den totale mængde, der anvendes til at generere fibriller, skal være mellem 100 og 500 μl for at opnå reproducerbare fibrilization-resultater.
  5. Kort vortex at blande, og centrifuge til at indsamle alle væske i bunden af røret. Aliquot monomerer til kvalitetskontrol sammenligning med fibriller som angivet i trin 1.8.1-1.8.4.
  6. Brug en rørlås eller voks/plastikfolie (tabel med materialer) til at fastgøre låget til mikrocentrifuge røret lukket.
  7. Røret anbringes i et orbital termo ixer med låg i 7 dage ved 37 °C, idet der rystes ved 1.000 RPM (tabel over materialer).
    Bemærk: ved udgangen af de 7 dage, bør indholdet af røret synes uklar. Termo ixen skal have et låg for at forhindre dannelse af kondens på rørlågene.
  8. Knips forsigtigt røret for at resuspendere α-syn fibrils. Aliquot fibriller for følgende kvalitetskontrol trin som angivet i trin 1.8.1-1.8.4.
    Bemærk: Fibrils for kvalitetskontrol trin kan lagres på RT natten over.
    1. Aliquot 6 μL til sedimentations analysen.
    2. Aliquot 5 μL til thioflavin T-bindings analysen.
    3. Aliquot 2 μl til transmissionselektronmikroskopi til atrieflimren-visualisering.
    4. Aliquot skal være mindst 10 μL for endotoksin analysen.
      Bemærk: ved endotoksin analyse anvendes en kommerciel Limulus Amebocyte Lysate (LAL), efter fabrikantens anvisninger (tabel over materialer). Endotoksinniveauerne bør være ≤ 0,5 endotoksin enheder/mL for fibrils. En endotoksin fjernelse kit kan anvendes, hvis dette kriterium ikke er opfyldt.
  9. Aliquot de resterende fibriller og butik. Til langtidsopbevaring (12-18 måneder), hurtigt fryse på tøris, og opbevares ved-80 °C.
    Bemærk: beløbet til alikvot afhænger af den ønskede downstream-applikation. In vivo brug kræver typisk mere fibriller ved højere koncentrationer end in vitro-brug, og alikvot volumener bør planlægges i overensstemmelse hermed. Fibrils skal opbevares mod bagsiden af fryseren for at forhindre beskadigelse fra potentiel fryse/optøning. Protokollen kan sættes på pause her.

2. sedimentations analyse

  1. I et rent mikrocentrifugerør tilsættes 6 μl PFF til 54 μl dpbs for at fortynde fibriller 1:10 og pipet blandes.
    1. I et separat rør tilsættes 6 μL monomer til 54 μL dPBS som en ekstra kontrol.
  2. Centrifuge prøverne ved 10.000 x g i 30 min ved RT og Overfør supernatanten til et rent mikrocentrifuge glas.
  3. Tilsæt 60 μL af dPBS til den resterende pellet og vortex for at resuspendere.
  4. Der tilsættes 30 μL 3x prøve buffer (140 μL af 50% glycerol/0,1% bromophenolblåt, 40 μL 10% SDS og 20 μL β-mercaptoethanol) til hvert rør og vortex for at blande.
  5. Prøverne inkubeeres ved 100 °C i 10 minutter og afkøles i 5 minutter på is.
  6. Brug en standard natriumdodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) protokol til at adskille protein efter masse. Brug en protein stige med en rækkevidde, der omfatter 14 kDa (størrelsesintervallet forventes for monomere α-syn).
  7. Gelen overføres til en farvnings skål og dækkes af gelen med Coomassie Blue Stain (0,1% Coomassie strålende blå, 20% methanol efter volumen og 10% eddikesyre efter volumen i ddH2O). Inkubeter i 3 timer ved RT under rystning.
  8. Coomassie blå plet hældes ud, og der tilsættes nok destain (50% methanol efter volumen og 10% eddikesyre efter volumen i ddH2O) til at dække gelen. Inkube i 30 min ved RT under omrystning.
  9. Hæld depletten af og Gentag deplettrinnet, indtil gelen er klar, og båndene er synlige.
  10. Vask gelen 3 gange i 5 min hver ved at ryste i ddH2O og billede gelen.

