Summary
박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
이 원고는 두 박테리아 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 감지하고 특성화하기 위한 배양 기반의 동전 분석기를 설명합니다. 이 방법은 각 인구의 선택과 시각적 인 차별을 위해 각 인구가 뚜렷한 항생제 내성 기능 및 형광 단백질로 차별적으로 태그 될 수 있도록 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 여기에서는, 우리는 경쟁하는 Vibrio fischeri 긴장, 형광 현미경 화상 진찰 및 정량적인 데이터 분석의 준비 그리고 동전을 기술합니다. 이 접근법은 간단하고, 빠른 결과를 산출하고, 한 집단이 다른 집단의 성장을 죽이거나 억제하는지, 그리고 경쟁이 확산 가능한 분자를 통해 매개되는지 또는 직접적인 세포 세포 접촉을 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 각 세균성 인구는 다른 형광 성 단백질을 표현하기 때문에, 분석은 혼합 된 식민지 내에서 경쟁 인구의 공간 차별을 허용합니다. 기재된 방법은 이 종에 최적화된 조건을 사용하여 공생 균 V. fischeri로 수행되지만, 프로토콜은 대부분의 균류균 분리에 적응될 수 있다.
Introduction
이 원고는 두 개의 세균 성 분리가 경쟁적인 상호 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하는 문화 기반 방법을 간략하게 설명합니다. 혼합 인구를 연구할 때, 박테리아 격리가 상호 작용하는 정도, 특히 격리가 간섭 메커니즘을 통해 직접 경쟁하고 있는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 간섭 경쟁은 한 집단이 직접 성장을 억제하거나 경쟁집단을 죽이는 상호 작용을 말합니다 1. 이러한 상호 작용은 미생물 커뮤니티의 구조 및 기능2,3에심오한 영향을 미칠 수 있기 때문에 식별하는 것이 중요합니다.
미생물 경쟁을 위한 기계장치는 호스트 관련및 자유로운 생활 박테리아를포함하여 다양한 환경에서 박테리아의 게놈에서 광범위하게 발견되었습니다 4,5,6,7, 8,9. 다양한 경쟁 전략이 기재된10,11은 살균 화학물질 1,12 및분비된 항균 펩티드(13)와 같은 확산성 기전을 포함한다. 뿐만 아니라 표적 세포로 억제 효과를 전달하기 위해 세포 접촉을 필요로 하는 접촉의존적 메커니즘 9,14,15,16,17 ,18.
배양 기반 동전은 일반적으로 미생물학5,8,19에서사용되지만, 이 원고는 분석법을 사용하여 경쟁 메커니즘을 특성화하는 방법과 적응을 위한 제안을 간략하게 설명합니다. 다른 세균 종과 함께 사용하기위한 프로토콜. 또한 이 방법은 경쟁 상호 작용의 특성에 대한 다양한 질문에 답하기 위해 데이터를 분석하고 제시하기 위한 여러 접근 방식을 설명합니다. 여기에 기술된 기술은 이전에 비브리오 피셔리 박테리아(19)의 공생 균주 사이의 비특이적 경쟁기의 근본적인 교단 내 생존 메커니즘을 확인하기 위해 사용되었지만, 이들은 환경 분리및 인간 병원균을 포함한 많은 세균종은 접촉 의존성 및 확산성 경쟁 메커니즘을 평가하는 데 활용될 수 있다. 프로토콜의 단계는 다른 세균 종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 더 많은 모델 시스템이 다른 유전자형을 포함하는 등소원 성 유기체의 사용을 넘어 연구를 확장하고 있음을 감안할 때10,16,20,21,이 방법은 귀중한 자원이 될 것입니다. 경쟁이 다중 균주 또는 다종 시스템에 미치는 영향을 이해하고자하는 연구자.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 동전 큐브에 대한 균주를 준비
- 동전 분석 동안 세균 경쟁의 표적으로 작용할 적절한 기준 균주를 선택한다. 참조 변형률을 선택할 때의 모범 사례와 참조 변형이 결과에 미치는 영향에 대한 토론을 참조하십시오. 이 프로토콜에서, V. fischeri 스트레인 ES114는 기준 균주로서 작용할 것이다.
-
코인큐베이션에서 분리된 분리를 구별하기 위해 어떤 선택 및 스크리닝 방법을 사용할지 결정
- 전형적으로, 각 균주를 위해 선택하기 위하여 다른 항생 저항 유전자 (예를 들면 카나마이신 또는 클로람페니콜)를 포함하는 안정한 플라스미드를 가진 긴장을, 뿐만 아니라 다른 형광성 단백질 (예를 들면 GFP 또는 RFP)를 시각적으로 위해 칭하는 유전자를 선택합니다 공동 배양에서 균주 유형을 구별합니다.
참고: 변형이 선택의 부재에서 플라스미드를 잃는 경우, 다음이 균주의 숫자는 정량화 할 때 과소 평가될 것이기 때문에 안정적인 플라스미드의 사용이 필요하며, 형광 현미경 을 사용하여 시각적으로 검출되지 않습니다. - 태그 코인큐베이트 V. fischeri 균주는 하나의 균주가 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 항생제 카나마이신 (Kan R)에 대한 내성을 발현하는 플라스미드 pVSV102를 포함하고, 두 번째 균주는 두 번째 균주를 포함하도록 차별화 플라스미드 pVSV208은, 적색 형광 단백질(dsRed) 및 항생제 클로람페니콜(CmR)에 대한 내성을 발현한다(Cm R)22.
참고: 다른 차동 선택은 동전 균주를 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 추가 방법은 토론을 참조하십시오. - 동전 분석법의 초기 최적화 동안 다음 제어를 포함하여 선택이 견고하도록 한다. 그것에 대하여 선택해야 하는 항생제를 포함하는 한천 판에 차별적으로 태그되는 각 스트레인 플레이트(즉, 변형균2를 선택하는 매체에 플레이트 스트레인 1, 그 반대의 경우도 마찬가지).
- 전형적으로, 각 균주를 위해 선택하기 위하여 다른 항생 저항 유전자 (예를 들면 카나마이신 또는 클로람페니콜)를 포함하는 안정한 플라스미드를 가진 긴장을, 뿐만 아니라 다른 형광성 단백질 (예를 들면 GFP 또는 RFP)를 시각적으로 위해 칭하는 유전자를 선택합니다 공동 배양에서 균주 유형을 구별합니다.
- 동전 분석, 줄무늬 기준 변형pVSV102, 기준 균주 pVSV208, 및 각 경쟁사 균주 pVSV208 -80°C 에서 적절한 항생제를 함유하는 LBS 한천 플레이트에 pVSV208(예를 들어, 100 μg/mL 카나마이신 또는 2 μg/mL) 클로람페니콜)을 24°C에서 밤새 배양한다. 항생제 선택은 모든 세포가 실험의 시작 부분에 플라스미드를 포함되도록 하는 데 필요합니다.
- 분석하기 하루 전에, 적절한 항생제와 함께 신선한 LBS 한천 접시에 균주 유형 (생물학적 복제)당 4 개의 개별 식민지를 선택하고 다시 24 °C에서 밤새 배양.
참고: 이 단계는 관심 있는 유기체의 성장 속도에 따라 충분한 세포를 얻기 위해 더 길거나 짧은 배양 시간이 필요할 수 있기 때문에 다른 세균 종에 대한 최적화를 요구할 수 있다.
2. 코인큐베이트 세균균주
- 배양을 위한 각 세균성 긴장의 준비(그림1A)
- 멸균 이쑤시개를 사용하여 한천 접시에서 세포를 긁어 내고 (쌀 알갱이 크기만큼) LBS 국물 1 mL을 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 튜브의 측면으로 누르고 활발하게 위아래로 파이펫팅하여 세포 덩어리를 분해.
- 튜브와 소용돌이를 1-2 초 동안 캡하십시오. 셀 덩어리가 여전히 보이는 경우 샘플이 시각적으로 균일 할 때까지 위아래로 소용돌이 또는 파이펫을 계속하십시오.
- 모든 샘플에 대해 2.1.1-2.1.2 단계를 반복합니다.
- 모든 시료에 대해 광학 밀도를 600nm(OD600)로측정하고 기록합니다. 정확한 OD 측정을 위해 LBS 국물을 사용하여 샘플을 최대 10배까지 희석해야 합니다. 원하는 OD600으로각 샘플을 정규화합니다. 균주는 전형적으로 OD600~1.0으로 정규화되며, 이는 V. fischeri에대해 ~106 박테리아/mL로 변환됩니다.
참고: 이 단계는 접종 세포 밀도가 경쟁의 메커니즘에 따라 코인큐브생성 결과에 영향을 미치기 때문에 상이한 세균 종에 대한 최적화를 요구할 수 있다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오. - 동전 균주(그림1B,C)
- 표지된 1.5 mL 원심분리튜브에 각 스트레인의 100 mL(OD 1.0으로 정규화)를 추가하여 기준 변형률과 경쟁균주를 1:1 비율(v/v)으로 혼합합니다. 컨트롤로서, 기준 스트레인을 차별화태그된 버전 자체(참조 스트레인 pVSV102 + 기준 변형변형 pVSV208)와 혼합한다. 이 제어는 경쟁 자 변형의 존재가 기준 변형의 성장에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 나중에 통계 분석에 필요합니다. 1-2s에 대한 혼합 스트레인 배양소용돌이.
참고: 이 단계는 시작 비율이 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으며 조정해야 할 수 있기 때문에 최적화가 필요할 수 있습니다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오. - 각 생물학적 복제에 대해 2.3.1 단계를 반복합니다. 이 단계를 완료 한 후, 8 개의 혼합 변형 튜브의 총이 있어야합니다 : 차별화 태그 참조 균주 (제어)와 네 개의 생물학적 복제, 차별화 태그 참조 및 경쟁 균주를 가진 네 개의 생물학적 복제 ( 실험).
- LBS 한천을 함유하는 페트리 플레이트에 각각의 대조군 및 실험혼합물의 10 mL을 스팟; 이러한 배양 반점은 배양 후 형광 현미경 검사법에 사용됩니다.
- 모든 액체가 한천에 흡수될 때까지 반점이 벤치에서 완전히 건조되도록 하고 24시간 동안 24°C에서 페트리 플레이트를 배양합니다. pVSV102 및 pVSV208로 태그가 지정된 V. fischeri 균주는 형광 해부 현미경을 사용하여 인구 수준에서 각각 GFP 및 RFP를 시각화하기에 충분한 세포 밀도로 성장하기 위해 최소 15회가 필요합니다. 여기에서, 우리는 화상 진찰 혼합 반점을 위한 24 시간 배양을 이용합니다.
참고: 너무 촉촉하거나 너무 건조하지 않은 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다. 접시가 너무 습한 경우, 동전 반점은 한천 접시에 흡수되지 않습니다; 같은 날 부은 접시를 사용하지 마십시오. 플레이트가 너무 건조하면 한천 표면에 작은 파도나 균열이 형성되어 동전 반점이 불규칙하게 형성될 수 있습니다. - 단계 2.3.3에서와 동일한 세균 현탁액을 사용하여, 각 대조군 및 실험 혼합물의 10 mL을 잘 당 LBS 한천 1 mL을 포함하는 24 웰 플레이트에 자리. 2.3.3 단계에서와 같이, 24 웰 플레이트의 한천에 적절한 수분을 가지고 있는지 확인하십시오. 반점이 완전히 건조되고 24 °C에서 5 시간 동안 배양하십시오. 이들 배양 스팟은 실험의 끝에 있는 각 균주에 대한 콜로니 형성 단위(CFUs)를 정량화하는데 사용될 것이다.
참고: 개별 우물에서 성장을 위한 세균 성 현탁액을 발견하면 종료 시점에서 쉽게 재서스펜션할 수 있습니다. 이 단계는 24웰 플레이트를 사용하는 보다 경제적인 접근법으로서 정사각형 멸균 필터 조각을 사용하여 달성될 수 있다. 정사각형 멸균 필터 조각은 한천 플레이트에 배치할 수 있으며 각 실험 혼합물의 10 mL는 24웰 플레이트가 아닌 이러한 필터 위에 발견될 수 있습니다. 동전 화 시간 후, 필터는 1.5 mL 원심분리기 튜브로 이송될 수 있고 코인큐브 스폿은 와류 또는 위아래로 피펫팅하여 재중단될 수 있다. 5 시간 배양 시간은 V. fischeri 격리19사이 간 세균 살해를 검출하기에 충분합니다, 그러나, 이 동전 벌기 시간은 그밖 종 또는 경쟁적인 기계장치를 위해 더 짧거나 더 길어야 할 수도 있습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
- 표지된 1.5 mL 원심분리튜브에 각 스트레인의 100 mL(OD 1.0으로 정규화)를 추가하여 기준 변형률과 경쟁균주를 1:1 비율(v/v)으로 혼합합니다. 컨트롤로서, 기준 스트레인을 차별화태그된 버전 자체(참조 스트레인 pVSV102 + 기준 변형변형 pVSV208)와 혼합한다. 이 제어는 경쟁 자 변형의 존재가 기준 변형의 성장에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 나중에 통계 분석에 필요합니다. 1-2s에 대한 혼합 스트레인 배양소용돌이.
- 접종을 시작하기 위한 직렬 희석
- 시작 동전 혼합물의 직렬 희석을 수행하려면 8 개의 열과 12 개의 행이 있도록 96 웰 플레이트90 °를 회전시면 됩니다. 각 행은 첫 번째 열에 희석되지 않은 혼합물의 샘플을 포함하고 행의 나머지 웰에 걸쳐 7개의 10 배 직렬 희석이 뒤따릅니다 (그림 2A).
- 변형률 ID, 복제 번호 및 시간(접종 시작 = T0)으로 각 행에 레이블을 지정합니다. 희석 시리즈를 발견할 수 있는 적절한 항생제로 보충된 LBS 한천 플레이트에 라벨을 붙입니다. 각 항생제 판이 선택하는 균주를 확인하십시오.
- 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 180 mL의 LBS 국물을 추가하고 원액 동전 혼합물에 대한 첫 번째 열을 비워 둡니다.
참고: 연구원은 특히 빠르게 성장하는 세균 종으로 작업하거나 직렬 희석이 걸릴 수 있습니다 큰 실험을 수행하는 경우 인산완충 식염수 (PBS)를 사용하여 동전 반점을 다시 중단하고 직렬 희석을 수행 하도록 선택할 수 있습니다. 오랜 시간 동안 수행 할 수 있습니다. 이러한 경우에 PBS를 사용 하 여 직렬 희석을 수행 하는 과정에서 박테리아의 상당한 발생을 방지할 것 이다. 그러나 크기 나 기간에 관계없이 모든 실험에서 사용되는 솔루션(예: PBS 또는 LBS)과 일관성을 유지해야 합니다. - 200 mL 단일 채널 파이펫을 사용하여, 튜브로부터 제1 컬럼으로 100 mL의 코인큐베이션 혼합물을 잘 이송한다. 팁을 버리고 모든 동전 혼합물에 대해 반복하십시오.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 기둥 1에서 2로 20mL를 전송하고 위아래로 파이펫팅하여 혼합합니다. 팁을 버리고 각 열에 대해 반복하여 각 행에 초기 동전 혼합물의 10 배 직렬 희석이 포함되어 있습니다.
참고: 희석이 위아래로 피펫처리되는 횟수와 일치합니다. 예를 들어, 각 희석에 대해 파이펫 핸들을 5회 누르고 희석 계열 전체에서 일관되게 합니다. - 8개의 팁이 장착된 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석 시리즈(즉, 8개의 우물 의 한 행)에서 각 우물에서 5mL를 흡인하고 참조 변형을 선택하는 LBS 한천 플레이트에 스폿을 놓습니다(카나마이신으로 보충). 이 단계를 반복하여 경쟁균주에 대해 선택된 플레이트에 스포팅(클로람페니콜보충제)(그림2B)을반복한다. 인큐베이터에 넣기 전에 반점이 완전히 건조되도록 하십시오.
참고: 동일한 팁은 참조 및 경쟁 자 변형을 위해 선택된 플레이트에서 복제 희석 계열을 스크리처하는 데 사용될 수 있지만 복제 사이에 변경되어야 합니다. 이 세균 식민지를 닮은 우울증을 만들 수 있으며 플레이트 카운트 동안 결과를 왜곡 할 수 있기 때문에 LBS 한천 접시에 파이펫 팁의 끝을 만지지 마십시오. 팁이 접시를 만지면 메모를하고 식민지 수에 우울증을 포함하지 마십시오.
- T 최종 측정
- 24웰 플레이트의 코인큐베이션 스팟을 24°C에서 5시간 동안 배양한 후, 각 웰에 1 mL의 LBS 국물을 추가하고 모든 세포가 다시 중단될 때까지 위아래로 파이펫팅하여 코인큐베이션 스팟을 다시 중단합니다. 세포가 모든 복제에 걸쳐 다시 일시 중단되는 활력과 일치합니다. 예를 들어 파이펫 핸들을 8번 누르고 각 샘플을 완전히 다시 일시 중단합니다.
- 각 코인큐브 스팟이 재중단되면, 2.4.1단계와 같은 방식으로 희석을 스니치하는 적절한 항생제로 직렬 희석 및 LBS 한천 플레이트를 위한 96웰 플레이트를 준비한다.
- 2.4.2-2.4.6 단계를 수행하여 T 최종 측정을 위한 직렬 희석을 완료합니다.
참고: 중요한 대조군은 동전 분석법의 초기 최적화 동안 포함되어야 한다. 동전 배기 기간의 끝에서, 혼합 된 균주를 두 항생제를 포함하는 매체에 플레이트. 1) 자발적인 돌연변이가 발생하거나 2) 선택 가능한 마커가 균주 간에 교환되지 않는 한 어느 균주도 성장할 수 없습니다.
3. 형광 현미경 을 사용하여 동전 을 시각화
- LBS 한천 페트리 플레이트상에서 각각의 코인큐베이션 스팟은 안정한 플라스미드 상에서 발현되는 형광 단백질에 대응하는 녹색 및 적색 형광 검출을 위해 장착된 스테레오 현미경을 사용하여 2.3.3 단계 및 2.3.4 단계에서 의한 각 동전 방출 스팟을 사용한다.
-
먼저 제어 코인큐브 스팟(참조 변형률 pVSV102 + 기준 변형률 pVSV208)의 이미지를 촬영합니다.
- 자리가 초점에 맞춰지 않도록 배율을 조정합니다.
- GFP를 관찰하기 위해 적절한 여기 빛과 필터를 사용하여, 코인큐베이션 스팟에서 단지 형광이 검출가능하고 매체에서 어떤 배경 형광이 낮거나 보이지 않도록 노출 시간을 조정합니다.
- 여기 빛과 필터를 변경하여 RFP를 관찰하고 노출 시간을 조정하여 매체의 배경을 최소화합니다.
- 실험 적 치료로부터의 각 코인큐베이션 스팟에 대해, GFP 필터를 이용한 기준 균주에 대한 이미지 및 3.2.2단계에서 결정된 노출 시간.
- RFP 필터를 사용하여 경쟁사 균주를 이미지화하고, 배지로부터의 코인큐베이션 스폿 및 배경 형광으로부터만 형광이 관찰되도록 노출 시간을 조정하는 것은 최소한의 양세이다. 두 이미지를 저장하고 이를 모두 저장하여 스트레인 아이디, 복제 번호, 이미지를 촬영한 인큐베이션 시간(예: 24시간)을 모두 포함합니다. 모든 복제에 대해 반복합니다.
참고: 코인큐베이션 시간은 다른 플라스미드 또는 세균 종에 대해 조정되어야 할 수도 있다. 최적화에 대한 토론을 참조하십시오.
4. 데이터 분석
- 각 시점에서 각 제어 및 실험 치료에 대한 CFUs 계산(T 시작 및 T 최종)
- 일단 콜로니가 직렬 희석 판(예를 들어, V. fischeri의경우 24°C에서 24시간)에 표시되면, 개별 콜로니가 계산될 수 있고 큰 다중 콜로니 클러스터로 함께 성장하지 않은 희석 계수를 식별합니다(그림2B). 각 복제에 대해 지정된 희석에 대한 개별 콜로니 수를 계산하고 기록합니다. 이 숫자는 해당 복제에 대한 CFU를 나타냅니다.
- 희석에 대한 CFU를 아래 수식을 사용하여 코인큐베이션의 각 균주에 대한 총 CFUs로 변환합니다.
[ 희석점의 CFUs (희석인자 x vol.) x vol. 희석되지 않은 시료 = 총 CFU
예: T0: [(6 CFUs) ́ (10^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 실험 시작 시 혼합 스팟에서 변형률 1의 총 CFU 1.2E7
T5: [(4 CFUs) ́ (10^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 5 시간 동전 방합 후 혼합 스팟에서 변형 1의 총 CFUs 8.0E5
각 스트레인의 CFU 값은 여러 가지 분석 및 통계 테스트에 사용할 수 있는 원시 데이터입니다(아래 섹션 4.2 참조).
- 다음 데이터 변환을 수행하여 경쟁 업체 변형이 기준 변형을 능가하는지 여부를 결정합니다: (i) 경쟁 스트레인의 존재 에서 기준 변형의 비율이 감소하는지 여부를 결정하거나 (ii) 상대적 경쟁 지수(RCI)를 기록할 수 있습니다. 이러한 분석은 원시 데이터를 비율로 변환하고 상호 작용의 경쟁 결과를 결정하는 데 유용할 수 있지만 경쟁 메커니즘(즉, 살인 대 성장 억제)을 결정할 수는 없습니다.
- 코인큐베이션 동안 각 시점에 대한 각 스트레인의 비율 계산
- CFU 데이터를 치료에서 각 균주의 비율로 변환합니다. T0의 기준 변형률(RS)의 경우 T0의 기준 변형률에 대한 총 CFU를 T0의 기준 변형률에 대한 총 Cfu와 T0의 경쟁자(CS)의 합계로 나눕니다.
RST0 CFUs (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = T0에서 기준 변형률의 비율.
동일한 계산을 수행하여 T0에서 경쟁 업체 변형률의 비율을 결정합니다.
CST0 CFUs (RST0 CFUs + CST0 CFUs) = T0에서 기준 변형률 비율
각 시점마다 이 과정을 반복하고 실험 적 치료 및 대조군 치료 모두에 대해 복제한다(차별화태그가 붙은 기준 변형균주 동전). - 누적 막대 그래프(그림 3A)에서 T0 및 T5의각 변형유형의 평균 비율을 그래프로 표시합니다.
- 균주의 원하는 시작 비율을 수득되었는지 확인합니다. 균주가 처음에 1:1을 혼합한 코인큐베이션의 경우, 각 균주 유형은 T0에서 인구의 ~0.5를 포함해야 하며 학생의 T-test(P > 0.05)를 사용하여 서로 통계적으로 달라서는 안 됩니다. 한 균주의 비율이 T0의 다른 균주보다 훨씬 큰 경우 1:1 시작 비율이 달성될 때까지 실험을 반복합니다.
- 경쟁 균주가 5 시간 후에 인구의 상당히 더 큰 비율을 포함하는지 여부를 결정합니다. T0 및 T5에서 실험 적 치료에서 각 균주의 비율을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다. 경쟁 균주의 비율이 T5(P < 0.05)의 기준 변형률과 크게 다른 경우, 이 결과는 변형 경쟁이 발생했을 수 있음을 시사한다. 4.2.1.5 단계로 진행합니다.
- 경쟁 균주의 존재가 5 시간 후에 기준 변형의 비율을 감소했는지 여부를 결정하기 위해, 대조군에서 기준 변형률의 비율을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행하고 실험 적 치료 (기준 변형 v 경쟁 변형).
참고 : 기준 균주의 비율이 대조군(P < 0.05)에 비해 실험 치료에서 통계적으로 낮은 경우, 경쟁 균주는 5 시간 후 기준 균주의 비율을 현저히 감소시키고 기준 변형률을 능가했습니다.
- CFU 데이터를 치료에서 각 균주의 비율로 변환합니다. T0의 기준 변형률(RS)의 경우 T0의 기준 변형률에 대한 총 CFU를 T0의 기준 변형률에 대한 총 Cfu와 T0의 경쟁자(CS)의 합계로 나눕니다.
- 각 치료에 대한 로그 RCI 값 계산(컨트롤 포함)
참고: 상대적 경쟁 지수(RCI)는 변형률 유형의 종단 비율이 시작 비율과 어떻게 다른지 비교하는 단일 값입니다. RCI 값은 로그 변환되어 로그 RCI 값이 0보다 큰 로그 RCI 값이 경쟁자 변형(CS)이 기준 변형률(RS)을 능가하고, 로그 RCI 값이 0보다 작다는 것은 경쟁자 변형을 능가하는 기준 스트레인을 나타내고, 로그 RCI가 경쟁자 변형을 능가하는 것을 나타냅니다. 값이 0이면 어느 스트레인도 경쟁하지 않았다는 것을 나타냅니다.- 다음 방정식을 사용하여 각 제어 및 실험 처리에 대한 로그 RCI 값을 계산합니다.
로그 [(CST5 CFU+ RST5 CFUs) - 그래프 로그 RCI 값은 분리된 상자 및 수염 플롯을 사용하여 데이터가수평 방향으로 그래프화됩니다(그림 3B).
- 각 치료의 로그 RCI 값(대조군 포함)을 동일한 수의 복제수를 0 값으로 비교한 데이터 세트와 학생의 t-test를 비교하여 각 치료가 0과 크게 다른지 여부를 결정합니다. 실험 적 치료에 대한 로그 RCI 값이 통계적으로 0(P < 0.05)보다 큰 경우, 경쟁 균주는 기준 변형을 능가합니다.
참고: 대조군이 0(P > 0.05)과 통계적으로 다르지 않아야 하는데, 이는 차별화된 참조 균주가 등소성이기 때문이다. - 실험적 치료에 대한 로그 RCI 값이 대조군(P < 0.05)보다 훨씬 큰지 여부를 결정하기 위해 학생의 t-검정을 수행한다. 실험적 치료로부터의 로그 RCI 값이 대조군 처리보다 통계적으로 큰 경우, 경쟁균주는 기준 균주를 능가한다.
- 다음 방정식을 사용하여 각 제어 및 실험 처리에 대한 로그 RCI 값을 계산합니다.
- 코인큐베이션 동안 각 시점에 대한 각 스트레인의 비율 계산
- 다음 통계 분석을 수행하여 경쟁 업체 변형이 기준 변형을 능가하는 메커니즘을 결정합니다: (i) 원시 총 CFU 데이터를 분석하거나 (ii) 기준 변형률의 백분율 복구를 검사합니다. 이러한 분석은 4.2단계에서 의한 것들을 기준으로 보는 것이 더 번거로울 수 있지만, 경쟁사 스트레인이 기준 스트레인을 성장시키고, 기준 변형률 성장을 억제하거나, 기준 변형률을 적극적으로 제거함으로써 기준 변형을 능가하는지 여부를 식별할 수 있습니다.
- 원시 총 CFU 데이터 분석
- 인터리브 란터 플롯을 사용하여 두 균주에 대한 원시 총 CFU 데이터를 그래프로 표시하고 복제는 개별 데이터 포인트로 표시됩니다(그림4A). 로그 축척에 데이터를 표시하고 두 균주에 대한 평균 T0 CFUs를 나타내는 수평 선을 추가합니다.
- 경쟁 균주의 존재가 기준 균주에 부정적인 영향을 미치는지 여부를 확인하려면 T5에서 제어 및 실험 치료에 대한 참조 변형 CFUs를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다. 실험 적 치료에서 기준 균주 CFUs가 대조군(P < 0.05)보다 통계적으로 낮은 경우, 경쟁 균주의 존재는 기준 균주에 크게 영향을 미쳤다.
- 경쟁 균주의 존재가 기준 균주의 성장을 억제하거나 제거했는지 여부를 결정하기 위해, 제어 및 실험 적 치료에 대한 T0 및 T5에서 기준 변형 CFUs를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행합니다.
참고: 경쟁자가 없는 경우, 대조군 치료를 위한 T0 및 T5를 비교할 때 기준 균주는 CFU에서 유의한 증가를 나타내야 한다. 실험적 치료를 분석할 때, T5에서의 기준 균주 CFUs가T0(P> 0.05)에 비해 통계적으로 다르지 않은 경우, 이어서 경쟁균주는 기준 균주의 성장을 억제하였다. 기준 변형률 T5 CFUs가 T0CFUs(P< 0.05)보다 현저히 낮은 경우, 경쟁 균주는 기준 변형을 죽였습니다.
- 기준 변형률의 백분율 복구 계산
- 아래 방정식을 사용하여 기준 변형률(RS)에 대한 총 CFU 데이터를 백분율 복구 데이터로 변환합니다.
- (RST5 CFUs ́ RST0 CFUs) x 100 = 기준 변형률 % 회수
- 각 막대가 대조군 또는 실험적 처리를 나타내는 분리된 막대 그래프를사용하여 기준 변형률의 백분율 복구를 표시합니다(그림 4B). 참조 변형률의 100% 복구를 나타내기 위해 y = 100에서 파선 선을 추가합니다(0시간에서 5시간까지 참조 변형 CFUs의 증가 또는 감소 없음).
- 경쟁 균주가 기준 균주에 부정적인 영향을 미치는지 여부를 확인하려면, 실험 치료에 대한 대조군 치료에 대한 기준 변형률 %의 회복을 비교하는 학생의 t 테스트를 수행한다. 백분율 회수가 대조군(P&0.05)보다 현저히 적으면 경쟁 균주가 기준 변형에 부정적인 영향을 미칩니다.
- 경쟁 균주가 기준 균주의 성장을 억제하거나 제거했는지 여부를 식별하려면 실험 치료에 대한 기준 변형률 백분율 복구를 비교하는 학생의 t 테스트를 수행하고 동일한 수의 복제물로 데이터 세트를 수행합니다. 값 100입니다.
참고: 실험적 치료가 100(P> 0.05)과 통계적으로 다르지 않은 경우, 경쟁균주는 기준 균주의 성장을 억제하였다. 실험 적 치료에서 기준 균주 퍼센트 회수가 100 (P< 0.05)보다 현저히 낮은 경우, 경쟁 균주는 기준 균주를 죽였다.
- 형광 현미경 이미지 해석
- 형광 현미경 이미지가 촬영되면, 각 균주가 동전 지점에서 눈에 띄게 검출 가능한지 여부를 결정합니다. 제어 코인큐브(기준 변형변형pVSV102 + 기준 변형변형pVSV208)의 경우, GFP와 RFP는 모두 하나의 코인큐베이션 스팟에서 볼 수 있어야 한다. 그렇지 않은 경우, 균주가 항생제없는 접시에 제대로 표지되고 동전화되도록 실험을 다시 설정하십시오.
- 각 실험 코인큐브 스팟에 대해 가능한 결과를 확인하십시오.
참고: 경쟁 기 변형이 표시되지만 기준 변형이 검출되지 않는 경우, 이는 경쟁자 변형이 기준 스트레인의 성장을 죽이거나 억제했음을 시사한다. 두 균주가 존재하고 균일하게 혼합된 경우(동전 배합 지점에 걸쳐 GFP 및 RFP 존재), 이러한 데이터는 경쟁 균주가 기준 균주와 경쟁하지 않고 두 균주가 공존하는 것을 시사한다. 두 균주가 존재하지만 공간적으로 분리된 경우(GFP 또는 RFP의 마이크로콜로니는 코인큐베이션 스폿 전체에 존재함), 기준 균주와 경쟁사 균주가 경쟁적인 상호 작용 및 변형에 관여할 수 있음을 시사합니다. 기준 변형또는 초기 코인큐베이션 비율이 필요할 수 있다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
- 원시 총 CFU 데이터 분석
5. 상호 작용이 접촉 의존적인지 여부 결정
참고: 하나의 스트레인이 기준 변형을 죽이거나 억제하는 것을 발견하면 상호작용이 확산가능하거나 접촉에 의존적일 수 있습니다. 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, 다음 의 변형을 가진 단계 1-2에 대해 전술한 바와 같이 동전 분석기를 수행한다.
- 단계 1.1-2.2를 수행합니다.
- 균주가 정규화되면 0.22 mm 기공 크기의 니트로 셀룰로오스 필터를 사용하여 균주를 물리적으로 분리합니다. 이 공극 크기는 항균제와 작은 분자의 확산을 허용하지만 V. fischeri 세포 사이의 물리적 접촉을 방지합니다.
참고: 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하는 경우, 경쟁균으로부터 기준 균주를 필터와 분리하여 살인 또는 억제 표현형을 폐지해야 하며 기준 균주는 CFU를 감소시키지 않아야 한다. 상호작용이 세포-세포 접촉에 의존하지 않고, 확산 성 메커니즘인 경우, 균주를 분리하는 것은 경쟁균이 기준 균주를 죽이는 것을 방지해서는 안 된다.- 기준 스트레인의 5 mL을 필터의 중심에 놓고 경쟁업체 의 스트레인을 다른 필터의 중심에 5 mL 를 스폿합니다. 참조 변형이 포함된 필터를 LBS 한천 플레이트의 표면에 놓습니다. 경쟁 업체 변형이 포함된 필터를 참조 변형이 있는 필터 바로 위에 놓습니다.
참고: 각 균주는 균주가 더 쉽게 서로의 상단에 직접 배치 할 수 있도록 한천 접시에 직접 발견 바닥 변형보다는 필터에 발견된다. - 균주가 서로의 상단에 직접 적층되지 않는 우려가있는 경우, 필터에 발견 기준 변형 접종의 볼륨을 감소. 이렇게 하면 기준 스트레인 스폿의 면적이 더 작고 완전히 경쟁기 스트레인 위 또는 아래에 있습니다. 한천 배지에서 영양소의 확산의 차이를 고려하기 위해 상단과 하단에 있는 균주가 대체됩니다.
- 필터가 소분자의 확산을 허용하도록 하기 위해, 기준 균주가 필터상에 발견되는 제어 처리를 포함하고 다른 것으로는 민감성(클로람페니콜)에 민감한 항생제를 포함한다. 필터를 서로 바로 겹치게 쌓고 LBS 한천 접시에 놓습니다. 항생제는 필터를 통해 확산 할 수 있어야하고 기준 변형을 죽여야한다.
- 기준 스트레인의 5 mL을 필터의 중심에 놓고 경쟁업체 의 스트레인을 다른 필터의 중심에 5 mL 를 스폿합니다. 참조 변형이 포함된 필터를 LBS 한천 플레이트의 표면에 놓습니다. 경쟁 업체 변형이 포함된 필터를 참조 변형이 있는 필터 바로 위에 놓습니다.
- 5 시간 동안 24 °C에서 필터로 플레이트를 배양하십시오. 필터를 이동하지 않도록 배양 할 때 한천 판을 반전시키지 마십시오.
- 단계 2.4에 따라 시작 접종에 대한 직렬 희석을 수행합니다.
-
T 최종 측정
- 멸균 핀셋을 사용하여 각 필터 세트를 LBS 국물 5mL가 들어 있는 50mL 팔콘 튜브로 옮김. 각 변형 유형의 전체 재현탁액을 허용하기 위해 필터가 튜브 내에서 물리적으로 분리되어 있는지 확인합니다.
- 필터가 모든 셀의 명확한 때까지 위아래로 파이펫팅하여 필터에서 균주를 다시 일시 중단합니다. 핀셋을 사용하여 필터를 회전시키고 양쪽에서 셀 재질을 지웁돌십시오. 샘플 사이에 에탄올로 핀셋을 살균하십시오.
- 2.5단계에 따라 T 파이널에 대한 직렬 희석을 수행합니다. T 파이널에 대한 총 CFU를 계산할 때 "원액 샘플의 총 부피"를 1mL에서 5mL로 조정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
세균 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 평가하기 위해, 동전 분석 프로토콜이 개발되고 V. fischeri에최적화되었다. 이 방법은 항생 저항 유전자 및 형광 성 단백질을 인코딩하는 안정한 플라스미드를 활용하여 각 균주의 차등 선택 및 시각적 차별을 허용합니다. 동전 분석에서 수집된 데이터를 분석함으로써, 상호작용의 경쟁적 결과 및 상호작용의 메커니즘을 식별할 수 있다. 일례로, 다음의 실험은 V. fischeri 분리체를 사용하여 수행하였다. 동전 균주는 두 개의 안정적인 플라스미드 중 하나를 품고 있었다: pVSV102 카나마이신 저항 및 GFP +를 표현, 또는 pVSV208 클로람페니콜 저항 및 DsRed +를 표현. 샘플 데이터에서, 균주는 1:1 비율로 혼합하고 LBS 한천 플레이트에서 5시간 동안 배양하였다. 대조군 처리로서, 기준 균주의 차별화태그된 버전을 서로 코인큐베이팅하였다. 실험적 처리는 기준 균주(항만 pVSV102) 및 경쟁자 변형균제 1 또는 경쟁자 변형률 2(항간 pVSV208)로 수행하였다. 도 1 및 도 2에도시된 바와 같이 각 균주의 배양액을 준비하고 코인큐베이팅하였다.
도3에서, 분석된 데이터는 경쟁사 스트레인 1 또는 2가 기준 스트레인을 능가하는지 여부를 결정하기 위해 두 가지 방법으로 제시된다. 도3A에서, 실험 동안 각 시점에 대한 각 균주 유형의 비율은 4.2.1단계에 따라 계산되었다. 실험 적 치료에서, 샘플 데이터는 기준 균주 및 경쟁자 균주 1이 대조군 치료에서 관찰되는 것과 일치하는 실험의 시작(0h) 및 끝(5h)에서 0.5의 비율로 존재한다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는 5시간 동전 화 후 변하지 않은 균주의 비율을 나타내며, 따라서 경쟁이 관찰되지 않았다. 대조적으로, 기준 균주가 경쟁균주 2로 배양되었을 때, 기준 균주는 실험의 시작 부분(0h)에서 0.5의 비율로 존재하였고, 실험의 끝(5시간)에서 비율 <01이 존재하였고, 이는 대조군보다 현저히 낮았다. 치료 (학생의 t-테스트 : P & 0.001). 이러한 데이터는 경쟁 스트레인 2의 존재 에서 기준 변형률의 비율이 감소했음을 나타내며, 따라서 경쟁 균주 2와 기준 변형률 간의 경쟁을 시사한다. 이러한 유형의 분석은 커뮤니티 내의 균주의 비율이 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는지 결정할 때 적용되어야 하지만 경쟁 상호 작용의 메커니즘을 결정하는 데 사용할 수 없으므로 추가 분석과 결합해야 합니다. 예를 들어, 경쟁사 균주 2의 존재에서 감소하는 기준 균주의 비율은 여러 유형의 상호 작용에 기인 할 수있다 : (i) 변형률 2는 기준 균주보다 더 빠르게 성장, (ii) 변형2 는 기준의 성장을 억제 변형, 또는 (iii) 변형 2 살인을 통해 기준 변형을 제거했다.
도3B에서, 로그 상대경쟁지수(RCI)는 4.2.2단계에 따라 각 치료에 대해 계산되었다. 기준 균주가 경쟁균1로 배양되었을 때, 로그 RCI 값은 0 또는 대조군 처리(P> 0.05)와 통계적으로 다르지 않았으며, 균주 들 간의 경쟁은 관찰되지 않았다. 그러나 기준 균주가 경쟁균주 2로 배양되었을 때, 로그 RCI 값은 0 및 대조군 처리보다 훨씬 컸다(학생의 t-test: P < 0.001). 이러한 데이터는 스트레인 2가 기준 변형을 능가하는 것을 시사한다. 로그 RCI 값을 분석하면 잠복기 동안 한 변형이 다른 스트레인보다 경쟁했는지 여부를 확인하는 간단한 방법을 제공합니다. 이 분석은 실험의 끝(5h)과 시작(0h)의 균주의 비율을 통합하기 때문에 시작 비율이 결과에 극적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 로그 RCI 데이터에서 결론을 도출할 때 시작 비율을 검토하고 고려해야 합니다. 또한, 이 분석은 경쟁 메커니즘에 대한 정보를 제공하지 않으며 단순히 배양 중에 균주의 비율이 어떻게 변하는지보고합니다.
그림 4는 주어진 상호 작용에 대한 경쟁 메커니즘을 결정하기 위한 두 가지 데이터 분석 방법을 표시합니다. 그림 4A에서는실험의 각 시점마다 각 균주에 대한 총 Cfus가 표시됩니다. 기준 균주가 경쟁균주 1로 배양되었을 때, 기준 균주에 대한 5h 및 CFUs의 과정에 걸쳐 두 균주의 CFU증가는 5시간(P> 0.05)에서 균주 1 또는 대조군과 유의히 다르지 않았다. 이러한 데이터는 기준 변형이 변형률 1의 존재에서 증가했음을 나타내며, 경쟁이 발생하지 않았다는 것을 시사한다. 그러나, 기준 균주를 경쟁균2로 배양했을 때, 스트레인 2 CFUs는 5시간 후에 증가하였으나 기준 균주에 대한 CFUs는 감소하였다. 기준 균주 CFUs는 균주 2 CFUs 및 5 시간에서 대조군보다 현저히 낮았다 (학생의 t-test: P & 0.002). 이러한 데이터는 균주 2의 존재 에서 기준 변형 CFUs가 감소한다는 것을 나타내고, 변형률 2가 기준 변형 세포를 죽인다는 것을 시사한다. 기준 균주가 CFU의 감소를 나타내지 않았지만 오히려 변화가 없는 경우(0 h 및 5h에서 기준 변형 CFUs 간의 통계적 차이 없음), 이러한 데이터는 기준 균주의 성장을 억제함으로써 기준 변형률 2를 능가하는 균주 2를 제안할 것이다. 각 시점에서 두 균주에 대한 CFU가 독립적으로 표시되고 경쟁 메커니즘을 식별하는 데 사용할 수 있기 때문에 변환되지 않은 총 CFU 데이터를 분석하는 것은 특히 유익합니다.
도 4B는 경쟁 자 변형의 존재가 기준 변형에 미치는 영향을 결정하기 위해 기준 변형의 백분율 회수를 보여줍니다. 기준 균주가 경쟁균주 1로 배양되었을 때, ~3,200% 회복이 관찰되었고, 이는 대조군과 통계적으로 다르지 않았으며 스트레인 1은 기준 균주의 백분율 회복에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 기준 균주가 경쟁균2로 배양되었을 때, ~4% 회복이 관찰되었고, 이는 대조군보다 현저히 낮았다(학생의 t-test: P < 0.002). 백분율 회복은 또한 100 (학생의 t-test: P < 0.002)보다 현저히 적었으며, 균주 2가 기준 변형 세포를 죽임으로써 기준 변형을 능가했음을 나타낸다. 백분율 회복이 100에서 통계적으로 다르지 않은 경우, 그 데이터는 균주 2가 기준 균주의 성장을 억제제안했다. 백분율 복구 데이터는 기준 변형률 모집단이 경쟁 균주의 존재에 어떻게 반응하는지 검사하여 경쟁 메커니즘을 특성화하는 간단한 방법을 제공합니다. 그러나 이러한 방식으로 데이터를 표시하면 시작 비율에 대한 정보와 인큐베이션 전반에 걸쳐 경쟁 균주의 풍부도가 어떻게 변화했는지를 제외합니다.
그림 1: 동전분석기를 보여주는 순서도. (A) pVSV102(기준 균주 표시 참조 균주 또는 R.S.) 또는 pVSV208(경쟁 균주 표시 컴플랭크 또는 C.S.)을 품고 있는 세균 균주는 기준 균주(LBS Kan) 또는 중 하나에 대해 선택적으로 미디어에서 별도로 성장합니다. 경쟁 변형 (LBS 캠). 그런 다음 균주는 LBS 국물에서 다시 일시 중단하고 OD = 1.0으로 정규화됩니다. (B) 기준 변형률과 경쟁스트레인은 부피별로 1:1 비율로 혼합된다. 직렬 희석은 0 h. (C) 변형 혼합물이 LBS한천을 함유하는 24 웰 플레이트상에서 발견된 후 두 균주에 대한 CFUs를 결정하기 위해 이 혼합물과 함께 수행된다. 각 복제는 자신의 우물로 발견된다. 반점은 건조시키고 5시간 동안 24°C에서 배양하였다. 5시간 후, 각 균주에 대한 CfU를 정량화하기 위해 직렬 희석이 수행됩니다. (D) 패널 B로부터의 변형 혼합물은 또한 LBS 한천 페트리 플레이트 상에서 발견되어 24°C에서 24시간 동안 건조및 배양하였다. 24 h에서, 동전 배기 반점은 녹색 (기준 변형) 및 적색 (경쟁 변형) 형광을 검출하기 위하여 적응되는 형광 해부 현미경을 사용하여 심상합니다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 직렬 희석에 필요한 플레이트의 대표적인 이미지입니다. (A) 96 웰 플레이트가 직렬 희석을 수행하는 데 사용됩니다. 플레이트는 12 행과 8 개의 열이 있도록 회전됩니다. 각 처리의 설명자는 사용되는 균주와 그들이 항구하는 플라스미드(예를 들어, pVSV102를 가진 기준 균주 및 pVSV208를 가진 경쟁자 변형) 및 각 행에 대한 복제 수(R1, R2, R3, 또는 R4)를 포함한다. 첫 번째 열은 원액 샘플이며 오른쪽의 각 컬럼은 이전 열에서 10배 희석을 나타냅니다(위에 나열된 희석 계수). (B) LBS 한천 플레이트는 실험 처리로부터 LBS 칸 플레이트(상부)에 대한 기준 변형및 LBS 캠 플레이트(아래)에 대한 경쟁균주에 대한 CFUs를 결정하는데 사용된다. 각 행은 처리에서 하나의 복제(예를 들어, R1)이고 각 스팟의 희석 계수는 플레이트의 상부에 나열된다. 각 복제에 대해 계산된 CFU 수가 오른쪽에 나열됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경쟁업체균이 기준 변형을 능가하는지 여부를 평가하기 위한 샘플 데이터입니다. (A) pVSV102 (진한 회색) 또는 pVSV208 (밝은 회색)을 품고 있는 코인큐어 균주의 비율입니다. R.S.는 기준 변형률을 나타내고 C.S.는 경쟁 스트레인을 나타냅니다. 파선 수평선은 0.5의 비율을 나타냅니다. 별표는 5시간에서 대조군에서 경쟁사 균주 또는 기준 변형률보다 통계적으로 더 작은 비율로 구성된 기준 균주를 나타낸다(학생의 t-test: P < 0.001); ns는 유의하지 않음을 나타냅니다(P > 0.05). (B) 동전 배양 검정에 대한 상대적 경쟁 지수 (RCI)를 기록합니다. 파선 된 세로 선은 로그 RCI = 0을 나타냅니다. 별표는 로그 RCI 값이 통계적으로 0보다 크고 컨트롤(학생의 t-test: P < 0.001)을 나타냅니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 경쟁 메커니즘을 결정하기 위한 샘플 데이터입니다. (A) pVSV102 또는 pVSV208로 차별화태그가 지정된 V. fischeri 분리물로 수행된 코인큐베이션 검정에 대한 총 CFU 카운트. CFUs는 실험(0h)의 시작 부분과 5시간 배양 후에 수집하였다. R.S.는 기준 변형률을 나타내고 C.S.는 경쟁 업체 변형률을 나타냅니다. 파선 수평선은 두 균주에 대한 평균 0h CFUs를 나타냅니다. 별표는 기준 균주 CFUs가 5시간에서 대조군 치료에 비해 실험적 치료에서 통계적으로 낮았음을 나타낸다(학생의 t-검정: P < 0.002). (B) 기준 변형률의 백분율 복구. 수평 파선은 100% 회복을 나타냅니다(CFU의 증가 또는 감소 없음). 별표는 백분율 회복이 통계적으로 100% 및 대조군 치료보다 낮았음을 나타낸다(학생의 t-test: P < 0.002). 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 인큐베이션 시간 및 이미징 최적화를 위한 샘플 데이터. (a) 5, 12, 및 24시간 배양 후 실험(0h)의 시작 부분에서 CFUs를 수집한 코인큐베이션 실험에 대한 총 CFUs. R.S.는 기준 변형률을 나타내고 C.S.2는 경쟁 업체 변형률 2를 나타냅니다. 파선 수평선은 두 균주에 대한 평균 0h CFUs를 나타냅니다. 별표는 주어진 시점에서 대조군 치료에 비해 실험적 치료에서 참조 균주 CFUs가 통계적으로 낮았음을 나타낸다(학생의 t-검정: P < 0.002). 오류 막대는 SEM. (B) 패널 A. 스케일 바 =1 mm.의 CFU 데이터와 대응하는 형광 현미경 이미지를 나타내며, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 코인큐베이션 비율 최적화를 위한 샘플 데이터. 동전 실험은 pVSV102(녹색, 맨 위 행)와 경쟁사 균주(C.S.) 항진 pVSV208(적색, 하단 행) 및 형광 현미경 영상 을 24시간(A)균주에서 촬영한 기준 균주(R.S.) 사이에서 수행하였다. pVSV102를 포함하는기준 스트레인이 pVSV208을 함유하는 경쟁 스트레인에 의해 열세였던 1:1 비율 또는 (B) 1:5 비율로 혼합하였다. 배율 표시줄 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
전술한 코인큐브레이션 분석법은 박테리아 간 경쟁을 발견할 수 있는 강력한 방법을 제공한다. 이러한 접근법은 V. fischeri 격리 및 경쟁 메커니즘의 특성화 사이의 특정 경쟁의 식별을허용19. 기재된 방법은 해양 균 V. fischeri에최적화되었지만 임상 및 환경 분리를 포함한 다른 세균 종을 수용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 경쟁 메커니즘은 종종 조건부 5, 6,23,24,25,26,27 규제된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. , 도 28,따라서 성장 조건(예를 들어, 흔들림 대 서 배양, 온도 등)과 미디어 유형(예를 들어, 염분 함량)의 작은 차이는 결과에 극적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 코인큐베이션 조건을 최적화하는 것은 다른 세균 종뿐만 아니라 다른 경쟁 메커니즘에 필요할 가능성이 높습니다. 격리된 자연 환경을 밀접하게 반영하는 문화 조건을 선택하는 것이 가장 좋습니다. 예를 들어, V. fischeri 균주 사이의 동전 배합 해석은 해양 환경의 염도 및 온도를 반영하기 위해 24°C에서 LBS 매체로 수행하였다. 그러나, 일부 박테리아는 그들의 환경27,28에서 자연적으로 유능하고 따라서 적대적 상호 작용 동안 에 의해 방출된 유전 물질을 차지할 수 있다29. 이러한 DNA 전달이 동전 배양 결과에 영향을 미치지 않도록하려면 자연적으로 또는 DNA 섭취 기계의 비활성화를 통해 유능하지 않은 능력이나 균주를 촉진하지 않는 조건을 사용하는 것이 중요합니다. 더욱이, 세포 성장 단계, 배양 밀도, 배양 시간, 또는 시작 균주 비율과 같은 실험적 파라미터는 또한 상이한 세균 종 또는 경쟁적인 기계장치에 대한 최적화를 요구할 수 있다. 예를 들면, 초기 배양 조밀도는 경쟁의 접촉 의존적인 기계장치를 전개하는 박테리아의 기능에 영향을 미칠 수 있는 긴장 사이 세포 접촉의 양을 지시할 것입니다.
그림 5A는 V. fischeri 분리물로 코인큐베이션 검정을 최적화하는 과정을 표시합니다. 여기서, CFU 수집 및 형광 현미경 이미징을 위한 다양한 배양 시간을 평가하여 수집될 각 메트릭에 대한 최적의 시간을 결정하였다. CFU는 기준 균주 및 경쟁균주 2의 혼합물을 LBS 한천 플레이트(0h)에 발견한 직후에 수집하였고, CFU 측정 및 형광 현미경 영상을 즉시 5, 12 및 24시간 후에 촬영하였다. 이 샘플 데이터는 두 균주 간의 상호 작용에 대한 결론을 도출하기 전에 철저한 최적화의 중요성을 강조합니다. 예를 들어, 상호 작용메커니즘에 대한 두 가지 다른 결론은 CFUs가 수집될 때에 따라 추론될 수 있습니다: 5 또는 12h의 CFU는 균주 2가 기준 균주를 죽였음을 나타내고, 24h에서 수집된 CFUs는 균주의 성장을 억제합니다. 참조 변형률.
형광 현미경 검사법을 통해 동전 배합 반점의 시각화를위한 최적의 시간은 CFU 수집을위한 최적의 시간과 다를 수 있습니다. 그림 5B는 0, 5, 12 및 24 h에서 동전 반점의 형광 현미경 심상을 표시합니다. 0 과 5 시간에서, 동전 반점은 형광 현미경 검사법으로 보이지 않습니다. 12시간에서 촬영한 이미지의 경우, 제어 처리에서 두 균주가 모두 볼 수 있지만 RFP(pVSV208를 항하는 기준 균주)는 특히 어둡습니다. 12 시간에서 실험 적 치료에서, 경쟁 변형률 2가 볼 수 (아직 희미한) 및 기준 균주는 검출 할 수 없습니다. 세균 분리사이의 균주별 차이는 형광 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 혼합 된 자리에있는 세포의 밝기에 영향을 미칠 수 있습니다. RFP는 대조군에서 GFP보다 현저하게 희미하기 때문에, 코인큐베이션 스팟은 계속해서 배양되고 나중에 다시 이미지화되어야 한다. 24시간에서 촬영한 이미지에서 두 균주는 눈에 띄게 감지가능하며 대조군 실험에서 비슷한 밝기를 가지고 있습니다. 실험적 치료에서 균주 2는 기준 균주가 동전 배양 스팟 내에서 관찰되지 않는 동안 볼 수 있다. 15-24시간 배양 시간은 각각 안정된 플라스미드 pVSV102 및 pVSV208을 사용하여 V. fischeri에 대한 GFP 및 RFP를 시각화하기에 충분하지만, 배양 시간은 상이한 플라스미드 또는 세균 종에 대해 조정되어야 할 수도 있다. 동전 반점의 시각화 및 CFU 데이터 수집을위한 최적의 시간은 다르지만, 24 시간에서 이미징은 24시간에서 이미징에서 얻은 결과 (대상이 보이는지 여부)에 대한 상호 작용을 신속하게 스크리플하는 좋은 방법입니다. 5 또는 12시간 에서 도금 CFU에서 얻은 더 많은 시간 집약적 정량 데이터를 반영합니다.
시작 비율은 특히 두 가지 억제 균주를 배양할 때 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 살인 효율 또는 성장 속도의 변형 특정 차이를 고려하여 조정되어야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 도 6A는 기준 균주가 자체(제어)로 코인화되고 다른 3개의 V. fischeri가 1:1 비율로 시작하는 실험의 형광 현미경 이미지를 표시합니다. 이러한 샘플 데이터에서, 기준 균주는 24시간 후에 자체, 경쟁자 변형률 1 및 경쟁스트레인 3을 배양할 때 눈에 띄게 검출된다. 그러나 시작 비율을 1:5(즉, 250 mL의 경쟁 균주와 혼합된 기준 변형균주 50mL)로 조정했을 때 기준 균주는 자체및 스트레인 1로 코인화될 때만 눈에 띄게 검출되며, 이는 스트레인 2와 스트레인 3이 모두 경쟁하지 않음을 나타냅니다. 참조 변형률입니다. 이러한 조정은 기준 변형의 빠른 증가속도가 경쟁 균주에 의해 나타나는 간섭 경쟁 메커니즘의 효과를 가리는 것을 방지합니다. 도 6A의결과에 기초하여, 1:5의 비율(기준 변형 : 경쟁균)은 기준 균주를 죽이는 능력에 대한 추가V. fischeri 균주를 스크리플하는데 사용되어야 한다.
이 프로토콜은 카나마이신 또는 클로람페니콜 저항 유전자를 포함하는 플라스미드로 균주를 차별적으로 표지하여 균주를 코인큐어하는 것을 구별합니다. 그러나, 다른 항생제 또는 다른 선택 방법은 다른 세균 종에 더 적합할 수 있다. 차등 선택을 위한 그밖 방법은 다음을 포함할 수 있습니다: 1) 특정 성장 인자 (예를 들면, DAP 또는 티미딘)에 대한 균주/종 특정 보조증을 이용하는, 2) 조건부 성장 요구 사항 (예를 들어, 한 균주는 37 °C에서 증가하는 반면 다른 균주는 그렇지 않음), 또는 3) "킬" 유전자(예를 들어, ccdB 또는 sacB)를발현하기 위해 적절한 조건하에서 성장할 때 태그된 균주의 성장을 제거하거나 억제하는 역선택 마커.
적절한 기준 변형률을 선택하는 것은 동전 분석분석에서 재현 가능한 결과를 얻고 해석하는 데 매우 중요합니다. 기준 균주는 잘 연구되어야한다 (즉, 과학 문학의 넓은 몸을 가지고), 명백한 살인 또는 억제 능력이 없는, 이상적으로 서열 게놈이. 예를 들어, 대장균의 특정 균주는 많은 세균 동전 배양 실험30,31에대한 일반적인 기준 균주이다. 그러나, 대장균은 결과에 영향을 미칠 수 있는 주어진 경쟁 적인 기계장치 또는 경쟁자를 위해 생태학적으로 관련이 없을 지도 모릅니다. 예를 들면, 몇몇 박테리아는 동일 생태 틈새 시장을 위한 밀접하게 관련종 또는 경쟁자를 표적으로 하는 기계장치를 구체적으로 발전시킬 수 있고 그들의 경쟁적인 기계장치는 대장균 기준 긴장에 대하여 효과적이지 않을 것입니다.
요약하자면, 여기서 설명한 방법은 쉽게 수정되고 견고한 접근법을 제공하여 박테리아 간 상호 작용 및 경쟁을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 환경 또는 임상 연구와 관련된 세균 분리물질에 적용될 수 있으며, 이전에 알려지지 않았거나 조사하기 어려운 미생물 상호작용의 다양한 메커니즘을 탐구하는데 사용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 그들의 유용한 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. A.N.S.는 그랜트 GBMF 255.03을 통해 고든과 베티 무어 재단의 지원을 받아 생명과학 연구 재단에 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1,000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| Forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| Petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1 M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
