Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.

Abstract

Dit manuscript beschrijft een op cultuur gebaseerde, coincubation assay voor het opsporen en karakteriseren van concurrerende interacties tussen twee bacteriële populaties. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die het mogelijk maken elke populatie te differentieel gelabeld met verschillende antibioticaresistentie capaciteiten en fluorescerende eiwitten voor selectie en visuele discriminatie van elke populatie, respectievelijk. Hier beschrijven we de voorbereiding en coincubatie van concurrerende Vibrio fischeri stammen, fluorescentiemicroscopie beeldvorming en kwantitatieve gegevensanalyse. Deze aanpak is eenvoudig, levert snelle resultaten op en kan worden gebruikt om te bepalen of een populatie de groei van een andere populatie doodt of remt, en of de concurrentie wordt gemedieerd door een diffugeerbaar molecuul of directe celcelcontact vereist. Omdat elke bacterie populatie een ander fluorescerend eiwit uitdrukt, maakt de bepaling de ruimtelijke discriminatie van concurrerende populaties in een gemengde kolonie mogelijk. Hoewel de beschreven methoden worden uitgevoerd met de symbiotische bacterie V. fischeri met voorwaarden die zijn geoptimaliseerd voor deze soort, kan het protocol worden aangepast voor de meeste culturable bacteriële isolaten.

Introduction

Dit manuscript schetst een op cultuur gebaseerde methode om te bepalen of twee bacteriële isolaten in staat zijn om concurrerende interacties te maken. Bij het bestuderen van gemengde populaties is het belangrijk om te beoordelen in hoeverre de bacteriële isolaten interageren, met name of isolaten rechtstreeks concurreren door middel van interferentie mechanismen. Interferentie concurrentie verwijst naar interacties waarbij één populatie direct de groei remt of een concurrent populatie doodt1. Deze interacties zijn belangrijk om te identificeren, omdat ze ingrijpende gevolgen kunnen hebben voor de structuur van een microbiële Gemeenschap en de functie2,3.

Mechanismen voor microbiële concurrentie zijn in grote lijnen ontdekt in het genoom van bacteriën uit diverse omgevingen, waaronder zowel gastheer-geassocieerde als vrijlevende bacteriën4,5,6,7, 8,9. Een verscheidenheid aan concurrentie strategieën zijn beschreven10,11 met inbegrip van diffundeerbaar mechanismen, zoals bactericide chemicaliën1,12 en uitgescheiden antimicrobiële peptiden13 , evenals contact afhankelijke mechanismen die celcelcontact vereisen om een remmende Effector over te brengen naar de doelcellen9,14,15,16,17 ,18.

Hoewel op cultuur gebaseerde coincubations vaak worden gebruikt in microbiologie5,8,19, schetst dit manuscript hoe de assay te gebruiken om het mechanisme van de concurrentie te karakteriseren, evenals suggesties voor het aanpassen van het protocol voor gebruik met andere bacteriesoorten. Bovendien beschrijft deze methode meerdere benaderingen voor het analyseren en presenteren van de gegevens om verschillende vragen over de aard van de concurrerende interacties te beantwoorden. Hoewel de hier beschreven technieken eerder werden gebruikt om het interbacteriële dodende mechanisme te identificeren dat onderliggende intraspecifieke concurrentie tussen symbiotische stammen van cogeïsoleerde Vibrio fischeri bacteriën19, zijn ze geschikt voor veel bacteriesoorten, waaronder milieu isolaten en menselijke pathogenen, en kunnen worden gebruikt om zowel contact afhankelijke als diffundeerbaar concurrerende mechanismen te evalueren. De stappen in het protocol kunnen optimalisatie vereisen voor andere bacteriesoorten. Gezien het feit dat meer modelsystemen hun studies verder uitbreiden dan het gebruik van isogene organismen om verschillende genotypen10,16,20,21te omvatten, zal deze methode een waardevolle bron zijn voor onderzoekers die willen begrijpen hoe de concurrentie invloed heeft op multi-strain of multi-species systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereid stammen voor Coincubation

  1. Kies een geschikte referentiestam die zal dienen als doelwit voor bacteriële concurrentie tijdens de coincubation assay. Zie discussie voor aanbevolen procedures bij het selecteren van een referentiestam en de invloed van de referentiestam op de resultaten. In dit protocol, V. fischeri stam ES114 zal dienen als de referentiestam.
  2. Bepalen welke selectie-en screeningsmethoden zullen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de isolaten in coincubation
    1. Typisch, transformeren stammen met stabiele plasmiden met verschillende antibioticaresistentiegenen (bv. kanamycine of chlooramfenicol) om te selecteren voor elke stam, evenals genen coderen verschillende fluorescerende eiwitten (bv. GFP of RFP) voor visueel onderscheidende stam typen in de cocultuur.
      Opmerking: Het gebruik van stabiele plasmiden is vereist, omdat als een stam het plasmide verliest bij afwezigheid van selectie, de aantallen van deze stam zullen worden onderschat wanneer ze worden gekwantificeerd, en zullen niet visueel detecteerbaar zijn met fluorescentiemicroscopie.
    2. Tag coincubated V. fischeri stammen differentieel zodanig dat een stam de plasmide pVSV102 bevat, die een groen fluorescerende proteïne (GFP) en resistentie tegen het antibioticum kanamycine (kanR), en de tweede stam bevat plasmide pVSV208, die een rood fluorescerende proteïne (dsRed) en resistentie tegen het antibioticum chlooramfenicol (cmR)22uitdrukt.
      Opmerking: Andere differentieel selecties kunnen worden gebruikt om coincubating-stammen te onderscheiden. Zie discussie voor aanvullende methoden.
    3. Neem de volgende controle op tijdens de initiële optimalisatie van de coincubation assay om ervoor te zorgen dat de selectie robuust is. Plaat elke stam die is gelabeld op agar-platen met het antibioticum dat moet worden geselecteerd (d.w.z. plaat stam 1 op media die selecteert voor stam 2, en omgekeerd).
  3. Twee dagen voorafgaand aan coincubation Assay, streak referentiestam pVSV102, referentiestam pVSV208, en elke concurrent stam pVSV208 van-80 °C voorraden op LBS agar platen met het geschikte antibioticum (bijv. 100 μg/mL kanamycine of 2 μg/mL chlooramfenicol) en incuberen de nacht bij 24 °C. Antibiotica selectie is vereist om ervoor te zorgen dat alle cellen het plasmide bevatten aan het begin van het experiment.
  4. Op een dag voorafgaand aan de Assay, pick en restreak vier individuele kolonies per stam type (biologische replicaten) op verse LBS agar-platen met geschikt antibioticum en geïnineerd 's nachts bij 24 °C.
    Opmerking: Deze stap kan optimalisatie vereisen voor andere bacteriesoorten, omdat langere of kortere incubatie tijden nodig kunnen zijn om voldoende cellen te verkrijgen, afhankelijk van de groeisnelheid van het organisme van belang.

2. coincubate bacteriële stammen

  1. Bereiding van elke bacteriestam voor incubatie (Figuur 1a)
    1. Gebruik een steriele tandenstoker, schraap de cellen van de agar plaat (zoveel als de grootte van een rijstkorrel) en onderbreek de cellen in een micro centrifugebuis van 1,5 mL met 1 mL LBS Bouillon. Breek de celklonters door ze in de zijkant van de buis te drukken en krachtig op en neer te pipetteren.
    2. Cap de buis en Vortex voor 1-2 s. Als de celklonten nog steeds zichtbaar zijn, gaat u verder met Vortex of pipet op en neer totdat het monster visueel uniform is.
    3. Herhaal stap 2.1.1-2.1.2 voor alle monsters.
  2. Meet en noteer de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) voor alle monsters. Monsters zullen waarschijnlijk tot tien maal moeten worden verdund met behulp van LBS Bouillon om een nauwkeurige OD-meting te verkrijgen. Normaliseer elk monster naar de gewenste OD600. Stammen zijn meestal genormaliseerd naar een OD600 ~ 1,0, wat zich vertaalt naar ~ 106 bacteriën/ml voor V. fischeri.
    Opmerking: Deze stap kan optimalisatie vereisen voor verschillende bacteriële soorten als de entmateriaal celdichtheid van invloed coincubation resultaten afhankelijk van het mechanisme van de concurrentie. Zie discussie voor optimalisatie.
  3. Coincubating-stammen (Figuur 1b, C)
    1. Meng de referentiestam en de concurrent stam in een verhouding van 1:1 (v/v) door 100 mL van elke stam (genormaliseerd naar OD 1,0) toe te voegen aan een gelabelde centrifugebuis van 1,5 mL. Als een controle, meng de referentiestam met een differentieel gelabelde versie van zichzelf (referentiestam pVSV102 + referentiestam pVSV208). Deze controle is vereist voor latere statistische analyse om te bepalen of de aanwezigheid van een concurrent stam van invloed is op de groei van de referentiestam. Vortex de Mixed-strain cultuur voor 1-2 s.
      Opmerking: Deze stap kan optimalisatie vereisen, omdat de start ratio de resultaten aanzienlijk kan beïnvloeden en mogelijk moet worden aangepast. Zie discussie voor optimalisatie.
    2. Herhaal stap 2.3.1 voor elke biologische replicatie. Na het voltooien van deze stap, moeten er in totaal acht gemengde-rek buizen: vier biologische replicaten met differentiaal gelabelde referentie stammen (controle), en vier biologische replicaten met differentiaal gelabelde referentie-en concurrent stammen ( experimenteel).
    3. Spot 10 mL van elke controle en het experimentele mengsel op Petri borden die LBS agar bevatten; deze cultuur vlekken zullen worden gebruikt voor fluorescentiemicroscopie na de incubatie.
    4. Laat de vlekken volledig op de Bank drogen totdat alle vloeistof in de agar is opgenomen en laat de Petri platen gedurende 24 uur bij 24 °C inbrokken. Een minimum van 15 h is vereist voor V. fischeri stammen gelabeld met PVSV102 en pVSV208 om te groeien tot een hoog genoeg celdichtheid te visualiseren GFP en RFP, respectievelijk, op het niveau van de bevolking met behulp van een fluorescentie ontleed Microscoop. Hier gebruiken we een incubatie van 24 uur voorbeeld vormende Mixed spots.
      Opmerking: Het is belangrijk om platen te gebruiken die niet te vochtig of te droog zijn. Als de platen te vochtig zijn, zullen coincubation spots niet in de agar plaat worden opgenomen; Vermijd het gebruik van platen gegoten op dezelfde dag. Als de platen te droog zijn, kunnen kleine golven of scheuren op het agar-oppervlak vormen, waardoor coincubation vlekken onregelmatig in vorm zijn.
    5. Gebruik dezelfde bacteriële suspensies als in stap 2.3.3 en spot 10 mL van elke controle en experimentele mengsels in 24-put platen met 1 mL LBS agar per put. Zoals in stap 2.3.3, zorg ervoor dat de agar in 24-Well platen de juiste vochtigheid heeft. Laat de vlekken volledig drogen en incuberen bij 24 °C gedurende 5 uur. Deze cultuur vlekken zullen worden gebruikt om de kolonie vormende eenheden (CFUs) te kwantificeren voor elke stam aan het einde van het experiment.
      Opmerking: Het spotten van bacteriële suspensies voor groei in individuele putjes zorgt voor een gemakkelijkere resuspensie op het eind tijdstip. Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van vierkante steriele filter stukken als een meer economische benadering van het gebruik van 24-Well platen. Vierkante steriele filter stukken kunnen op een agar plaat worden geplaatst en 10 mL van elk experimenteel mengsel kan op deze filters worden gespot, in plaats van op 24-Well platen. Na de coincubation-tijd kunnen de filters worden overgebracht naar een centrifugebuis van 1,5 ml en kan de coincubation-spot worden geresuspendeerd door grondig of pipetteren op en neer. Een incubatietijd van 5 uur volstaat om interbacterieel doden tussen V. fischeri isolaten19te detecteren, maar deze coincubation-tijd kan nodig zijn om korter of langer te zijn voor andere soorten of concurrerende mechanismen. Zie discussie voor meer informatie.
  4. Seriële verdunning voor het starten van entmateriaal
    1. Om een seriële verdunning van het starten van coincubation-mengsels uit te voeren, draait u een 96-goed plaat 90 ° zodat er acht kolommen en twaalf rijen zijn. Elke rij bevat een monster van het onverdunde mengsel in de eerste kolom, gevolgd door 7 10-voudige seriële verdunningen over de resterende putjes in de rij (Figuur 2a).
    2. Label elke rij met de stam-id, het replicatienummer en de tijd (beginnend entmateriaal = T0). Etikettering van de agar-agarplaten aangevuld met het geschikte antibioticum om de verdunningsreeks te spotten. Zorg ervoor dat u te identificeren welke stam elke antibiotica plaat is selecteren voor.
    3. Voeg met behulp van een multikanaalspipet 180 mL pond Bouillon toe aan elk goed, waarbij de eerste kolom leeg is voor het onverdunde coincubation-mengsel.
      Opmerking: Onderzoekers kunnen ervoor kiezen om fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te gebruiken om coincubation-vlekken te hervatten en seriële verdunning uit te voeren als ze werken met een bijzonder snel groeiende bacteriesoort of consequent grote experimenten uitvoeren waarbij seriële verdunningen kunnen duren een lange tijd om te presteren. Het gebruik van PBS in deze gevallen zal aanzienlijke uitgroei van bacteriën voorkomen tijdens het proces van het uitvoeren van seriële verdunningen. Het is echter belangrijk om consistent te zijn met welke oplossing wordt gebruikt (bijvoorbeeld PBS of LBS) voor alle experimenten, ongeacht hun grootte of duur.
    4. Gebruik een pipet van één kanaal van 200 mL en breng 100 mL van het coincubation-mengsel over van de buis naar de eerste kolom. Gooi de punt weg en herhaal dit voor alle coincubation-mengsels.
    5. Gebruik een multikanaalspipet en breng 20 mL over van kolom 1 naar 2 en meng door Pipetteer op en neer. Gooi de tips weg en herhaal voor elke kolom, zodat aan het einde elke rij een tien-voudige seriële verdunning van het initiële coincubation-mengsel bevat.
      Opmerking: Wees consistent met het aantal malen dat verdunningen op en neer worden opgepipetteren. Druk de pipet hendel bijvoorbeeld vijf keer op voor elke verdunning om consistent te zijn in de verdunningsreeks.
    6. Met behulp van een meerkanaals pipet met acht uiteinden, aspiraat 5 ml van elke put in een verdunningsreeks (dat wil zeggen, één rij van acht putjes) en spot deze op de lbs-agar-plaat die voor de referentiestam selecteert (aangevuld met kanamycine). Herhaal deze stap spotting op de plaat selecteren voor de concurrent stam (aangevuld met chlooramfenicol) (Figuur 2b). Laat de vlekken volledig drogen voordat u ze in een incubator plaatst.
      Opmerking: Dezelfde tips kunnen worden gebruikt voor het spotten van een replicaatverdunnings reeks op platen die selecteren voor de referentie-en concurrent stam, maar moeten worden gewijzigd tussen replicaten. Vermijd het aanraken van het uiteinde van de pipetpunt aan de LBS agar-platen, omdat dit een depressie kan veroorzaken die op een bacteriële kolonie kan lijken en resultaten scheeftrekken tijdens plaattellingen. Als de tip de plaat aanraakt, maak een notitie en neem niet de depressie in kolonie graven.
  5. Het nemen van T Final metingen
    1. Nadat de coincubation spots in de 24-Well platen zijn geïncubeerd voor 5 uur bij 24 °C, voeg je 1 mL LBS bouillon toe aan elk goed en hervat je de coincubation spots door Pipetteer op en neer totdat alle cellen zijn geresuspendeerd. Consistent zijn met de kracht waarin de cellen worden geresuspendeerd over alle replicaten. Druk bijvoorbeeld acht keer op de pipet hendel om elk monster volledig te hervatten.
    2. Zodra elke coincubation-plek is geresuspendeerd, bereidt u een 96-goed plaat voor een seriële verdunning en LBS agar-platen met de juiste antibiotica om de verdunning op dezelfde manier te spotten als stap 2.4.1.
    3. Voer de stappen 2.4.2-2.4.6 uit om de seriële verdunning voor T-eind metingen te voltooien.
      Opmerking: Een belangrijke controle moet worden opgenomen tijdens de initiële optimalisatie van de coincubation assay. Aan het einde van de coincubation-periode, plaat de gemengde stammen op media die beide antibiotica omvat. Geen enkele stam moet kunnen groeien tenzij 1) een spontane mutatie optreedt, of 2) selecteerbare markers worden uitgewisseld tussen stammen.

3. Coincubations visualiseren met behulp van fluorescentiemicroscopie

  1. Afbeelding elke coincubation plek op LBS agar Petri platen uit de stappen 2.3.3 en 2.3.4 met behulp van een stereomicroscoop die is uitgerust voor groene en rode fluorescentiedetectie, die overeenkomen met de fluorescentie eiwitten die worden uitgedrukt op de stabiele plasmiden.
  2. Begin met het nemen van beelden van de controle coincubation spot (referentiestam pVSV102 + referentiestam pVSV208).
    1. Pas de vergroting aan zodat de spot scherp is.
    2. Gebruik het juiste excitatie licht en filter om GFP te observeren, pas de belichtingstijd aan, zodat alleen fluorescentie van de coincubation-spot detecteerbaar is en elke achtergrond fluorescentie van de Media laag of niet zichtbaar is.
    3. Verander het excitatie lampje en filter om RFP te observeren, en pas de belichtingstijd aan om de achtergrond van het medium te minimaliseren.
  3. Voor elke coincubation-spot van de experimentele behandelingen, afbeelding voor de referentiestam met behulp van het GFP-filter en belichtingstijd bepaald in stap 3.2.2.
  4. Afbeelding van de concurrent stam met behulp van het RFP filter, het aanpassen van de belichtingstijd zodat fluorescentie alleen wordt waargenomen vanaf de coincubation spot en de achtergrond fluorescentie van het medium is minimaal. Sla beide afbeeldingen op en noem ze beide stam-Id's, het replicatienummer, de incubatietijd wanneer de afbeelding is genomen (bijvoorbeeld 24 uur). Herhaal dit voor alle replicaten.
    Opmerking: Coincubation tijd moet mogelijk worden aangepast voor verschillende plasmiden of bacteriesoorten. Zie discussie voor optimalisatie.

4. gegevensanalyse

  1. Berekenen van CFUs voor elke controle en experimentele behandeling op elk tijdpunt (T start en T Final)
    1. Zodra de kolonies zichtbaar zijn op seriële verdunnings platen (bijvoorbeeld 24 uur bij 24 °C voor V. fischeri), moet de verdunningsfactor worden vastgesteld waarbij afzonderlijke kolonies kunnen worden geteld en niet samen zijn gegroeid tot grote clusters met meerdere kolonie (Figuur 2b). Tel en noteer voor elke replicaat het aantal individuele kolonies voor een bepaalde verdunning. Dit nummer vertegenwoordigt de CFUs voor die replicatie.
    2. Converteer CFUs voor de verdunning naar totaal CFUs voor elke stam in de coincubation met behulp van de onderstaande formule:
      [CFUs ÷ (verdunningsfactor x vol verdunnings punt)] x vol van het onverdund monster = totaal CFUs
      Voorbeeld: t0: [(6 CFUs) (10 ^-6 x 0,005 mL)] x [0,01 mL] = 1,2 E7 totaal CFUs van stam 1 op de gemengde plek aan het begin van het experiment
      T5: [(4 CFUs) (10 ^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8,0 E5 totaal CFUs van stam 1 in de gemengde vlek na 5 h coincubation
      De CFU-waarden voor elke stam op elk moment zijn de onbewerkte gegevens die kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses en statistische tests (zie paragraaf 4,2 hieronder).
  2. Voer de volgende gegevenstransformaties uit om te bepalen of een concurrent stam de referentie spanning overtreft door: (i) te bepalen of het aandeel van de referentiestam afneemt in aanwezigheid van de concurrent stam, of (II) de berekening van de Log relatieve concurrerende index (RCI). Deze analyses zetten onbewerkte gegevens om in verhoudingen en kunnen nuttig zijn om de concurrentie uitkomst van een interactie te bepalen, maar kunnen het mechanisme van de concurrentie niet bepalen (d.w.z. het doden versus groeiremming).
    1. Berekening van het aandeel van elke stam voor elk tijdspunt tijdens de coincubation
      1. Converteer CFU-gegevens naar het aandeel van elke stam in een behandeling. Verdeel voor de referentiestam (RS) op t0 de totale CFUs voor de referentiestam op T0 door de som van de totale CFUs voor de referentiestam en de concurrent (CS) op t0:
        RST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + CST0 cfus) = percentage van de referentiestam op T0.
        Voer dezelfde berekening uit om het aandeel van de concurrent stam op T0 te bepalen:
        CST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + CST0 cfus) = percentage van de referentiestam op T0
        Herhaal dit proces voor elk tijdspunt en repliceer voor zowel de experimentele behandeling als de controle behandeling (differentiaal-gelabelde referentiestam coincubation).
      2. Grafiek het gemiddelde aandeel van elk type stam in t0 en T5 in een gestapelde staafgrafiek (Figuur 3a).
      3. Zorg ervoor dat de gewenste start ratio van stammen werd verkregen. Voor coincubations waar stammen aanvankelijk gemengd waren 1:1, elk type stam moet omvatten ~ 0,5 van de bevolking op t0 en mag niet statistisch verschillen van elkaar met behulp van een student t-test (P > 0,05). Als het aandeel van één stam aanzienlijk groter is dan dat van de andere stam op T0, herhaalt u het experiment totdat een 1:1-Start verhouding is bereikt.
      4. Bepaal of de concurrent stam een significant groter deel van de populatie bevat na 5 uur. Voer de t-toets van een student uit met een vergelijking van het aandeel van elke stam in de experimentele behandeling op t0 en T5. Als het aandeel van de concurrent belasting significant verschilt van dat van de referentiestam bij T5 (P < 0,05), suggereert dit resultaat dat de concurrentie kan zijn opgetreden. Ga verder naar stap 4.2.1.5.
      5. Om te bepalen of de aanwezigheid van de concurrent stam het aandeel van de referentiestam na 5 uur heeft verlaagd, voert de t-toets van een student een vergelijking uit van het aandeel van de referentiestam in de controle met het aandeel van de referentiestam in de experimentele behandeling (referentiestam v concurrent stam).
        Opmerking: als de verhouding van de referentiestam statistisch lager is in de experimentele behandeling ten opzichte van de controle (P < 0,05), heeft de concurrent stam de verhouding van de referentiestam na 5 uur significant verlaagd en de referentiestam overtroffen.
    2. Berekenen van de log RCI-waarde voor elke behandeling (inclusief de controle)
      Opmerking: De relatieve concurrerende index, of RCI, is een enkele waarde die vergelijkt hoe de eind ratio van stam typen verschilt van de begin verhouding. De RCI-waarde is log-getransformeerd zodanig dat een log RCI-waarde groter dan nul geeft aan dat de concurrent stam (CS) de referentie-stam (RS) overtreft, een log RCI-waarde kleiner dan nul geeft aan dat de referentiestam buiten de concurrent stam, en een log RCI waarde van nul geeft aan dat geen van beide spanning is overconcurreerde.
      1. Bereken log RCI-waarden voor elke controle en experimentele behandeling met behulp van de volgende vergelijking:
        Log [(CST5 CFU "RST5 cfus") (CST0 CFU, RST0 cfus)] = log RCI
      2. Grafiek log RCI-waarden met behulp van een gescheiden vak & snorharen plot waar gegevens in de horizontale richting worden grafisch (Figuur 3b).
      3. Bepaal of elke behandeling significant verschilt van nul door het uitvoeren van een t-toets van een student die de log RCI-waarden van elke behandeling (inclusief het besturingselement) vergelijkt met een gegevensset die hetzelfde aantal replicaties met een nulwaarde vergelijkt. Als de log RCI-waarden voor de experimentele behandeling statistisch groter zijn dan nul (P < 0,05), dan heeft de stam van de concurrent de referentiestam overtroffen.
        Opmerking: Het besturingselement mag niet statistisch verschillen van nul (P > 0,05), omdat de differentiaal gelabelde referentie stammen isogeen zijn.
      4. Voer de t-toets van een student uit om te bepalen of de log RCI-waarden voor de experimentele behandeling significant groter waren dan het besturingselement (P < 0,05). Als de log RCI waarden van de experimentele behandeling zijn statistisch groter dan de controle behandeling, vervolgens de concurrent stam overtroffen de referentiestam.
  3. Voer de volgende statistische analyse uit om het mechanisme te bepalen waarmee de stam van de concurrent de referentiestam overtreft: (i) analyseren van onbewerkte totale CFU-gegevens, of (II) het percentage terugwinning van de referentiestam onderzoeken. Deze analyses kunnen meer omslachtig zijn om te bekijken ten opzichte van die van stap 4,2, maar zullen bepalen of de concurrent stam de referentiestam overtreft door deze te ontgroeien, de groei van de referentiestam te remmen of de referentiestam actief te elimineren.
    1. Analyse van onbewerkte totale CFU-gegevens
      1. Grafiek RAW totaal CFU gegevens voor beide stammen met behulp van een Interleaved Scatter plot, waarbij replicaten worden weergegeven als afzonderlijke gegevenspunten (Fig. 4a). Geef gegevens weer op een logboek schaal en voeg een horizontale lijn toe die de gemiddelde T0 CFUs voor beide stammen aangeeft.
      2. Om te bepalen of de aanwezigheid van de concurrent stam negatief beïnvloed de referentiestam, uitvoeren van een student t-test vergelijking referentiestam CFUs voor de controle en experimentele behandelingen bij T5. Als de referentiestam CFUs in de experimentele behandeling statistisch lager dan in de controle (P < 0,05), dan is de aanwezigheid van de concurrent stam aanzienlijk beïnvloed de referentiestam.
      3. Om te bepalen of de aanwezigheid van de concurrent stam ofwel geremd de groei van of geëlimineerd de referentiestam, uitvoeren van een student t-test vergelijking van de referentiestam CFUs op t0 en T5 voor de controle en experimentele behandelingen.
        Opmerking: Bij afwezigheid van een concurrent moet de referentiestam een significante toename van de CFU vertonen bij de vergelijking van t0 en T5 voor de controle behandeling. Bij het analyseren van de experimentele behandeling, als referentiestam CFUs bij T5 niet statistisch verschillend zijn vergeleken met T0 (P > 0,05), dan heeft de concurrent stam de groei van de referentiestam geremd. Als de referentiestam T5 CFUs beduidend lager is dan T0 CFUs (P < 0,05), dan heeft de concurrent stam de referentiestam gedood.
    2. Percentage terugvinding van de referentiestam berekenen
      1. Transformeer de totale CFU-gegevens voor de referentiestam (RS) in percentage herstelgegevens met behulp van de onderstaande vergelijking:
      2. (RST5 CFUS, RST0 cfus) x 100 =% terugwinning van de referentiestam
      3. Geef het procentuele herstel van de referentiestam weer met behulp van een staafdiagram waarbij elke staaf het besturingselement of de experimentele behandeling vertegenwoordigt (figuur 4b). Voeg een onderbroken lijn toe bij y = 100 om 100% herstel van de referentiestam aan te geven (geen toename of afname van de referentiestam CFUs van 0 h tot 5 h).
      4. Om te bepalen of de concurrent stam negatief beïnvloed de referentiestam, uitvoeren van een student t-test vergelijking referentiestam procent herstel voor de controle behandeling aan de experimentele behandeling. Als het percentage herstel aanzienlijk minder is dan het besturingselement (P < 0,05), heeft de stam van de concurrent een negatieve invloed op de referentiestam.
      5. Om vast te stellen of de concurrent stam de groei van de referentiestam heeft afgeremd of geëlimineerd, voert zij een t-toets van een student uit met een vergelijking van het percentage herstel van de referentiestam voor de experimentele behandeling en een gegevensset met hetzelfde aantal replicaten, allemaal met een waarde van 100.
        Opmerking: Als de experimentele behandeling niet statistisch verschilt van 100 (P > 0,05), dan heeft de concurrent stam de groei van de referentiestam geremd. Als het referentiestam percentage herstel in de experimentele behandeling significant lager is dan 100 (P < 0,05), dan heeft de concurrent stam de referentiestam gedood.
    3. Fluorescentiemicroscopie beelden interpreteren
      1. Zodra fluorescentiemicroscopie beelden worden genomen, bepalen of elke stam zichtbaar detecteerbaar is in de coincubation-spot. Voor de controle coincubation (referentiestam pVSV102 + referentiestam pVSV208) moeten zowel GFP als RFP zichtbaar zijn vanaf één coincubation-spot. Als dit niet het geval is, stelt u het experiment opnieuw zorgen voor stammen zijn goed gelabeld en coincubated op antibiotica-vrije platen.
      2. Controleer voor elke experimentele coincubation-plek op mogelijke uitkomsten.
        Opmerking: Als de concurrent stam zichtbaar is, maar de referentiestam wordt niet gedetecteerd, dat suggereert dat de concurrent stam gedood of geremd de groei van de referentiestam. Als beide stammen aanwezig zijn en uniform gemengd (GFP en RFP aanwezig zijn op de coincubation plek), deze gegevens suggereren dat de concurrent stam niet concurreren met de referentiestam en beide stammen naast elkaar bestaan. Als beide stammen aanwezig zijn, maar ruimtelijk gescheiden zijn (micro kolonies van ofwel GFP of RFP zijn aanwezig in de coincubation spot), dat suggereert dat de referentiestam en concurrent stam kunnen betrokken zijn bij concurrerende interacties en wijzigingen aan de referentiestam of initiële coincubation ratio kan nodig zijn. Zie discussie voor meer informatie.

5. bepalen of interactie contact-afhankelijk is

Opmerking: Als u vindt dat een stam doodt of remt de referentiestam, de interactie kan worden diffundeerbaar of contact-afhankelijk. Om te bepalen of de interactie afhankelijk is van celcelcontact, voert u een coincubation assay uit zoals hierboven beschreven voor stap 1-2 met de volgende wijzigingen.

  1. Voer de stappen 1.1-2.2 uit.
  2. Zodra stammen zijn genormaliseerd, fysiek scheiden stammen met behulp van een nitrocellulose filter met een 0,22 mm poriegrootte. Deze poriegrootte zorgt voor de verspreiding van antimicrobiële stoffen en kleine moleculen, maar voorkomt fysiek contact tussen V. fischeri cellen.
    Opmerking: Als de interactie afhankelijk is van celcelcontact, moet de scheiding van de referentiestam van de concurrent stam met het filter het doden of inhiberende fenotype afbreken en mag de referentiestam geen CFUs hebben verlaagd. Als de interactie is niet afhankelijk van celcelcontact, en is een diffundeerbaar mechanisme, scheiden van de stammen mag niet verhinderen dat de concurrent stam van het doden van de referentiestam.
    1. Spot 5 mL van de referentiestam op het midden van een filter en Spot 5 mL van de concurrent stam op het midden van een ander filter. Plaats het filter met de referentiestam op het oppervlak van een LBS agar plaat. Plaats het filter met de concurrent stam direct bovenop het filter met de referentiestam.
      Opmerking: Elke stam wordt op de filters gespot in plaats van op de bodem stam die direct op de agar-plaat wordt gespot, zodat de stammen gemakkelijker direct op elkaar kunnen worden geplaatst.
    2. Als er bezorgdheid is dat de stammen niet direct bovenop elkaar worden gestapeld, verlaagt u het volume van de referentiespannings entmateriaal op het filter. Dit zorgt ervoor dat het gebied van de referentie-strain spot kleiner is en volledig boven of onder de concurrent stam. Afwisselen welke stam boven en onder is om rekening te kunnen maken met verschillen in diffusie van voedingsstoffen uit het agar-medium.
    3. Om ervoor te zorgen dat het filter de verspreiding van kleine moleculen mogelijk maakt, moet u een controle behandeling opnemen waarbij de referentiestam op een filter wordt gespot en een antibioticum dat het gevoelig is voor (chlooramfenicol) op de andere wordt gespot. Stapel de filters direct op elkaar en plaats ze op een LBS agar plaat. Het antibioticum moet kunnen diffuus door het filter en moet de referentiestam te doden.
  3. Inincuberen de platen met filters bij 24 °C gedurende 5 uur. De agar-plaat mag niet worden omgekeerd om te voorkomen dat de filters worden verplaatst.
  4. Voer seriële verdunningen uit voor het start entmateriaal volgens stap 2,4.
  5. Het nemen van T Final metingen
    1. Gebruik steriele pincet om elke set filters over te brengen naar een 50 mL Falcon tube met 5 mL LBS Bouillon. Zorg ervoor dat de filters fysiek gescheiden zijn in de buis om volledige resuspensie van elk stam type mogelijk te maken.
    2. Respendeer de stammen van filters door Pipetteer omhoog en omlaag totdat de filters zijn duidelijk van alle cellen. Gebruik pincet om de filters te roteren en het celmateriaal van beide zijden te wissen. Steriliseren pincet met ethanol tussen monsters.
    3. Voer seriële verdunning uit voor de T-Finale volgens stap 2,5. Bij het berekenen van de totale CFUs voor T Final, pas "totale volume van onverdund monster" van 1 mL tot 5 mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de concurrerende interacties tussen bacteriële populaties te beoordelen, werd een coincubation assay protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor V. fischeri. Deze methode maakt gebruik van stabiele plasmiden die antibioticaresistentie-genen en fluorescerende eiwitten coderen, waardoor differentiële selectie en visuele discriminatie van elke stam mogelijk zijn. Door het analyseren van de gegevens verzameld uit de coincubation Assay, het concurrentie resultaat van een interactie en het mechanisme van de interactie kan worden geïdentificeerd. Als voorbeeld werden de volgende experimenten uitgevoerd met behulp van V. fischeri isolaten. Coincubated stammen harverveeld een van de twee stabiele plasmiden: pVSV102 uitdrukken kanamycine weerstand en GFP +, of pVSV208 uitdrukken chlooramfenicol weerstand en dsred +. In de voorbeeldgegevens werden stammen gemengd in een verhouding van 1:1 en geïnineerd op LBS-agar-platen gedurende 5 uur. Als controle behandeling werden differentiaal gelabelde versies van de referentiestam coincubated met elkaar. De experimentele behandelingen werden uitgevoerd met de referentiestam (harboring pVSV102) en concurrent stam 1 of concurrent stam 2 (harkotteren pVSV208). Culturen van elke stam werden bereid en coincubated zoals hierboven beschreven en zoals weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2.

In Figuur 3worden gegevens die zijn geanalyseerd om te bepalen of concurrent stam 1 of 2 de referentiestam overtreft, op twee manieren gepresenteerd. In Figuur 3awerd het aandeel van elk type stam voor elk tijdspunt tijdens het experiment berekend volgens stap 4.2.1. In de experimentele behandelingen, de monster gegevens tonen de referentiestam en concurrent stam 1 aanwezig zijn in een verhouding van 0,5 aan het begin (0 h) en einde (5 h) van het experiment, die consistent is met wat wordt waargenomen in de controle behandeling. Deze gegevens tonen aan dat het aandeel van de stammen niet veranderd na een 5 h coincubation, en dus geen competitie werd waargenomen. Daarentegen, wanneer de referentiestam werd geïnineerd met concurrent stam 2, was de referentiestam aanwezig in een verhouding van 0,5 aan het begin (0 uur), en een aandeel < 0,01 aan het einde (5 uur) van het experiment, dat significant lager was dan de controle behandeling (student t-test: P < 0,001). Deze gegevens geven aan dat het aandeel van de referentiestam daalde in aanwezigheid van concurrent stam 2, en suggereert daarom concurrentie tussen concurrent stam 2 en de referentiestam plaatsvond. Dit type analyse moet worden toegepast wanneer wordt bepaald hoe het aandeel van de stammen binnen een Gemeenschap in de loop van de tijd verandert, maar niet kan worden gebruikt om het mechanisme van de concurrentie-interactie te bepalen, en moet daarom worden gecombineerd met een aanvullende analyse. Bijvoorbeeld, het aandeel van de referentiestam afnemende in de aanwezigheid van concurrent stam 2 kan worden toegeschreven aan verschillende soorten interacties: (i) stam 2 groeide sneller dan de referentiestam, (II) stam 2 remde groei van de referentie (III) stam 2 de referentiestam geëlimineerd door middel van doden.

In Figuur 3bwerd de log relatieve competitieve index (RCI) berekend voor elke behandeling volgens stap 4.2.2. Wanneer de referentiestam werd geïnineerd met concurrent stam 1, waren de log RCI-waarden niet statistisch verschillend van nul of van de controle behandeling (P > 0,05), wat suggereert dat de concurrentie tussen stammen niet werd waargenomen. Toen de referentiestam werd geïnventariseerd met concurrent stam 2, waren de log RCI-waarden echter significant groter dan nul en de controle behandeling (student t-toets: P < 0,001). Deze gegevens suggereren stam 2 overtreffen de referentiestam. Het analyseren van log RCI-waarden biedt een eenvoudige methode om te bepalen of een stam tijdens de incubatieperiode buiten de andere uitnam. Omdat deze analyse de verhouding van stammen aan het einde (5 h) en het begin (0 h) van het experiment omvat, kan de start ratio dramatisch invloed hebben op het resultaat. Daarom moet de start ratio worden onderzocht en overwogen bij het afleiden van conclusies uit log RCI-gegevens. Bovendien geeft deze analyse geen informatie over het concurrentie mechanisme en meldt zij eenvoudigweg hoe de verhouding tussen stammen tijdens de incubatie verandert.

In Figuur 4 worden twee methoden voor gegevensanalyse weergegeven om het mechanisme van de concurrentie voor een bepaalde interactie te bepalen. In Fig. 4aworden totaal cfus voor elke stam op elk tijdstip van het experiment weergegeven. Wanneer de referentiestam werd geïnineerd met concurrent stam 1, CFUs van beide stammen toenemen in de loop van 5 h en CFUs voor de referentiestam waren niet significant verschillend van stam 1 of de controle op 5 h (P > 0,05). Deze gegevens geven aan dat de referentiestam groeide in de aanwezigheid van stam 1, en suggereren geen concurrentie heeft plaatsgevonden. Echter, wanneer de referentiestam werd geïnineerd met concurrent stam 2, stam 2 CFUs steeg na 5 h maar CFUs voor de referentiestam daalde. Referentiestam CFUs waren significant lager dan stam 2 CFUs en de controle op 5 h (student t-test: P < 0,002). Deze gegevens geven aan dat de referentiestam CFUs afname in de aanwezigheid van stam 2, en suggereren stam 2 doodt referentiestam cellen. Als de referentiestam geen afname in CFUs vertoont, maar geen verandering (geen statistisch verschil tussen de referentiestam CFUs bij 0 h en 5 h), zouden deze gegevens suggereren dat stam 2 de referentiestam zou overtreffen door de groei van de referentiestam te remmen. Het analyseren van niet-getransformeerde totale CFU-gegevens is bijzonder informatief, omdat CFUs voor beide stammen op elk tijdstip onafhankelijk wordt weergegeven en kan worden gebruikt om het mechanisme van de concurrentie te identificeren.

Figuur 4b toont het percentage herstel van de referentiestam om te bepalen hoe de aanwezigheid van een concurrent stam de referentiestam beïnvloedt. Wanneer de referentiestam werd geïnineerd met concurrent stam 1, een ~ 3.200 procent herstel werd waargenomen, die niet statistisch verschilt van de controle en geeft stam 1 heeft geen invloed op het percentage herstel van de referentiestam. Wanneer de referentiestam werd geïnventariseerd met concurrent stam 2, werd een ~ 4 procent herstel waargenomen, die significant lager was dan de controle (student t-test: P < 0,002). Het percentage herstel was ook significant minder dan 100 (student t-test: P < 0,002), wat aangeeft dat stam 2 de referentiestam uitnam door het doden van referentiestam cellen. Als het percentage herstel niet statistisch verschilt van 100, zouden die gegevens suggereren dat stam 2 de groei van de referentiestam remde. Percentage herstelgegevens biedt een vereenvoudigde manier om het mechanisme van de concurrentie te karakteriseren door te onderzoeken hoe de populatie van de referentiestam reageert op de aanwezigheid van een concurrent stam. Echter, het weergeven van de gegevens op deze manier uitsluit informatie over de start ratio en hoe de overvloed van de concurrent stam veranderde tijdens de incubatie.

Figure 1
Figuur 1: stroomdiagram dat de coincubation-test illustreert. A) bacteriestammen die ofwel pVSV102 (referentiestam aangegeven met Ref. stam of R.S.) of pVSV208 (door de concurrent aangegeven stam of C.S.) worden gegroeid, worden afzonderlijk geteeld op media die selectief zijn voor ofwel de referentiestam (lbs kan) of concurrent stam (LBS CAM). Stammen worden vervolgens geresuspendeerd in LBS Bouillon en genormaliseerd naar een OD = 1,0. B) de referentiestam en de concurrent stam worden gemengd met een verhouding van 1:1 per volume. Een seriële verdunning wordt uitgevoerd met dit mengsel om te bepalen CFUs voor beide stammen op 0 h. (C) het stam mengsel wordt vervolgens gespot op 24-Well platen met lbs agar. Elke replicaat wordt gespot in zijn eigen put. Vlekken mogen drogen en vervolgens geïnineerd bij 24 °C gedurende 5 uur. Na 5 uur wordt een seriële verdunning uitgevoerd om CFUs voor elke stam te kwantificeren. D) het stam mengsel van paneel B wordt ook GESPOT op lbs-agar-Petri platen die gedurende 24 uur op 24 °c mogen worden gedroogd en geïnineerd. Bij 24 h wordt de coincubation-spot afgebeeld met behulp van een fluorescentie-ontleed Microscoop die is aangepast om groen te detecteren (referentiestam) en rood (concurrent stam) fluorescentie. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatieve afbeeldingen van platen die nodig zijn voor een seriële verdunning. A) 96-goed plaat gebruikt om seriële verdunning uit te voeren. De plaat wordt zodanig geroteerd dat er 12 rijen en 8 kolommen zijn. Descriptoren van elke behandeling omvatten de gebruikte stammen en de plasmiden die ze haven (bijv. referentiestam met pVSV102 en concurrent stam met pVSV208) en het replicatienummer voor elke rij (R1, R2, R3 of R4). De eerste kolom is het onverdund monster en elke kolom aan de rechterkant vertegenwoordigt een 10-voudige verdunning uit de vorige kolom (verdunningsfactor hierboven vermeld). (B) lbs-agar-plaat gebruikt om cfus te bepalen voor de referentiestam op lbs kan-platen (boven) en de concurrent belasting op lbs-nok-platen (onder) van de experimentele behandeling. Elke rij is een replicaat in een behandeling (bijv. R1) en de verdunningsfactor van elke vlek wordt boven aan de plaat vermeld. Het aantal CFUs geteld voor elke replicaat wordt weergegeven aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: voorbeeldgegevens om te beoordelen of de stammen van concurrenten de referentiestam overtreffen. A) het aandeel coincubating-stammen dat ofwel pVSV102 (donkergrijs) of pVSV208 (lichtgrijs) verveelt. R.S. geeft de referentiestam aan en C.S. geeft de concurrent stam aan. Onderbroken horizontale lijn geeft een verhouding van 0,5 aan. Asterisk geeft de referentiestam aan die een statistisch kleiner deel van de populatie bevat dan de stam van de concurrent of de referentiestam in de controle bij 5 uur (student t-toets: P < 0,001); NS duidt niet op significante (P > 0,05). (B) Log relatieve competitieve index (RCI) voor coincubation-assays. Onderbroken verticale lijn geeft log RCI = nul aan. Sterretje geeft aan dat de log RCI-waarde statistisch groter is dan nul en het besturingselement (student t-toets: P < 0,001). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeldgegevens voor het bepalen van het mededingings mechanisme. (A) totaal aantal CFU voor coincubation-assays uitgevoerd met V. fischeri -isolaten die differentieel zijn getagd met pVSV102 of pVSV208. CFUs werden verzameld aan het begin van het experiment (0 uur) en na 5 h incubatie. R.S. geeft referentiestam aan en C.S. geeft concurrent stam aan. Onderbroken horizontale lijn geeft de gemiddelde 0 h CFUs voor beide stammen; asterisk geeft de referentiestam aan CFUs was statistisch lager in de experimentele behandeling ten opzichte van de controle behandeling bij 5 uur (student t-toets: P < 0,002). B) procentuele terugwinning van de referentiestam. Horizontale onderbroken lijn geeft 100% herstel (geen toename of afname van CFUs); sterretje geeft aan dat het percentage herstel statistisch lager was dan 100% en de controle behandeling (student t-toets: P < 0,002). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Afbeelding 5: voorbeeldgegevens voor incubatietijd en imaging optimalisatie. (A) totaal cfus voor coincubation testen waar cfus werden verzameld aan het begin van het experiment (0 uur), na 5, 12, en 24 h incubatie. R.S. geeft referentiestam aan en C. S. 2 geeft concurrent stam 2 aan. Onderbroken horizontale lijn geeft de gemiddelde 0 h CFUs voor beide stammen; asterisken duiden op referentiestam CFUs waren statistisch lager in de experimentele behandeling ten opzichte van de controle behandeling op het opgegeven tijdstip (student t-toets: P < 0,002). Foutbalken geven SEM aan. (B) fluorescerende microscopie beelden die corresponderen met CFU-gegevens in paneel A. schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6. Voorbeeldgegevens voor coincubation ratio-optimalisatie. Coincubation experimenten werden uitgevoerd tussen de referentiestam (R.S.) cellen pVSV102 (groene, bovenste rij) en concurrent stam (C.S.) harkotteren pVSV208 (rood, onderste rij) en fluorescerende microscopie beelden werden genomen op 24 h. a) stammen werden gemengd in een verhouding van 1:1 of (B) een 1:5 ratio waarbij de referentiestam, die pVSV102 bevat, werd overtroffen door de concurrent stam die pVSV208 bevat. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De coincubation assay die hierboven is beschreven, biedt een krachtige methode om interbacteriële concurrentie te ontdekken. Deze aanpak stond in voor de identificatie van intraspecifieke concurrentie tussen V. fischeri isolaten en de karakterisering van het competitieve mechanisme19. Hoewel de beschreven methode geoptimaliseerd is voor de mariene bacterie V. fischeri, kan deze gemakkelijk worden aangepast om andere bacteriesoorten te herbergen, waaronder klinische en milieu-isolaten. Het is belangrijk op te merken dat concurrerende mechanismen worden vaak voorwaardelijk gereguleerd5,6,23,24,25,26,27 , 28, dus kleine verschillen in groeiomstandigheden (bijv. schudden versus staande cultuur, temperatuur, enz.) en mediatype (bijv. zoutgehalte) kunnen de resultaten drastisch beïnvloeden. Daarom is het optimaliseren van coincubation voorwaarden waarschijnlijk noodzakelijk voor verschillende bacteriesoorten en verschillende concurrerende mechanismen. Het is het beste om cultuuromstandigheden te kiezen die de natuurlijke omgeving van de isolaten op de voet weerspiegelen. Bijvoorbeeld, coincubation testen tussen V. fischeri stammen werden uitgevoerd met lbs media op 24 ° c, om het zoutgehalte en de temperatuur van het mariene milieu weer te geven. Echter, sommige bacteriën zijn natuurlijk bekwaam in hun omgeving27,28 en daarom kunnen nemen van genetisch materiaal vrijgegeven door gelyseerd cellen tijdens antagonistische interacties29. Om te voorkomen dat dergelijke DNA-overdracht van invloed coincubation resultaten, het is belangrijk om te gebruiken voorwaarden die niet bevorderen competentie of stammen die niet bekwaam zijn, hetzij natuurlijk of door inactivatie van DNA-opname machines. Bovendien kunnen experimentele parameters zoals celgroei fase, cultuur dichtheid, incubatietijd of beginnende stam ratio ook optimalisatie vereisen voor verschillende bacteriesoorten of concurrerende mechanismen. De initiële cultuur dichtheid zal bijvoorbeeld de hoeveelheid celcelcontact tussen stammen dicteren, wat het vermogen van bacteriën kan beïnvloeden om contact afhankelijke mechanismen van concurrentie te implementeren.

Figuur 5a toont het proces van optimalisatie van coincubation-assays met V. fischeri -isolaten. Hier werden een reeks incubatie tijden voor CFU-verzameling en fluorescerende microscopie-beeldvorming geëvalueerd om de optimale tijd te bepalen voor elke metrische waarde die moet worden verzameld. CFUs werden verzameld onmiddellijk na het mengsel van de referentiestam en concurrent stam 2 werd gespot op LBS agar platen (0 h), en CFU metingen en fluorescerende microscopie beelden werden onmiddellijk genomen en na 5, 12, en 24 h. Deze voorbeeldgegevens benadrukken het belang van grondige optimalisatie voorafgaand aan het tekenen van conclusies over de interactie tussen twee stammen. Bijvoorbeeld, twee verschillende conclusies over het mechanisme van interactie kan worden afgeleid op basis van wanneer CFUs worden verzameld: CFUs van 5 of 12 h geven stam 2 gedood de referentiestam, terwijl CFUs verzameld op 24 h suggereren stam 2 remt de groei van de referentiestam.

De optimale tijd voor visualisatie van coincubation spots via fluorescerende microscopie kan afwijken van de optimale tijd voor CFU collectie. Afbeelding 5b geeft fluorescerende microscopie beelden van coincubation spots weer op 0, 5, 12 en 24 uur. Bij 0 en 5 h zijn de coincubation spots niet zichtbaar met fluorescerende microscopie. Voorbeelden genomen op 12 h, beide stammen in de controle behandeling zijn zichtbaar, maar de RFP (referentiestam cellen pVSV208) is met name dimmer. In de experimentele behandeling om 12 uur, concurrent stam 2 is zichtbaar (maar toch Dim) en de referentiestam is niet detecteerbaar. Strain-specifieke verschillen tussen bacteriële isolaten kunnen de expressie van fluorescerende eiwitten beïnvloeden, en dus de helderheid van de cellen op de gemengde plek. Omdat RFP met name dimmer is dan GFP in het besturingselement, moeten de coincubation-vlekken nog steeds worden geïncubeerd en op een later tijdstip opnieuw worden afbeelding gemaakt. In beelden genomen op 24 h, beide stammen zijn zichtbaar detecteerbaar en met een vergelijkbare helderheid in de controle-experiment. In de experimentele behandeling stam 2 is zichtbaar terwijl de referentiestam wordt niet waargenomen binnen de coincubation plek. 15-24 h incubatietijd volstaat om GFP en RFP voor V. fischeri te visualiseren met behulp van stabiele plasmiden PVSV102 en pVSV208, maar de incubatietijd moet mogelijk aangepast worden voor verschillende plasmiden of bacteriesoorten. Hoewel de optimale tijd voor visualisatie van coincubation spots en het verzamelen van CFU-gegevens verschillend zijn, is beeldvorming bij 24 h een goede manier om snel interacties voor V. fischerite scherm, omdat het resultaat verkregen uit beeldvorming op 24 h (doel is zichtbaar of niet) weerspiegelt de meer tijd-intensieve kwantitatieve gegevens verkregen van het beplating CFUs op 5 of 12 h.

De start ratio kan de resultaten significant beïnvloeden, met name bij het inbroeren van twee remmende stammen, en moet mogelijk worden aangepast om rekening te kunnen maken met specifieke verschillen in het doden van de efficiëntie of de groeisnelheid. Fig. 6a geeft bijvoorbeeld fluorescerende microscopie beelden van experimenten weer waarbij de referentiestam coincubated met zichzelf was (controle) en drie andere V. fischeri isolaten beginnend bij een 1:1 ratio. In deze voorbeeldgegevens wordt de referentiestam zichtbaar gedetecteerd bij geïncubeerd met zichzelf, concurrent stam 1 en concurrent stam 3 na 24 uur. Echter, wanneer de start ratio werd aangepast aan 1:5 (d.w.z. 50 mL van de referentiestam vermengd met 250 mL van de concurrent stam), wordt de referentiestam alleen zichtbaar gedetecteerd wanneer coincubated met zichzelf en stam 1, wat aangeeft dat beide stam 2 en stam 3 uitconcurreren de referentiestam. Deze aanpassing voorkomt dat de hogere groeisnelheid van de referentiestam het effect van de door de concurrent stammen tentoongestelde mechanismen voor interferentie concurrentie verduisterde. Op basis van de resultaten in Figuur 6amoet een verhouding van 1:5 (referentiestam: concurrent stam) worden gebruikt om extra V. fischeri -stammen te laten uitschermen voor de mogelijkheid om de referentiestam te doden.

Dit protocol discrimineert tussen coincuberende stammen door het differentiëren van stammen met plasmiden die ofwel kanamycine of chlooramfenicol resistentiegenen bevatten. Verschillende antibiotica of andere selectiemethoden kunnen echter beter geschikt zijn voor verschillende bacteriesoorten. Andere methoden voor differentiële selectie kunnen zijn: 1) het exploiteren van een stam/soortspecifieke auxotrofie voor specifieke groeifactoren (bijv. DAP of thymidine), 2) voorwaardelijke groei vereisten (bv. een stam groeit op 37 °C, terwijl de andere niet), of 3) Counter Selection markers die de groei van de gelabelde stam elimineren of remmen wanneer ze onder de juiste omstandigheden worden geteeld om een "Kill"-gen uit te drukken (bijv. ccdb of sacb).

Het selecteren van de juiste referentiestam is van cruciaal belang voor het verkrijgen en interpreteren van reproduceerbare resultaten van de coincubation assay. Een referentiestam moet goed bestudeerd zijn (d.w.z. een breed lichaam van wetenschappelijke literatuur hebben), geen duidelijk doden-of remmende vermogen hebben en idealiter een gesequentieerd genoom hebben. Bijvoorbeeld, bepaalde stammen van Escherichia coli zijn gemeenschappelijke referentie stammen voor vele bacteriële coincubation experimenten30,31. Echter, E. coli kan niet ecologisch relevant zijn voor een bepaalde concurrerende mechanisme of concurrent, die gevolgen kunnen hebben voor de resultaten. Bijvoorbeeld, sommige bacteriën kunnen hebben geëvolueerd mechanismen specifiek gericht op nauw verwante soorten of concurrenten voor dezelfde ecologische niche en hun concurrerende mechanisme zou niet effectief tegen een E. coli referentiestam.

Kortom, de hier beschreven methode beoogt een gemakkelijk aangepaste en robuuste benadering te bieden om interbacteriële interacties en concurrentie te evalueren. Deze methode kan worden toegepast op bacteriële isolaten die relevant zijn voor milieu-of klinisch onderzoek en kan worden gebruikt om diverse mechanismen van microbiële interactie te onderzoeken die eerder onbekend of moeilijk te onderzoeken zijn geweest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We willen reviewers bedanken voor hun nuttige feedback. A.N.S. werd gesteund door de Gordon en Betty Moore Foundation via Grant GBMF 255,03 aan de Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

Immunologie en infectie probleem 149 interferentie competitie fluorescentiemicroscopie aliivibrio fischeri interstrain interacties interspecifieke interacties interbacterieel doden
Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen <em>Vibrio fischeri</em> isolaten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter