Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Coinkubations analyse til kvantificering af konkurrence interaktioner mellem Vibrio Stormhat isolater

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Bakterier indkode forskellige mekanismer til at engagere sig i interbakteriel konkurrence. Her præsenterer vi en kultur baseret protokol til karakterisering af konkurrence interaktioner mellem bakterielle isolater, og hvordan de påvirker den rumlige struktur af en blandet befolkning.

Abstract

Dette manuskript beskriver en kultur baseret, coinkubations analyse til påvisning og karakterisering af konkurrencemæssige interaktioner mellem to bakterie populationer. Denne metode anvender stabile plasmider, som gør det muligt for hver population at blive differentielt mærket med forskellige antibiotikaresistens kapaciteter og fluorescerende proteiner til udvælgelse og visuel diskrimination af hver population, hhv. Her beskriver vi forberedelsen og coinkubationen af konkurrerende Vibrio Stormhat -stammer, Fluorescens mikroskopi Imaging og kvantitativ dataanalyse. Denne fremgangsmåde er enkel, giver hurtige resultater, og kan bruges til at afgøre, om en population dræber eller hæmmer væksten i en anden population, og om konkurrencen er medieret gennem et diffusible molekyle eller kræver direkte celle celle kontakt. Fordi hver bakteriepopulation udtrykker et andet fluorescerende protein, tillader analysen den geografiske diskrimination af konkurrerende populationer i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metoder udføres med symbiotisk bakterie V. Stormhat ved hjælp af betingelser, der er optimeret til denne art, kan protokollen tilpasses for de fleste bestemmelse antal kimtal bakteriel isolater.

Introduction

Dette manuskript skitserer en kultur-baseret metode til at afgøre, om to bakterielle isolater er i stand til konkurrencemæssige interaktioner. Når man studerer blandede populationer, er det vigtigt at vurdere, i hvilket omfang de bakterielle isolater interagerer, især om isolater konkurrerer direkte gennem interferens mekanismer. Interferens konkurrence refererer til interaktioner, hvor en population direkte hæmmer væksten eller dræber en konkurrent befolkning1. Disse interaktioner er vigtige at identificere, fordi de kan have dybtgående virkninger på en mikrobiel samfund struktur og funktion2,3.

Mekanismer for mikrobiel konkurrence er blevet opdaget bredt i genomer af bakterier fra forskellige miljøer, herunder både værts-associerede og frie levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En række forskellige konkurrencestrategier er blevet beskrevet10,11 herunder difsible mekanismer, såsom bakteriedræbende kemikalier1,12 og udskillet antimikrobielle peptider13 , samt kontaktafhængige mekanismer, der kræver celle celle kontakt for at overføre en hæmmende Effector til målcellerne9,14,15,16,17 ,18.

Selv om kulturbaserede coinkubationer almindeligvis anvendes i mikrobiologi5,8,19, skitserer dette manuskript, hvordan man bruger analysen til at karakterisere konkurrence mekanismen, samt forslag til tilpasning protokollen til brug sammen med andre bakteriearter. Desuden beskriver denne metode flere tilgange til at analysere og præsentere dataene for at besvare forskellige spørgsmål om karakteren af de konkurrencemæssige interaktioner. Selv om de teknikker, der er beskrevet her, tidligere blev anvendt til at identificere den interbakterielle dræbende mekanisme underliggende intraspecifik konkurrence mellem symbiotiske stammer af coisolerede Vibrio Stormhat bakterier19, er de velegnede til mange bakteriearter, herunder miljø isolater og humane patogener, og kan udnyttes til at evaluere både kontaktafhængige og difsible konkurrencemekanismer. Trin i protokollen kan kræve optimering for andre bakteriearter. Da flere modelsystemer udvider deres studier ud over brugen af isogene organismer til at omfatte forskellige genotyper10,16,20,21, vil denne metode være en værdifuld ressource for forskere, som søger at forstå, hvordan konkurrencen påvirker systemer med flere belastninger eller flere arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered stammer til Coinkubation

  1. Vælg en passende referencestamme, der vil tjene som mål for bakteriel konkurrence under coinkukation assay. Se diskussionen om bedste praksis, når du vælger en referencestamme, og hvordan reference stammen vil påvirke resultaterne. I denne protokol vil V. Stormhat Strain ES114 tjene som referencestamme.
  2. Afgøre, hvilke udvælgelses-og screeningsmetoder der vil blive anvendt til at skelne mellem isolaterne i coinkubation
    1. Typisk omdanne stammer med stabile plasmider indeholder forskellige antibiotikaresistensgener (f. eks kanamycin eller chloramphenicol) at vælge for hver stamme, samt gener kodning forskellige fluorescerende proteiner (f. eks GFP eller RFP) for visuelt skelne stamme typer i coculture.
      Bemærk: Brug af stabile plasmider er nødvendig, fordi hvis en stamme mister plasmid i fravær af udvælgelse, så denne stamme tal vil blive undervurderet, når kvantificeret, og vil ikke være visuelt detekterbare ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
    2. Tag koinkuberet V. Stormhat stammer differentielt således, at en stamme indeholder plasmid pVSV102, som udtrykker et grønt fluorescerende protein (gfp) og resistens over for antibiotikum kanamycin (kanR), og den anden stamme indeholder plasmid pVSV208, som udtrykker et rødt fluorescerende protein (dsRed) og resistens over for antibiotika-chloramphenicol (cmR)22.
      Bemærk: Andre differentialvalg kan bruges til at skelne mellem coinkuerende stammer. Se diskussionen om yderligere metoder.
    3. Medtag følgende kontrol under den indledende optimering af coinkubations analysen for at sikre, at valget er robust. Plade hver stamme, der er differentielt mærket på agar plader indeholdende det antibiotikum, der skal vælge mod det (dvs. plade stamme 1 på medier, der vælger for stamme 2, og vice versa).
  3. To dage før koinkubations assay, streak referencestamme pVSV102, referencestamme pVSV208, og hver konkurrent stamme pVSV208 fra-80 °C bestande på LBS agar plader indeholdende det relevante antibiotikum (f. eks 100 μg/mL kanamycin eller 2 μg/mL chloramphenicol) og Inkuber natten over ved 24 °C. Antibiotika udvælgelse er nødvendig for at sikre, at alle celler indeholder plasmid i begyndelsen af eksperimentet.
  4. En dag før analysen, plukke og restreak fire individuelle kolonier pr stamme type (biologiske replikater) på friske LBS agar plader med passende antibiotikum og inkuberet natten ved 24 °C.
    Bemærk: Dette trin kan kræve optimering for andre bakteriearter, da længere eller kortere inkubationstider kan være påkrævet for at opnå tilstrækkelige celler afhængigt af vækstraten af skadegøreren af interesse.