3. transmission elektronmikroskopi til atrieflimren visualisering

  1. 20 mg uranylnitrat acetat afvejes i et mikrocentrifuge glas, og der tilsættes 1 mL ddH2O for at lave en 2% vandig opløsning. Vortex, indtil uranylnitrat acetat er i opløsning, og lad det sidde natten over.
    Bemærk: uranyl acetat skal laves dagen før tilberedning af prøver til transmissionselektronmikroskopi. Udsættelse for lys eller agitation kan medføre, at uranylnitrat acetat udfælder, som sådan, bør røret, der indeholder uranylnitrat acetat opløsningen, dækkes i aluminiumsfolie, opbevares på et mørkt sted og ikke rystes, efter at uranylnitrat acetat er i opløsning.
  2. Der tilsættes 2 μl PFF til 98 μl dpb'er for at fortynde fibriller 1:50 og derefter pipet for at blande.
  3. Forbered en ren voks/plastikfolie (tabel over materialer) dækket overflade (ca. 50 mm x 50 mm) på bordpladen. På den rene voks/plastikfilm (tabel over materialer) skal du tilføje følgende (figur 2).
    1. Der tilsættes 4 x 10 μL dråber ddH2O.
    2. Der tilsættes 1 x 10 μl dråbe fortyndet fibriller eller monomer prøve.
    3. Der tilsættes 2 x 10 μL dråber 2% uranylnitrat acetat.
  4. Brug fintippet tang til at afhente en formvar/Carbon belagt, mesh kobber transmission elektronmikroskopi gitter (tabel af materialer).
    Bemærk: Sørg for kun at afhente gitteret ved kanten, og undgå maskedelen i midten (figur 2A). Hvis pincet røre masken, den formvar/Carbon belagt film vil blive beskadiget, hvilket gør billeddannelse i dette område af nettet umulig.
  5. Flyde gitteret formvar/Carbon belagt side (skinnende side) ned på den første dråbe af ddH2o. Brug forsigtigt pincet til at holde gitteret og tryk ned for at sikre, at hele den coatede overflade er i kontakt med DDH2o. Lad gitteret flyde i 1 min.
  6. Afhente gitteret, og uden at røre mesh del af nettet, væge væk ddH2O med filterpapir.
  7. Flyde gitteret som ovenfor på den anden dråbe af ddH2o i 1 min og væge væk DDH2o.
  8. Flyde gitteret på dråbe af fortyndet fibriller i 1 min og væge væk overskydende som ovenfor.
  9. Flyde gitteret på den første dråbe uranylnitrat acetat i 1 min og væge væk det overskydende.
  10. Flyde gitteret på den anden dråbe uranylnitrat acetat i 1 min, væge væk overskydende.
  11. Flyde gitteret som ovenfor på den tredje dråbe af Hedeselskabet2o kortvarigt og væge væk DDH2o.
  12. Flyde gitteret som ovenfor på den fjerde dråbe af ddH2o kort og væge væk DDH2o, at være sikker på at fjerne så meget DDH2o som muligt.
  13. Overfør til en gitter boks til opbevaring indtil billedbehandling.
    Bemærk: gitre skal tørre i mindst 5 minutter før billeddannelse. Gitre kan være lagret i mindst et år efter tilberedningen og skal opbevares i et tørt miljø.

4. thioflavin T-assay

  1. I et rent mikrocentrifugerør tilsættes 5 μl PFF til 245 μl dpbs for at fortynde fibriller 1:50 og pipet blandes.
  2. Der tilsættes 250 μL dPBS til et separat mikrocentrifugerør, som kan fungere som en negativ kontrol.
  3. Der tilsættes 5 μL monomer til 245 μL dPBS for at fungere som monomer kontrol.
  4. Der tilsættes 250 μL thioflavin T i glycin-buffer (25 μM thioflavin T, 100 mM glycin, 1% Triton X-100, pH 8,5) til hver prøve og blandes forsigtigt.
  5. Pipet 2 replikater, 200 μL hver, til en sort 96 brønd plade. Hold pladen i mørke for at forhindre foto blegning.
  6. Inkube i 1 time ved RT og læse pladen ved hjælp af en excitation af 450 Nm og emission af 510 nm.
    Bemærk: Thioflavin T-aflæsninger vil svinge over tid. Prøverne skal læses på samme inkubationstid. Hvis det ønskes, kan flere aflæsninger tages i løbet af time inkubation og plottes over tid.

5. sonikering af α-synuclein præformerede fibriller

Forsigtig: sonicator og alle sonikering trin udføres i en kultur hætte for at forhindre udsættelse for fibriller, der kan aerosolize under sonikering. Det personale, der udfører sonikering trin bør bære personlige værnemidler, herunder handsker, beklædning beskyttelse i form af en lab frakke, og en ansigtsskærm, mens sonikering. Risiko for atrieflimren eksponering kan reduceres ved sonikering med en kop horn sonicator, så røret indeholder fibriller at forblive lukket under sonikering.

Bemærk: optimal sonikering parametre af fibriller er afhængige af den model af sonicator anvendes. Af denne grund, nogle optimering skal udføres for at sikre fibriller er den korrekte størrelse. Den sonicator, der anvendes, kan findes i tabellen over materialer og de skitserede parametre er baseret på tidligere resultater med denne model af sonicator. Nedenstående parametre vil virke for 2-4 μg/μL PFFs i 200-400 μL opløsning. Test sonikering med instrumentet skal udføres og fibriller analyseres for at sikre de ønskede resultater opnås før brug af pffs i eksperimenter.

  1. Fastgør en sonde med 3,2 mm diameter (tabel over materialer) til konverteren, og Indstil sonicator-parametrene som angivet nedenfor i trin 5.1.1-5.1.3.
    1. Indstil amplitude til 30%.
    2. Indstil pulsen til 01 01 (1 s på; 1 s slukket).
    3. Indstil tiden til 0:01:00.
      Bemærk: 1 minut af pulserende svarer til 60 pulser, og denne model af sonicator (tabel af materialer) vil stoppe automatisk. Med andre sonicator modeller, antallet af pulser skal tælles.
  2. Tø fibriller på RT og fortyndes med sterile dpbs i en kultur hætte.
    Bemærk: et klart 0,6 ml mikrocentrifugerør fungerer bedst til sonikering, og den endelige atrieflimren-koncentration afhænger af den tilsigtede anvendelse. Repræsentative resultater fremgår af en endelig atrieflimren-koncentration på 4 μg/μl.
  3. Tør sonde af sonikatoren med et laboratorie væv fugtet med 70% ethanol for at rense sonden. Sænk spidsen af sonden i ddH2O og puls 10 gange for at rense sonden yderligere, og tør derefter tørre med et laboratorie væv.
  4. Anbring sondespidsen i røret af fortyndede fibrils, og Anbring spidsen i bunden af røret.
  5. Soniker for 60 pulser (1 s på; 1 s slukket). Bevæg sonden op og ned under hver puls for at sikre, at alle fibriller i væsken soniseres. og ren.
  6. Efter 60 pulser fjernes sonden fra pffs, og der tilsættes 2 μl PFF til 98 μl dpbs i et rent mikrocentrifuge glas for at fortynde fibriller 1:50 til soniskeret atrieflimren-måling ved elektronmikroskopi.
    Bemærk: ideelt set bør en lille delmængde af fibriller måles før in vivo injektion og en mere omfattende måling af fibriller udføres, når tiden tillader det.
  7. Efter sonikering skal der kort centrifugeres PFFs i 1 s ved 2.000 x g for at samle al væske fra siderne af røret.
    Forsigtig: hvis røret bliver varmt at røre ved, skal du stoppe sonikatating efter 30 impulser, vent 1 min, og sonikeres for de sidste 30 pulser.
    Bemærk: mens sonicating, holde sondespidsen mod bunden af væsken i starten af hver puls, for tæt på toppen af væsken vil forårsage prøve tab.
  8. Sænk sondespidsen i 1% SDS og puls 10 gange for at rense sonden. Fjern spidsen fra SDS, sænk i ddH2O og puls 10 gange.
  9. Aftør sonden med et laboratorie vævet fugtet med 70% ethanol, og tør derefter sonden af med et tørt laboratorie væv. Afmonter sonden fra konverteren og opbevar den.
  10. Aftør alle overflader i hætten med 1% SDS, efterfulgt af 70% ethanol.
    Bemærk: 1% SDS-opløsningen bruges til at adskille fibriller og rene overflader og udstyr16.

6. transmissionselektronmikroskopi til måling af soniskerede fibriller

Bemærk: Hvis elektronmikroskopi ikke er mulig, kan en thioflavin T kinetik assay og dynamisk lysspredning anvendes som indirekte målinger af såning effektivitet og atrieflimren størrelse4,14.

  1. Forbered prøver ved hjælp af protokollen fra afsnittet "elektronmikroskopi til atrieflimren visualization" ovenfor.
  2. Brug et transmissions-elektronmikroskop til at tage et billede af fibriller fra 6 til 10 forskellige gitter åbninger.
    Bemærk: billeder skal være en høj nok forstørrelse til at måle fibriller, men lav nok til at visualisere flere fibriller samtidigt. En sidste forstørrelse på ca. 75, 000x bør være tilstrækkelig.
  3. Mål længden af en lille delmængde på mindst 25 fibriller før brug af fibriller i et eksperiment.
    Bemærk: disse målinger kan typisk udføres ved hjælp af den billedbehandlingssoftware, der er forbundet med mikroskop. For hurtig validering, skal den person, der måler vælge repræsentative fibriller og beregne den gennemsnitlige størrelse. Fibril længde bør gennemsnit omkring 50 nm eller mindre, med en mere præcis måling til at følge.
  4. Mål længden af 500 + fibriller for mere omfattende resultater.
    Bemærk: den billedbehandlingssoftware, der er forbundet med mikroskopet, kan bruges til atrieflimren-målinger. Alternativt kan billeder åbnes og fibriller måles med billedbehandling software, ved hjælp af skalaen bar forbundet med hvert billede som en størrelse reference til at sammenligne atrieflimren længder.

7. klargøring af brugerdefinerede glas nåle sprøjter til stereotaktiske injektioner (figur 3)

  1. Der tilsættes ca. 10 mL siliconizing reagens (tabel over materialer) til et rent 50 ml bægerglas.
  2. Anbring glas kapillarrørene (længde 54 mm; udvendig diameter: 0,86 mm; indvendig diameter 0,59 mm) lodret i bægerglasset af siliconizing reagens og tillade kapillar handling at trække siliconizing reagenset op i røret gennem den nedre slange åbning under vandet i siliconizing-reagens.
  3. Pipet yderligere siliconizing reagens i den øvre tube åbning, der ikke er nedsænket i siliconizing reagens til helt at fylde glasset Kapillarrøret.
  4. Kapillarrørene fjernes fra siliconizing reagenset, og de åbne ender af rørene på et papirhåndklæde fjernes for at fjerne siliconizing reagens i rørene. Lad kapillarrørene tørre i mindst 8 timer.
  5. Anbring et Silikoniseret glas kapillar rør i en glasnåle aftrækker (tabel over materialer).
  6. Tænd for varmeelementet og lad de vedlagte vægte til at strække det opvarmede glas Kapillarrøret.
  7. Skær det trukket glas kapillar rør med saks på det tyndeste punkt i midten og fjern glas nålen fra glasset nåle Puller.
    Bemærk: den trak nål indre og udvendige diameter skal være henholdsvis ca 80 og 100 μm. Flere glas nåle kan laves på én gang og opbevares indtil klar til at vedhæfte til en glassprøjte med påsat metalnål (Table of Materials).
  8. Skær en længde af krympe-wrap slange (gennemsnitlig indre diameter 0,021 "og gennemsnitlig vægtykkelse 0,001") til ca 40 mm med en saks. Skub krympe ombrydningen over metal nålen på en 10 μl facet sprøjte (tabel med materialer).
  9. Brug en åben flamme til at varme og overholde krympe wrap til nålen, mens roterende nålen til at anvende varme jævnt.
  10. Skub den store ende af den trukket glasnål forsigtigt over sprøjtens metalnål.
  11. Skær en længde af krympe-wrap slange (gennemsnitlig indre diameter 0,036 "og gennemsnitlig vægtykkelse 0,005") til ca 40 mm med en saks og forsigtigt glide over glas nålen til at overlappe bunden af glas nålen og metalnålen af sprøjten (tabel over Af materialer). Brug en åben flamme til at opvarme krympe-wrap for at sikre glas nålen til metalnålen.
  12. Tilføj et ekstra lag af krympe-wrap for at sikre glas nålen. Skær en længde af krympe-wrap slange (gennemsnitlig indre diameter 0,044 "og gennemsnitlig vægtykkelse 0,005") til ca 40 mm med en saks og forsigtigt glide over glas nålen til at overlappe bunden af glas nålen og metalnålen af sprøjten (tabel over Af materialer). Brug en åben flamme til at opvarme krympe-wrap for at sikre glas nålen til metalnålen.
  13. Trim glas nålen med en saks, så spidsen er ca. 8 mm lang.
    Bemærk: nålen skal være lang nok til at målrette de ønskede hjerneområder (den påkrævede længde afhænger af rygterne/ventral koordinaterne).
  14. Brug trin 7.14.1-7.14.3 til at teste nålen for at forsikre der er ingen lækager, og der er tilstrækkelig flow både i at trække og dispensering væske fra glasset nålen.
    1. Fyld en 1 mL sprøjte med en påsat 26 gauge nål med dH2O.
    2. Fjern metal stemplet fra den brugerdefinerede kanyle sprøjte, og sæt nålen på den fyldte dH2O-sprøjte i bunden af sprøjten. Pres for at dispensere dH2O fra glas nålen. Inspicer grænsefladen af glas nålen og metalnålen for lækager og bekræft en stabil dH2O flow.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan glas nålen trimmes for at øge let flow og yderligere lag af krympe-wrap tilføjet for at lappe eventuelle lækager fra bunden af glasset nålen.
    3. Fyld et mikrocentrifugerør med dH2o. Brug den brugerdefinerede kanyle sprøjte til at trække i DH2o. Undersøg nålen for at bekræfte, at væsken tages i sprøjten, og at der ikke er bobler.
      Bemærk: Hvis der er bobler eller dH2O ikke bliver trukket ind i nålen, trimning nålen kan hjælpe med at lindre trykket.
  15. Opbevar forsigtigt sprøjten med vedlagte glas nåle i sprøjte kasserne, indtil de skal bruges til operationer.
  16. Brug standard stereotaxic kirurgi metoder til intrastriatal levering af PFFs på optimerede koordinater i mus (et sted: AP + 0,2 mm og ML + 2,0 mm fra bregma, DV-2,6 mm fra Dura) eller i rotter (to steder: AP + 1,6 mm og ML + 2,0 mm fra bregma, DV-4,0 fra Dura; AP + 0,1 mm og ml + 4,2 mm fra bregma, DV-5,0 fra Dura)1,14,17.
    Bemærk: disse koordinater er blevet anvendt i C57BL6/C3H-mus og Fischer 344 rotter. Ved brug af andre stammer, bør koordinaterne optimeres.

