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Immunology and Infection

Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Abstract

Ce manuscrit décrit un test de coincubation fondé sur la culture pour détecter et caractériser les interactions concurrentielles entre deux populations bactériennes. Cette méthode utilise des plasmides stables qui permettent à chaque population d'être étiquetée différemment avec des capacités distinctes de résistance aux antibiotiques et des protéines fluorescentes pour la sélection et la discrimination visuelle de chaque population, respectivement. Ici, nous décrivons la préparation et la coincubation des souches concurrentes de Vibrio fischeri, l'imagerie par microscopie de fluorescence et l'analyse quantitative des données. Cette approche est simple, donne des résultats rapides, et peut être utilisée pour déterminer si une population tue ou inhibe la croissance d'une autre population, et si la concurrence est négociée par une molécule diffusible ou nécessite un contact direct cellule-cellule. Parce que chaque population bactérienne exprime une protéine fluorescente différente, l'épreuve permet la discrimination spatiale des populations concurrentes au sein d'une colonie mixte. Bien que les méthodes décrites soient effectuées avec la bactérie symbiotique V. fischeri en utilisant des conditions optimisées pour cette espèce, le protocole peut être adapté pour la plupart des isolats bactériens culturables.

Introduction

Ce manuscrit décrit une méthode basée sur la culture pour déterminer si deux isolats bactériens sont capables d'interactions concurrentielles. Lors de l'étude des populations mixtes, il est important d'évaluer dans quelle mesure les isolats bactériens interagissent, en particulier si les isolats sont directement en concurrence par des mécanismes d'interférence. La concurrence d'interférence se rapporte aux interactions où une population inhibe directement la croissance ou tue une population concurrente1. Ces interactions sont importantes à identifier car elles peuvent avoir des effets profonds sur la structure et la fonction d'une communauté microbienne2,3.

Des mécanismes de concurrence microbienne ont été découverts largement dans les génomes de bactéries provenant d'environnements divers, y compris les bactéries associées à l'hôte et les bactéries vivant librement4,5,6,7, 8,9. Diverses stratégies de concurrence ont été décrites10,11 comprenant des mécanismes diffusibles, tels que les produits chimiques bactéricides1,12 et les peptides antimicrobiens sécrétés13 , ainsi que les mécanismes dépendants du contact qui nécessitent un contact cellule-cellule pour transférer un effecteur inhibiteur dans les cellules cibles9,14,15,16,17 ,18.

Bien que les coincubations basées sur la culture soient couramment utilisées en microbiologie5,8,19, ce manuscrit décrit comment utiliser le résultat pour caractériser le mécanisme de la concurrence, ainsi que des suggestions pour adapter protocole d'utilisation avec d'autres espèces bactériennes. En outre, cette méthode décrit de multiples approches pour analyser et présenter les données pour répondre à différentes questions sur la nature des interactions concurrentielles. Bien que les techniques décrites ici aient été utilisées précédemment pour identifier le mécanisme de mise à mort interbactérienne sous-jacent à la concurrence intraspécifique entre les souches symbiotiques des bactéries coisolées de Vibrio fischeri 19,elles conviennent de nombreuses espèces bactériennes, y compris les isolats environnementaux et les agents pathogènes humains, peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes concurrentiels dépendants du contact et les mécanismes de concurrence diffusibles. Les étapes du protocole peuvent nécessiter une optimisation pour d'autres espèces bactériennes. Étant donné que plus de systèmes modèles élargissent leurs études au-delà de l'utilisation d'organismes isogéniques pour inclure différents génotypes10,16,20,21, cette méthode sera une ressource précieuse chercheurs qui cherchent à comprendre comment la concurrence a un impact sur les systèmes multi-souches ou multi-espèces.

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Protocol

1. Préparer des souches pour la coincubation

  1. Choisissez une souche de référence appropriée qui servira de cible pour la compétition bactérienne pendant l'épreuve de coincubation. Voir Discussion pour les meilleures pratiques lors de la sélection d'une souche de référence et comment la souche de référence aura un impact sur les résultats. Dans ce protocole, la souche V. fischeri ES114 servira de souche de référence.
  2. Déterminer quelles méthodes de sélection et de dépistage seront utilisées pour distinguer les isolats en coincubation
    1. En règle générale, transformer les souches avec des plasmides stables contenant différents gènes de résistance aux antibiotiques (p. ex. kanamycine ou chloramphenicol) pour sélectionner pour chaque souche, ainsi que des gènes codant avec différentes protéines fluorescentes (p. ex. GFP ou DP) pour un distinguer les types de souches en coculture.
      REMARQUE: L'utilisation de plasmides stables est nécessaire parce que si une souche perd le plasmide en l'absence de sélection, alors les nombres de cette souche seront sous-estimés lorsqu'ils seront quantifiés, et ne seront pas visuellement détectables à l'aide de la microscopie à fluorescence.
    2. Tag ventcubated V. fischeri souches différentiellement telle qu'une souche contient le plasmide pVSV102, qui exprime une protéine fluorescente verte (GFP) et la résistance à l'antibiotique kanamycine (KanR), et la deuxième souche contient plasmid pVSV208, qui exprime une protéine fluorescente rouge (dsRed) et une résistance à l'antibiotique chloramphenicol (CmR)22.
      REMARQUE: D'autres sélections différentielles peuvent être utilisées pour distinguer les souches de coincubating. Voir Discussion pour d'autres méthodes.
    3. Inclure le contrôle suivant lors de l'optimisation initiale de l'examen de coincubation pour s'assurer que la sélection est robuste. Plaquez chaque souche qui est marquée différemment sur des plaques d'agar contenant l'antibiotique qui devrait choisir contre elle (c.-à-d., souche de plaque 1 sur les médias qui sélectionne ntre pour la souche 2, et vice versa).
  3. Deux jours avant l'analyse de coincubation, la souche de référence pVSV102, la souche de référence pVSV208, et chaque souche concurrente pVSV208 à partir de -80 stocks de C sur des plaques d'agar LBS contenant l'antibiotique approprié (p. ex., 100 g/mL de kanamycine ou 2 g/mL chloramphenicol) et incuber pendant la nuit à 24 oC. La sélection d'antibiotiques est nécessaire pour s'assurer que toutes les cellules contiennent le plasmide au début de l'expérience.
  4. Un jour avant l'antest, cueillez et restreak quatre colonies individuelles par type de souche (répliques biologiques) sur des plaques d'agar LBS fraîches avec un antibiotique approprié et incubées pendant la nuit à 24 oC.
    REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation pour d'autres espèces bactériennes, car des temps d'incubation plus ou moins longs peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de cellules en fonction du taux de croissance de l'organisme d'intérêt.

