Summary
Målet med denne artikkelen er å skissere trinnene som kreves for generering av fibrils fra monomere Alpha-synuclein, påfølgende kvalitetskontroll, og bruk av preformed fibrils in vivo.
Abstract
Bruk av in vivo Alpha-synuclein preformed fibril (α-syn PFF) modell av synucleinopathy blir stadig mer populært blant forskere som mål å modellere Parkinsons sykdom synucleinopathy og nigrostriatal degenerasjon. Standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo-programmet er avgjørende for å sikre konsistent, robust α-syn patologi. Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av fibrils fra monomere α-syn, post-fibrilization kvalitetskontroll trinn, og foreslåtte parametre for vellykket nevrokirurgisk injeksjon av α-syn PFFs til rotter eller mus. Fra og med monomere α-syn oppstår fibrilization over en 7-dagers inkubasjonsperiode mens risting ved optimale buffer forhold, konsentrasjon og temperatur. Post-fibrilization kvalitetskontroll er vurdert av tilstedeværelsen av pelletable fibrils via sedimentering analysen, dannelsen av amyloid konformasjon i fibrils med en thioflavin T-analysen, og elektron mikroskopisk visualisering av fibrils. Mens vellykket validering ved hjelp av disse analysene er nødvendig for å lykkes, er de ikke tilstrekkelig til å garantere PFFs vil frø α-syn inkluderinger i neurons, slik aggregering aktivitet av hver PFF batch bør testes i cellekultur eller pilot dyr kohorter. Før bruk, PFFs må sonikert under nøyaktig standardiserte forhold, etterfulgt av undersøkelse ved hjelp av elektron mikroskopi eller dynamisk lysspredning for å bekrefte fibril lengder er innenfor optimal størrelse rekkevidde, med en gjennomsnittlig lengde på 50 NM. PFFs kan deretter legges til cellekultur medier eller brukes i dyr. Patologi oppdages av immunostaining for fosforylert α-syn (psyn; Serine 129) er åpenbare dager eller uker senere i cellekultur og gnager modeller.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er primært preget postmortem av to store patologiske funksjoner: utbredt og progressiv Alpha-synuclein (α-syn) patologi, og nigrostriatal degenerasjon. Etter injeksjon i wildtype mus eller rotter, α-syn preformed fibrils (PFFs) induserer progressiv akkumulering av patologisk α-syn, noe som kan resultere i langvarige degenerasjon av substantia Nigra Pars compacta (SNpc) dopamin neurons i løpet av mange måneder, samt Sensorimotor underskudd1,2,3,4,5,6. Neurons er eksponert for α-syn fibrils, enten via direkte intracerebrale injeksjon eller lagt til Media av kulturperler neurons. Når PFFs er tatt inn i neurons, den PFFs handle for å "Seed" dannelsen av inkluderinger gjennom templating, og akkumulering av endogene α-syn i fosforylert inkluderinger1,7,8, 9i. Inkluderinger dele lignende egenskaper til Lewy organer: inneholder α-syn fosforylert på Serine 129 (pSyn), ubiquitin, og p62; besitter amyloid kvartær strukturer som vist med positiv thioflavin farging; og er motstandsdyktig mot proteinase K fordøyelse1,3,5,7,8,9,10,11, det er 12. PFF eksponering fører til α-syn inkludering formasjon i primær og noen udødeliggjort neurons i kultur, så vel som mus, rotter, og ikke-menneskelige primater i vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det er viktig å merke seg at PFFs ikke vil føre til α-syn inkludering formasjon i alle cellekultur modeller og noen kultivert neurons vil frø bedre enn andre.
En annen viktig funksjon i in vivo α-syn PFF modellen er den distinkte sekvensielle patologiske faser som dukker opp over flere måneder. I gnagere, etter intrastriatal injeksjon, α-syn inkludering formasjon generelt topper i SNpc og mange kortikale regioner innen 1-2 måneder. Denne aggregering peak etterfølges av nigrostriatal degenerasjon ≈ 2-4 måneder senere1,3,5. Disse distinkte patologiske stadier gir forskere plattformen som å studere og utvikle strategier som 1) redusere α-syn aggregering, 2) klart allerede dannet α-syn inkluderinger, og/eller 3) hindre påfølgende neurodegeneration. PFF modellen tilbyr distinkte fordeler og ulemper i forhold til neurotoxicant, transgene, og viral vektor mediert α-syn overuttrykte modeller som tidligere gjennomgått6. Valget av hvilken modell eller tilnærming til å ta bør bestemmes av hvilken modell som passer best til spørsmålet etterforskerne spør.
Selv om PFF modellen har blitt utnyttet av mange laboratorier, er det fortsatt grupper som har opplevd uoverensstemmelser med å generere fibrils og produsere konsistent α-syn patologi14. Eksempler på inkonsekvenser spenner fra PFFs som produserer lite eller ingen α-syn patologi, batch til batch seeding effektivitet, og selv svikt i fibrils å danne. Dermed er standardisering av α-syn PFF generasjon og in vivo søknad avgjørende for å muliggjøre nøyaktige tolkninger om virkningen av romanen terapeutiske intervensjoner. Følgende protokoll skisserer trinnene som kreves for generering av PFFs fra α-syn-monomerer, kvalitetskontroll av PFFs-en gang dannet, sonikering og måling av PFFs før bruk, og forslag for å muliggjøre vellykket in vivo-injeksjon av PFFs til rotter eller mus.
Protocol
Alle metoder som involverer dyr har blitt godkjent av Michigan State University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. dannelse av α-synuclein preformed fibrils fra monomerer (figur 1)
- Tin α-synuclein monomerer på isen, forsiktig resuspend ved å sveipe røret, og sentrifuger ved 15 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
Merk: α-syn-monomer må være spesielt formulert for fibrilization. Rekombinant monomerer kan kjøpes fra kommersielle kilder eller genereres av protokoller på stedet4,9,14,15. Hvis det kjøpes fra kommersielle kilder, må produktet opplyse om at α-syn-monomer er spesielt for generering av fibrils. Uansett om monomerer er kjøpt eller generert på stedet, bør kvalitetskontroll trinnene skissert nedenfor utføres med hvert parti for å sikre fibrils har dannet og vil frø effektivt før bruk i eksperimenter. - Overfør supernatanten til en ren 1,5 mL mikrosentrifugen tube og registrere det overførte beløpet.
Merk: Vær forsiktig for å unngå pellet, som, hvis den er til stede, vil være små. - Mål protein konsentrasjonen av de overførte supernatanten ved enten en standard bicinchoninic acid analysen (BCA), eller måle absorbansen ved 280 NM med en microvolume spektrofotometer.
Merk: BCA-analysen er ikke så nøyaktig for den spesifikke målingen av α-syn og kan gi resultater overestimating proteinkonsentrasjon. Som et resultat, måle absorbansen ved 280 NM er den anbefalte metoden for å bestemme proteinkonsentrasjon.- For å måle med BCA analysen, følger standard BCA protokoller og opptre med tre forskjellige fortynninger av α-syn monomer. Foreslåtte fortynninger er 1:25, 1:50 og 1:100.
- For å måle med A280-metoden, blank leseren med steril 1x Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (dPBS) uten kalsium og magnesium, med en saltkonsentrasjon på ca 100 mM NaCl, og pH-område 7.0-7.3 (tabell av materialer).
- Tilsett 2 μL av prøven til leseren og Les absorbansen ved 280 NM.
- Bruk Beer-Lambert-loven til å bestemme konsentrasjonen av monomerer.
Merk: utryddelse koeffisient ε for Human α-syn er 5 960 M-1cm-1 og for mus α-syn er 7 450 M1cm-1. Veilengde måles i cm. Molekylvekten av α-syn (14 kDa) er anslått til å anta 1 da = 1 g/mol.
- Fortynne monomerer med 1x dPBS til en endelig konsentrasjon på 5 mg/mL. Bruk ligningen nedenfor til å beregne hvor mye 1x dPBS som er lagt til for å fortynne monomerer.
Merk: alle konsentrasjoner er i mg/mL, og volumer i μL. monomer fortynninger bør utføres med 1x dPBS. Totalt volum som brukes til å generere fibrils bør være mellom 100 og 500 μL for å oppnå reproduserbar fibrilization resultater. - Kort Vortex å mikse, og sentrifuger for å samle all væske i bunnen av røret. Alikvot monomerer for kvalitetskontroll sammenligning med fibrils som angitt i trinn 1.8.1-1.8.4.
- Bruk en tube Lock eller voks/plastfilm (tabell av materialer) for å feste mikrosentrifugen røret lokket lukket.
- Plasser røret i en orbital thermomixer med lokk i 7 dager ved 37 ° c, risting ved 1 000 RPM (tabell av materialer).
Merk: på slutten av 7 dager, innholdet i røret skal vises grumsete. Thermomixer må ha et lokk for å hindre kondens dannelse på rørlokkene. - Knips forsiktig på røret for å resuspend α-syn-fibrils. Alikvot fibrils for følgende kvalitetskontroll trinn som angitt i trinn 1.8.1-1.8.4.
Merk: fibrils for kvalitetskontroll trinn kan lagres ved RT over natten.- Alikvot 6 μL for sedimentering analysen.
- Alikvot 5 μL for thioflavin T-binding-analysen.
- Alikvot 2 μL for overføring elektron mikroskopi for fibril visualisering.
- Alikvot minst 10 μL for endotoksin analysen.
Merk: for endotoksin-analysen brukes en kommersiell Limulus amebocyte Lysat (LAL), etter produsentens anvisninger (tabell av materialer). Endotoksin nivåer bør være ≤ 0,5 endotoksin enheter/mL for fibrils. En endotoksin fjerning Kit kan brukes hvis dette kriteriet ikke er oppfylt.
- Alikvot de resterende fibrils og lagre. For langtidsoppbevaring (12-18 måneder), fryser du raskt på tørr is og lagrer ved-80 ° c.
Merk: beløpet som skal alikvot, avhenger av ønsket nedstrøms anvendelse. In vivo-bruk krever vanligvis mer fibrils ved høyere konsentrasjoner enn in vitro-bruk, og alikvot volumer bør planlegges i henhold til dette. Fibrils skal oppbevares mot baksiden av fryseren for å forhindre skade fra potensiell fryse/tine. Protokollen kan stanses midlertidig her.
2. sedimentering analysen
- I en ren mikrosentrifugen tube, tilsett 6 μL av PFF til 54 μL av dPBS å fortynne fibrils 1:10, og Pipet å blande.
- I et separat rør, tilsett 6 μL av monomer til 54 μL av dPBS som en ekstra kontroll.
- Sentrifuge prøver ved 10 000 x g i 30 min ved RT og Overfør supernatanten til et rent mikrosentrifugen rør.
- Tilsett 60 μL av dPBS til den resterende pellet og Vortex til resuspend.
- Tilsett 30 μL av 3x prøve buffer (140 μL av 50% glyserol/0,1% bromophenol blå, 40 μL av 10% SDS og 20 μL av β-mercaptoethanol) til hvert rør og Vortex å blande.
- Ruge prøver ved 100 ° c i 10 min og la avkjøles i 5 min på isen.
- Bruk en standard natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) protokoll for å skille protein av massen. Bruk en protein stige med et område som inkluderer 14 kDa (størrelsen bandet forventet for monomere α-syn).
- Overfør gelen til en farge rett og dekk til gelen med Coomassie blå flekk (0,1% Coomassie brilliant blå, 20% metanol etter volum, og 10% eddiksyre etter volum i ddH2O). Ruge for 3 timer ved RT mens risting.
- Hell av Coomassie blå flekken og tilsett nok destain (50% metanol etter volum, og 10% eddiksyre etter volum i ddH2O) for å dekke gelen. Ruge i 30 min ved RT mens risting.
- Hell av destain og gjenta destain trinnet til gelen er klar og band er synlige.
- Vask gelen 3 ganger i 5 minutter hver ved risting i ddH2O og image gelen.
3. Transmission elektron mikroskopi for fibril visualisering
- Veie 20 mg uranylnitratet acetate i et mikrosentrifugen rør og tilsett 1 mL ddH2O for å lage en 2% vandig oppløsning. Vortex til uranylnitratet acetate er i løsning, og tillate å sitte over natten.
Merk: Uranylnitratet acetate bør gjøres dagen før du forbereder prøver for overføring elektron mikroskopi. Eksponering for lys eller agitasjon kan føre til at uranylnitratet acetate å utløse, slik, røret inneholder uranylnitratet acetate løsningen skal dekkes i aluminiumsfolie, oppbevares på et mørkt sted, og ikke rystet etter uranylnitratet acetate er i løsning. - Tilsett 2 μL av PFF til 98 μL av dPBS for å fortynne fibrils 1:50, og deretter Pipet å blande.
- Forbered en ren voks/plastfilm (tabell over materialer) dekket overflate (ca 50 mm x 50 mm) på benken toppen. På ren voks/plastfilm (tabell av materialer), legger du til følgende (figur 2).
- Tilsett 4 x 10 μL dråper av ddH2O.
- Tilsett 1 x 10 μL dråpe fortynnet fibrils eller monomer prøve.
- Tilsett 2 x 10 μL dråper 2% uranylnitratet acetate.
- Bruk fine-tippet tang for å plukke opp en formbar/karbon belagt, mesh kobber overføring elektron mikroskopi rutenett (tabell av materialer).
Merk: Pass på å bare plukke opp rutenettet ved kanten, unngår mesh delen i midten (figur 2A). Hvis pinsett berører mesh, formbar/Carbon belagt film vil bli skadet, noe som gjør Imaging i det området av nettet umulig. - Float rutenettet formbar/Carbon belagt side (blanke siden) ned på den første dråpe ddH2o. forsiktig bruk Tangen for å holde rutenettet og trykk ned for å sikre at hele den belagte overflaten er i kontakt med ddH2o. La rutenettet flyte i 1 min.
- Plukk opp rutenettet, og uten å berøre mesh delen av rutenettet, Wick bort ddH2O med filter papir.
- Float rutenettet som ovenfor på den andre dråpe ddH2o i 1 min og Wick bort ddH2o.
- Float rutenettet på dråpe fortynnet fibrils i 1 min og isolere bort overflødig som ovenfor.
- Float rutenettet på den første dråpe uranylnitratet acetate i 1 min og isolere bort overflødig.
- Float rutenettet på den andre dråpe uranylnitratet acetate i 1 min, Wick bort overflødig.
- Float rutenettet som ovenfor på den tredje dråpe ddH2o kort og Wick bort ddH2o.
- Float rutenettet som ovenfor på den fjerde dråpe ddH2o kort og Wick bort ddH2o, å være sikker på å fjerne så mye ddH2o som mulig.
- Overfør til en rutenett boks for lagring til avbildning.
Merk: rutenett skal tørke i minst 5 minutter før bildebehandling. Rutenett kan bli avbildet i minst et år etter tilberedning og bør oppbevares i et tørt miljø.
4. Thioflavin T-analysen
- I en ren mikrosentrifugen tube, tilsett 5 μL av PFF til 245 μL av dPBS å fortynne fibrils 1:50, og Pipet å blande.
- Tilsett 250 μL av dPBS til et separat mikrosentrifugen rør for å tjene som en negativ kontroll.
- Tilsett 5 μL av monomer til 245 μL av dPBS for å fungere som monomer kontroll.
- Tilsett 250 μL av thioflavin T i Glycine buffer (25 μM thioflavin T, 100 mM Glycine, 1% Triton X-100, pH 8,5) til hver prøve og bland forsiktig.
- Pipet 2 replikerer, 200 μL hver, i en svart 96 brønn plate. Hold platen i mørket for å hindre photobleaching.
- Ruge for 1 time ved RT og Les platen med en eksitasjon på 450 nm og utslipp på 510 NM.
Merk: Thioflavin T-avlesninger vil svinge over tid. Prøvene bør leses på samme inkubasjonstid. Hvis ønskelig, kan flere avlesninger tas i løpet av timen inkubasjons og plottet over tid.
5. sonikering av α-synuclein preformed fibrils
FORSIKTIG: sonicator og alle sonikering utføres i en kultur hette for å hindre eksponering for fibrils som kan aerosolize under sonikering. Personellet som utfører sonikering, bør bruke personlig verneutstyr, inkludert hansker, beskyttelse av klær i form av en Laboratoriefrakk, og et ansiktsskjold mens sonikere. Risiko for fibril eksponering kan reduseres ved sonikere med en kopp horn sonicator, slik at røret som inneholder fibrils å forbli lukket under sonikering.
Merk: optimale sonikering parametre for fibrils er avhengig av modell av sonicator som brukes. Av denne grunn må noen optimalisering utføres for å sikre at fibrils har riktig størrelse. Sonicator som brukes, finner du i materialfortegnelsen og parametrene som er skissert er basert på tidligere resultater med denne modellen av sonicator. Parametrene nedenfor vil fungere for 2-4 μg/μL av PFFs i 200-400 μL oppløsning. Test sonikering med instrumentet bør utføres og fibrils analyseres for å sikre at ønskede resultater oppnås før bruk av PFFs i eksperimenter.
- Fest en 3,2 mm diameter sonde (tabell av materialer) til omformeren, og angi sonicator parametrene som angitt nedenfor i trinn 5.1.1-5.1.3.
- Sett amplitude til 30%.
- Sett pulsen til 01 01 (1 s på; 1 s av).
- Still klokken til 0:01:00.
Merk: 1 min av pulserende tilsvarer 60 pulser, og denne modellen av sonicator (tabell over materialer) vil stoppe automatisk. Med andre sonicator modeller må antall pulser telles.
- Tin fibrils ved RT og fortynne med steril dPBS i en kultur hette.
Merk: en klar 0,6 mL mikrosentrifugen tube fungerer best for sonikering og den endelige fibril konsentrasjonen avhenger av tiltenkt bruk. Representative resultater som vises er fra en endelig fibril konsentrasjon på 4 μg/μL. - Tørk av proben på sonicator med et laboratorie vev som er fuktet med 70% etanol for å rengjøre proben. Senk tuppen av proben i ddH2O og Pulse 10 ganger for å rengjøre proben ytterligere, og tørk deretter med et laboratorie vev.
- Plasser sonde spissen i røret med fortynnet fibrils, og plasser spissen i bunnen av røret.
- Sonikere for 60 pulser (1 s på; 1 s av). Beveg sonden opp og ned under hver puls for å sikre at alle fibrils i væsken er sonikert. og ren.
- Etter 60 pulser, Fjern sonden fra PFFs, og tilsett 2 μL av PFF til 98 μL av dPBS i et rent mikrosentrifugen rør for å fortynne fibrils 1:50 for sonikert fibril måling ved elektron mikroskopi.
Merk: ideelt sett bør en liten undergruppe av fibrils måles før in vivo-injeksjon og en mer omfattende måling av fibrils som utføres når tiden tillater det. - Etter sonikering, kort sentrifuge PFFs for 1 s ved 2 000 x g for å samle all væske på sidene av røret.
FORSIKTIG: Hvis røret blir varmt å ta på, stopp sonikere etter 30 pulser, vent 1 min, og sonikere for de siste 30 pulser.
Merk: mens sonikere, hold sonde spissen mot bunnen av væsken ved starten av hver puls, for nær toppen av væsken vil føre til tap av prøver. - Senk sonde spissen i 1% SDS og puls 10 ganger for å rengjøre proben. Fjern spissen fra SDS, Senk i ddH2O og Pulse 10 ganger.
- Tørk av proben med et laboratorie vev som er fuktet med 70% etanol, og tørk deretter sonden med et tørt laboratorie vev. Løsne sonden fra omformeren og oppbevar.
- Tørk ned alle overflater i hetten med 1% SDS, etterfulgt av 70% etanol.
Merk: 1% SDS-løsningen brukes til å distansere fibrils og rene overflater og utstyr16.
6. overførings elektron mikroskopi for måling av sonikert fibrils
Merk: Hvis elektron mikroskopi ikke er gjennomførbart, kan en thioflavin T Kinetics-analyse og dynamisk lysspredning brukes som indirekte målinger av seeding effektivitet og fibril størrelse4,14.
- Klargjør prøver ved hjelp av protokollen fra delen "Electron mikroskopi for fibril visualisering" ovenfor.
- Bruk et overførings elektronmikroskop for å ta et bilde av fibrils fra 6 til 10 forskjellige rutenett åpninger.
Merk: bilder bør være en høy nok forstørrelse til å måle fibrils, men lav nok til å visualisere flere fibrils samtidig. En siste forstørrelse på ca 75, 000x bør være tilstrekkelig. - Mål lengden på en mindre undergruppe på minst 25 fibrils før du bruker fibrils i et eksperiment.
Merk: disse målingene kan vanligvis utføres ved hjelp av bilde programvaren som er knyttet til mikroskopet. For rask validering bør personen som måler velge representative fibrils og beregne gjennomsnitts størrelsen. Fibril lengde bør gjennomsnittlig rundt 50 NM eller mindre, med en mer nøyaktig måling å følge. - Mål lengden på 500 + fibrils for mer omfattende resultater.
Merk: bildebehandlingsprogram varen som er tilknyttet mikroskopet, kan brukes til fibril målinger. Alternativt kan bilder åpnes og fibrils måles med bildebehandling programvare, ved hjelp av skalaen bar forbundet med hvert bilde som en størrelse referanse som å sammenligne fibril lengder.
7. utarbeidelse av tilpassede glass nål sprøyter for stereotactic injeksjoner (Figur 3)
- Tilsett ca. 10 mL siliconizing reagens (materialfortegnelsen) i et rent 50 ml beger.
- Plasser glass kapillærrør (lengde på 54 mm; ytre diameter: 0,86 mm; indre diameter 0,59 mm) vertikalt i begeret med siliconizing reagens og la kapillær aksjon for å trekke siliconizing reagens opp røret gjennom den nedre rør åpningen nedsenket i siliconizing reagens.
- Pipet ytterligere siliconizing reagens i den øvre rør åpningen som ikke er nedsenket i siliconizing reagens for å fylle glass kapillærrøret helt.
- Fjern kapillær rørene fra siliconizing reagens og blot de åpne endene av rørene på et papir håndkle for å fjerne siliconizing reagens i rørene. La kapillærrør tørke i minst 8 timer.
- Plasser et silikonbehandlet glass kapillærrør i en avtrekker med glass nål (tabell med materialer).
- Slå på varmeelementet og la de vedlagte vektene strekke det oppvarmede glass kapillærrøret.
- Skjær det trakk glass kapillærrøret med saks på det tynneste punktet i midten og fjern glass nålen fra glass nålen avtrekker.
Merk: den trekkes nålen indre og ytre diameter bør være ca 80 og 100 μm, henholdsvis. Flere glass nåler kan gjøres på en gang og lagres til klar til å feste til en glass sprøyte med vedlagt metall nål (tabell av materialer). - Skjær en lengde på krympe-wrap slange (gjennomsnittlig indre diameter 0,021 "og gjennomsnittlig veggtykkelse 0,001") til ca 40 mm med saks. Skyv krymper vikle over metall nålen på en 10 μL skrå sprøyte (tabell av materialer).
- Bruk en åpen flamme for å varme opp og fest krymper til nålen mens du roterer nålen for å påføre varme jevnt.
- Skyv den største enden av den trekkes nålen forsiktig over metall nålen på sprøyten.
- Skjær en lengde på krympe-wrap rør (gjennomsnittlig indre diameter 0,036 "og gjennomsnittlig veggtykkelse 0,005") til ca 40 mm med saks og forsiktig skyver over glass nål for å overlappe bunnen av glass nålen og metall nålen på sprøyten (tabell over Materialer). Bruk en åpen flamme for å varme opp krympe-wrap for å feste glass nålen til metall nålen.
- Legg til et ekstra lag med krymper for å feste glass nålen. Skjær en lengde på krympe-wrap rør (gjennomsnittlig indre diameter 0,044 "og gjennomsnittlig veggtykkelse 0,005") til ca 40 mm med saks og forsiktig skyver over glass nål for å overlappe bunnen av glass nålen og metall nålen på sprøyten (tabell over Materialer). Bruk en åpen flamme for å varme opp krympe-wrap for å feste glass nålen til metall nålen.
- Trim glass nålen med saks, slik at spissen er ca 8 mm lang.
Merk: nålen må være lang nok til å målrette de ønskede hjerne regionene (nødvendig lengde er avhengig av rygg/ventrale koordinater). - Bruk trinn 7.14.1-7.14.3 for å teste nålen for å sikre at det ikke er lekkasjer, og det er tilstrekkelig Flow både i å trekke ut og dispenser væske fra glass nålen.
- Fyll en 1 mL sprøyte med vedlagt 26 gauge nål med dH2O.
- Fjern metall stempelet fra den egendefinerte glass nål sprøyten og sett nålen på dH2O fylt sprøyte inn i sprøyten. Påfør Trykk for å dispensere dH2O fra glass nålen. Inspiser grensesnittet på glass nålen og metall nålen for lekkasjer og Bekreft en jevn dH2O Flow.
Merk: Hvis det er nødvendig, kan glass nålen beskjæres for å øke den enkle flyten og flere lag av krympe-wrap lagt til patch eventuelle lekkasjer fra undersiden av glass nålen. - Fyll et mikrosentrifugen rør med dH2o. Bruk den tilpassede glass nål sprøyten til å tegne i dH2o. Inspiser nålen for å bekrefte at væsken blir tatt inn i sprøyten og at det ikke er bobler.
Merk: Hvis det er bobler eller dH2O ikke trekkes inn i nålen, kan trimming av nålen bidra til å lindre trykket.
- Oppbevar sprøyten forsiktig med vedlagte glass nåler i sprøyte boksene til de trengs for operasjoner.
- Bruk standard stereotaxic kirurgi metoder for intrastriatal levering av PFFs på optimaliserte koordinater i mus (ett område: AP + 0,2 mm og ML + 2,0 mm fra bregma, DV-2,6 mm fra Dura) eller i rotter (to steder: AP + 1,6 mm og ML + 2,0 mm fra bregma, DV-4,0 fra Dura; Ap + 0,1 mm og ml + 4,2 mm fra bregma, DV-5,0 fra Dura)1,14,17.
Merk: disse koordinatene har blitt brukt i C57BL6/C3H mus og Fischer 344 rotter. Ved bruk av andre stammer bør koordinatene optimaliseres.
Representative Results
Generering av fibrils fra α-syn-monomerer begynner med å bestemme konsentrasjonen av monomerer. Både BCA-analysen og måling av absorbansen ved 280 NM (A280) kan brukes til å måle proteininnhold; den BCA analysen resultatene, men foreslo en høyere konsentrasjon enn A280 metoden. PFFs avledet fra mus α-syn monomer hadde en BCA-verdi på 14,05 ± 0,22 og en A280 på 8,05 ± 0,03 μg/μL (figur 1). Likeledes, PFFs avledet fra menneskelige α-syn monomer også ut til å være på en høyere konsentrasjon, med en BCA verdi på 12,95 ± 0,38 og en A280 på 7,83 ± 0,05 μg/μL (figur 1). Den A280 målingene er spesifikke for α-syn basert på inkludering av utryddelse koeffisienter og disse resultatene ble brukt til å fortynne monomerer før 7-dagers inkubasjons.
Før inkubasjons, væsken som inneholder α-syn monomerer var klar, men skal vises grumsete etter fibril formasjon. Undersøkelse med overføring elektron mikroskopi bekreftet tilstedeværelsen av lange fibrils, måling 10-20 NM bred (Figur 4). Til sammenligning var α-syn-monomerer knapt synlige uten merkbar form (Figur 4). Med visuell bekreftelse av fibrillær strukturer, amyloid konformasjon av fibrils er neste trekk ved PFFs som skal bekreftes ved hjelp av en thioflavin T-analysen. Thioflavin T utstillinger forbedret fluorescens ved binding til amyloid; Dermed, økt fluorescerende signal fra prøvene indikerer tilstedeværelsen av amyloid. Som et eksempel, thioflavin i dPBS produsert et signal på 3 287 ± 580 relative fluorescerende enheter (RFU), mus α-syn monomer produserte et signal på 4 174 ± 158 RFU, og musen PFFs produsert et signal på 59 754 ± 6 224 RFU (figur 5). Til sammenligning menneskelige α-syn monomer produsert et lignende signal på 4 158 ± 105 RFU til mus monomer, og menneskelig PFFs produsert et høyere signal på 1 235 967 ± 113 747 RFU sammenlignet med musen PFFs (figur 5). For å vurdere tilstedeværelsen av pelletable fibrils, en sedimentering analysen ble utført. Fibrils vil pellet med sentrifugering. I både mus og menneskelige PFF prøver, bør supernatanten fraksjonen har mer protein i pellet enn supernatanten (figur 6). I kontrast, flertallet av proteinet fra musen og menneskelige monomerer var til stede i supernatanten, med liten til stede i pellet (figur 6). Med PFFs synlig tilstede av elektron mikroskopi, amyloid strukturer tilstede, og fibrils pelletable, PFFs bestått alle in vitro kvalitetskontroll trinn.
Både mus og menneskelig PFFs var sonikert å produsere PFFs av passende lengder for seeding α-syn inkluderinger4,18. PFFs ble fortynnet til den ønskede konsentrasjonen av 4 μg/μL og sonikert. Umiddelbart før kirurgi, 25 representative fibrils ble avbildet av elektron mikroskopi og målt til spot sjekke fibril størrelse. Den sonikert musen PFFs målt 48,8 ± 3,1 NM, mens den menneskelige PFFs målt 52,1 ± 4,4 NM i lengde; PFFs av begge artene var derfor passende lengde (50 NM eller mindre) for å indusere seeding aktivitet. Mer omfattende undersøkelse av ca 500 fibrils avslørte gjennomsnittlig lengde og lengde distribusjon av sonikert musen fibrils. Den gjennomsnittlige lengden var 44,4 ± 0,6 NM, med 86,6% av PFFs måling 60 nm eller mindre (Figur 4). Til sammenligning menneskelige PFFs gjennomsnitt 55,9 ± 1,1 NM med 69,6% av PFFs måling 60 nm eller mindre (Figur 4).
Etter intrastriatal injeksjon av sonikert mus PFFs til rotter som tidligere beskrevet3,5, en rekke vev seksjoner ble behandlet på 2 måneder etter operasjonen, når antall inkludering inneholder neurons er kjent for å Peak i SNpc, for bekreftelse av fosforylert α-syn inkluderinger5. Inkludering av neurons, som indikert av immunhistokjemiske farging for pSyn (antistoff i tabell av materialer) er til stede innenfor SNpc (figur 7), samt andre regioner i hele hjernen som innervate striatum (fremre olfactory nucleus, motor, cingulum, Piriform, prelimbic, somatosensory, entorhinal, og Insular barken, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Disse inkluderinger dele lignende eiendommer med Lewy organer, for eksempel binding thioflavin S, og motstanden av totalt α-syn til proteinase K (figur 7), som vist ved immunhistokjemiske farging (antistoff og proteinase K i tabell over materialer) . Bekreftelse av seeding i hjernen indikerer at in vivo kvalitetskontroll er passert, og alikvoter av PFFs tidligere frosset og reddet fra samme batch kan være sonikert under identiske parametre, med lengder validert, i større eksperimenter.
Figur 1 . Metoder for generering av α-syn fibrils. Omriss av trinnene som kreves for å produsere fibrils fra α-syn-monomerer. Monomerer er sentrifugert i 10 min (15 000 x g, ved 4 ° c). Supernatanten overføres til et rent rør og protein konsentrasjonen bestemmes av enten absorbansen ved 280 NM, eller en BCA analysen. Grafen viser konsentrasjoner fra menneske-og mus α-syn-monomerer. Kolonner indikerer gruppe betyr, feilfelt representerer ± 1 standard feil av gjennomsnittet. Etter at protein konsentrasjonen er fastslått, er α-syn-monomerer fortynnet, kort blåste og inkubert for 37 ° c i 7 dager, mens risting på en orbital mikser satt til 1 000 RPM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Farging metoder for overføring elektron mikroskopi. Diagram av negative flekker for elektron mikroskopi. A) bilder som viser elektron mikroskopi prøve nett. Rutenettet har en kjedelig eller lett side og en skinnende eller mørk side. Den blanke/mørke siden er belagt med en formbar/Carbon støtte film. B) illustrasjon av farge prosedyre. Rutenettet er fløt skinnende/mørk side ned på den første dråpe ddH2O for 1 min og det overskytende er onde unna med filter papir. Prosessen gjentas med den andre dråpe ddH2o, utvannet PFFs eller monomerer, to dråper uranylnitratet acetate, og to ekstra dråper ddH2O. rutenett kan lagres i en rutenett boks til avbildet. Scale bar = 3 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Montering av tilpassede glass nål sprøyter. Diagram over trinnene som kreves for å montere glass nål vedlagte sprøyter. Silikonbehandlet glass kapillærrør trekkes og kuttes i midten for å produsere glass nåler. Krympe wrap slangen brukes til å forberede metall nålen og danner en indre forsegling når glass nålen er gled på metall nålen. To ekstra lag av krympe-wrap slange som overlapper bunnen av glass nålen og metall nålen er fortløpende lagt til og varme brukes til å feste glass nålen og danner en vann-tett forsegling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Visualisering av α-syn monomerer og α-syn fibrils via overføring elektron mikroskopi. Representative micrographs av α-syn monomerer og fibrils. Top paneler: mus og menneskelig α-syn monomer. Midtre paneler: full lengde mus og menneske α-syn PFFs. bunnplater: mus og menneske α-syn PFFs etter sonikering. Bottom graf: fordeling av sonikert mus og menneskelige α-syn PFF lengder. Scale bar = 500 NM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Bekreftelse av amyloid strukturer av thioflavin T-analysen. Måling av fluorescerende signal fra mus og menneskelige α-syn monomer og PFF prøver. Venstre: resultater fra mus α-syn monomerer og α-syn PFFs. Høyre: resultater fra menneske α-syn-monomerer og α-syn PFFs. En dPBS negativ kontroll vises i hver graf. Alle målinger uttrykkes som relative fluorescerende enheter (RFU). Kolonner indikerer gruppe betyr, feilfelt representerer ± 1 standard feil av gjennomsnittet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Sedimentering-analysen for pelletable α-syn. bilder fra Coomassie beiset gels. Bandene som vises er på ca 14 kDa basert på protein stigen. Venstre: mus monomer og PFFs. Høyre: Human monomerer og PFFs. For alle monomer og PFF prøver, blir resuspendert pellet (P) og supernatanten (S) vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Funksjoner av inkluderinger i rotte modellen bekrefter α-syn patologi. Representative micrographs fra substantia Nigra Pars compacta ved 2 måneder etter injeksjon. Venstre: nevroner som inneholder pSyn og counterstained med cresyl fiolett. Middle: Thioflavin S positive neurons. Høyre: α-syn-inneholdende inkluderinger motstandsdyktig mot proteinase K. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Produksjon av α-syn PFFs i stand til seeding neurons og fører til Lewy kropp-lignende inkluderinger er avhengig av flere faktorer og trinn. En kritisk faktor er at monomerer som brukes til å generere fibrils må være spesielt formulert for fibrilization4,9,14,15. Hvis monomerer ikke er formulert for fibrilization, fibrils kan ikke danne eller fibrils som gjør skjemaet kan ikke produsere α-syn patologi. Likeledes, buffer som monomerer er i også påvirke fibrilization. Som sådan, for de beste resultatene, bør salt konsentrasjonen være ca 100 mM NaCl og pH mellom 7,0 og 7,3. Et første skritt som introduserer variasjon er metoden der første proteininnhold bestemmes, med måling på A280 sannsynlig å produsere mer nøyaktige resultater, og derfor er den foretrukne metoden. Avviket i proteinkonsentrasjon kan redusere effekten av fibrilization prosessen, samt endre antatt PFF konsentrasjon som brukes i eksperimenter. Begge kan føre til en nedgang i seeding effektivitet og batch variasjon mellom eksperimenter.
Initial kvalitetskontroll trinn vil bekrefte kritiske funksjoner i PFFs, spesielt at de har en fibrillary konformasjon (elektron mikroskopi), inneholder amyloid strukturer (thioflavin T-analysen), og er pelletable (sedimentering analysen). Det er viktig å merke seg at resultatene av thioflavin T-analysen vil svinge med tiden og er ikke et direkte mål på mengden av amyloid strukturer stede, heller, thioflavin T-analysen bør bare brukes som en indikator på amyloid strukturer tilstedeværelse innen prøven. Thioflavin T brukes vanligvis i in vitro-analyser, slik som den nevnte analysen for å vise fibrils inneholde amyloid strukturer. Alternativt er thioflavin S brukt i vev for å detektere amyloid strukturer, som vist i figur 7. I forhold til sedimentering analysen, resultatene viser bare at PFFs er funnet hovedsakelig i pelletable brøkdel. Som prøvene er kjørt i denaturering forhold, en enkelt fremtredende band på ca 14 kDa, størrelsen på α-syn monomerer, er til stede på gels. Dette er ulikt flere band til stede ved høyere molekyl vekter som ville bli forventet med PFFs hvis en innfødt eller ikke-denaturering gel ble brukt. Til slutt, vellykket bestått av alle disse første kvalitetskontroll trinnene garanterer ikke α-syn inkludering seeding aktivitet. Av denne grunn, cellekultur eksperimenter eller en liten kohort av kirurgisk-injisert dyr bør brukes til å teste effekten av PFFs før bruk i større eksperimenter.
Sonikering er et avgjørende skritt i prosessen og parametrene vil variere avhengig av modell av sonicator som brukes. Sonikering parametere må brukes og verifiseres for å vise at korte PFF fragmenter har blitt produsert. Fibril størrelse har peiling på seeding, med kortere fibrils seeding mer effektivt. Selv om kortere fibrils frø mer effektivt, denne effekten vidder og den optimale PFF lengden er ca 50 NM4,18. Det er også viktig å ikke sonikere prøvene og utsette PFFs for overdreven varme, da dette kan redusere seeding effektivitet. Disse sonikert PFFs skal testes for effekt i små cellekultur eller in vivo eksperimenter før bruk i større skala eksperimenter. Som ulike sonikering økter har potensial til å innføre variasjon, eksperimentell behandling grupper bør planlegges tilsvarende.
Når du leverer PFFs in vivo, kan lokaliseringen av injeksjonsstedet (e) og den totale mengden PFFs som brukes, påvirke antallet neurons som vil utvikle inkluderinger, samt omfanget av neurodegeneration7,14. Koordinatene i protokollen gir et sted å starte, men bør testes i laboratoriet for å sikre den ønskede målregionen utvikler α-syn patologi før bruk i stor skala eksperimenter. Hvis ønskelig, kan spore fargestoff eller fluorescerende perler brukes som en måte å teste regional målretting før du bruker PFFs. Mengden PFFs som brukes i vivo varierer mellom grupper, og de fleste grupper bruker totalt mellom 5 og 20 mikrogram PFFs på ett eller delt mellom to injeksjonssteder1,2,3,4,5 , 6 andre priser , 7 andre er , 14. ettersom antall injeksjonssteder, plassering av injeksjonssteder, og mengden av PFFs injisert kan påvirke resultater og progresjon av synucleinopathy, bør nedstrøms utfall av parametrene karakteriseres før du bruker modellen til å teste potensielle intervensjoner eller undersøke timelige trekk ved modellen.
Når du velger en modell som skal brukes til testing legemiddel selskap eller studere sykdomsprogresjon, bør modellen velges for å best svare på spørsmålet spurt. Ikke alle modeller vil ha visse sykdoms funksjoner av PD, eller tilby den tidsrammen som trengs for å teste potensielle intervensjoner. PFF modellen viser viktige funksjoner i PD, som α-syn patologi og neurodegeneration, og kan føre til beskjedne motoriske hemninger. Modellen tilbyr en forutsigbar og langvarig tid-kurs, der inkluderinger skjema måneder før neurodegeneration. Dette gjør at forskerne kan undersøke og utnytte de ulike fasene gjennom den langvarige utviklingen av synucleinopathy. Den nåværende og fremtidig bruk av modellen generelt er forventet å være fordelaktig i studiet av sykdomsprogresjon og utvikling av romanen terapier.
Disclosures
Joseph Patterson, Kelvin Luk, og Caryl Sortwell er for tiden involvert i kontraktsmessige ordninger med Michael J. Fox Foundation til kvalitetskontroll α-syn materiale generert av Proteos, Inc. medforfatter Nicole Polinski, er en ansatt i Michael J. Fox Foundation, som har kontrakt Proteos, Inc. for å produsere α-syn monomer. Medforfattere Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley, og Nicholas Kanaan har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Michael J. Fox Foundation, National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (NS099416) og Weston Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
| Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
| Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
| Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
| Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
| Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
| Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
| Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
| Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
| Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
| Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
| Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
| ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
| Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
- Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
- Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).
- Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
- Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
- Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
- Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
- Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
- Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
- Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
- Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
- Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).