Representative Results

Dannelsen af fibriler fra α-syn monomerer begynder med bestemmelse af koncentrationen af monomerer. Både BCA assay og måling af absorbans ved 280 Nm (A280) kan anvendes til at måle proteinindhold; BCA assay resultater, dog, foreslog en højere koncentration end A280 metode. PFFs afledt af mus α-syn monomer havde en BCA værdi på 14,05 ± 0,22 og en A280 på 8,05 ± 0,03 μg/μL (figur 1). Ligeledes syntes PFFs afledt af humant α-syn monomer også at være i en højere koncentration med en BCA-værdi på 12,95 ± 0,38 og en A280 på 7,83 ± 0,05 μg/μL (figur 1). A280 målingerne er specifikke for α-syn baseret på inklusionen af ekstinktions koefficienterne, og disse resultater blev brugt til at fortynde monomererne før 7-dages inkubation.

Før inkubationen var væsken indeholdende α-syn monomerer klar, men bør forekomme uklar efter atrieflimren dannelse. Undersøgelse med transmissionselektronmikroskopi bekræftede tilstedeværelsen af lange fibriller, der måler 10-20 Nm bred (figur 4). Til sammenligning var α-syn-monomerer knapt synlige uden nogen mærkbar form (figur 4). Med visuel bekræftelse af fibrillar strukturer, amyloid kropsbygning af fibriller er den næste funktion af pffs, der skal bekræftes ved hjælp af en thioflavin T assay. Thioflavin T udviser forbedret fluorescens ved binding til amyloid; således, øget fluorescerende signal fra prøverne indikerer tilstedeværelsen af amyloid. F. eks. producerede thioflavin i dPBS et signal på 3.287 ± 580 relative fluorescerende enheder (RFU), mus α-syn monomer producerede et signal på 4.174 ± 158 RFU, og muse PFFs producerede et signal på 59.754 ± 6.224 RFU (figur 5). Til sammenligning producerede humant α-syn monomer et lignende signal på 4.158 ± 105 RFU til muse monomer, og humane PFFs producerede et højere signal på 1.235.967 ± 113.747 RFU sammenlignet med muse PFFs (figur 5). For at vurdere tilstedeværelsen af pelleterings fibrils blev der udført en sedimentations analyse. Fibrils vil pille ved centrifugering. I både mus og humane PFF-prøver bør supernatanten have mere protein i pillen end supernatanten (figur 6). I modsætning hertil var størstedelen af proteinet fra mus og humane monomerer til stede i supernatanten, med lidt til stede i pillen (figur 6). Med pffs synligt til stede ved elektronmikroskopi, amyloid strukturer til stede, og fibriller pelletabel, de pffs bestået alle in vitro kvalitetskontrol trin.

Både mus og humane pffs blev soniseret for at producere pffs af passende længder til såning α-syn inklusioner4,18. PFFs blev fortyndet til den ønskede koncentration på 4 μg/μL og soniseret. Umiddelbart før operationen, 25 repræsentative fibriller blev lagret af elektronmikroskopi og måles til spot kontrollere atrieflimren størrelse. Den sonierede muse PFFs målte 48,8 ± 3,1 nm, hvorimod de humane PFFs målte 52,1 ± 4,4 nm i længden; PFFs af begge arter var derfor den passende længde (50 nm eller derunder) til at inducere såning. Mere omfattende undersøgelse af ca 500 fibriller afslørede den gennemsnitlige længde og længde fordeling af sonierede mus fibriller. Den gennemsnitlige længde var 44,4 ± 0,6 nm, med 86,6% af PFFs-målingen 60 nm eller derunder (figur 4). Til sammenligning var humane PFFs i gennemsnit 55,9 ± 1,1 nm med 69,6% af PFFs, der måler 60 nm eller derunder (figur 4).

Efter intrastriatal injektion af soniseret muse pffs til rotter, som tidligere beskrevet3,5, blev en række vævs sektioner behandlet ved 2 måneder efter operationen, når antallet af inklusion, der indeholder neuroner, er kendt for at toppe i til bekræftelse af fosforylerede α-syn-inklusioner5. Inklusion bærende neuroner, som indikeret ved immunhistokemiske farvning for psyn (antistof i tabel af materialer) er til stede i snpc (figur 7), samt andre regioner i hele hjernen, som innerverer striatum (anterior olfaktoriske kerne, motor, cingulate, Piriform, prelimbic, somatosensoriske, entorhinal, og økarakter cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Disse inklusioner deler lignende egenskaber med Lewy kroppe, såsom bindende thioflavin S, og modstand af total α-syn til proteinase K (figur 7), som påvist ved immunohistokemisk farvning (antistof og proteinase k i tabel over materialer) . Bekræftelse af såning i hjernen indikerer, at in vivo kvalitetskontrollen er bestået, og aliquoter af PFFs, der tidligere er frosset og gemt fra samme batch, kan sonieres under identiske parametre, med længder valideret, i større eksperimenter.

Figure 1
Figur 1 . Metoder til generering af α-syn fibrils. Skitse af de trin, der kræves for at producere fibriller fra α-syn monomerer. Monomerer centrifugeres i 10 min. (15.000 x gved 4 °c). Supernatant overføres til et rent rør, og proteinkoncentrationen bestemmes enten ved absorbans ved 280 Nm eller ved en BCA-analyse. Grafen viser koncentrationer fra humane og mus α-syn monomerer. Kolonner angiver, at gruppen betyder, at fejllinjer repræsenterer ± 1 standardfejl i middelværdien. Efter at proteinkoncentrationen er fastlagt, fortyndes α-syn monomerer, kort hvirvlede og inkueres til 37 °C i 7 dage, mens der rystes på en orbitalmixer indstillet til 1.000 RPM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Farvningsmetoder til transmission elektronmikroskopi. Diagram over negativ farvning af elektronmikroskopi. A) billeder, der afbilder elektronmikroskopi prøve gitre. Gitteret har en kedelig eller lys side og en skinnende eller mørk side. Den skinnende/mørke side er belagt med en formvar/Carbon støtte film. B) illustration af farvnings procedure. Gitteret er flød skinnende/mørk side ned på den første dråbe af ddH2O i 1 min og det overskydende er ugudeligt væk med filtrerpapir. Processen gentages med den anden dråbe af ddH2o, fortyndede pffs eller monomerer, to dråber uranylnitrat acetat og to yderligere dråber DDH2o. gitre kan lagres i en gitter boks, indtil de bliver indpakket. Skala stang = 3 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Montering af brugerdefinerede glas nåle sprøjter. Diagram over de trin, der kræves for at montere glas nåle tilsluttede sprøjter. Siliconized glas kapillar rør er trukket og skåret i midten for at producere glas nåle. Krympe wrap slange bruges til at forberede metal nålen og danne en indre forsegling, når glasset nålen er gled på metal nålen. To ekstra lag af krympe-wrap slange, der overlapper bunden af glasset nålen og metalnålen er fortløbende tilsættes og varme påføres for at sikre glas nålen og danne en vand-tæt forsegling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Visualisering af α-syn monomerer og α-syn fibriller via transmission elektronmikroskopi. Repræsentative mikrografier af α-syn monomerer og fibriler. Toppaneler: mus og humant α-syn monomer. Midterste paneler: fuld længde mus og menneskelige α-syn PFFs. bund paneler: mus og humant α-syn PFFs efter sonikering. Bund graf: distribution af soniseret mus og humane α-syn PFF længder. Skala stang = 500 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Bekræftelse af amyloid strukturer ved thioflavin T-assay. Måling af fluorescerende signal fra mus og humane α-syn monomer og PFF prøver. Venstre: resultater fra mus α-syn monomerer og α-syn PFFs. Til højre: resultater fra humane α-syn monomerer og α-syn PFFs. Der vises en dPBS-negativ kontrol i hver graf. Alle målinger udtrykkes som relative fluorescerende enheder (RFU). Kolonner angiver, at gruppen betyder, at fejllinjer repræsenterer ± 1 standardfejl i middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Sedimentations analyse til pelletabel α-syn. billeder fra Coomassie farvede geler. Bands vist er på ca 14 kDa baseret på protein stigen. Venstre: mus monomer og PFFs. Til højre: humane monomerer og PFFs. For alle monomer-og PFF-prøver vises den opslæmmede pellet (P) og supernatanten (S). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Funktioner af inklusioner i rotte model bekræfter α-syn patologi. Repræsentative mikrografer fra substantia nigra pars Compacta på 2 måneder efter injektion. Venstre: neuroner, der indeholder psyn og kontra plettet med cresy violet. Midten: Thioflavin S positive neuroner. Til højre: α-syn-holdige inklusioner resistente over for proteinase K. Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Produktion af α-syn PFFs i stand til såning neuroner og fører til Lewy Body-lignende inklusioner er afhængig af flere faktorer og trin. En afgørende faktor er, at de monomerer, der anvendes til at generere fibriller, skal være specifikt formuleret til fibrilization4,9,14,15. Hvis monomererne ikke er formuleret til fibrilization, kan fibriller ikke dannes, eller de fibrider, der gør form, må ikke producere α-syn patologi. Ligeledes, bufferen, at monomererne er i også indflydelse fibrilization. For at få de bedste resultater bør saltkoncentrationen derfor være ca. 100 mM NaCl og pH mellem 7,0 og 7,3. Et første skridt, der introducerer variabilitet, er den metode, hvorved det oprindelige proteinindhold bestemmes, idet målingen på A280 sandsynligvis vil give mere nøjagtige resultater og derfor er den foretrukne metode. Uoverensstemmelsen i proteinkoncentrationen kan mindske effekten af fibrilization processen, samt ændre den formodede PFF koncentration, der anvendes i eksperimenter. Begge kunne føre til et fald i såning effektivitet og batch variation mellem eksperimenter.

Indledende kvalitetskontrol trin vil bekræfte kritiske egenskaber af PFFs, specifikt at de har en fibrillær konformation (elektronmikroskopi), indeholder amyloid strukturer (thioflavin T assay), og er pelletabel (sedimentation assay). Det er vigtigt at bemærke, at resultaterne af thioflavin T-analysen vil svinge med tiden og ikke er en direkte målestok for mængden af amyloid strukturer til stede, snarere, thioflavin T assay bør kun anvendes som en indikator for amyloid strukturer tilstedeværelse inden for prøven. Thioflavin T anvendes typisk i in vitro-assays, såsom førnævnte analyse for at vise fibriller indeholder amyloid strukturer. Alternativt, thioflavin S anvendes i væv til at detektere amyloid strukturer, som vist i figur 7. Med hensyn til sedimentations analysen viser resultaterne kun, at PFFs overvejende findes i pelleterings fraktionen. Da prøverne udføres under Denaturerings betingelser, findes der et enkelt fremtrædende bånd på ca. 14 kDa, størrelsen af α-syn monomerer, på gelene. Dette er i modsætning til de mange bånd til stede ved højere molekylære vægte, der ville være forventet med PFFs, hvis en indfødt eller ikke-Denaturerings gel blev brugt. Endelig er en vellykket gennemgang af alle disse første kvalitetskontrol trin ikke en garanti for, at der er en sådan aktivitet. Af denne grund bør forsøg med cellekulturer eller en lille kohorte af kirurgisk indskudte dyr anvendes til at teste effekten af PFFs, før de anvendes i større forsøg.

Sonikering er et afgørende skridt i processen, og parametrene vil variere afhængigt af den model af sonicator, der anvendes. Sonikering parametre skal anvendes og verificeres for at vise, at korte PFF fragmenter er blevet produceret. Fibril størrelse har indflydelse på såning, med kortere fibriller såning mere effektivt. Selvom kortere fibriller frø mere effektivt, denne effekt plateauer og den optimale PFF længde er ca 50 nm4,18. Det er også vigtigt ikke at over-sonikatere prøverne og udsætte PFFs for overdreven varme, da dette kan mindske såning effektivitet. Disse sonierede PFFs skal testes for effekt i små cellekulturer eller in vivo-eksperimenter før brug i større eksperimenter. Da forskellige sonikering sessioner har potentiale til at indføre variation, bør eksperimentelle behandlingsgrupper planlægges i overensstemmelse hermed.

Ved levering af pffs in vivo kan lokaliseringen af injektionsstedet (-erne) og den samlede mængde pffs, der anvendes, påvirke antallet af neuroner, der vil udvikle inklusioner samt omfanget af neurodegeneration7,14. Koordinaterne i protokollen giver et sted at starte, men bør testes i laboratoriet for at sikre, at den ønskede målregion udvikler α-syn patologi før brug i store eksperimenter. Hvis det ønskes, kan sporing farvestof eller fluorescerende perler bruges som en måde at teste regional målretning før du bruger PFFs. Mængden af pffs, der anvendes in vivo, varierer mellem grupperne, idet de fleste grupper anvender en total på mellem 5 og 20 μg pffs ved en eller delt mellem to injektionssteder1,2,3,4,5 , 6 af , 7 af , 14. da antallet af injektionssteder, placering af injektionssteder og mængden af injicerede pffs kan påvirke resultaterne og progressionen af synukleinopati, bør downstream-resultaterne af de anvendte parametre karakteriseres, før modellen anvendes til at afprøve potentielle interventioner eller undersøge modellens tidsmæssige karakteristika.

Når du vælger en model til at bruge til afprøvning af terapeutisk eller studere sygdomsprogression, bør den anvendte model vælges for bedst at besvare det stillede spørgsmål. Ikke alle modeller vil besidde visse sygdoms funktioner i PD, eller tilbyde den tidsramme, der er nødvendig for at afprøve potentielle interventioner. PFF-modellen genberegner de vigtigste egenskaber ved PD, såsom α-syn patologi og neurodegeneration, og kan føre til beskedne motoriske funktionsnedsættelser. Modellen tilbyder et forudsigeligt og langvarigt tidsforløb, hvor inklusioner danner måneder før neurodegeneration. Dette giver forskerne mulighed for at undersøge og udnytte de forskellige faser i hele den langvarige progression af synukleinopati. Den nuværende og fremtidige anvendelse af modellen generelt forventes at være gavnlig i studiet af sygdomsprogression og udvikling af nye terapier.

Disclosures

Joseph Patterson, Kelvin Luk, og Caryl Sortwell er i øjeblikket involveret i kontraktlige arrangementer med Michael J. Fox Foundation til kvalitetskontrol α-syn materiale genereret af Proteos, Inc. Coauthor Nicole Polinski, er en medarbejder i Michael J. Fox Institut, som har indgået kontrakt med Proteos, Inc. om at fremstille α-syn monomer. Coforfattere Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley, og Nicholas Kanaan har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af tilskud fra Michael J. Fox Foundation, National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde (NS099416) og Weston Brain Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline Thermo Fisher (Gibco) 14190144
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody Abcam AB184674
Anti-alpha-synuclein antibody Abcam AB15530
Bicinchonic acid Thermo Fisher (Pierce) PI23228
Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) Nordson Medical 103-0143
Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) Nordson Medical 103-0296
Copper sulfate Thermo Fisher (Pierce) PI23224
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 2231000574
Eppendorf ThermoTop heated lid Eppendorf 5308000003
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids Eletron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) Drummond 22-326223
Glass needle puller Narishige PC-10
Hamilton syringe Hamilton 80000
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils Proteos RP-003
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils Proteos RP-009
Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) Nordson Medical 103-0152
Parafilm M Sigma-Aldrich P7543
Proteinase K Invitrogen 25530015
Qsonica 3.2 mm tip Qsonica 4422
Qsonica Q125 sonicator Qsonica Q125
Thioflavin S Sigma-Aldrich T1892
Thioflavin T EMD Millipore 596200
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit Genscript L00350C
Uranyl acetate Eletron Microscopy Sciences 22400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  2. Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
  3. Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
  4. Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
  5. Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).
  6. Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).
  7. Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
  8. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
  9. Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
  10. Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
  11. Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
  12. Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
  13. Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).
  14. Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
  15. Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
  16. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788 (2018).
  17. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
  18. Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
  19. Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).

Tags

Neurovidenskab alpha-Synuclein monomerer præformerede Fibrils Parkinsons sygdom kvalitetskontrol Stereotaxic kirurgi
Generering af alpha-Synuclein præformerede Fibrils fra monomerer og brug in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, J. R., Polinski, N. K.,… More

Patterson, J. R., Polinski, N. K., Duffy, M. F., Kemp, C. J., Luk, K. C., Volpicelli-Daley, L. A., Kanaan, N. M., Sortwell, C. E. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e59758, doi:10.3791/59758 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter