Summary
Målet med denna artikel är att beskriva de steg som krävs för generering av fibriller från monomer alfa-Synuclein, efterföljande kvalitets kontroll, och användning av de förformade fibriller in vivo.
Abstract
Användning av in vivo alfa-Synuclein förformade fibrillcellulosa (α-syn PFF) modell av synucleinopati ökar i popularitet bland forskare som syftar till att modellera Parkinsons sjukdom synucleinopati och nigrostriatala degeneration. Standardiseringen av α-syn PFF-generering och in vivo-applicering är kritisk för att säkerställa en konsekvent, robust α-syn-patologi. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för generering av fibriller från monomer α-syn, post-fibrilization kvalitets kontroll steg, och föreslog parametrar för framgångs rik Neurokirurgisk injektion av α-syn PFFs till råttor eller möss. Från och med monomer α-syn sker fibrillering under en 7-dagars inkubations tid under skakningen vid optimala buffertförhållanden, koncentration och temperatur. Efter fibrilization kvalitets kontroll bedöms av närvaron av pelletable fibriller via sedimentering assay, bildandet av amyloid kon formation i fibriller med en tioflavin T-analys, och elektron mikroskopisk visualisering av fibriller. En lyckad validering med hjälp av dessa analyser är nödvändig för att lyckas, de är inte tillräckliga för att garantera att PFFs kommer att frön α-syn inne slutningar i nerv celler, eftersom sådan agg regering aktivitet av varje PFF parti bör testas i cell kultur eller i pilot djur kohorter. Före användning måste PFFs vara sonicated under exakt standardiserade förhållanden, följt av undersökning med elektronmikroskopi eller dynamisk ljus spridning för att bekräfta fibrillcellulosa längder är inom optimal storleks intervall, med en genomsnittlig längd på 50 nm. PFFs kan sedan tillsättas till cell odlings medier eller användas i djur. Patologi detekterbar genom immuninfärgning för fosforylerat α-syn (psyn; serin 129) är uppenbara dagar eller veckor senare i cell kulturer respektive gnagare.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) kännetecknas främst efter döden av två stora patologiska egenskaper: utbredd och progressiv alfa-Synuclein (α-syn) patologi, och nigrostriatala degeneration. Efter injektion i wildtyp möss eller råttor, α-syn förformade fibriller (PFFs) inducera progressiv ansamling av patologiskt α-syn, vilket kan resultera i utdragen degeneration av substantia nigra pars compacta (SNpc) dopamin nerv celler under loppet av många samt sensorimotoriska underskott1,2,3,4,5,6. Neuroner utsätts för α-syn fibriller, antingen via direkt Intracerebral injektion eller läggas till media av odlade nerv celler. När PFFS tas in i nerv celler, den PFFS agera för att "frö" bildandet av inne slutningar genom Templating, och ackumulering av endogena α-syn till fosforylerade inne slutningar1,7,8, och 9. Inne slutningar har liknande egenskaper som Lewy organ: innehåll ande α-syn fosforylerat vid serin 129 (pSyn), ubiquitin och P62; inneha aamyloida Kvartära strukturer som visas med positiv färgning av tioflavin; och är resistenta mot proteinas K mat smältning1,3,5,7,8,9,10,11, med 12. PFF exponering leder till α-syn inkludering bildandet i primär och några förevigas nerv celler i kulturen, samt möss, råttor och icke-mänskliga primater in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Det är viktigt att notera att PFFs inte kommer att leda till α-syn inkludering formation i alla cell kulturer modeller och vissa odlade nerv celler kommer utsäde bättre än andra.
En annan viktig egenskap hos in vivo α-syn PFF-modellen är de distinkta sekventiella patologiska faser som uppstår under flera månader. I gnagare, efter intrastriatal injektion, α-syn inklusion bildas generellt inom SNpc och många kortikala regioner inom 1-2 månader. Denna agg regering topp följs av nigrostriatala degeneration ≈ 2-4 månader senare1,3,5. Dessa distinkta patologiska stadier ger forskarna den plattform som man kan studera och utveckla strategier som 1) minska α-syn aggregation, 2) klart redan bildade α-syn inne slutningar, och/eller 3) förhindra efterföljande neurodegeneration. Den PFF modellen erbjuder distinkta fördelar och nack delar jämfört med neurotoxicant, transgena, och viral vektor medierad α-syn överuttryck modeller som tidigare granskat6. Valet av vilken modell eller metod att ta bör bestämmas av vilken modell som bäst passar den fråga som utredarna efterfrågar.
Även om PFF-modellen har framgångs rikt använts av många laboratorier, det finns fortfarande grupper som har upplevt inkonsekvenser med att generera fibriller och producerar konsekvent α-syn patologi14. Exempel på inkonsekvenser varierar från PFFs som producerar liten eller ingen α-syn patologi, batch till batch seedning effektivitet, och även fel i fibriller att bilda. Därför är standardiseringen av α-syn PFF-generationen och in vivo-applicering kritisk för att möjliggöra korrekta tolkningar av effekten av nya terapeutiska ingrepp. Följande protokoll beskriver de steg som krävs för generering av PFFs från α-syn monomerer, in vitro kvalitets kontroll av PFFs en gång bildades, ultraljudsbehandling och mätning av PFFs före användning, och förslag för att under lätta framgångs rik in vivo injektion av PFFs till råttor eller möss.
Protocol
Alla metoder som involverar djur har godkänts av Michigan State University institutionella djur vård och användning kommitté (IACUC).
1. bildande av α-Synuclein förformade fibriller från monomerer (figur 1)
- Tina α-Synuclein monomerer på is, försiktigt resuspendera genom att snärta röret, och centrifugera vid 15 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
Anmärkning: α-syn monomeren måste vara specifikt formulerad för fibrilization. Rekombinanta monomerer kan köpas från kommersiella källor eller genereras av protokoll på plats4,9,14,15. Om produkten köps från kommersiella källor måste den ange att α-syn monomeren är specifikt för generering av fibriller. Oavsett om monomererna köps eller genereras på plats, bör de kvalitets kontroll steg som beskrivs nedan utföras med varje parti för att säkerställa fibriller har bildats och kommer utsäde effektivt före användning i experiment. - Överför supernatanten till ett rent 1,5 mL mikrocentrifugerör och anteckna det överförda beloppet.
Obs: var noga med att undvika pelleten, som, om den finns, kommer att vara liten. - Mät protein koncentrationen hos den överförda supernatanten antingen med en standard-bicinchoninic Acid-analys (BCA) eller genom att mäta absorbansen vid 280 Nm med en mikrovolymspektrofotometer.
Obs: BCA-analysen är inte lika exakt för den specifika mätningen av α-syn och kan ge resultat som överskattar protein koncentrationen. Som ett resultat, mätning av absorbansen vid 280 Nm är den rekommenderade metoden för bestämning av protein koncentrationen.- För att mäta med BCA-analysen, Följ standard-BCA-protokollen och utför med tre olika utspädningar av α-syn monomer. Föreslagna utspädningar är 1:25, 1:50 och 1:100.
- Att mäta med A280 metoden, Tom läsaren med steril 1x Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (dPBS) utan kalcium och magnesium, med en salt koncentration av cirka 100 mM NaCl, och pH-område 7.0-7.3 (tabell över material).
- Tillsätt 2 μL av provet till läsaren och Läs absorbansen vid 280 nm.
- Använd Beer-Lambert lag för att bestämma koncentrationen av monomerer.
Anmärkning: Utdöpningskoefficient ε för humant α-syn är 5 960 M-1cm-1 och för mus α-syn är 7 450 M1cm-1. PATHLENGTH mäts i cm. molekyl vikt för α-syn (14 kDa) uppskattas anta 1 da = 1 g/mol.
- Späd ut monomererna med 1x dPBS till en slutlig koncentration på 5 mg/mL. Använd ekvationen nedan för att beräkna mängden 1x dPBS tillsätts för att späda monomerer.
Obs: alla koncentrationer är i mg/mL och volymerna i μL. monomer spädningar ska utföras med 1x dPBS. Total volym som används för att generera fibriller bör vara mellan 100 och 500 μL för att uppnå reproducerbara fibrilization resultat. - Kort virvel att blanda, och centrifugera för att samla in all vätska i botten av röret. Ali kvoter för kvalitets kontroll jämförelse med fibriller som anges i steg 1.8.1-1.8.4.
- Använd ett rör lås eller vax/plast film (tabell över material) för att säkra mikrocentrifug röret locket stängt.
- Placera röret i en orbital thermomixer med lock i 7 dagar vid 37 ° c, skaka vid 1 000 RPM (material tabell).
Obs: i slutet av 7 dagar, bör innehållet i röret visas grumlig. Thermomixer måste ha ett lock för att förhindra kondens bildning på rör locken. - Knacka försiktigt på röret för att återuppkoppla α-syn fibriller. Ali kvoter för följande kvalitets kontroll steg som anges i steg 1.8.1-1.8.4.
Obs: fibriller för kvalitets kontroll steg kan lagras vid RT över natten.- Alikvot 6 μL för sedimenteringstest.
- Alikvot 5 μL för tioflavin T-bindningsanalysen.
- Alikvot 2 μL för transmissionselektronmikroskopi av fibrilvisualisering.
- Alikvot av minst 10 μL för endotoxinanalysen.
Anmärkning: för endotoxinanalys används en kommersiell Limulus amebocyte Lysate (LAL), enligt tillverkarens anvisningar (tabell över material). Endotoxinhalten skall vara ≤ 0,5 endotoxinenheter/mL för fibriller. En endotoxinborttagningssats kan användas om detta kriterium inte uppfylls.
- Alikvot av kvarvarande fibriller och lager. För långtids förvaring (12-18 månader), frys snabbt på torris och förvara vid-80 ° c.
Anmärkning: det belopp som ska alikvot beror på önskad nedströms ansökan. In vivo-användning kräver normalt fler fibriller vid högre koncentrationer än in vitro-användning, och Ali kvoter bör planeras i enlighet med detta. Fibriller bör förvaras mot bak sidan av frysen för att förhindra skador från eventuell frysning/Tina. Protokollet kan pausas här.
2. sedimenteringstest
- Tillsätt 6 μL PFF i ett rent mikrocentrifugerör till 54 μL dPBS för att späda fibriller 1:10 och Pipettera för att blanda.
- Tillsätt 6 μL monomer till 54 μL dPBS som en extra kontroll i ett separat rör.
- Centrifugera proverna vid 10 000 x g i 30 min vid RT och överför supernatanten till ett rent mikrocentrifugerör.
- Tillsätt 60 μL dPBS till den kvarvarande pelleten och virveln för att resuspendera.
- Tillsätt 30 μL 3x provbuffert (140 μL 50% glycerol/0.1% bromfenolblått, 40 μL 10% SDS och 20 μL β-merkaptoetanol) i varje tub och skaka för att blanda.
- Inkubera proverna vid 100 ° c i 10 min och låt svalna i 5 min på isen.
- Använd en standard natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) protokoll för att separera protein i massa. Använd en protein stege med ett intervall som inkluderar 14 kDa (det storleks intervall som förväntas för monomer α-syn).
- Överför gelen till en Färgnings mat rätt och täck gelen med Coomassie blå fläck (0,1% Coomassie briljant blått, 20% metanol i volym, och 10% ättiksyra i volym i ddH2O). Inkubera i 3 timmar vid RT under skakningen.
- Häll av Coomassie blå fläck och tillsätt tillräckligt destain (50% metanol i volym, och 10% ättiksyra i volym i ddH2O) för att täcka gelen. Inkubera i 30 min vid RT under skakningen.
- Häll av destain och upprepa destain steg tills gelen är klar och band är synliga.
- Tvätta gelen 3 gånger i 5 min vardera genom att skaka i ddH2O och bild gelen.
3. transmission elektronmikroskopi för fibrillcellulosa visualisering
- Väg 20 mg uranyl acetat i ett mikrocentrifugerör och tillsätt 1 mL ddH2O för att göra en 2% vatten lösning. Vortex tills uranyl acetat är i lösning, och Låt sitta över natten.
Obs: uranyl acetat bör göras dagen innan du förbereder prover för överföring elektronmikroskopi. Exponering för ljus eller agitation kan orsaka uranyl acetat att fälla, som sådan, röret som innehåller uranyl acetat lösningen bör täckas i aluminiumfolie, förvaras på en mörk plats, och inte skakas efter uranyl acetat är i lösning. - Tillsätt 2 μL PFF till 98 μL dPBS för att späda fibriller 1:50 och sedan Pipettera för att blanda.
- Förbered en ren vax/plast film (tabell över material) täckt yta (ca 50 mm x 50 mm) på bänk skivan. På ren vax/plast film (tabell över material), tillsätt följande (figur 2).
- Tillsätt 4 x 10 μL droppar ddH2O.
- Tillsätt 1 x 10 μL droppe utspätt fibriller eller monomerprov.
- Tillsätt 2 x 10 μL droppar 2% uranyl acetat.
- Använd fintippade pincett för att plocka upp en formvar/kolbelagd, mesh koppar transmission elektronmikroskopi rutnät (tabell över material).
Obs: se till att bara plocka upp rutnätet vid kanten, undvika mesh delen i mitten (figur 2a). Om pincett vidrör mesh, kommer formvar/kolbelagd film skadas, vilket gör avbildning i det området av nätet omöjligt. - Float rutnätet formvar/kolbelagd sida (blanka sidan) ner på den första droppen av ddH2o. Använd försiktigt pincett för att hålla i rutnätet och tryck ner för att säkerställa att hela belagda ytan är i kontakt med DDH2o. Låt rutnätet flyta i 1 min.
- Plocka upp nätet, och utan att röra mesh delen av rutnätet, Wick bort ddH2O med filter papper.
- Float rutnätet som ovan på den andra droppe ddH2o för 1 min och Wick bort DDH2o.
- Float rutnätet på droppe utspädda fibriller för 1 min och Wick bort överskottet som ovan.
- Float rutnätet på första droppe uranyl acetat för 1 min och Wick bort överskottet.
- Float rutnätet på andra droppe uranyl acetat för 1 min, Wick bort överskottet.
- Float rutnätet som ovan på den tredje droppe ddH2o kort och Wick bort DDH2o.
- Float rutnätet som ovan på den fjärde droppe ddH2o kort och Wick bort DDH2o, vara säker på att ta bort så mycket DDH2o som möjligt.
- Överför till en rutnätslåda för lagring tills avbildning.
Obs: galler ska torka i minst 5 minuter före avbildning. Nät kan avbildas i minst ett år efter beredning och bör förvaras i en torr miljö.
4. thioflavin T-analys
- Tillsätt 5 μL PFF i ett rent mikrocentrifugerör till 245 μL dPBS för att späda fibriller 1:50 och Pipettera för att blanda.
- Tillsätt 250 μL dPBS till ett separat mikrocentrifugerör för att fungera som en negativ kontroll.
- Tillsätt 5 μL monomer till 245 μL dPBS för att fungera som monomerkontroll.
- Tillsätt 250 μL tioflavin T i glycinbuffert (25 μM tioflavin T, 100 mM glycin, 1% Triton X-100, pH 8,5) till varje prov och blanda försiktigt.
- Pipet 2 replikerar, 200 μL vardera, till en svart 96 brunn tallrik. Håll plattan i mörkret för att förhindra foto blekning.
- Inkubera i 1 h vid RT och Läs plattan med en excitation av 450 nm och emission av 510 nm.
Obs: Tioflavin T avläsningar kommer att fluktuera över tiden. Proverna ska läsas vid samma inkubations tid. Om så önskas kan flera avläsningar tas under timmen inkubation och plottas över tiden.
5. ultraljudsbehandling av α-Synuclein förformade fibriller
Varning: den någon sonikator och alla ultraljudsbehandling steg utförs i en kultur huva för att förhindra exponering för fibriller som kan aerosolize under ultraljudsbehandling. Den personal som utför ultraljudsbehandling steg bör bära personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, kläd skydd i form av en labbrock, och ett ansikte sköld medan sonicating. Risk för fibrillcellulosa exponering kan reduceras genom att sonicera med en kopp horn Sonicator, vilket gör att röret som innehåller fibriller att förbli stängd under ultraljudsbehandling.
Obs: optimal ultraljudsbehandling parametrar fibriller är beroende av den modell av någon sonikator används. Av denna anledning, en del optimering kommer att behöva utföras för att säkerställa fibriller är rätt storlek. Den någon sonikator som används kan hittas i tabellen över material och de parametrar som beskrivs är baserade på tidigare resultat med denna modell av någon sonikator. Parametrarna nedan kommer att fungera för 2-4 μg/μL av PFFs i 200-400 μL lösning. Test ultraljudsbehandling med instrumentet bör utföras och fibriller analyseras för att säkerställa önskat resultat uppnås innan användning av PFFs i experiment.
- Fäst en sond med diametern 3,2 mm (material tabell) till omvandlaren och Ställ in parametrarna för sonikator enligt nedan i steg 5.1.1-5.1.3.
- Ställ in amplitud på 30%.
- Ställ in pulsen på 01 01 (1 s på; 1 s av).
- Ställ in tiden till 0:01:00.
Obs: 1 min av pulserande motsvarar 60 pulser, och denna modell av någon sonikator (tabell över material) kommer att sluta automatiskt. Med andra någon sonikator modeller, antalet pulser kommer att behöva räknas.
- Tina fibriller vid RT och späd med sterila dPBS i en kulturhuv.
Obs: en klar 0,6 mL mikrocentrifug röret fungerar bäst för ultraljudsbehandling och den slutliga fibrillcellulosa koncentrationen beror på avsedd användning. Representativa resultat som visas är från en slutlig fibrillcellulosa koncentration av 4 μg/μL. - Torka av sonden på sonikator med en laboratorie vävnad fuktad med 70% etanol för att rengöra sonden. Sänk spetsen på sonden i ddH2O och puls 10 gånger för att ytterligare rengöra sonden och torka sedan torrt med en labb vävnad.
- Placera sond spetsen i röret med utspädda fibriller och placera spetsen längst ner på röret.
- Sonikera för 60 pulser (1 s på; 1 s av). Flytta sonden upp och ner under varje puls för att säkerställa alla fibriller i vätskan är sonicated. och ren.
- Efter 60 pulser, ta bort sonden från PFFs, och tillsätt 2 μL av PFF till 98 μL av dPBS i en ren mikrocentrifug tub för att späda fibriller 1:50 för sonicated fibrillcellulosa mätning av elektronmikroskopi.
Anmärkning: helst bör en liten delmängd av fibriller mätas före in vivo-injektionen och en mer omfattande mätning av fibriller som utförs när tiden tillåter. - Efter ultraljudsbehandling, kort Centrifugera PFFs för 1 s på 2 000 x g att samla all vätska från sidorna av röret.
Varning: om röret blir varmt vid beröring, stoppa son ICA ting efter 30 pulser, vänta 1 min, och sonikera för den slutliga 30 pulser.
Obs: medan sonicating, hålla sonden spetsen mot botten av vätskan i början av varje puls, för nära till toppen av vätskan kommer att orsaka prov förlust. - Sänk sond spetsen i 1% SDS och puls 10 gånger för att rengöra sonden. Ta bort spetsen från SDS, Sänk i ddH2O och puls 10 gånger.
- Torka av sonden med en labb vävnad fuktad med 70% etanol, och torka sedan sonden med en torr labb vävnad. Lossa sonden från konverteraren och lagra.
- Torka av alla ytor i huven med 1% SDS, följt av 70% etanol.
Obs: 1% SDS-lösningen används för att separera fibriller och rena ytor och utrustning16.
6. transmission elektronmikroskopi för mätning av sonicated fibriller
Anmärkning: om elektronmikroskopi inte är genomförbar, kan en tioflavin T kinetik-analys och dynamisk ljus spridning användas som indirekta mått på sådd verknings grad och fibrillcellulosa storlek4,14.
- Förbered proverna med hjälp av protokollet från avsnittet "elektronmikroskopi för fibrillcellulosa visualisering" ovan.
- Använd ett transmissions elektron Mikroskop för att ta en bild av fibriller från 6 till 10 olika rutnät öppningar.
Obs: bilder bör vara en tillräckligt hög förstoring för att mäta fibriller, men tillräckligt låg för att visualisera flera fibriller samtidigt. En slutlig förstoring på cirka 75 000 x bör räcka. - Mät längden på en liten delmängd av minst 25 fibriller innan du använder fibriller i ett experiment.
Obs: dessa mätningar kan vanligt vis utföras med hjälp av bild program vara som är associerad med Mikroskop. För snabb validering bör den person som mäter välja representativa fibriller och beräkna den genomsnittliga storleken. Fibril längd bör genomsnitt runt 50 nm eller mindre, med en mer exakt mätning att följa. - Mät längderna på 500 + fibriller för mer omfattande resultat.
Obs: den bild program vara som är associerad med Mikroskop kan användas för fibrillcellulosa mätningar. Alternativt kan bilder öppnas och fibriller mäts med bild behandling program vara, med hjälp av skalan bar i samband med varje bild som en storleks referens som att jämföra fibrillcellulosa längder.
7. beredning av anpassade sprutor av glas nål för stereotaktiska injektioner (figur 3)
- Tillsätt cirka 10 mL silikoniseringsreagens (material tabell) till en ren 50 ml-bägare.
- Placera glas kapillärrör (längd 54 mm; Ytterdiameter: 0,86 mm, innerdiameter 0,59 mm) vertikalt i bägaren på silikoniseringsreagens och låt kapillärverkan dra silikoniseringsreagenset upp röret genom det undre röret som öppnas nedsänkt i med silikoniseringsreagens.
- Pipet ytterligare silikonizing reagens i övre röret öppningen som inte är nedsänkt i silikonizing reagens för att helt fylla glaset kapillärröret.
- Avlägsna kapillärrören från silikoniseringsreagenset och torka av rören på en pappers hand duk för att avlägsna silikoniseringsreagens i rören. Låt kapillärrören torka i minst 8 timmar.
- Placera ett kapillärrör av silikoniserat glas i en nålavdragare av glas (material tabell).
- Slå på värmeelement och låt de bifogade vikter för att sträcka den uppvärmda glas kapillärröret.
- Skär den dragna glas kapillärröret med sax på den tunnaste punkten i mitten och ta bort glasnålen från glaset nålen avdragare.
Anmärkning: den dragna nålen inre och yttre diameter bör vara cirka 80 och 100 μm, respektive. Flera glasnålar kan göras på en gång och lagras tills redo att fästa till en glas spruta med bifogade metallnål (tabell över material). - Skär en längd av krympfolie slangar (genomsnittlig inre diameter 0,021 "och genomsnittlig vägg tjock lek 0,001") till cirka 40 mm med sax. Skjut krympomslaget över metallnålen på en 10 μL avfasad spruta (material tabell).
- Använd en öppen låga för att värma och fästa krymppinpackning till nålen medan rotera nålen att tillämpa värme jämnt.
- Skjut försiktigt den större änden av den dragna glasnålen över metallnålen på sprutan.
- Skär en längd av krympfolie slangar (genomsnittlig inre diameter 0,036 "och genomsnittlig vägg tjock lek 0,005") till cirka 40 mm med sax och försiktigt glida över glasnålen för att överlappa basen av glasnålen och metallnålen på sprutan (tabell över Och material). Använd en öppen låga för att värma krympfolie för att säkra glasnålen till metallnålen.
- Lägg till ytterligare ett lager av krympfolie för att fästa glasnålen. Skär en längd av krympfolie slangar (genomsnittlig inre diameter 0,044 "och genomsnittlig vägg tjock lek 0,005") till cirka 40 mm med sax och försiktigt glida över glasnålen för att överlappa basen av glasnålen och metallnålen på sprutan (tabell över Och material). Använd en öppen låga för att värma krympfolie för att säkra glasnålen till metallnålen.
- Trimma glasnålen med saxen så att spetsen är ca 8 mm lång.
Obs: nålen måste vara tillräckligt lång för att rikta de önskade hjärn regionerna (erforderlig längd är beroende av dorsala/ventrala koordinater). - Använd steg 7.14.1-7.14.3 för att testa nålen för att försäkra att det inte finns några läckor och det finns tillräckligt flöde både i dra ut och dispensering vätska från glasnålen.
- Fyll en 1 mL spruta med en bifogad 26 gauge nål med dH2O.
- Ta bort kolvstången från den anpassade sprutan med glas nål och för in nålen på den förfyllda sprutan dH2O i basen på sprutan. Applicera tryck för att fördela dH2O från glasnålen. Inspektera gränssnittet för glasnålen och metallnålen för läckor och bekräfta en stadig dH2O flöde.
Obs: om det behövs, glaset nålen kan trimmas för att öka lätt flöde och ytterligare lager av shrink-wrap läggas till lapp eventuella läckor från basen av glasnålen. - Fyll ett mikrocentrifugerör med dH2o. Använd den anpassade sprutan med glasnål för att dra i DH2o. inspektera nålen för att bekräfta att vätskan tas in i sprutan och att det inte finns några bubblor.
Obs: om det finns bubblor eller dH2O inte dras in i nålen, kan trimma nålen hjälpa till att lindra trycket.
- Förvara försiktigt sprutan med bifogade glasnålar i sprutboxarna tills de behövs för kirurgiska ingrepp.
- Använd vanliga stereotaxiiska kirurgiska metoder för intrastriatal tillförsel av PFFs vid optimerade koordinater hos möss (en plats: AP + 0,2 mm och ML + 2,0 mm från bregma, DV-2,6 mm från Dura) eller hos råttor (två platser: AP + 1,6 mm och ML + 2,0 mm från bregma, DV-4,0 från Dura; AP + 0,1 mm och ml + 4,2 mm från bregma, DV-5,0 från Dura)1,14,17.
Obs: dessa koordinater har använts i C57BL6/C3H möss och Fischer 344 råttor. När du använder andra stammar, bör koordinaterna optimeras.
Representative Results
Generering av fibriller från α-syn monomerer börjar med bestämning av koncentrationen av monomerer. Både BCA-analysen och mätningen av absorbansen vid 280 nm (A280) kan användas för att mäta proteinhalten. BCA-analysresultaten föreslog dock en högre koncentration än A280-metoden. PFFs som härrör från mus α-syn monomer hade ett BCA-värde på 14,05 ± 0,22 och en A280 på 8,05 ± 0,03 μg/μL (figur 1). Likaså verkade PFFs som härrör från humana α-syn monomer också ha en högre koncentration, med ett BCA-värde på 12,95 ± 0,38 och en A280 på 7,83 ± 0,05 μg/μL (figur 1). A280-mätningarna är specifika för α-syn baserat på inkluderingen av utdöningskoefficienterna och dessa resultat användes för att späda ut monomererna före 7-dagars inkubation.
Före inkubation var vätskan som innehåller α-syn monomererna klar, men den bör verka grumlig efter fibrilbildningen. Undersökning med transmission elektronmikroskopi bekräftade närvaron av långa fibriller, mätning 10-20 nm bred (figur 4). I jämförelse var α-syn monomerer knappt synlig utan märkbar form (figur 4). Med visuell bekräftelse av fibrillar strukturer, amyloid kon formation av fibriller är nästa inslag i PFFs som bör bekräftas med hjälp av en thioflavin T-analys. Thioflavin T uppvisar förbättrad fluorescens vid bindning till amyloid; Därför indikerar ökad fluorescerande signal från proverna förekomst av amyloid. Som ett exempel, gav tioflavin i dPBS en signal på 3 287 ± 580 relativa fluorescerande enheter (RFU), mus α-syn monomer producerade en signal på 4 174 ± 158 RFU, och mus PFFs producerade en signal på 59 754 ± 6 224 RFU (figur 5). I jämförelse, humana α-syn monomer producerade en liknande signal på 4 158 ± 105 RFU till mus monomer, och mänskliga PFFs producerade en högre signal på 1 235 967 ± 113 747 RFU jämfört med mus PFFs (figur 5). För att bedöma förekomsten av pelletable fibriller, en sedimentering assay utfördes. Fibriller kommer pellet med centrifugering. I både mus och humana PFF-prover bör supernatanten ha mer protein i pelleten än supernatanten (figur 6). Däremot var majoriteten av proteinet från mus och mänskliga monomerer närvarande i supernatanten, med liten present i pelleten (figur 6). Med PFFs synligt närvarande genom elektronmikroskopi, amyloid strukturer närvarande, och fibriller pelletable, passerade PFFs alla in vitro kvalitets kontroll steg.
Både mus och mänskliga PFFS var sonicated att producera PFFS av lämpliga längder för sådd α-syn inne slutningar4,18. PFFs späddes till önskad koncentration av 4 μg/μL och sonicated. Omedelbart före operationen, 25 representativa fibriller var avbildad av elektronmikroskopi och mätt för att upptäcka kontrol lera fibrillcellulosa storlek. Sonicated mus PFFs mätt 48,8 ± 3,1 Nm, medan de mänskliga PFFs mätt 52,1 ± 4,4 Nm i längd; PFFs av båda arterna var därför lämplig längd (50 nm eller mindre) för att inducera sådd aktivitet. Mer omfattande undersökning av cirka 500 fibriller avslöjade den genomsnittliga längden och längden fördelningen av sonicated mus fibriller. Den genomsnittliga längden var 44,4 ± 0,6 Nm, med 86,6% av PFFs som mäter 60 nm eller mindre (figur 4). I jämförelse var de humana PFFs i genomsnitt 55,9 ± 1,1 Nm med 69,6% av PFFs som mäter 60 nm eller mindre (figur 4).
Efter intrastriatal injektion av sonicated mus PFFS till råttor som tidigare beskrivits3,5, en serie av vävnad sektioner behandlades vid 2 månader efter operationen, när antalet inklusion som innehåller nerv celler är känd för att topp i SNpc, för bekräftelse av fosforylerade α-syn inne slutningar5. Inklusion bärande neuroner, som indikeras av immunhistokemisk färgning för pSyn (anti kropp i tabell över material) finns inom SNPC (figur 7), liksom andra regioner i hela hjärnan som innerverar striatum (främre lukt Nucleus, motor, cingulate, Piriform, prelimbic, somatosensorisk, entorhinal, och Insular cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Dessa inkluderingar har likartade egenskaper hos Lewy organ, såsom bindande tioflavin S, och resistens av total α-syn till proteinas K (figur 7), som visas av immunohistokemisk färgning (anti kropp och proteinas K i tabell över material) . Bekräftelse av seedning i hjärnan visar in vivo kvalitets kontroll har passerat, och Ali kvoter av PFFs tidigare fryst och sparas från samma parti kan vara sonicated under identiska parametrar, med längder validerade, i större experiment.
Figur 1 . Metoder för generering av α-syn fibriller. Översikt över de steg som krävs för att framställa fibriller från α-syn monomerer. Monomerer centrifugeras i 10 min (15 000 x gvid 4 ° c). Supernatanten överförs till ett rent rör och protein koncentrationen bestäms antingen av absorbansen vid 280 nm eller en BCA-analys. Grafen visar koncentrationer av α-syn monomerer från människa och mus. Kolumnerna anger grupp medel, felstaplar representerar ± 1 standard fel av medelvärdet. Efter att protein koncentrationen är fastställd, späds α-syn monomerer, kort viras och inkuberas för 37 ° c i 7 dagar, medan skakningar på en orbital mixer inställd på 1 000 RPM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Infärgnings metoder för transmissionens elektronmikroskopi. Diagram över negativ färgning för elektronmikroskopi. A) bilder som föreställer elektronmikroskopi preparat rutnät. Rutnätet har en tråkig eller ljus sida och en glänsande eller mörk sida. Den blanka/mörka sidan är belagd med en formvar/Carbon stöd film. B) illustration av Färgnings proceduren. Rutnätet är flöt glänsande/mörk sida ner på den första droppen av ddH2O för 1 min och överskottet är ogudaktiga bort med filter papper. Processen upprepas med den andra droppen av ddH2o, utspädda PFFS eller monomerer, två droppar uranyl acetat, och två ytterligare droppar DDH2o. gridteknik kan lagras i en rutnätslåda tills avbildas. Scale bar = 3 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Montering av anpassade sprutor av glas nål. Diagram över de steg som krävs för att montera glasnålsmonterade sprutor. Silikoniserat glas kapillärrör dras och skärs i mitten för att producera glasnålar. Shrink wrap slang används för att förbereda metallnålen och bildar en inre tätning när glaset nålen skjuts på metallnålen. Två ytterligare lager av krympslang som överlappar basen av glasnålen och metallnålen är i följd tillsätts och värme appliceras för att säkra glasnålen och bildar en vatten tät tätning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Visualisering av α-syn monomerer och α-syn fibriller via transmissionselektronmikroskopi. Representativa mikrografer över α-syn monomerer och fibriller. Topp paneler: mus och människa α-syn monomer. Mellersta paneler: full längd mus och mänskliga α-syn PFFs. botten paneler: mus och mänskliga α-syn PFFs efter ultraljudsbehandling. Nedre grafen: distribution av sonicated mus och mänskliga α-syn PFF längder. Skalbar = 500 Nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Bekräftelse av amyloid strukturer av tioflavin T-analys. Mätning av fluorescerande signal från mus och humana α-syn monomer och PFF-prover. Vänster: resultat från mus α-syn monomerer och α-syn PFFs. Höger: resultat från humana α-syn monomerer och α-syn PFFs. En dPBS negativ kontroll visas i varje graf. Alla mätningar uttrycks som relativa fluorescerande enheter (RFU). Kolumnerna anger grupp medel, felstaplar representerar ± 1 standard fel av medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Sedimenteringstest för pelletable α-syn. bilder från Coomassie färgade geler. Band som visas är på cirka 14 kDa baserat på protein stege. Vänster: mus monomer och PFFs. Höger: mänskliga monomerer och PFFs. För alla monomer-och PFF-prover visas den återsuspenderade pelleten (P) och supernatanten (S). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 . Dragen av inne slutningar i råtta modell som bekräftar α-syn patologi. Representativa elektronmikrografier från substantia nigra pars compacta på 2 månader efter injektionen. Vänster: neuroner som innehåller psyn och motfärgas med tolyloxi violett. Mitten: Thioflavin S positiva nerv celler. Höger: α-syn-innehållande inne slutningar resistenta mot proteinas K. skalbar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Produktion av α-syn PFFs kan sådd neuroner och leder till Lewy Body-liknande inne slutningar är beroende av flera faktorer och steg. En kritisk faktor är att monomerer som används för att generera fibriller måste vara specifikt formulerade för fibrilization4,9,14,15. Om monomererna inte är formulerade för fibrilization, fibriller kan inte bildas eller fibriller som gör form får inte producera α-syn patologi. Likaså, den buffert som monomererna är i också påverka fibrilization. Som sådan, för bästa resultat, salt koncentrationen bör vara cirka 100 mM NaCl och pH mellan 7,0 och 7,3. Ett första steg som introducerar variation är den metod där initial protein halt bestäms, med mätning på A280 sannolikt att producera mer exakta resultat och därför är den föredragna metoden. Skillnaden i protein koncentration kan minska effekten av fibrilization processen, samt ändra den antagna PFF koncentrationen används i experiment. Båda kan leda till en minskning av sådd effektivitet och batchvariation mellan experiment.
Inledande kvalitets kontroll steg kommer att bekräfta kritiska egenskaper hos PFFs, särskilt att de har en fibrillär kon formation (elektronmikroskopi), innehåller amyloid strukturer (tioflavin T-analys), och är pelletable (sedimentation analys). Det är viktigt att notera att resultaten av thioflavin T-analysen kommer att fluktuera med tiden och är inte ett direkt mått på mängden av amyloid strukturer närvarande, snarare, thioflavin T-analysen bör endast användas som en indikator på amyloid strukturer närvaro inom provet. Thioflavin T används vanligt vis i in vitro-analyser, såsom den ovan nämnda analysen för att Visa fibriller innehåller amyloid strukturer. Alternativt, tioflavin S används i vävnad för att upptäcka amyloid strukturer, som visas i figur 7. När det gäller sedimenteringstest, visar resultaten endast att PFFs finns huvudsakligen i pelletable fraktion. Eftersom proverna körs i denaturering villkor, en enda framstående band av cirka 14 kDa, storleken på α-syn monomerer, finns på gelerna. Detta är till skillnad från de flera band som finns på högre molekyl vikter som skulle förväntas med PFFs om en infödd eller icke-denaturering gel användes. Slutligen garanterar lyckad överföring av alla dessa inledande kvalitets kontroll steg inte α-syn inkludering aktivitet. Av denna anledning, cell kultur experiment eller en liten kohort av kirurgiskt injicerade djur bör användas för att testa effekten av PFFs före användning i större experiment.
Ultraljudsbehandling är ett avgörande steg i processen och parametrarna kommer att variera beroende på modell av någon sonikator används. Ultraljudsbehandling parametrar måste tillämpas och verifieras för att visa att korta PFF fragment har producerats. Fibril storlek har betydelse för seedning, med kortare fibriller seedning mer effektivt. Även kortare fibriller utsäde mer effektivt, denna effekt platåer och den optimala PFF längd är cirka 50 nm4,18. Det är också viktigt att inte över-Sonikera proverna och exponera PFFs till överdriven värme, eftersom detta kan minska seedning effektivitet. Dessa sonicated PFFs bör testas för effekt i liten cell kultur eller in vivo experiment före användning i större skala experiment. Som olika ultraljudsbehandling sessioner har potential att införa variation, experimentella behandlings grupper bör planeras i enlighet med detta.
Vid leverans av PFFS in vivo, lokalisering av injektions stället (s) och den totala mängden PFFS används kan påverka antalet nerv celler som kommer att utveckla inne slutningar samt omfattningen av neurodegeneration7,14. Koordinaterna i protokollet ger en plats att starta, men bör testas i labbet för att säkerställa att önskad mål region utvecklar α-syn patologi före användning i storskaliga experiment. Om så önskas kan spårnings färg eller fluorescerande pärlor användas som ett sätt att testa regional inriktning innan du använder PFFs. Mängden PFFS som används i vivo varierar mellan grupperna, där de flesta grupper använder en total summa mellan 5 och 20 μg PFFS på en eller uppdelad mellan två injektions ställen1,2,3,4,5 , 6 att ha , 7 för att , 14. eftersom antalet injektions ställen, placeringen av injektions ställena och mängden PFFS som injicerats kan leda till resultat och progression av synucleinopati, bör resultaten av de parametrar som används i efterföljande led karakteriseras före användning av modellen för att testa potentiella interventioner eller undersöka tidsmässiga särdrag i modellen.
När man väljer en modell som ska användas för att testa terapier eller studera sjukdomsprogression, bör den modell som används väljas för att bäst besvara frågan. Inte alla modeller kommer att ha vissa sjukdoms egenskaper hos PD, eller erbjuda den tidsram som behövs för att testa potentiella interventioner. Den PFF modell recapitulates nyckel dragen av PD, sådan som α-syn patologi och neurodegeneration, och kanna leda till blygsam motor försämringar. Modellen erbjuder en förutsägbar och utdragen tid-kurs, där inne slutningar form månader före neurodegeneration. Detta gör det möjligt för forskare att undersöka och utnyttja de olika faserna under den långvariga utvecklingen av synucleinopati. Den nuvarande och framtida användningen av modellen övergripande förväntas vara fördelaktigt i studiet av sjukdomsprogression och utveckling av nya terapier.
Disclosures
Joseph Patterson, Kelvin Luk, och Caryl Sortwell är för närvarande inblandade i avtals arrangemang med Michael J. Fox stiftelsen för kvalitets kontroll α-syn material som genereras av Proteos, Inc. Coauthor Nicole Polinski, är anställd av Michael J. Fox Stiftelsen, som har kontrakterat Proteos, Inc. för att producera α-syn monomer. Medförfattare Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley, och Nicholas Kanaan har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från Michael J. Fox Foundation, National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NS099416) och Weston Brain Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
| Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
| Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
| Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
| Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
| Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
| Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
| Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
| Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
| Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
| Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
| Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
| Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
| ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
| Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).
- Paumier, K. L., et al. Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration. Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).
- Abdelmotilib, H., et al. alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).
- Duffy, M. F., et al. Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration. Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).
- Duffy, M. F., et al. Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease. Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).
- Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).
- Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies. Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).
- Neumann, M., et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies. The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).
- Li, J. Y., et al. Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).
- Shimozawa, A., et al. Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain. Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents. Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).
- Fares, M. B., et al. Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).
- Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Scientific Reports. 8, 10788 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. , (2008).
- Tarutani, A., et al. The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation. Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).
- Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons. Neuron. 79, 347-360 (2013).