2. Souches bactériennes Coincubate

  1. Préparation de chaque souche bactérienne pour l'incubation (Figure 1A)
    1. À l'aide d'un cure-dent stérile, gratter les cellules de la plaque d'agar (jusqu'à la taille d'un grain de riz) et re-suspendre les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant 1 ml de bouillon LBS. Briser les amas cellulaires en les pressant sur le côté du tube et en faisant monter et descendre vigoureusement.
    2. Cap le tube et le vortex pour 1-2 s. Si les amas cellulaires sont encore visibles, continuez à vortexoutir ou pipette de haut en bas jusqu'à ce que l'échantillon soit visuellement uniforme.
    3. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.2 pour tous les échantillons.
  2. Mesurer et enregistrer la densité optique à 600 nm (OD600) pour tous les échantillons. Les échantillons devront probablement être dilués jusqu'à dix fois à l'aide du bouillon LBS pour obtenir une mesure précise de l'OD. Normaliser chaque échantillon à oD600désiré . Les souches sont généralement normalisées à un OD600 1.0, ce qui se traduit par 106 bactéries/mL pour V. fischeri.
    REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation pour différentes espèces bactériennes car la densité des cellules inoculum a un impact sur les résultats de la coincubation en fonction du mécanisme de compétition. Voir discussion pour l'optimisation.
  3. Souches de coincubating (Figure 1B, C)
    1. Mélanger la souche de référence et la souche concurrente dans un rapport de 1:1 (v/v) en ajoutant 100 ml de chaque souche (normalisée à OD 1,0) à un tube de centrifugeuse étiqueté de 1,5 ml. En tant que contrôle, mélangez la souche de référence avec une version étiquetée différentiellement de lui-même (souche de référence pVSV102 - souche de référence pVSV208). Ce contrôle est nécessaire pour une analyse statistique ultérieure afin de déterminer si la présence d'une souche concurrente a une incidence sur la croissance de la souche de référence. Vortex la culture mixte pour 1-2 s.
      REMARQUE: Cette étape peut nécessiter une optimisation car le ratio de départ peut avoir un impact significatif sur les résultats et peut devoir être ajusté. Voir discussion pour l'optimisation.
    2. Répétez l'étape 2.3.1 pour chaque réplique biologique. Après avoir terminé cette étape, il devrait y avoir un total de huit tubes à souches mixtes : quatre répliques biologiques avec des souches de référence marquées de façon différentielle (contrôle) et quatre répliques biologiques avec des souches de référence et des souches concurrentes marquées différemment ( expérimental).
    3. Spot 10 ml de chaque mélange de commande et d'expérimentation sur des plaques Petri contenant de l'agar LBS; ces taches de culture seront utilisées pour la microscopie à fluorescence après l'incubation.
    4. Laisser sécher complètement les taches sur le banc jusqu'à ce que tout le liquide ait été absorbé dans l'agar et incuber les plaques De Petri à 24 oC pendant 24 h. Un minimum de 15 h est nécessaire pour que les souches de V. fischeri étiquetées avec pVSV102 et pVSV208 atteignent une densité cellulaire suffisamment élevée pour visualiser le PPF et la DP, respectivement, au niveau de la population à l'aide d'un microscope à disséquer la fluorescence. Ici, nous utilisons une incubation de 24 h pour l'imagerie des taches mixtes.
      REMARQUE: Il est important d'utiliser des assiettes qui ne sont pas trop humides ou trop sèches. Si les plaques sont trop humides, les taches de coincubation ne seront pas absorbées dans la plaque d'agar; éviter d'utiliser des plaques versées le même jour. Si les plaques sont trop sèches, de petites vagues ou des fissures peuvent se former sur la surface de l'agar, ce qui rend les taches de coincubation de forme irrégulière.
    5. En utilisant les mêmes suspensions bactériennes que dans l'étape 2.3.3, repérer 10 ml de chaque mélange de contrôle et d'expérimentation dans des plaques de 24 puits contenant 1 ml de lbs agar par puits. Comme dans l'étape 2.3.3, assurez-vous que l'agar dans les plaques de 24 puits a l'humidité appropriée. Laisser sécher complètement les taches et les incuber à 24 oC pendant 5 h. Ces taches de culture seront utilisées pour quantifier les unités de formation de colonies (UFC) pour chaque souche à la fin de l'expérience.
      REMARQUE: Repérer les suspensions bactériennes pour la croissance des puits individuels permet une résuspension plus facile au point de fin. Cette étape peut être accomplie en utilisant des morceaux de filtre stériles carrés comme une approche plus économique à l'utilisation de plaques de 24 puits. Des morceaux de filtre stériles carrés peuvent être placés sur une plaque d'agar et 10 ml de chaque mélange expérimental peuvent être repérés sur ces filtres, plutôt que sur des plaques de 24 puits. Après le temps de coincubation, les filtres peuvent être transférés dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml et la tache de coincubation peut être resuspendue par le vortex ou le tuyautrage de haut en bas. Un temps d'incubation de 5 h est suffisant pour détecter la mise à mort interbactérienne entre les isolats De V. fischeri 19,cependant, ce temps de coincubation peut devoir être plus court ou plus long pour d'autres espèces ou mécanismes concurrentiels. Voir la discussion pour plus de détails.
  4. Dilution en série pour le démarrage de l'inoculum
    1. Pour effectuer une dilution en série des mélanges de coincubation de départ, faites pivoter une plaque de 96 puits de 90 degrés afin qu'il y ait huit colonnes et douze rangées. Chaque rangée contiendra un échantillon du mélange non dilué dans la première colonne, suivi de sept dilutions en série décuplée sur les puits restants de la rangée (figure 2A).
    2. Étiquetez chaque ligne avec l'ID de contrainte, le nombre de répliques et l'heure (démarrage de l'inoculum t0). Étiqueter les plaques d'agar LBS complétées par l'antibiotique approprié sur lequel repérer la série de dilution. Assurez-vous d'identifier la souche pour laquelle chaque plaque antibiotique est sélectionnée.
    3. À l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 180 ml de bouillon LBS à chaque puits, en laissant la première colonne vide pour le mélange de coincubation non dilué.
      REMARQUE: Les chercheurs peuvent choisir d'utiliser la saline tamponnée par phosphate (PBS) pour resuspendre les taches de coincubation et effectuer une dilution en série si vous travaillez avec une espèce bactérienne à croissance particulièrement rapide ou si elle effectue constamment de grandes expériences où des dilutions en série peuvent prendre longtemps à effectuer. L'utilisation de PBS dans ces cas empêchera la prolifération significative des bactéries pendant le processus d'exécution des dilutions sérielles. Cependant, il est important d'être cohérent avec la solution utilisée (p. ex., PBS ou LBS) dans toutes les expériences, quelle que soit leur taille ou leur durée.
    4. À l'aide d'une pipette à canal unique de 200 ml, transférer 100 ml du mélange de coincubation du tube au puits de la première colonne. Jeter la pointe et répéter pour tous les mélanges de coincubation.
    5. À l'aide d'une pipette multicanal, transférer 20 ml de la colonne 1 à 2 et mélanger en pipetting de haut en bas. Jetez les pointes et répétez pour chaque colonne de sorte qu'à la fin, chaque ligne contient une dilution sériedée décuplée du mélange initial de coincubation.
      REMARQUE: Soyez cohérent avec le nombre de fois que les dilutions sont pipetted de haut en bas. Par exemple, appuyez cinq fois sur la poignée de pipette pour que chaque dilution soit cohérente dans toute la série de dilution.
    6. À l'aide d'une pipette multicanal munie de huit pointes, aspirez 5 ml de chaque puits dans une série de dilution (c.-à-d. une rangée de huit puits) et repérez-la sur la plaque d'agar LBS qui sélectionne la souche de référence (complétée par de la kanamycine). Répétez cette étape de repérage sur la plaque en sélectionnant pour la souche concurrente (complétée par du chloramphenicol) (Figure 2B). Laisser sécher complètement les taches avant de les placer dans l'incubateur.
      REMARQUE: Les mêmes pointes peuvent être utilisées pour repérer une série de dilution de repli sur les plaques de sélection pour la souche de référence et concurrente, mais doivent être modifiées entre les répliques. Évitez de toucher l'extrémité de la pointe de pipette aux plaques d'agar LBS car cela peut créer une dépression qui peut ressembler à une colonie bactérienne et fausser les résultats pendant le comptage des plaques. Si la pointe touche la plaque, prenez une note et n'incluez pas la dépression dans le nombre de colonies.
  5. Prendre des mesures finales T
    1. Une fois que les taches de coincubation dans les plaques de 24 puits ont été incubées pendant 5 h à 24 oC, ajouter 1 ml de bouillon LBS à chaque puits et resuspendre les taches de coincubation en faisant monter et descendre jusqu'à ce que toutes les cellules soient remises en suspension. Soyez compatible avec la vigueur dans laquelle les cellules sont suspendues à travers toutes les répliques. Par exemple, appuyez huit fois sur la poignée de pipette pour resuspendre complètement chaque échantillon.
    2. Une fois que chaque tache de coincubation est suspendue, préparer une plaque de 96 puits pour une dilution sérielle et des plaques d'agar LBS avec les antibiotiques appropriés sur lesquels repérer la dilution de la même manière que l'étape 2.4.1.
    3. Effectuer des étapes 2.4.2-2.4.6 pour compléter la dilution en série pour les mesures finales T.
      REMARQUE: Un contrôle important devrait être inclus lors de l'optimisation initiale de l'évaluation de la coincubation. À la fin de la période de coincubation, plaquez les souches mélangées sur les médias qui comprend les deux antibiotiques. Ni l'une ni l'autre souche ne devrait pouvoir se développer à moins que 1) une mutation spontanée se produise, ou 2) marqueurs sélectionnables soient échangés entre les souches.

3. Visualiser coincubations à l'aide de la microscopie à fluorescence

  1. Imagez chaque tache de coincubation sur les plaques de Petri d'agar LBS des étapes 2.3.3 et 2.3.4 à l'aide d'un microscope stéréo équipé pour la détection de fluorescence verte et rouge, qui correspond aux protéines de fluorescence exprimées sur les plasmides stables.
  2. Commencez par prendre des images du spot de coincubation témoin (souche de référence pVSV102 et souche de référence pVSV208).
    1. Ajuster le grossissement de sorte que l'endroit est au point.
    2. En utilisant la lumière d'excitation et le filtre appropriés pour observer le GFP, ajustez le temps d'exposition de sorte que seule la fluorescence de la tache de coincubation est détectable et toute fluorescence de fond du milieu est faible ou non visible.
    3. Modifier la lumière d'excitation et le filtre pour observer la DP, en ajustant le temps d'exposition pour minimiser l'arrière-plan du milieu.
  3. Pour chaque tache de coincubation des traitements expérimentaux, image de la souche de référence à l'aide du filtre GFP et temps d'exposition déterminé à l'étape 3.2.2.
  4. Imagez la souche concurrente à l'aide du filtre de la DP, en ajustant le temps d'exposition de sorte que la fluorescence ne soit observée qu'à partir de la tache de coincubation et la fluorescence de fond du milieu est minime. Enregistrez les deux images et nommez-les pour inclure les deux ID de contrainte, le numéro de répétition, le temps d'incubation lorsque l'image a été prise (par exemple, 24 h). Répétez l'opération pour toutes les répliques.
    REMARQUE: Le temps de coincubation peut devoir être ajusté pour différentes plasmides ou espèces bactériennes. Voir discussion pour l'optimisation.

4. Analyse des données

  1. Calcul des UFC pour chaque traitement de contrôle et d'expérimentation à chaque point temporel (t start et T final)
    1. Une fois que les colonies sont visibles sur des plaques de dilution en série (p. ex., 24 h à 24 oC pour V. fischeri), identifiez le facteur de dilution où les colonies individuelles peuvent être comptées et n'ont pas grandi ensemble en grands groupes multi-colonies (figure 2B). Pour chaque réplique, comptez et enregistrez le nombre de colonies individuelles pour une dilution donnée. Ce nombre représente les UFC pour cette réplique.
    2. Convertir les UFC pour la dilution en UFC totale pour chaque souche de la coincubation en utilisant la formule ci-dessous :
      [ CfUs (facteur de dilution x vol. de la tache de dilution)] x vol. de l'échantillon non dilué - Total des UFC
      Exemple : T0 : [(6 UFC) (10 à 6 x 0,005 ml)] x [0,01 ml] - 1,2E7 Total des UFC de la souche 1 dans la tache mixte au début de l'expérience
      T5 : [(4 UFC) (10 à 3 x 0,005 mL)] x [1,0 ml] - 8,0E5 Total des UFC de la souche 1 dans la tache mixte après 5 h de coincubation
      Les valeurs cFU pour chaque souche à chaque moment sont les données brutes qui peuvent être utilisées pour plusieurs analyses et tests statistiques différents (voir la section 4.2 ci-dessous).
  2. Effectuer les transformations de données suivantes pour déterminer si une souche concurrente surpasse la souche de référence en : (i) en déterminant si la proportion de la souche de référence diminue en présence de la souche concurrente, ou (ii) en calculant le l'indice relatif de la concurrence (RCI). Ces analyses convertissent les données brutes en ratios et peuvent être utiles pour déterminer le résultat concurrentiel d'une interaction, mais ne peuvent pas déterminer le mécanisme de la concurrence (c.-à-d. tuer vs inhibition de la croissance).
    1. Calcul de la proportion de chaque souche pour chaque point de temps pendant la coincubation
      1. Convertir les données de l'UFC à la proportion de chaque souche dans un traitement. Pour la souche de référence (RS) à T0, diviser le total des UFC pour la souche de référence à T0 par la somme du total des UFC pour la souche de référence et le concurrent (CS) à T0 :
        RST0 CfUs (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Proportion de souche de référence à T0.
        Effectuez le même calcul pour déterminer la proportion de la souche concurrente à T0 :
        CST0 CUS (RST0 CFUs - CST0 CFUs) - Proportion de souche de référence à T0
        Répétez ce processus pour chaque point de temps et reproduisez-le pour le traitement expérimental et le traitement témoin (coincubation de souche de référence marquée de façon différentielle).
      2. Graphiquez la proportion moyenne de chaque type de souche à T0 et T5 dans un graphique à barres empilés (figure 3A).
      3. Assurez-vous que le rapport de départ souhaité des souches a été obtenu. Pour les coincubations où les souches ont été initialement mélangées 1:1, chaque type de souche devrait comprendre 0,5 de la population à T0 et ne devrait pas être statistiquement différent les uns des autres en utilisant un test de t-test de l'étudiant (P -gt; 0,05). Si la proportion d'une souche est significativement plus grande que celle de l'autre souche à T0, alors répétez l'expérience jusqu'à ce qu'un rapport de départ de 1:1 soit atteint.
      4. Déterminer si la souche concurrente représente une proportion significativement plus importante de la population après 5 h. Effectuer un test de dépistage d'un étudiant en comparant la proportion de chaque souche dans le traitement expérimental à T0 et T5. Si la proportion de souche concurrente est significativement différente de celle de la souche de référence à T5 (P et 0,05), ce résultat suggère que la concurrence de souche peut avoir eu lieu. Passez à l'étape 4.2.1.5.
      5. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a réduit la proportion de la souche de référence après 5 h, effectuez le test t de l'étudiant en comparant la proportion de la souche de référence dans le contrôle avec la proportion de la souche de référence dans le traitement expérimental (souche de référence v souche concurrente).
        REMARQUE : Si la proportion de la souche de référence est statistiquement plus faible dans le traitement expérimental par rapport au contrôle (P -lt; 0,05), la souche concurrente a considérablement réduit la proportion de la souche de référence après 5 h et surpassés la souche de référence.
    2. Calcul de la valeur RCI journal pour chaque traitement (y compris le contrôle)
      REMARQUE: L'indice concurrentiel relatif, ou RCI, est une valeur unique qui compare la façon dont le rapport de fin des types de souches diffère du ratio de départ. La valeur RCI est transformée en rondins de telle sorte qu'une valeur RCI de journal supérieure à zéro indique que la souche concurrente (CS) a surpassé la souche de référence (RS), une valeur RCI de journal inférieure à zéro indique que la souche de référence a surpassé la souche concurrente, et un journal RCI valeur de zéro indique qu'aucune des deux souches n'a été surencoutée.
      1. Calculez les valeurs RCI journal pour chaque traitement de contrôle et expérimental en utilisant l'équation suivante:
        Log [(CST5 CFU - RST5 CFUs) (CST0 CFU - RST0 CFUs)] - journal RCI
      2. Graphique des valeurs RCI à l'aide d'une boîte séparée et de moustaches tracer où les données sont graphiques dans la direction horizontale (Figure 3B).
      3. Déterminer si chaque traitement était significativement différent de zéro en effectuant le test t d'un élève comparant les valeurs RCI journal de chaque traitement (y compris le contrôle) à un ensemble de données comparant le même nombre de répliques toutes avec une valeur nulle. Si les valeurs RCI journal pour le traitement expérimental sont statistiquement supérieures à zéro (P lt; 0,05), alors la souche concurrente a surpassé la souche de référence.
        REMARQUE: Le contrôle ne doit pas être statistiquement différent de zéro (P 'gt; 0.05), parce que les souches de référence marqués différemment sont isogéniques.
      4. Effectuez le test t d'un étudiant pour déterminer si les valeurs RCI journal pour le traitement expérimental étaient significativement plus grandes que le contrôle (P lt; 0,05). Si les valeurs RCI journal du traitement expérimental sont statistiquement plus grandes que le traitement de contrôle, alors la souche concurrente a surpassés la souche de référence.
  3. Effectuer l'analyse statistique suivante pour déterminer le mécanisme par lequel la souche concurrente surpasse la souche de référence : (i) analyser les données brutes totales de l'UFC, ou (ii) examiner la récupération en pourcentage de la souche de référence. Ces analyses peuvent être plus lourdes à voir par rapport à celles de l'étape 4.2, mais détermineront si la souche concurrente surpasse la souche de référence en la surpassant, en inhibant la croissance de la souche de référence ou en éliminant activement la souche de référence.
    1. Analyse des données brutes totales de l'UFC
      1. Graphiquez les données brutes totales de l'UFC pour les deux souches à l'aide d'une parcelle de diffusion entrelacée, où les répliques sont affichées sous forme de points de données individuels (Figure 4A). Affichez les données sur une échelle de journal et ajoutez une ligne horizontale indiquant les UFC T0 moyens pour les deux souches.
      2. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence, effectuez le test t de référence d'un étudiant comparant les UCF de souche de référence pour les traitements de contrôle et d'expérimentation à T5. Si les UFC de la souche de référence dans le traitement expérimental sont statistiquement inférieurs à ceux du contrôle (Pet lt; 0,05), la présence de la souche concurrente a eu une incidence importante sur la souche de référence.
      3. Pour déterminer si la présence de la souche concurrente a inhibé la croissance ou éliminé la souche de référence, effectuez le test t d'un étudiant en comparant la souche de référence DESFc à T0 et T5 pour les traitements de contrôle et d'expérimentation.
        REMARQUE: En l'absence d'un concurrent, la souche de référence devrait montrer une augmentation significative de cFU en comparant T0 et T5 pour le traitement de contrôle. Lors de l'analyse du traitement expérimental, si la souche de référence CFUs à T5 ne sont pas statistiquement différents par rapport à T0 (P 'gt; 0,05), puis la souche concurrente inhibé la croissance de la souche de référence. Si la souche de référence T5 CFUs est significativement inférieure à t0 CFUs (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a tué la souche de référence.
    2. Calcul de la récupération en pourcentage de la souche de référence
      1. Transformez les données totales de l'UFC pour la souche de référence (RS) en données de récupération en pourcentage à l'aide de l'équation ci-dessous :
      2. (RST5 CFUs - RST0 CFUs) x 100 % de récupération de la souche de référence
      3. Afficher le pourcentage de récupération de la souche de référence à l'aide d'un graphique à barres séparé où chaque barre représente soit le traitement de contrôle, soit le traitement expérimental (figure 4B). Ajouter une ligne pointillée à 100 euros pour indiquer une récupération de 100 % de la souche de référence (pas d'augmentation ou de diminution des UFC de la souche de référence de 0 h à 5 h).
      4. Pour déterminer si la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence, effectuez le test t d'un étudiant comparant le rétablissement de la souche de référence pour le traitement témoin au traitement expérimental. Si la récupération en pourcentage est significativement inférieure à la commande (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a eu une incidence négative sur la souche de référence.
      5. Pour déterminer si la souche concurrente a inhibé la croissance de la souche de référence ou en a éliminé, effectuez le test t d'un étudiant comparant la récupération de la souche de référence pour le traitement expérimental et un ensemble de données avec le même nombre de répliques valeur de 100.
        REMARQUE: Si le traitement expérimental n'est pas statistiquement différent de 100 (P 'gt; 0.05), alors la souche concurrente a inhibé la croissance de la souche de référence. Si la récupération de la souche de référence pour cent dans le traitement expérimental est significativement inférieure à 100 (Plt; 0,05), alors la souche concurrente a tué la souche de référence.
    3. Interprétation des images de microscopie à fluorescence
      1. Une fois que les images de microscopie de fluorescence sont prises, déterminez si chaque souche est visiblement détectable dans le point de coincubation. Pour la coincubation de contrôle (souche de référence pVSV102 - souche de référence pVSV208), le GFP et la DP doivent être visibles à partir d'un point de coincubation. Si ce n'est pas le cas, configurez à nouveau l'expérience en veillant à ce que les souches soient correctement étiquetées et inventées sur des plaques exemptes d'antibiotiques.
      2. Pour chaque point de coincubation expérimental, vérifiez les résultats possibles.
        REMARQUE: Si la souche concurrente est visible, mais que la souche de référence n'est pas détectée, cela suggère que la souche concurrente a tué ou inhibé la croissance de la souche de référence. Si les deux souches sont présentes et uniformément mélangées (GFP et DP présents dans tout le spot de coincubation), ces données suggèrent que la souche concurrente n'est pas en concurrence avec la souche de référence et que les deux souches coexistent. Si les deux souches sont présentes mais sont séparées spatialement (des microcolonies de PPF ou de DP sont présentes tout au long du spot de coincubation), cela suggère que la souche de référence et la souche concurrente peuvent s'engager dans des interactions concurrentielles et des modifications à la souche de référence ou le rapport initial de coincubation peuvent être nécessaires. Voir la discussion pour plus de détails.

5. Déterminer si l'interaction dépend du contact

REMARQUE: Si vous constatez qu'une souche tue ou inhibe la souche de référence, l'interaction peut être diffusable ou dépendante du contact. Pour déterminer si l'interaction dépend du contact cellule-cellule, effectuez un récarquille de coincubation comme décrit ci-dessus pour les étapes 1-2 avec les modifications suivantes.

  1. Effectuer des étapes 1.1-2.2.
  2. Une fois les souches normalisées, les souches séparées physiquement à l'aide d'un filtre à nitrocellulose d'une taille de 0,22 mm pore. Cette taille de pores permet la diffusion d'antimicrobiens et de petites molécules, mais empêche le contact physique entre les cellules de V. fischeri.
    REMARQUE: Si l'interaction dépend du contact cellule-cellule, la séparation de la souche de référence de la souche concurrente avec le filtre devrait abroger le phénotype de mise à mort ou inhibiteur et la souche de référence n'aurait pas dû réduire les UFC. Si l'interaction n'est pas dépendante du contact cellule-cellule, et est un mécanisme diffusible, la séparation des souches ne devrait pas empêcher la souche concurrente de tuer la souche de référence.
    1. Spot 5 mL de la souche de référence sur le centre d'un filtre et repérer 5 ml de la souche concurrente sur le centre d'un filtre différent. Placez le filtre contenant la souche de référence sur la surface d'une plaque d'agar LBS. Placez le filtre contenant la souche concurrente directement sur le dessus du filtre avec la souche de référence.
      REMARQUE: Chaque souche est repérée sur des filtres plutôt que la souche inférieure repérée directement sur la plaque d'agar afin que les souches peuvent être plus facilement placées directement les unes sur les autres.
    2. S'il est inquiétant que les souches ne sont pas empilées directement les unes sur les autres, diminuer le volume d'inoculum souche de référence repéré sur le filtre. Cela permettra de s'assurer que la zone de la tache de contrainte de référence est plus petite et entièrement au-dessus ou sous la souche concurrente. Alterner quelle souche est sur le dessus et sur le fond pour tenir compte des différences dans la diffusion des nutriments du milieu de l'agar.
    3. Pour s'assurer que le filtre permet la diffusion de petites molécules, inclure un traitement de contrôle où la souche de référence est repérée sur un filtre et un antibiotique qu'il est sensible à (chloramphenicol) est repéré sur l'autre. Empilez les filtres directement les uns sur les autres et placez-les sur une plaque d'agar LBS. L'antibiotique doit pouvoir se diffuser à travers le filtre et doit tuer la souche de référence.
  3. Incuber les plaques avec des filtres à 24 oC pendant 5 h. Ne pas inverser la plaque d'agar lors de l'incubation pour éviter de déplacer les filtres.
  4. Effectuer des dilutions en série pour l'inoculum de départ selon l'étape 2.4.
  5. Prendre des mesures finales T
    1. À l'aide d'une pince stérile, transférer chaque ensemble de filtres dans un tube Falcon de 50 ml contenant 5 ml de bouillon LBS. Assurez-vous que les filtres sont physiquement séparés dans le tube pour permettre une résuspension complète de chaque type de souche.
    2. Resuspendre les souches des filtres en faisant monter et descendre jusqu'à ce que les filtres soient dégagés de toutes les cellules. Utilisez une pince à épiler pour faire pivoter les filtres et effacer le matériel cellulaire des deux côtés. Stériliser les pinces à éthanol entre les échantillons.
    3. Effectuer la dilution en série pour la finale T selon l'étape 2.5. Lors du calcul du total des UFC pour la finale T, ajustez le « volume total de l'échantillon non dilué » de 1 ml à 5 ml.

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Representative Results

Afin d'évaluer les interactions concurrentielles entre les populations bactériennes, un protocole d'analyse de coincubation a été développé et optimisé pour V. fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent les gènes de résistance aux antibiotiques et les protéines fluorescentes, permettant une sélection différentielle et la discrimination visuelle de chaque souche. En analysant les données recueillies à partir de l'analyse de coincubation, le résultat concurrentiel d'une interaction et le mécanisme de l'interaction peuvent être identifiés. À titre d'exemple, les expériences suivantes ont été réalisées à l'aide d'isolats V. fischeri. Les souches de pièces de monnaie abritaient l'un des deux plasmides stables : pVSV102 exprimant la résistance à la kanamycine et gFPMD, ou pVSV208 exprimant la résistance au chloramphenicol et DsRedMD. Dans les données de l'échantillon, les souches ont été mélangées dans un rapport de 1:1 et incubées sur des plaques d'agar LBS pendant 5 h. En tant que traitement de contrôle, des versions marquées différemment de la souche de référence ont été inventées les unes avec les autres. Les traitements expérimentaux ont été effectués avec la souche de référence (harboring pVSV102) et soit la souche concurrente 1 ou la souche concurrente 2 (harboring pVSV208). Les cultures de chaque souche ont été préparées et inventées comme décrit ci-dessus et comme le montrent la figure 1 et la figure 2.

À la figure 3, les données analysées pour déterminer si la souche 1 ou 2 des concurrents ont dépassé les concurrents, la souche de référence est présentée de deux façons. Dans la figure 3A, la proportion de chaque type de souche pour chaque point de temps au cours de l'expérience a été calculée en fonction de l'étape 4.2.1. Dans les traitements expérimentaux, les données de l'échantillon montrent que la souche de référence et la souche 1 du concurrent sont présentes à une proportion de 0,5 au début (0 h) et à la fin (5 h) de l'expérience, ce qui est compatible avec ce qui est observé dans le traitement témoin. Ces données montrent que la proportion des souches n'a pas changé après une coincubation de 5 h, et donc aucune concurrence n'a été observée. En revanche, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente 2, la souche de référence était présente à une proportion de 0,5 au début (0 h), et une proportion de lt;0,01 à la fin (5 h) de l'expérience, qui était significativement inférieure à la traitement (test t de l'étudiant : P et lt; 0,001). Ces données indiquent que la proportion de la souche de référence a diminué en présence de la souche 2 du concurrent et suggèrent donc qu'il y a eu concurrence entre la souche 2 et la souche de référence du concurrent. Ce type d'analyse devrait être appliqué pour déterminer comment la proportion de souches au sein d'une collectivité change au fil du temps, mais ne peut pas être utilisée pour déterminer le mécanisme de l'interaction concurrentielle, et devrait donc être combinée à une analyse supplémentaire. Par exemple, la proportion de la souche de référence diminuant en présence de la souche 2 du concurrent pourrait être attribuée à plusieurs types d'interactions : (i) la souche 2 a augmenté plus rapidement que la souche de référence, (ii) la souche 2 a inhibé la croissance de la référence (iii) la souche 2 a éliminé la souche de référence par la mise à mort.

Dans la figure 3B, l'indice relatif de compétitivité (RCI) a été calculé pour chaque traitement selon l'étape 4.2.2. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 1 du concurrent, les valeurs RCI journal n'étaient pas statistiquement différentes de zéro ou du traitement de contrôle (P 'gt; 0.05), suggérant que la concurrence entre les souches n'a pas été observée. Cependant, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 2 du concurrent, les valeurs RCI journal étaient significativement supérieures à zéro et le traitement de contrôle (test de l'étudiant : P et lt; 0,001). Ces données suggèrent que la souche 2 a surpassés la souche de référence. L'analyse des valeurs RCI du journal fournit une méthode simple pour déterminer si une souche a survolé l'autre pendant la période d'incubation. Étant donné que cette analyse intègre le rapport des souches à la fin (5 h) et au début (0 h) de l'expérience, le rapport de départ peut avoir un impact considérable sur le résultat. Par conséquent, le ratio de départ devrait être examiné et pris en considération lors de l'enregistrement des conclusions des données RCI journal. De plus, cette analyse ne fournit pas d'information sur le mécanisme concurrentiel et explique simplement comment le rapport des souches change pendant l'incubation.

La figure 4 présente deux méthodes d'analyse des données pour déterminer le mécanisme de concurrence pour une interaction donnée. Dans la figure 4A, le total des UFC pour chaque souche à chaque moment de l'expérience est affiché. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 1 concurrente, les UFC des deux souches augmentent au cours de 5 h et les UFC pour la souche de référence n'étaient pas significativement différents de la souche 1 ou du contrôle à 5 h (P 'gt; 0.05). Ces données indiquent que la souche de référence s'est développée en présence de la souche 1 et suggèrent qu'il n'y a pas eu de concurrence. Cependant, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 2 du concurrent, la souche 2 des UFC a augmenté après 5 h, mais les UFC pour la souche de référence ont diminué. Les UFC de souche de référence étaient significativement inférieurs à la souche 2 CFUs et le contrôle à 5 h (t-test de l'étudiant : P et lt; 0,002). Ces données indiquent que la souche de référence CFUs diminue en présence de la souche 2, et suggèrent que la souche 2 tue les cellules de souche de référence. Si la souche de référence n'a pas montré une diminution des UFC, mais plutôt pas de changement (aucune différence statistique entre les UCF souche de référence à 0 h et 5 h), ces données suggèrent que la souche 2 a surpassé la souche de référence en inhibant la croissance de la souche de référence. L'analyse des données totales non transformées de l'UFC est particulièrement instructive, car les Ufc fcu pour les deux souches à chaque moment sont affichés indépendamment et peuvent être utilisés pour identifier le mécanisme de la concurrence.

La figure 4B montre le pourcentage de récupération de la souche de référence afin de déterminer comment la présence d'une souche concurrente affecte la souche de référence. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 1 du concurrent, on a observé une récupération de 3 200 pour cent, ce qui n'était pas statistiquement différent du contrôle et indique que la souche 1 n'a pas affecté la récupération en pourcentage de la souche de référence. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche 2 du concurrent, on a observé une récupération de 4 p. 100, ce qui était nettement inférieur au contrôle (test de l'élève : P et lt; 0,002). Le pourcentage de récupération a également été significativement inférieur à 100 (test t de l'étudiant: P lt; 0,002), indiquant la souche 2 a surpassé la souche de référence en tuant les cellules de souche de référence. Si le pourcentage de récupération n'était pas statistiquement différent de 100, ces données suggèrent que la souche 2 a inhibé la croissance de la souche de référence. Les données de récupération en pourcentage fournissent un moyen simplifié de caractériser le mécanisme de la concurrence en examinant comment la population de souches de référence réagit à la présence d'une souche concurrente. Toutefois, l'affichage des données de cette façon exclut les informations sur le ratio de départ ainsi que sur la façon dont l'abondance de la souche concurrente a changé tout au long de l'incubation.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de flux illustrant l'exemple de coincubation. (A) Les souches bactériennes hébergeant soit pVSV102 (souche de référence indiquée Ref. Strain ou R.S.) ou pVSV208 (souche concurrente indiquée Comp. Strain ou C.S.) sont cultivées séparément sur des supports sélectifs pour la souche de référence (LBS Kan) ou concurrence (LBS Cam). Les souches sont ensuite remises en suspension dans le bouillon LBS et normalisées à un OD 1.0. (B) La souche de référence et la souche concurrente sont mélangées à un rapport de 1:1 par volume. Une dilution en série est effectuée avec ce mélange pour déterminer les UFC pour les deux souches à 0 h. (C) Le mélange de souches est ensuite repéré sur des plaques de 24 puits contenant de l'agar LBS. Chaque réplique est repérée dans son propre puits. Les taches sont autorisées à sécher puis incubées à 24 oC pendant 5 h. Après 5 h, une dilution en série est effectuée pour quantifier les UFC pour chaque souche. (D) Le mélange de souches du panneau B est également repéré sur des plaques de Petri lbs agar autorisées à sécher et incubées à 24 oC pendant 24 h. À 24 h, la tache de coincubation est représentée à l'aide d'un microscope à disséquer à la fluorescence qui est adapté pour détecter la fluorescence verte (souche de référence) et rouge (souche concurrente). Barre d'échelle de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images représentatives des plaques requises pour une dilution en série. (A) plaque de 96 puits utilisée pour effectuer la dilution en série. La plaque est tournée de telle sorte qu'il y ait 12 rangées et 8 colonnes. Les descripteurs de chaque traitement comprennent les souches utilisées et les plasmides qu'ils hébergent (p. ex., souche de référence avec pVSV102 et souche concurrente avec pVSV208) et le numéro de réplique pour chaque ligne (R1, R2, R3 ou R4). La première colonne est l'échantillon non dilué et chaque colonne à droite représente une dilution 10 fois par rapport à la colonne précédente (facteur de dilution énuméré ci-dessus). (B) Plaque d'agar LBS utilisée pour déterminer les UFC pour la souche de référence sur les plaques LBS Kan (en haut) et la souche concurrente sur les plaques LBS Cam (en bas) du traitement expérimental. Chaque ligne est une réplique dans un traitement (p. ex. R1) et le facteur de dilution de chaque tache est répertorié en haut de la plaque. Le nombre d'UFC comptés pour chaque réplique est répertorié à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Exemples de données pour déterminer si les souches concurrentes surpassent la souche de référence. (A) La proportion de souches de pièces de monnaie abritant soit pVSV102 (gris foncé) ou pVSV208 (gris clair). R.S. indique la souche de référence et C.S. indique la souche concurrente. La ligne horizontale pointillée indique une proportion de 0,5. L'astérisque indique que la souche de référence a constitué une proportion statistiquement plus faible de la population que la souche concurrente ou la souche de référence dans le contrôle à 5 h (t-test de l'étudiant : P lt; 0,001); ns indique pas significatif (P 'gt; 0.05). (B) Log relative competitive index (RCI) for coincubation tests. La ligne verticale pointée indique le journal RCI 'zéro. L'astérisque indique que la valeur RCI du journal est statistiquement supérieure à zéro et le contrôle (test de l'étudiant : P et lt; 0,001). Les barres d'erreur indiquent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de données pour déterminer le mécanisme de la concurrence. (A) Nombretotal total de cFU pour les essais de coincubation effectués avec des isolats V. fischeri qui ont été marqués différemment avec pVSV102 ou pVSV208. Les UFC ont été recueillis au début de l'expérience (0 h) et après 5 h d'incubation. R.S. indique la souche de référence et C.S. indique la souche concurrente. La ligne horizontale pointillée indique la moyenne de 0 h de CFU pour les deux souches; l'astérisque indique que les UFC de souche de référence étaient statistiquement plus faibles dans le traitement expérimental par rapport au traitement témoin à 5 h (test t de l'étudiant : P et lt; 0,002). (B) Récupération en pourcentage de la souche de référence. La ligne pointillée horizontale indique une récupération de 100 % (pas d'augmentation ou de diminution des UFC); l'astérisque indique que le rétablissement en pourcentage était statistiquement inférieur à 100 % et que le traitement de contrôle (test de l'étudiant : P et lt; 0,002). Les barres d'erreur indiquent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Exemples de données pour le temps d'incubation et l'optimisation de l'imagerie. (A) Total des UFC pour les essais de coincubation où les UFC ont été recueillis au début de l'expérience (0 h), après 5, 12 et 24 h d'incubation. R.S. indique la souche de référence et C.S.2 indique la souche 2 du concurrent. La ligne horizontale pointillée indique la moyenne de 0 h de CFU pour les deux souches; les astérisques indiquent que les UFC de souche de référence étaient statistiquement plus faibles dans le traitement expérimental par rapport au traitement témoin au moment donné (test t de l'étudiant : P et lt; 0,002). Les barres d'erreur indiquent SEM. (B) Images de microscopie fluorescente correspondant aux données cFU dans le panneau A. Barre d'échelle de 1 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6. Exemple de données pour l'optimisation du ratio de coincubation. Des expériences de coincubation ont été réalisées entre la souche de référence (R.S.) hébergeant pVSV102 (vert, rangée supérieure) et la souche concurrente (C.S.) hébergeant pVSV208 (rouge, rangée inférieure) et des images fluorescentes de microscopie ont été prises à 24 h. (A) Strains ont été mélangés dans un rapport de 1:1 ou (B) un rapport de 1:5 où la souche de référence, contenant pVSV102, a été dépassée en nombre par la souche concurrente contenant pVSV208. Barre d'échelle de 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le résultat coincubation décrit ci-dessus fournit une méthode puissante pour découvrir la concurrence interbactérienne. Cette approche a permis d'identifier la concurrence intraspécifique entre les isolats de V. fischeri et de caractériser le mécanisme concurrentiel19. Bien que la méthode décrite ait été optimisée pour la bactérie marine V. fischeri, elle peut être facilement modifiée pour accueillir d'autres espèces bactériennes, y compris des isolats cliniques et environnementaux. Il est important de noter que les mécanismes concurrentiels sont souvent réglementés sous condition5,6,23,24,25,26,27 , 28, donc de petites différences dans les conditions de croissance (p. ex., secouer par rapport à la culture debout, la température, etc.) et le type de média (p. ex., teneur en sel) peuvent avoir une incidence considérable sur les résultats. Par conséquent, l'optimisation des conditions de coincubation est probablement nécessaire pour différentes espèces bactériennes ainsi que pour différents mécanismes concurrentiels. Il est préférable de choisir des conditions de culture qui reflètent étroitement l'environnement naturel des isolats. Par exemple, des essais de coincubation entre souches de V. fischeri ont été effectués avec des milieux LBS à 24 oC, afin de refléter la salinité et la température de l'environnement marin. Cependant, certaines bactéries sont naturellement compétentes dans leur environnement27,28 et pourraient donc prendre du matériel génétique libéré par les cellules lysées au cours des interactions antagonistes29. Pour éviter qu'un tel transfert d'ADN n'ait un impact sur les résultats de la coincubation, il est important d'utiliser des conditions qui ne favorisent pas la compétence ou les souches qui ne sont pas compétentes, que ce soit naturellement ou par l'inactivation de machines d'utilisation de l'ADN. En outre, les paramètres expérimentaux tels que la phase de croissance cellulaire, la densité de culture, le temps d'incubation ou le ratio de souche de départ peuvent également nécessiter une optimisation pour différentes espèces bactériennes ou mécanismes concurrentiels. Par exemple, la densité de culture initiale dictera la quantité de contact cellule-cellule entre les souches, ce qui peut affecter la capacité des bactéries à déployer des mécanismes de concurrence dépendants du contact.

Figure 5A affiche le processus d'optimisation des essais de coincubation avec des isolats V. fischeri. Ici, une gamme de temps d'incubation pour la collecte de CFU et l'imagerie fluorescente de microscopie ont été évaluées pour déterminer le temps optimal pour chaque mesure à recueillir. Les Ufc ont été recueillis immédiatement après que le mélange de la souche de référence et de la souche 2 du concurrent a été repéré sur des plaques d'agar LBS (0 h), et des mesures de cFU et des images fluorescentes de microscopie ont été prises immédiatement et après 5, 12 et 24 h. Ces exemples de données soulignent l'importance d'une optimisation approfondie avant de tirer des conclusions sur l'interaction entre deux souches. Par exemple, deux conclusions différentes sur le mécanisme d'interaction peuvent être déduites en fonction du moment où les UFC sont recueillis : les UFC de 5 ou 12 h indiquent que la souche 2 a tué la souche de référence, tandis que les UFC recueillis à 24 h suggèrent que la souche 2 inhibe la croissance de la souche de référence.

Le temps optimal pour la visualisation des taches de coincubation par microscopie fluorescente peut être différent du temps optimal pour la collecte de CFU. La figure 5B affiche des images de microscopie fluorescente des taches de coincubation à 0, 5, 12 et 24 h. A 0 et 5 h, les taches de coincubation ne sont pas visibles avec la microscopie fluorescente. Pour les images prises à 12 h, les deux souches du traitement de contrôle sont visibles, mais la DP (souche de référence hébergeant pVSV208) est particulièrement plus faible. Dans le traitement expérimental à 12 h, la souche 2 du concurrent est visible (encore faible) et la souche de référence n'est pas détectable. Les différences spécifiques entre les isolats bactériens peuvent affecter l'expression des protéines fluorescentes, et donc la luminosité des cellules dans le point mélangé. Étant donné que la DP est particulièrement plus faible que gFP dans le contrôle, les taches de coincubation devraient continuer à être incubées et être redirigées à nouveau à une date ultérieure. Dans les images prises à 24 h, les deux souches sont visiblement détectables et à une luminosité similaire dans l'expérience de contrôle. Dans le traitement expérimental, la souche 2 est visible alors que la souche de référence n'est pas observée dans la tache de coincubation. 15 - 24 h de temps d'incubation est suffisant pour visualiser GFP et DP pour V. fischeri en utilisant des plasmides stables pVSV102 et pVSV208, respectivement, mais le temps d'incubation peut avoir besoin d'être ajusté pour différents plasmides ou espèces bactériennes. Bien que le temps optimal pour la visualisation des taches de coincubation et la collecte des données CFU sont différents, l'imagerie à 24 h est un bon moyen de filtrer rapidement les interactions pour V. fischeri, parce que le résultat obtenu à partir de l'imagerie à 24 h (cible est visible ou non) reflète les données quantitatives plus chronophonnent obtenues à partir du placage des UFC à 5 ou 12 h.

Le ratio de départ peut avoir un impact significatif sur les résultats, en particulier lors de l'incubation de deux souches inhibitrices, et peut-être besoin d'être ajusté pour tenir compte des différences spécifiques de souche dans l'efficacité de tuer ou le taux de croissance. Par exemple, la figure 6A affiche des images de microscopie fluorescente d'expériences où la souche de référence a été inventée avec elle-même (contrôle) et trois autres isolats V. fischeri à partir d'un rapport de 1:1. Dans ces données d'échantillon, la souche de référence est visiblement détectée lorsqu'elle est incubée avec elle-même, la souche 1 du concurrent et la souche concurrente 3 après 24 h. Toutefois, lorsque le rapport de départ a été ajusté à 1:5 (c.-à-d. 50 ml de souche de référence mélangée à 250 ml de souche concurrente), la souche de référence n'est visiblement détectée que lorsqu'elle est conée avec elle-même et la souche 1, ce qui indique que la souche 2 et la souche 3 surpassent la souche de référence. Cet ajustement empêche le taux de croissance plus rapide de la souche de référence d'occulter l'effet de tout mécanisme de concurrence d'interférence exposé par les souches concurrentes. Sur la base des résultats de la figure 6A, un rapport de 1:5 (souche de référence : souche concurrente) devrait être utilisé pour filtrer les souches supplémentaires de V. fischeri pour la capacité de tuer la souche de référence.

Ce protocole établit une distinction entre les souches de coquetage en étiquetant différemment les souches avec des plasmides contenant soit des gènes de résistance à la kanamycine, soit au chloramphenicol. Cependant, différents antibiotiques ou d'autres méthodes de sélection peuvent être mieux adaptés à différentes espèces bactériennes. D'autres méthodes de sélection différentielle pourraient inclure : 1) l'exploitation d'une auotrophie spécifique à la souche/espèce pour des facteurs de croissance spécifiques (p. ex., DAP ou thymidine), 2) les besoins conditionnels de croissance (p. ex., une souche pousse à 37 oC alors que l'autre ne le fait pas), ou 3) marqueurs de contre-sélection qui éliminent ou inhibent la croissance de la souche étiquetée lorsqu'ils sont cultivés dans des conditions appropriées pour exprimer un gène « tuer » (p. ex., ccdB ou sacB).

La sélection de la souche de référence appropriée est essentielle pour obtenir et interpréter les résultats reproductibles de l'analyse de coincubation. Une souche de référence devrait être bien étudiée (c.-à-d., avoir un large corps de littérature scientifique), n'ont aucune capacité apparente de tuer ou d'inhibiteur, et idéalement avoir un génome séquencé. Par exemple, certaines souches d'Escherichia coli sont des souches de référence courantes pour de nombreuses expériences de coincubation bactérienne30,31. Cependant, E. coli peut ne pas être écologiquement pertinent pour un mécanisme ou un concurrent concurrentiel donné, ce qui peut affecter les résultats. Par exemple, certaines bactéries peuvent avoir développé des mécanismes ciblant spécifiquement des espèces ou des concurrents étroitement apparentés pour la même niche écologique et leur mécanisme concurrentiel ne serait pas efficace contre une souche de référence E. coli.

En résumé, la méthode décrite ici vise à fournir une approche facilement modifiée et robuste pour évaluer les interactions interbactériennes et la concurrence. Cette méthode peut être appliquée aux isolats bactériens pertinents à la recherche environnementale ou clinique, et peut être utilisée pour explorer divers mécanismes d'interaction microbienne qui étaient auparavant inconnus ou difficiles à étudier.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier les évaluateurs pour leurs commentaires utiles. A.N.S. a reçu le soutien de la Fondation Gordon et Betty Moore par l'entremise de Grant GBMF 255.03 à la Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

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References

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  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
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Immunologie et infection numéro 149 compétition d'interférences microscopie fluorescence Aliivibrio fischeri interactions intersouches interactions inter-espèces mise à mort interbactérienne
Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre <em>Vibrio fischeri</em> Isolates
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Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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