2. coincubate bakteriestammer

  1. Klargøring af hver bakteriestamme til inkubation (figur 1a)
    1. Brug et sterilt tandstikker til at skrabe cellerne fra agarpladen (så meget som størrelsen af et riskorn) og re-suspendere cellerne i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas indeholdende 1 mL LBS bouillon. Opdel celle klumper ved at trykke dem ind i siden af røret og pipettering op og ned kraftigt.
    2. Cap røret og vortex til 1-2 s. Hvis celle klumper stadig er synlige, skal du fortsætte med at vortex eller pipettere op og ned, indtil prøven er visuelt ensartet.
    3. Gentag trin 2.1.1-2.1.2 for alle prøver.
  2. Måle og registrere den optiske tæthed ved 600 nm (OD600) for alle prøver. Prøver vil sandsynligvis skal fortyndes op til ti gange ved hjælp af LBS bouillon for at opnå en nøjagtig OD måling. Normaliserer hver prøve til den ønskede OD600. Stammer er typisk normaliseret til en OD600 ~ 1,0, som oversætter til ~ 106 bakterier/ml for V. Stormhat.
    Bemærk: Dette trin kan kræve optimering for forskellige bakteriearter som inokulum celletæthed påvirker coinkubation resultater afhængigt af mekanismen for konkurrence. Se diskussionen om optimering.
  3. Coinkuerende stammer (figur 1b, C)
    1. Bland reference stammen og konkurrent stammen i et 1:1-forhold (v/v) ved at tilsætte 100 mL af hver stamme (normaliseret til OD 1,0) til et mærket 1,5 mL centrifugeglas. Som en kontrol, bland reference stammen med en differentielt kodet version af sig selv (referencestamme pVSV102 + referencestamme pVSV208). Denne kontrol er nødvendig for senere statistisk analyse for at afgøre, om tilstedeværelsen af en konkurrent stamme påvirker væksten af reference stammen. Vortex den blandede stammekultur for 1-2 s.
      Bemærk: Dette trin kan kræve optimering, da udgangs forholdet kan påvirke resultaterne betydeligt og skal muligvis justeres. Se diskussionen om optimering.
    2. Gentag trin 2.3.1 for hver biologisk replikat. Efter at have afsluttet dette trin, bør der være i alt otte blandede rør: fire biologiske replikater med differentielt mærkede reference stammer (kontrol), og fire biologiske replikater med differentielt mærkede reference og konkurrent stammer ( eksperimentel).
    3. Spot 10 mL af hver kontrol og eksperimentel blanding på Petri plader indeholdende LBS agar; disse kultur pletter vil blive anvendt til fluorescens mikroskopi efter inkubationen.
    4. Lad pletterne tørre helt på bænken, indtil al væsken er absorberet i agar og Inkuber Petri pladerne ved 24 °C i 24 timer. Minimum 15 h er påkrævet for V. Stormhat stammer Tagged med pVSV102 og pVSV208 at vokse til en høj nok celletæthed til at visualisere gfp og RFP, henholdsvis på befolkningsniveau ved hjælp af en fluorescens dissekere mikroskop. Her bruger vi en 24 h inkubation til billeddannelse blandede pletter.
      Bemærk: Det er vigtigt at bruge plader, der ikke er for fugtige eller for tørre. Hvis pladerne er for fugtige, optages der ikke coinkubations pletter i agarpladen. undgå at bruge plader hældes på samme dag. Hvis pladerne er for tørre, kan der dannes små bølger eller revner på agar-overfladen, hvilket gør coinkubations pletter uregelmæssige i form.
    5. Ved hjælp af de samme bakterielle suspensioner som i trin 2.3.3, Spot 10 mL af hver kontrol og eksperimentelle blandinger i 24-brønden plader indeholdende 1 mL LBS agar per brønd. Som i trin 2.3.3, sikre agar i 24-brønd plader har passende fugt. Lad pletterne tørre helt og inkubere ved 24 °C i 5 timer. Disse kultur pletter vil blive brugt til at kvantificere kolonidannende enheder (CFUs) for hver stamme ved afslutningen af eksperimentet.
      Bemærk: Spotting bakterielle suspensioner for vækst i individuelle brønde giver mulighed for lettere opblanding ved sluttidspunktet. Dette trin kan opnås ved hjælp af firkantede sterile filter stykker som en mere økonomisk tilgang til brug af 24-brønd plader. Firkantede sterile filter stykker kan anbringes på en agar plade og 10 mL af hver eksperimentel blanding kan ses på disse filtre, snarere end på 24-brønden plader. Efter coinkubationstid kan filtrene overføres til et 1,5 mL centrifugeglas, og coinkubations stedet kan resuspenderes ved vortexning eller pipettering op og ned. En 5 h inkubationstid er tilstrækkelig til at detektere interbakterielle drab mellem V. Stormhat isolater19, men denne coinkubationstid kan være nødvendigt at være kortere eller længere for andre arter eller konkurrencedygtige mekanismer. Se diskussionen for at få flere oplysninger.
  4. Seriel fortynding til start af inokulum
    1. For at udføre en seriel fortynding af start coinkubations blandinger, rotere en 96-brønd plade 90 °, så der er otte kolonner og tolv rækker. Hver række vil indeholde en prøve af den ufortyndede blanding i den første kolonne efterfulgt af 7 10-fold serielle fortyndinger på tværs af de resterende brønde i rækken (figur 2a).
    2. Mærk hver række med stamme-id'et, replikatummeret og klokkeslættet (starter inokulum = t0). Etiketten LBS agar plader suppleret med passende antibiotikum, som til at spotte fortyndings serien. Sørg for at identificere, hvilken stamme hver antibiotika plade vælger for.
    3. Ved hjælp af en multikanals pipette tilsættes 180 mL LBS bouillon til hver brønd, hvilket efterlader den første kolonne tom for den ufortyndede coinkubations blanding.
      Bemærk: Forskerne kan vælge at bruge fosfat bufferet saltvand (PBS) til at resuspendere coinkubations pletter og udføre seriel fortynding, hvis de arbejder med en særlig hurtigt voksende bakteriearter eller konsekvent udfører store eksperimenter, hvor serielle fortyndinger kan tage lang tid at udføre. Brug af PBS i disse tilfælde vil forhindre betydelig vækst af bakterier under processen med at udføre serielle fortyndinger. Det er dog vigtigt at være konsistent med, hvilken løsning der anvendes (f. eks. PBS eller LBS) på tværs af alle eksperimenter, uanset deres størrelse eller varighed.
    4. Ved hjælp af en 200 mL enkeltkanalpipette overføres 100 mL af coinkubations blandingen fra røret til den første kolonne godt. Kassér spidsen og Gentag for alle coinkubations blandinger.
    5. Ved hjælp af en multikanals pipette overføres 20 mL fra kolonne 1 til 2 og blandes ved pipettering op og ned. Kassér spidserne og Gentag for hver kolonne, så hver række i slutningen indeholder en 10-fold seriel fortynding af den oprindelige coinkubations blanding.
      Bemærk: Være i overensstemmelse med det antal gange, fortyndinger er pipetteret op og ned. For eksempel trykkes pipette håndtaget fem gange for hver fortynding for at være konsistent på tværs af fortyndings serien.
    6. Ved hjælp af en pipette med flere kanaler, der er udstyret med otte spidser, Aspirér 5 mL fra hver brønd i en fortyndings serie (dvs. en række på otte brønde), og spot den på den LBS-agar plade, som vælger reference stammen (suppleret med kanamycin). Gentag dette trin spotting på pladen vælger for konkurrent stamme (suppleret med chloramphenicol) (figur 2b). Lad pletterne tørre helt, inden de placeres i inkubator.
      Bemærk: De samme spidser kan anvendes til at spotte en replikat fortyndings serie på plader, der vælger for reference-og konkurrent stammen, men skal skiftes mellem replikater. Undgå at berøre enden af pipettespidsen til LBS agar pladerne, da dette kan skabe en depression, der kan ligne en bakteriel koloni og skævvridning resultater under pladetal. Hvis spidsen rører pladen, skal du notere og ikke inkludere depression i koloni tællinger.
  5. Tage T endelige målinger
    1. Efter at coinkubations punkterne i 24-brøndens plader er inkuberet i 5 timer ved 24 °C, tilsættes 1 mL LBS bouillon til hver brønd og resuspension af coinkubations pletter ved pipettering op og ned, indtil alle celler er resuspenderet. Være i overensstemmelse med den Vigor, hvori cellerne er resuspenderet på tværs af alle replikater. For eksempel, tryk pipette håndtaget otte gange for fuldt ud at resuspendere hver prøve.
    2. Når hvert koinkubations punkt er opslæmmet, skal der forberedes en 96-brønd plade til en seriel fortynding og LBS agar plader med de relevante antibiotika, som at få øje på fortynding på samme måde som trin 2.4.1.
    3. Udfør trin 2.4.2-2.4.6 for at fuldføre den serielle fortynding for T endelige målinger.
      Bemærk: En vigtig kontrol bør inkluderes under den indledende optimering af coinkubations analysen. I slutningen af coinkubations perioden, plade de blandede stammer på medier, der omfatter begge antibiotika. Hverken stamme bør være i stand til at vokse, medmindre 1) en spontan mutation opstår, eller 2) valgbar markører udveksles mellem stammer.

3. visualisering af Coinkubationer ved hjælp af Fluorescens mikroskopi

  1. Billede hver coinkubations spot på LBS agar Petri plader fra trin 2.3.3 og 2.3.4 ved hjælp af et stereomikroskop udstyret til grøn og rød fluorescens detektering, som svarer til fluorescens proteiner, der udtrykkes på de stabile plasmider.
  2. Begynd med at tage billeder af kontrol-coinkubations stedet (referencestamme pVSV102 + referencestamme pVSV208).
    1. Juster forstørrelse, så stedet er i fokus.
    2. Ved hjælp af passende excitation lys og filter til at observere GFP, justere eksponeringstid, så kun fluorescens fra coinkubations stedet er detekterbar og enhver baggrund fluorescens fra mediet er lav eller ikke synlig.
    3. Skift excitation lys og filter for at observere RFP, justere eksponeringstid for at minimere baggrunden fra mediet.
  3. For hvert coinkubations sted fra de eksperimentelle behandlinger, billede for reference stammen ved hjælp af GFP-filteret og eksponeringstid bestemt i trin 3.2.2.
  4. Billede konkurrentens stamme ved hjælp af RFP filter, justering af eksponeringstid, således at fluorescens kun observeres fra coinkubation spot og baggrund fluorescens fra mediet er minimal. Gem begge billeder, og navngiv dem for at inkludere både stamme-id'er, replikatummeret, inkubationstiden, når billedet blev taget (f. eks. 24 timer). Gentag for alle replikater.
    Bemærk: Det kan være nødvendigt at justere coinkubations tiden for forskellige plasmider eller bakteriearter. Se diskussionen om optimering.

4. data analyse

  1. Beregning af CFUs for hver kontrol og eksperimentel behandling på hvert tidspunkt (T-start og T-endeligt)
    1. Når kolonierne er synlige på de serielle fortyndings plader (f. eks. 24 timer ved 24 °c for V. Stormhat), identificeres fortyndingsfaktoren, hvor individuelle kolonier kan tælles og ikke er vokset sammen til store klynger af flere koloni grupper (figur 2b). For hver replikat tælles og registreres antallet af individuelle kolonier for en given fortynding. Dette nummer repræsenterer CFUs for den replikat.
    2. Konverter CFUs til fortynding til total CFUs for hver stamme i coinkubationen ved hjælp af formlen nedenfor:
      [CFUs ÷ (fortyndingsfaktor x vol. af fortyndings stedet)] x vol. af den ufortyndede prøve = total CFUs
      Eksempel: t0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0,005 mL)] x [0,01 mL] = 1,2 E7 total CFUs af stamme 1 i det blandede spot ved eksperimentets begyndelse
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8.0 E5 total CFUs af stamme 1 på blandet sted efter 5 h coinkubation
      CFU-værdierne for hver stamme på hvert tidspunkt er de rå data, der kan anvendes til flere forskellige analyser og statistiske tests (Se afsnit 4,2 nedenfor).
  2. Udfør følgende data omdannelser for at afgøre, om en konkurrent stamme overgår reference stammen ved at: (i) afgøre, om andelen af reference stammen falder i tilstedeværelse af konkurrentens stamme, eller (II) beregning af Log relative Competitive Index (RCI). Disse analyser omdanner rå data til nøgletal og kan være nyttige til at bestemme det konkurrencemæssige resultat af en interaktion, men kan ikke bestemme konkurrence mekanismen (dvs. drab vs væksthæmning).
    1. Beregning af andelen af hver stamme for hvert tidspunkt under coinkubationen
      1. Konverter CFU-data til andelen af hver stamme i en behandling. For reference stammen (RS) ved t0 Dividerer den samlede CFUs for reference stammen ved t0 med summen af total CFUs for reference stammen og konkurrenten (CS) ved t0:
        RSt0 cfus ÷ (RSt0 Cfus + cst0 cfus) = andelen af referencestamme ved t0.
        Udfør den samme beregning for at bestemme andelen af konkurrentens stamme på t0:
        CSt0 cfus ÷ (RSt0 Cfus + cst0 cfus) = andel af reference stammen på t0
        Gentag denne proces for hvert tidspunkt og Repliker for både eksperimentel behandling og kontrol behandling (differentielt kodet referencestamme coinkubation).
      2. Graf den gennemsnitlige andel af hver stamme type på t0 og T5 i et stablet bjælkediagram (figur 3a).
      3. Sørg for, at det ønskede start forhold for stammer blev opnået. For coinkubationer, hvor stammerne oprindelig var blandet 1:1, bør hver stamme type omfatte ~ 0,5 af populationen ved t0 og bør ikke være statistisk forskellig fra hinanden ved hjælp af en elevs t-test (P > 0,05). Hvis andelen af en stamme er betydeligt større end den anden stamme i t0, gentages eksperimentet, indtil der opnås et 1:1-Start forhold.
      4. Fastslå, om konkurrentens stamme omfatter en signifikant større andel af befolkningen efter 5 h. Udfør en elevs t-test, der sammenligner andelen af hver stamme i den eksperimentelle behandling på t0 og T5. Hvis andelen af konkurrent stamme afviger betydeligt fra reference stammen på T5 (P < 0,05), tyder dette resultat på, at der kan være forekommet stamme konkurrence. Fortsæt til trin 4.2.1.5.
      5. For at afgøre, om tilstedeværelsen af konkurrentens stamme reducerede andelen af reference stammen efter 5 timer, skal der udføres en t-test af eleven, der sammenligner andelen af reference stammen i kontrolelementet med andelen af reference stammen i Eksperimentel behandling (referencestamme v konkurrent stamme).
        Bemærk: Hvis reference belastningens andel er statistisk lavere i den eksperimentelle behandling i forhold til kontrol (P < 0,05), reducerede konkurrentens stamme signifikant andelen af reference stammen efter 5 timer og udkonkurrerede reference stammen.
    2. Beregning af log RCI-værdien for hver behandling (inkl. kontrol)
      Bemærk: Det relative konkurrencemæssige indeks, eller RCI, er en enkelt værdi, der sammenligner, hvordan forholdet for stamme typer afviger fra udgangs forholdet. RCI-værdien er log-transformeret, så en log RCI-værdi, der er større end nul, angiver, at konkurrent stammen (CS) konkurrerede med reference stammen (RS), en log RCI-værdi på mindre end nul indikerer, at reference stammen konkurrerede med konkurrentens stamme, og en log RCI værdien på nul angiver, at ingen af belastningen blev over konkurreret.
      1. Beregn log RCI værdier for hver kontrol og eksperimentel behandling ved hjælp af følgende ligning:
        Log [(CST5 CFU ̧ RST5 cfus) ̧ (CSt0 CFU ̧ RSt0 cfus)] = Log RCI
      2. Graf log RCI-værdier ved hjælp af en separeret boks & whiskers plot, hvor data tegnes i den vandrette retning (figur 3b).
      3. Bestem, om hver behandling var signifikant forskellig fra nul ved at udføre en elevs t-test sammenligne log RCI værdier af hver behandling (herunder kontrol) til et datasæt, der sammenligner det samme antal replikater alle med en nulværdi. Hvis log RCI-værdierne for den eksperimentelle behandling er statistisk større end nul (P < 0,05), konkurrerede konkurrent stammen om reference stammen.
        Bemærk: Kontrolelementet må ikke være statistisk forskelligt fra nul (P > 0,05), da de differentielt mærkede reference stammer er isogene.
      4. Udfør en elevs t-test for at afgøre, om log RCI-værdier for den eksperimentelle behandling var betydeligt større end kontrolelementet (P < 0,05). Hvis log RCI-værdierne fra den eksperimentelle behandling er statistisk større end kontrolbehandlingen, konkurrerede konkurrentens stamme om reference stammen.
  3. Udfør følgende statistiske analyse for at bestemme den mekanisme, hvormed konkurrenten stamme outkonkurrerer reference stammen: (i) analysere rå samlede CFU data, eller (II) undersøge procent inddrivelse af reference stammen. Disse analyser kan være mere besværlige at se i forhold til dem fra trin 4,2, men vil identificere, om konkurrentens stamme overgår reference stammen ved at uddyrke det, hæmme referencestamme vækst, eller aktivt at eliminere reference stammen.
    1. Analysere rå total CFU-data
      1. Graf rå total CFU-data for begge stammer ved hjælp af et Interleaved scatter plot, hvor replikater vises som individuelle datapunkter (figur 4a). Vis data på en bjælke skala, og Tilføj en vandret linje, der angiver den gennemsnitlige t0 CFUs for begge stammer.
      2. For at afgøre, om tilstedeværelsen af konkurrenten stamme negativt påvirket reference stammen, udføre en Student's t-test sammenligne referencestamme CFUs for kontrol og eksperimentelle behandlinger på T5. Hvis reference stammen CFUs i forsøgsbehandlingen er statistisk lavere end i kontrol (P < 0,05), påvirkede tilstedeværelsen af konkurrentens stamme signifikant reference stammen.
      3. For at afgøre, om tilstedeværelsen af konkurrentens stamme enten hæmmet væksten af eller elimineret reference stammen, udføre en Student's t-test sammenligne reference stammen CFUs på t0 og T5 for kontrol og eksperimentelle behandlinger.
        Bemærk: Hvis der ikke er nogen konkurrent, bør reference stammen udvise en signifikant stigning i CFU ved sammenligningen af t0 og T5 for kontrolbehandlingen. Ved analyse af den eksperimentelle behandling, hvis reference stammen CFUs på T5 ikke er statistisk forskellig i forhold til t0 (P > 0,05), hæmmede konkurrentens stamme væksten af reference stammen. Hvis reference stammen T5 CFUs er betydeligt lavere end t0 CFUs (P < 0,05), har konkurrentens stamme dræbt reference stammen.
    2. Beregning af procent genfinding af reference stammen
      1. Transformér total CFU data for reference stammen (RS) i procent opsving data ved hjælp af nedenstående ligning:
      2. (RST5 cfus ̧ rt0 cfus) x 100 =% genvinding af referencestamme
      3. Vis den procentvise genindvinding af reference stammen ved hjælp af en adskilt bjælke graf, hvor hver bjælke repræsenterer enten kontrol eller eksperimentel behandling (figur 4b). Tilføj en stiplet linje ved y = 100 for at indikere 100% inddrivelse af referencestamme (ingen stigning eller fald i referencestamme CFUs fra 0 h til 5 h).
      4. For at afgøre, om konkurrenten stamme negativt påvirket reference stammen, udføre en Student's t-test sammenligne referencestamme procent opsving for kontrol behandling til den eksperimentelle behandling. Hvis procentdelen af genfinding er betydeligt mindre end kontrolelementet (P < 0,05), har konkurrentens stamme påvirket reference stammen negativt.
      5. For at identificere, om konkurrentens stamme hæmmede væksten af eller elimineret reference stammen, udføre en Student's t-test sammenligne referencestamme procent opsving for den eksperimentelle behandling og et datasæt med det samme antal replikater alle med en værdi af 100.
        Bemærk: Hvis forsøgsbehandlingen ikke er statistisk forskellig fra 100 (P > 0,05), hæmmede konkurrentens stamme væksten af reference stammen. Hvis reference stammen procent opsving i den eksperimentelle behandling er betydeligt lavere end 100 (P < 0,05), så konkurrenten stamme dræbte reference stammen.
    3. Tolkning af Fluorescens mikroskopi billeder
      1. Når Fluorescens mikroskopi billeder er taget, afgøre, om hver stamme er synligt detekterbare i coinkubations stedet. Til kontrol coinkubation (referencestamme pVSV102 + referencestamme pVSV208) bør både GFP og RFP være synlige fra ét coinkubations punkt. Hvis dette ikke er tilfældet, indstilles eksperimentet igen, så det sikres, at stammerne er korrekt mærket og coinkuberet på antibiotika frie plader.
      2. For hver eksperimentel coinkubation spot, kontrollere for mulige udfald.
        Bemærk: Hvis konkurrentens stamme er synlig, men reference stammen ikke opdages, der tyder på, at konkurrenten stamme dræbt eller hæmmet væksten af reference stammen. Hvis begge stammer er til stede og ensartet blandet (GFP og RFP til stede i hele coinkubations stedet), tyder disse data på, at konkurrentens stamme ikke konkurrerer med reference stammen, og begge stammer sameksistere. Hvis begge stammer er til stede, men er rumligt adskilte (mikrokolonier af enten GFP eller RFP er til stede i hele coinkubations stedet), hvilket tyder på, at reference stammen og konkurrent stammen kan være engagerende i konkurrencemæssige interaktioner og ændringer til reference stammen eller det indledende koinkubationstal kan være påkrævet. Se diskussionen for at få flere oplysninger.

5. bestemmelse af, om interaktion er kontakt afhængig

Bemærk: Hvis du opdager, at en stamme dræber eller hæmmer reference stammen, kan interaktionen være difble eller kontakt afhængig. For at afgøre, om interaktionen er afhængig af celle celle kontakt, skal du udføre en coinkubations analyse som beskrevet ovenfor for trin 1-2 med følgende ændringer.

  1. Udfør trin 1.1-2.2.
  2. Når stammerne er normaliseret, fysisk adskilte stammer ved hjælp af et nitrocellulose filter med en 0,22 mm porestørrelse. Denne porestørrelse giver mulighed for Diffusion af antimikrobielle stoffer og små molekyler, men forhindrer fysisk kontakt mellem V. Stormhat celler.
    Bemærk: Hvis interaktionen er afhængig af celle celle kontakt, skal adskillelsen af reference stammen fra konkurrentens stamme med filteret ophæve dræbende eller hæmmende fænotype, og reference stammen bør ikke have reduceret CFUs. Hvis interaktionen ikke er afhængig af celle celle kontakt, og er en diffusible mekanisme, bør adskillelse af stammerne ikke forhindre konkurrenten stamme fra at dræbe reference stammen.
    1. Spot 5 mL af reference stammen på midten af et filter og spot 5 mL af konkurrentens stamme på midten af et andet filter. Anbring filteret med reference stammen på overfladen af en LBS agar plade. Placer filteret, der indeholder konkurrentens stamme, direkte oven på filteret med reference stammen.
      Bemærk: Hver stamme er plettet på filtre snarere end den nederste stamme spottet direkte på agar pladen, så stammer kan lettere placeres direkte på toppen af hinanden.
    2. Hvis der er bekymring for, at stammer ikke stables direkte oven på hinanden, mindske mængden af referencestamme inokulum plettet på filteret. Dette vil sikre, at arealet af referencestamme stedet er mindre og fuldt ud over eller under konkurrentens stamme. Suppleant hvilken stamme er på toppen og på bunden for at højde for forskelle i diffusion af næringsstoffer fra agar medium.
    3. For at sikre, at filteret giver mulighed for Diffusion af små molekyler, omfatte en kontrol behandling, hvor reference stammen er spottet på et filter og et antibiotikum, at det er følsomt over for (chloramphenicol) er spottet på den anden. Stak filtrene direkte oven på hinanden og Placer på en LBS agar plade. Antibiotika bør være i stand til at diffus gennem filteret og bør dræbe reference stammen.
  3. Pladerne inkubates med filtre ved 24 °C i 5 timer. Agarpladen må ikke vendes, når den inkubeerer, for at undgå at bevæge filtrene.
  4. Udfør serielle fortyndinger til start inokulum i henhold til trin 2,4.
  5. Tage T endelige målinger
    1. Ved hjælp af sterile pincet, overføre hvert sæt af filtre til en 50 mL Falcon tube indeholdende 5 mL LBS bouillon. Sørg for, at filtrene er fysisk adskilt i røret for at give mulighed for fuld opblanding af hver stamme type.
    2. Resuspendere stammer fra filtre ved pipettering op og ned, indtil filtrene er fri for alle celler. Brug pincet til at rotere filtrene og rydde cellemateriale fra begge sider. Steriliser pincet med ethanol mellem prøverne.
    3. Udfør seriel fortynding for T Final i henhold til trin 2,5. Ved beregning af total CFUs for T Final justeres "total volumen af ufortyndet prøve" fra 1 mL til 5 mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere den konkurrencemæssige interaktion mellem bakterie populationer blev der udviklet en coinkubations analyse protokol, som blev optimeret til V. Stormhat. Denne metode udnytter stabile plasmider at indkode antibiotikaresistensgener og fluorescerende proteiner, giver mulighed for differentiel udvælgelse og visuel diskrimination af hver stamme. Ved at analysere de data, der indsamles fra coinkubations analysen, kan det konkurrencemæssige resultat af en interaktion og interaktionsmekanismen identificeres. F. eks. blev følgende eksperimenter udført med V. Stormhat isolates. Coinkuated stammer næret en af to stabile plasmid'er: pVSV102 udtrykker kanamycin resistens og gfp +, eller pVSV208 udtrykker chloramphenicol resistens og dsred +. I eksempeldataene blev stammerne blandet i et 1:1-forhold og inkuberet på LBS agar plader i 5 timer. Som kontrol behandling blev differentielt mærkede versioner af reference stammen coinkuberet med hinanden. De eksperimentelle behandlinger blev udført med reference stammen (harboring pVSV102) og enten konkurrent stamme 1 eller konkurrent stamme 2 (harboring pVSV208). Kulturer af hver stamme blev forberedt og coinkuberet som beskrevet ovenfor og som vist i figur 1 og figur 2.

I figur 3, analyseret data for at afgøre, om konkurrent stamme 1 eller 2 udkonkurrerede reference stammen er præsenteret på to måder. I figur 3ablev andelen af hver stamme type for hvert tidspunkt under forsøget beregnet i henhold til trin 4.2.1. I de eksperimentelle behandlinger viser stikprøvedataene reference stammen, og konkurrent stamme 1 er til stede i en andel af 0,5 i begyndelsen (0 h) og slutningen (5 timer) af forsøget, hvilket er i overensstemmelse med, hvad der observeres i kontrolbehandlingen. Disse data viser, at andelen af stammerne ikke ændrede sig efter en 5-h coinkubation, og der blev derfor ikke observeret nogen konkurrence. Når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 2, var reference stammen derimod til stede i en andel af 0,5 i begyndelsen (0 timer), og en andel < 0,01 ved slutningen (5 timer) af forsøget, hvilket var signifikant lavere end kontrol behandling (elevens t-test: P < 0,001). Disse data tyder på, at andelen af reference stammen faldt i nærværelse af konkurrent stamme 2, og foreslår derfor konkurrence mellem konkurrent stamme 2 og reference stammen indtraf. Denne type analyse bør anvendes ved fastlæggelsen af, hvordan andelen af stammer inden for et fællesskab ændres over tid, men ikke kan anvendes til at bestemme mekanismen for den konkurrencemæssige interaktion, og bør derfor kombineres med yderligere analyser. F. eks. kan andelen af reference stammen, der falder i tilstedeværelse af konkurrent stamme 2, tilskrives flere typer interaktioner: (i) stamme 2 voksede hurtigere end reference stammen, (II) stamme 2 hæmmede væksten i reference stamme, eller (III) stamme 2 eliminerede reference stammen gennem drab.

I figur 3bblev log relative Competitive Index (RCI) beregnet for hver behandling i henhold til trin 4.2.2. Når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 1, var log RCI-værdierne ikke statistisk forskellige fra nul eller fra kontrolbehandlingen (P > 0,05), hvilket tyder på, at konkurrencen mellem stammerne ikke blev observeret. Når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 2, var log RCI-værdierne dog signifikant større end nul og kontrolbehandlingen (elevens t-test: P < 0,001). Disse data tyder på, at stamme 2 udkonkurrerede reference stammen. Analyse af log RCI-værdier giver en enkel metode til at afgøre, om en stamme over konkurrerede den anden i inkubationsperioden. Da denne analyse inkorporerer forholdet mellem stammer i slutningen (5 h) og begyndelsen (0 h) af eksperimentet, kan start forholdet dramatisk påvirke resultatet. Udgangs forholdet bør derfor undersøges og tages i betragtning, når der drages konklusioner af log RCI-data. Desuden giver denne analyse ikke oplysninger om konkurrence mekanismen og rapporterer blot, hvordan forholdet mellem stammerne ændrer sig under inkubationen.

Figur 4 viser to metoder til dataanalyse for at bestemme konkurrence mekanismen for en given interaktion. I figur 4avises total cfus for hver stamme på hvert tidspunkt af eksperimentet. Da reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 1, steg CFUs af begge stammer i løbet af 5 timer, og CFUs for reference stammen var ikke signifikant forskellig fra stamme 1 eller kontrol ved 5 timer (P > 0,05). Disse data indikerer, at reference stammen voksede i nærværelse af stamme 1, og tyder på, at der ikke var nogen konkurrence. Men, når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 2, stamme 2 CFUs steg efter 5 h, men CFUs for reference stammen faldt. Reference stammen CFUs var signifikant lavere end belastning 2 CFUs og kontrol ved 5 h (Student's t-test: P < 0,002). Disse data indikerer, at reference stammen CFUs fald i tilstedeværelsen af stamme 2, og foreslå stamme 2 dræber referencestamme celler. Hvis reference stammen ikke viste et fald i CFUs, men snarere ingen ændring (ingen statistisk forskel mellem referencestamme CFUs ved 0 h og 5 h), disse data ville foreslå stamme 2 udkonkurrerede reference stammen ved at hæmme væksten af reference stammen. Analyse af utransformerede samlede CFU-data er særligt informative, da CFUs for begge stammer på hvert tidspunkt vises selvstændigt og kan bruges til at identificere konkurrence mekanismen.

Figur 4b viser den procentvise genindvinding af reference stammen for at bestemme, hvordan tilstedeværelsen af en konkurrent stamme påvirker reference stammen. Når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 1, en ~ 3.200 procent opsving blev observeret, som ikke var statistisk forskellig fra kontrol og indikerer stamme 1 påvirkede ikke den procentvise inddrivelse af reference stammen. Når reference stammen blev inkuberet med konkurrent stamme 2, en ~ 4 procent opsving blev observeret, som var betydeligt lavere end kontrol (Student's t-test: P < 0,002). Den procentvise opsving var også betydeligt mindre end 100 (Student's t-test: P < 0,002), hvilket indikerer stamme 2 udkonkurrerede reference stammen ved at dræbe referencestamme celler. Hvis den procentvise opsving ikke var statistisk forskellig fra 100, disse data ville foreslå stamme 2 hæmmet væksten af reference stammen. Procentvise opsving data giver en forenklet måde at karakterisere konkurrence mekanismen ved at undersøge, hvordan reference stammen befolkning reagerer på tilstedeværelsen af en konkurrent stamme. Men visning af data på denne måde udelukker oplysninger om start ratio samt hvordan den overflod af konkurrent stamme ændret i hele inkubationen.

Figure 1
Figur 1: rutediagram, som illustrerer coinkubations analysen. A) bakteriestammer, der harkedeligt enten pVSV102 (referencestamme angivet Ref. stamme eller R.S.) eller pVSV208 (konkurrent stamme angivet comp. stamme eller C.S.) dyrkes separat på medie selektiv for enten reference STAMMEN (lbs kan) eller konkurrent stamme (LBS cam). Stammer er derefter ophængt i LBS bouillon og normaliseret til en OD = 1,0. B) reference stammen og konkurrent stammen blandes med et 1:1-forhold på volumen. En seriel fortynding udføres med denne blanding for at bestemme CFUs for begge stammer ved 0 h.C) stamme blandingen derefter spottet på 24-brønden plader, der indeholder lbs agar. Hver replikat er plettet i sin egen brønd. Pletter må tørre og inkuberet derefter ved 24 °C i 5 timer. Efter 5 timer udføres en seriel fortynding for at kvantificere CFUs for hver stamme. D) stamme blandingen fra panel B er også PLETTET på lbs agar Petri plader, der er tilladt at tørre og inkuberet ved 24 °c i 24 timer. Ved 24 timer, er coinkubations stedet afbildet ved hjælp af en fluorescens dissekere mikroskop, der er tilpasset til at detektere grøn (referencestamme) og rød (konkurrent stamme) fluorescens. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative billeder af plader, der kræves til en seriel fortynding. (A) 96-brønd plade, der anvendes til at udføre seriel fortynding. Pladen drejes således, at der er 12 rækker og 8 kolonner. Deskriptorerne for hver behandling omfatter de anvendte stammer og de plasmider, de nærer (f. eks. reference stamme med pVSV102 og konkurrent stamme med pVSV208) og replikatet for hver række (R1, R2, R3 eller R4). Den første kolonne er den ufortyndede prøve, og hver kolonne til højre repræsenterer en 10-fold fortynding fra den foregående kolonne (fortyndingsfaktor anført ovenfor). B) lbs agar plade anvendes til at bestemme cfus for reference STAMMEN på lbs kan plader (top) og konkurrent stamme på lbs cam plader (bund) fra den eksperimentelle behandling. Hver række er en replikat i en behandling (f. eks. R1), og fortyndingsfaktoren for hvert punkt står øverst på pladen. Antallet af CFUs-optællingen for hver replikat vises til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: stikprøvedata til vurdering af, om konkurrerende stammer udkonkurrerer reference stammen. (A) andelen af coinkuerende stammer, der harkedeligt enten pVSV102 (mørkegrå) eller pVSV208 (lysegrå). R.S. angiver reference stammen og C.S. indikerer konkurrentens stamme. Den stiplede vandrette linje angiver en andel på 0,5. Asterisk indikerer, at reference stammen udgjorde en statistisk mindre del af populationen end konkurrentens stamme eller referencestamme i kontrolelementet ved 5 timer (Student's t-test: P < 0,001); NS indikerer ikke signifikant (P > 0,05). (B) log det relative konkurrencemæssige indeks (RCI) for coinkubations analyser. Stiplet lodret linje angiver log RCI = nul. Asterisk angiver, at log RCI-værdien er statistisk større end nul, og at kontrolelementet (elevens t-test: P < 0,001). Fejllinjer indikerer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: stikprøvedata til bestemmelse af konkurrence mekanismen. A) samlede CFU-tal for coinkubationsassays udført med V. Stormhat -isolater, der var differentieret mærket med enten pVSV102 eller pVSV208. CFUs blev indsamlet i begyndelsen af forsøget (0 h) og efter 5 timer inkubation. R.S. indikerer referencestamme og C.S. indikerer konkurrent stamme. Stiplede vandrette linje angiver den gennemsnitlige 0 h CFUs for begge stammer; Asterisk indikerer referencestamme CFUs var statistisk lavere i den eksperimentelle behandling i forhold til kontrolbehandlingen ved 5 timer (elevens t-test: P < 0,002). B) procentvis inddrivelse af reference stammen. Vandret stiplet linje angiver 100% opsving (ingen stigning eller fald i CFUs); Asterisk indikerer, at procent genfinding var statistisk lavere end 100% og kontrolbehandlingen (Student's t-test: P < 0,002). Fejllinjer indikerer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: eksempeldata for inkubationstiden og optimering af billeddannelse. A) total cfus for coinkubations analyser, hvor cfus blev indsamlet i begyndelsen af forsøget (0 timer) efter 5, 12 og 24 timers inkubation. R.S. indikerer referencestamme og C. S. 2 indikerer konkurrent stamme 2. Stiplede vandrette linje angiver den gennemsnitlige 0 h CFUs for begge stammer; asterisker indikerer referencestamme CFUs var statistisk lavere i den eksperimentelle behandling i forhold til kontrolbehandlingen på det givne tidspunkt (elevens t-test: P < 0,002). Fejllinjer indikerer SEM.B) fluorescerende mikroskopi billeder, der svarer til CFU-data i panel A. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Eksempeldata til optimering af coinkubations forhold. Der blev udført coinkubations eksperimenter mellem reference stammen (R.S.) husly pVSV102 (grøn, øverste række) og konkurrent stamme (C.S.) husly pVSV208 (rød, nederste række) og fluorescerende mikroskopi billeder blev taget på 24 h. (a) stammer blev blandet i et 1:1-forhold eller (B) et 1:5-forhold, hvor reference stammen, indeholdende pVSV102, var i undertal af den konkurrent stamme, der indeholdt pVSV208. Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den coinkubations analyse, der er beskrevet ovenfor, giver en effektiv metode til at opdage interbakteriel konkurrence. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at identificere den intraspecifikke konkurrence mellem V. Stormhat isolater og karakteriseringen af konkurrence mekanismen19. Selv om den beskrevne metode blev optimeret til marine bakterien V. Stormhat, det kan nemt ændres til at rumme andre bakterielle arter, herunder kliniske og miljømæssige isolater. Det er vigtigt at bemærke, at konkurrerende mekanismer ofte er reguleret5,6,23,24,25,26,27 , 28, så små forskelle i vækstbetingelser (f. eks. rystelser vs. stående kultur, temperatur osv.) og medietype (f. eks. saltindhold) kan påvirke resultaterne dramatisk. Derfor er optimering af coinkubations betingelserne sandsynligvis nødvendig for forskellige bakteriearter samt forskellige konkurrencemekanismer. Det er bedst at vælge kulturforhold, der nøje afspejler isolaterne naturlige miljø. For eksempel blev der udført coinkubations assays mellem V. Stormhat -stammer med lbs-medier ved 24 °c for at afspejle saltindholdet og temperaturen i havmiljøet. Men nogle bakterier er naturligt kompetente i deres miljø27,28 og derfor kunne tage op genetisk materiale frigivet af lyserede celler under antagonistiske interaktioner29. For at forhindre en sådan DNA-overførsel i at påvirke coinkubations resultater er det vigtigt at bruge betingelser, der ikke fremmer kompetence eller stammer, der ikke er kompetente, enten naturligt eller ved inaktivering af DNA-optagelses maskiner. Desuden kan eksperimentelle parametre såsom cellevækst fase, kultur tæthed, inkubationstid, eller start stamme ratio også kræve optimering for forskellige bakteriearter eller konkurrencedygtige mekanismer. For eksempel vil den indledende kultur tæthed diktere mængden af celle celle kontakt mellem stammer, hvilket kan påvirke bakteriernes evne til at implementere kontaktafhængige mekanismer for konkurrence.

Figur 5a viser processen med optimering af coinkubations assays med V. Stormhat isolater. Her blev en række inkubationstider for CFU-opsamling og fluorescerende mikroskopi-billeddannelse evalueret for at bestemme den optimale tid for hver måling, der skal indsamles. CFUs blev indsamlet umiddelbart efter blandingen af reference stammen og konkurrent stamme 2 blev spottet på LBS agar plader (0 h), og CFU målinger og fluorescerende mikroskopi billeder blev taget straks og efter 5, 12, og 24 h. Disse eksempeldata fremhæver vigtigheden af grundig optimering, før de drager konklusioner om samspillet mellem to stammer. For eksempel, to forskellige konklusioner om mekanismen for interaktion kan udledes baseret på, når CFUs indsamles: CFUs fra 5 eller 12 h indikerer stamme 2 dræbte reference stammen, mens CFUs indsamlet ved 24 h tyder stamme 2 hæmmer væksten af referencestamme.

Den optimale tid til visualisering af coinkubations pletter gennem fluorescerende mikroskopi kan være anderledes end den optimale tid for CFU-samlingen. Figur 5b viser fluorescerende mikroskopi billeder af coinkubations pletter ved 0, 5, 12 og 24 timer. Ved 0 og 5 timer er coinkubations punkterne ikke synlige med fluorescerende mikroskopi. For billeder taget på 12 h, begge stammer i kontrol behandling er synlige, men RFP (referencestamme husly pVSV208) er især lysdæmper. Ved eksperimentel behandling på 12 timer er konkurrent stamme 2 synlig (endnu Dim), og reference stammen kan ikke påvises. Stamme-specifikke forskelle mellem bakterielle isolater kan påvirke ekspression af fluorescerende proteiner, og dermed lysstyrken af cellerne i den blandede spot. Da RFP er særligt lysdæmper end gfp i kontrolelementet, bør coinkubations stederne fortsat inkuberet og blive afbildet igen på et senere tidspunkt. I billeder taget på 24 timer er begge stammer synligt detekterbare og med en tilsvarende lysstyrke i kontrol forsøget. I den eksperimentelle behandling er stamme 2 synlig, mens reference stammen ikke observeres inden for coinkubations stedet. 15-24 h Inkubationstiden er tilstrækkelig til at visualisere gfp og RFP for V. Stormhat ved hjælp af stabile plasmider pVSV102 og pVSV208, men inkubationstiden kan være nødvendig for at blive justeret for forskellige plasmider eller bakteriearter. Selv om den optimale tid til visualisering af coinkubations pletter og indsamling CFU data er forskellige, Imaging på 24 h er en god måde at hurtigt skærm interaktioner for V. Stormhat, fordi resultatet opnået fra Imaging på 24 h (Target er synlig eller ej) afspejler de mere tids intensive kvantitative data opnået fra plating CFUs ved 5 eller 12 timer.

Udgangs forholdet kan i høj grad påvirke resultaterne, især ved inkuberingen af to hæmmende stammer, og det kan være nødvendigt at justere for at begrænse stamme specifikke forskelle i drab effektivitet eller vækstrate. For eksempel viser figur 6a fluorescerende mikroskopi billeder af eksperimenter, hvor reference stammen blev coinkuberet med sig selv (kontrol) og tre andre V. Stormhat isolater begyndende ved et 1:1-forhold. I disse stikprøvedata påvises reference stammen synligt, når den inkuberet med sig selv, konkurrent stamme 1, og konkurrent stamme 3 efter 24 h. Men når udgangs forholdet blev justeret til 1:5 (dvs. 50 mL referencestamme blandet med 250 mL konkurrent stamme), påvises reference stammen kun synligt, når den er coinkuberet med sig selv og stamme 1, hvilket indikerer, at både stamme 2 og stamme 3 konkurrerer reference stammen. Denne justering forhindrer den hurtigere vækst i reference stammen i at sløre virkningen af eventuelle interferens konkurrencemekanismer, som konkurrentens stammer har udvist. Baseret på resultaterne i figur 6a, et forhold på 1:5 (referencestamme: konkurrent stamme) bør anvendes til at screene yderligere V. Stormhat stammer for evnen til at dræbe reference stammen.

Denne protokol diskriminerer mellem coinkuerende stammer ved differentielt mærkning stammer med plasmider indeholder enten kanamycin eller chloramphenicol resistensgener. Men, forskellige antibiotika eller andre udvælgelsesmetoder kan være bedre egnet til forskellige bakteriearter. Andre metoder til differentialudvælgelse kan omfatte: 1) udnyttelse af en stamme/Arts-specifik auxotrofi for specifikke vækstfaktorer (f. eks. DAP eller thymidine), 2) betingede vækst krav (f. eks. en stamme vokser ved 37 °C, mens den anden ikke), eller 3) kontra selektions markører, der eliminerer eller hæmmer væksten af den mærkede stamme, når de dyrkes under passende forhold for at udtrykke et "Kill"-gen (f. eks. Ccdb eller sacb).

Det er afgørende at vælge den relevante referencestamme for at opnå og fortolke reproducerbare resultater fra coinkubations analysen. En referencestamme skal være godt undersøgt (dvs. have en bred vifte af videnskabelig litteratur), har ingen tilsyneladende drab eller hæmmende evne, og ideelt set have en sequeneret genom. For eksempel er visse stammer af Escherichia coli fælles reference stammer for mange bakterielle koinkubations eksperimenter30,31. E. coli kan dog ikke være økologisk relevant for en given konkurrencemekanisme eller konkurrent, hvilket kan påvirke resultaterne. For eksempel kan nogle bakterier have udviklet mekanismer specifikt rettet mod nært beslægtede arter eller konkurrenter for den samme økologiske niche og deres konkurrencemekanisme ville ikke være effektiv mod en E. coli referencestamme.

Kort sagt, den metode, der er beskrevet her, har til formål at give en let modificeret og robust tilgang til at evaluere interbakterielle interaktioner og konkurrence. Denne metode kan anvendes på bakterielle isolater, der er relevante for miljømæssig eller klinisk forskning, og kan anvendes til at udforske forskellige mekanismer af mikrobiel interaktion, som tidligere er ukendte eller svære at undersøge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke anmeldere for deres nyttige feedback. A.N.S. blev støttet af Gordon og Betty Moore Foundation gennem Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

Immunologi og infektion interferens konkurrence Fluorescens mikroskopi aliivibrio Stormhat interstrain interaktioner interspecies interaktioner interbakterielle drab
Coinkubations analyse til kvantificering af konkurrence interaktioner mellem <em>Vibrio Stormhat</em> isolater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter