Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

Abstract

כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.

Introduction

כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.

מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים4,5,6,7, 8,9. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית13 , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד9,14,15,16,17 ,בן 18

למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים19, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. להכין זנים עבור Coincubation

  1. לבחור זן התייחסות מתאים שישמש כיעד לתחרות חיידקים במהלך שיטת הדגירה. ראה דיון לגבי שיטות עבודה מומלצות בעת בחירת זן הפניה וכיצד מאמץ ההפניה ישפיע על התוצאות. בפרוטוקול זה, V. פישרי זן ES114 ישמש זן התייחסות.
  2. קביעת הבחירה ושיטות ההקרנה ישמשו להבחנה בין הבודדת בקובדגירה
    1. בדרך כלל, זנים שינוי עם פלסטלינה יציבה המכילה גנים שונים עמידות לאנטיביוטיקה (g. kanamycin ' או כלוראמאניול) כדי לבחור עבור כל זן, כמו גם גנים קידוד חלבונים פלורסנט שונים (g. GFP or RFP) עבור ויזואלית מבחין סוגי הזנים בתרבות הcoculture
      הערה: השימוש בפלמידים יציבים נדרש מכיוון שאם המתח מאבד את הפלפמיד בהיעדר הבחירה, אזי מספרי הנבג לא יעריכו כאשר הם מקוונו, ולא יהיו ניתנים לזיהוי חזותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    2. תג V. פישרי הזנים הדיפרנציאלי כזה זן אחד מכיל את pVSV102 באמצע, אשר מבטא חלבון פלורסנט ירוק (gfp) והתנגדות לקאנאמיצין אנטיביוטיקה (קןR), והזן השני מכיל פלpVSV208 בינוני, אשר מבטא חלבון פלורסנט אדום (dsRed) והתנגדות כלורמפאנרול אנטיביוטי (CmR)22.
      הערה: בחירות דיפרנציאליות אחרות ניתן להשתמש כדי להבדיל זנים coדגירה. ראה דיון לשיטות נוספות.
    3. כלול את הפקד הבא במהלך המיטוב הראשוני של שיטת הדגירה כדי להבטיח שהבחירה תהיה איתנה. צלחת כל זן כי הוא מתויג באופן הדיפרנציאלי על לוחות אגר המכיל את האנטיביוטיקה שצריך לבחור נגדה (כלומר, זן צלחת 1 על המדיה בוחרת עבור זן 2, ולהיפך).
  3. יומיים לפני שיטת הדגירה, פס התייחסות זן pVSV102, התייחסות זן pVSV208, וכל מתחרה מאמץ pVSV208 מ-80 מניות ° c אל ליברות אגר לוחות המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה (למשל, 100 μg/mL kanamycin או 2 μg/mL כלוראמאנקול) ומהדגירה לילה ב -24 ° c. בחירה אנטיביוטית נדרשת כדי להבטיח את כל התאים מכילים את הפלאמצע בתחילת הניסוי.
  4. יום אחד לפני הצורך, לקטוף ולאסוף לסירוגין ארבע מושבות הפרט לסוג מאמץ (משכפל ביולוגי) על צלחות ליברות אגר טרי עם אנטיביוטיקה המתאימה מודענות לילה ב 24 ° c.
    הערה: שלב זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים אחרים, ככל שזמני הדגירה ארוך או קצר יותר עשוי להידרש כדי להשיג תאים מספיקים בהתאם לקצב הצמיחה של האורגניזם של הריבית.

2. coדגירה זנים חיידקיים

  1. הכנת כל זן חיידקי לדגירה (איור 1a)
    1. באמצעות קיסם סטרילי, לגרד את התאים מן הצלחת אגר (ככל הגודל של גרגר של אורז) ו להשעות מחדש את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל 1 מ ל של מרק ליברות. לשבור את הגושים התא על ידי לחיצה עליהם לתוך הצד של הצינור ללטף למעלה ולמטה במרץ.
    2. קאפ את הצינור ואת המערבולת עבור 1-2 s. אם הגושים של התא עדיין גלויים, המשך למערבולת או לפיפטה למעלה ולמטה עד שמדגם הוא אחיד באופן חזותי.
    3. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.2 עבור כל הדגימות.
  2. למדוד ולהקליט את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) עבור כל הדגימות. סביר להניח שיהיה צורך לדלל דגימות עד לקיפול של 10 באמצעות ציר ליברות כדי לקבל מדידה מדויקת של OD. הנרמל כל אחת מהדוגמאות לצורך OD600. זנים הם מנורמל בדרך כלל כדי OD600 ~ 1.0, אשר מיתרגם ~ 106 חיידקים/mL עבור V. פישרי.
    הערה: שלב זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים שונים כמו צפיפות התא האינוייתי משפיע על תוצאות coincubation בהתאם מנגנון התחרות. ראה דיון למיטוב.
  3. זני החלקה (איור 1b, ג)
    1. מערבבים את זן ההפניה ואת זן מתחרה ביחס 1:1 (v/v) על-ידי הוספת 100 mL של כל זן (מנורמל ל-OD 1.0) כדי התווית 1.5 שפופרת צנטריפוגה mL. כפקד, לערבב את זן התייחסות עם גרסה מתויג מבחינה מדומה של עצמו (התייחסות זן pVSV102 + התייחסות זן pVSV208). פקד זה נדרש לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר כדי לקבוע אם הנוכחות של זן מתחרה משפיעה על התפתחותם של מאמץ ההפניה. מערבולת התרבות זן מעורב עבור 1-2 s.
      הערה: ייתכן ששלב זה ידרוש אופטימיזציה כאשר יחס ההתחלה יכול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות וייתכן שיהיה צורך לכוונן אותם. ראה דיון למיטוב.
    2. חזור על שלב 2.3.1 עבור כל שכפול ביולוגי. לאחר השלמת שלב זה, צריך להיות סך של שמונה מעורב מאמץ צינורות: ארבע משכפל ביולוגי עם התייחסות משולבת מתויג זנים (שליטה), וארבעה משכפל ביולוגי עם התייחסות דיפרנציאלי מתויג וזנים מתחרה ( ניסיוני).
    3. נקודה 10 מ ל של כל שליטה והתערובת הניסיונית על לוחות פטרי המכילים ליברות אגר; כתמי תרבות אלה ישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה.
    4. הניחו לכתמים להתייבש לחלוטין על הספסל עד שהנוזל נספג בתוך האגר ומודלים את צלחות פטרי ב -24 ° c עבור 24 שעות. מינימום של 15 h נדרש עבור זנים V. פישרי מתויג עם pVSV102 ו pVSV208 לצמוח צפיפות תא גבוהה מספיק כדי להמחיש gfp ו rfp, בהתאמה, ברמת האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ מבתר פלואורסצנטית. כאן, אנו משתמשים בדגירה של 24 שעות לדימות מקומות מעורבים.
      הערה: חשוב להשתמש בלוחות שאינם לחים או יבשים מדי. אם הלוחות הם לחים מדי, כתמים coincubation לא נספג לתוך הצלחת אגר; להימנע משימוש בלוחות שנשפכו באותו יום. אם הלוחות יבשים מדי, גלים קטנים או סדקים עשויים להיווצר על פני השטח של אגר, הפיכת כתמי הדגירה לא סדיר בצורה.
    5. השימוש באותם שתלים חיידקיים כמו בשלב 2.3.3, ספוט 10 מ ל של כל שליטה ותערובות ניסיוני לתוך לוחות 24-היטב המכיל 1 מ ל ליברות אגר לכל טוב. כמו בשלב 2.3.3, לוודא אגר ב 24-הצלחות היטב יש את הלחות המתאימה. הניחו לכתמים להתייבש לחלוטין ולדגירה ב -24 ° c עבור 5 h. כתמי תרבות אלה ישמשו לכמת את היחידות היוצרות את המושבה (הדפוס) לכל מאמץ בסוף הניסוי.
      הערה: בארות בודדות מאפשרות השעיה בקטריאלי לצמיחה בבארות נפרדות בשעת סיום הזמן. שלב זה עשוי להתבצע באמצעות חתיכות סינון מרובע סטרילי כגישה חסכונית יותר לשימוש לוחות 24-היטב. כיכר חתיכות סינון סטרילי ניתן להציב על צלחת אגר ו 10 מ ל של כל תערובת ניסיוני ניתן לזהות על המסננים האלה, ולא על לוחות 24-היטב. לאחר הזמן coincubation, המסננים יכולים להיות מועברים לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ומקום coincubation ניתן להשעות מחדש על ידי vortexing או ליטוף למעלה ולמטה. זמן דגירה 5 h מספיק כדי לזהות הריגה בין חיידקים בין V. פישרי מבודד19, עם זאת, הזמן הזה coincubation יכול להיות קצר יותר או ארוך יותר עבור מינים אחרים או מנגנונים תחרותיים. עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים.
  4. דילול סדרתי לצורך התחלת הרשת
    1. כדי לבצע דילול סדרתי של התחלת תערובות coincubation, לסובב 96-טוב צלחת 90 ° כך יש שמונה טורים 12 שורות. כל שורה תכיל מדגם של התערובת הבלתי מדוללת בעמודה הראשונה ואחריו מדלל סדרתי 7 10 מתקפל על פני הבארות הנותרות בשורה (איור 2A).
    2. סמן כל שורה באמצעות מזהה המתח, את מספר השכפול ואת השעה (החל את המקור = T0). סמן את הצלחות ליברות אגר בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה לזהות את סדרת הדילול. הקפד לזהות איזה זן כל צלחת אנטיביוטי בחירה עבור.
    3. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 180 מ ל של מרק ליברות לכל באר, והשאירו את הטור הראשון ריק לתערובת הקוונט הבלתי מדוללת.
      הערה: החוקרים יכולים לבחור להשתמש מלוחים באגירה פוספט (PBS) כדי להשהות מחדש כתמים coincubation ולבצע דילול סדרתי אם עובד עם מינים במיוחד בקטריאלי הגוברת או בעקביות ביצוע ניסויים גדולים שבו מדלל סדרתי עשוי לקחת זמן רב לביצוע. שימוש ב-PBS במקרים אלה ימנע צמיחה משמעותית של חיידקים במהלך תהליך של ביצוע מדלל סדרתי. עם זאת, חשוב להיות עקבי באיזה פתרון משתמשים (לדוגמה, PBS או £) בכל הניסויים, ללא קשר לגודלם או למשך הזמן שלהם.
    4. באמצעות 200 mL בערוץ אחד הצינורות, העברה 100 mL של תערובת coincubation מן הצינור אל העמודה הראשונה היטב. מחק את העצה וחזור על כל תערובות coincubation.
    5. שימוש בפיפטה רב-ערוצית, העברת 20 מ ל מטור 1 עד 2 ומערבבים באמצעות ליטוף למעלה ולמטה. מחק את העצות וחזור על כל עמודה כך שבסופו של דבר, כל שורה מכילה דילול טורי בעל עשרה קיפולים של התערובת הראשונית של הדגירה.
      הערה: להיות עקבי עם מספר הפעמים. שדילול בצינורות למעלה ולמטה לדוגמה, לדכא את ידית הפיפטה חמש פעמים עבור כל דילול להיות עקבי לאורך סדרת הדילול.
    6. שימוש בפיפטה רב ערוצי מצויד עם שמונה טיפים, מאלץ 5 מ ל מכל באר בסדרת דילול (כלומר, שורה אחת של שמונה בארות) ולאתר אותו על צלחת אגר ליברות הבוחר עבור זן התייחסות (בתוספת kanamycin). חזור על שלב זה האיתור על הצלחת בחירה עבור זן המתחרה (בתוספת עם כלורמפננול) (איור 2B). לאפשר למקומות להתייבש לגמרי לפני הצבת בחממה.
      הערה: ניתן להשתמש באותם עצות כדי לזהות סדרת דילול שכפול על לוחות בחירה עבור ההפניה והמתח המתחרה, אך יש לשנותה בין שכפול. הימנע לגעת בסופו של עצה הצינורות לצלחות ליברות אגר כמו זה יכול ליצור דיכאון שיכול להידמות מושבה חיידקית ותוצאות הטיה במהלך ספירות צלחות. אם העצה נוגעת בצלחת, רשום הערה ואינך כולל את הדיכאון בספירות המושבה.
  5. לקיחת מדידות אחרונות
    1. לאחר כתמי הדגירה של לוחיות הרישוי של 24 לוחות הבאר כבר מודללו עבור 5 h ב -24 ° c, להוסיף 1 מ ל של מרק ליברות כל טוב ולהשעות מחדש את כתמי coincubation על ידי ליטוף למעלה ולמטה עד כל התאים מושעה מחדש. הקפד על עקביות בעוצמה שבה התאים מושעים מחדש על פני כל המשכפלת. לדוגמה, לדכא את ידית הפיפטה שמונה פעמים כדי להשעות מחדש כל דוגמה.
    2. לאחר כל נקודה coincubation מושהה מחדש, להכין צלחת 96-באר עבור דילול סדרתי צלחות ליברות אגר עם אנטיביוטיקה המתאים שבו לזהות את הדילול באותו אופן כמו שלב 2.4.1.
    3. בצע את השלבים 2.4.2-2.4.6 כדי להשלים את הדילול הטורי עבור מדידות הסופי T.
      הערה: שליטה חשובה צריכה להיכלל במהלך האופטימיזציה הראשונית של שיטת הדגירה. בסוף תקופת הדגירה, צלחת זנים מעורבים על מדיה הכוללת גם אנטיביוטיקה. מאמץ לא צריך להיות מסוגל לגדול אלא אם 1) מוטציה ספונטנית מתרחשת, או 2) סמנים לבחירה מוחלפים בין זנים.

3. מדמיין את Coincubations באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

  1. תמונה כל מיקום coincubation על ליברות אגר לוחיות פטרי משלבים 2.3.3 ו 2.3.4 באמצעות מיקרוסקופ סטריאו מצויד ירוק ואדום איתור פלואורסצנטית, אשר תואמים את החלבונים הפלואורסצנטית להיות מבוטא על פלמידים יציבים.
  2. התחל על-ידי לקיחת תמונות של ספוט coincubation הבקרה (התייחסות זן pVSV102 + הפניה זן pVSV208).
    1. התאימו את ההגדלה כך שהנקודה תהיה ממוקדת.
    2. באמצעות אור עירור המתאים ולסנן כדי להתבונן GFP, להתאים את זמן החשיפה כך רק הזריחה מן הכתם coincubation ניתן לזיהוי וכל זריחה רקע מהתקשורת הוא נמוך או לא גלוי.
    3. שנו את אור העירור והמסנן כדי להתבונן ב-RFP, כוונון זמן החשיפה כדי למזער את הרקע מהמדיום.
  3. עבור כל נקודת הדגירה של הטיפולים הניסיוניים, התמונה של זן התייחסות באמצעות מסנן GFP וזמן חשיפה נקבע בשלב 3.2.2.
  4. התמונה של זן המתחרה באמצעות מסנן RFP, כוונון זמן החשיפה כך שהקרינה הפלואורסצנטית רק מנקודת הדגירה של הקוקובציה והרקע של המדיום הוא מינימלי. שמור את שתי התמונות ואת שמם כדי לכלול גם את מזהי המתח, את מספר השכפול, את זמן הדגירה כאשר התמונה צולמה (למשל, 24 שעות). חזור על הפעולה עבור כל המשכפלת.
    הערה: הזמן coincubation יכול להיות צריך להיות מותאם עבור פלמידים שונים או מינים חיידקיים. ראה דיון למיטוב.

4. ניתוח נתונים

  1. חישוב של CFUs עבור כל שליטה וטיפול ניסיוני בכל זמן (התחלה T סופי)
    1. לאחר שהמושבות נראות לעין על לוחיות הדילול הסדרתיות (למשל, 24 שעות ב -24 ° c עבור V. פישרי), לזהות את גורם הדילול שבו ניתן לספור מושבות בודדות ולא לגדול ביחד לתוך אשכולות גדולים, רב מושבות (איור 2b). עבור כל שכפול, לספור ולתעד את מספר המושבות הבודדות עבור דילול נתון. מספר זה מייצג את ה-CFUs עבור השכפול.
    2. המרת הדפוס לדילול הכולל של כל מאמץ באמצעות הנוסחה להלן:
      * X vol. של המדגם הבלתי מדולל = סה כ הפוס
      דוגמה: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0.005 mL)] x [0.01 mL] = 1.2 E7 סך כל הדפוס של זן 1 במקום המעורב בתחילת הניסוי
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0.005 mL)] x [1.0 mL] = 8.0 הסכום הכולל של מאמץ 1 בנקודה מעורבת לאחר 5 שעות הדגירה
      ערכי CFU לכל מאמץ בכל נקודת זמן הם נתונים גולמיים שניתן להשתמש בהם עבור מספר ניתוחים שונים ובדיקות סטטיסטיות (ראה סעיף 4.2 להלן).
  2. בצע את המרות הנתונים הבאים כדי לקבוע אם מתח מתחרה מתחרה במתח ההפניה על-ידי: (i) קביעה אם הפרופורציה של מאמץ ההפניה פוחתת בנוכחות המתח המתחרה, או (ii) חישוב ה לרשום אינדקס תחרותי יחסי (RCI). מנתח אלה להמיר נתונים גולמיים לתוך יחסי והוא יכול להיות שימושי כדי לקבוע את התוצאה התחרותית של אינטראקציה, אבל לא יכול לקבוע את המנגנון של התחרות (כלומר, הריגת לעומת עיכוב הצמיחה).
    1. חישוב הפרופורציה של כל מאמץ לכל נקודת זמן במהלך הדגירה
      1. המרת נתוני CFU לפרופורציה של כל זן בטיפול. עבור זן ההפניה (RS) ב-T0, חלק את ה-CFUs הכולל למתח הייחוס ב-T0 על-ידי סכום הסיכום הכולל של מאמץ ההפניות והמתחרה (CS) ב-T0:
        ר'T0 (ר'T0 cfus + הפקולטה למדעי העניינים) = חלק ממתח הייחוס בT0.
        בצע את אותו חישוב כדי לקבוע את שיעור המתח של המתחרה ב-T0:
        הפקולטה למדעיהT0 (ר'T0 Cfus + csT0 cfus) = חלק ממתח הייחוס בT0
        חזור על תהליך זה עבור כל נקודת זמן ולשכפל עבור שני הטיפול הניסיוני ואת הטיפול בקרת (דיפרנציאלי-מתויג התייחסות להתאמץ החומר הדגירה).
      2. גרף החלק הממוצע של כל סוג זן ב T0 ו T5 בגרף עמודות מוערמות (איור 3A).
      3. ודא שהיחס ההתחלתי הרצוי של זנים התקבל. עבור coincubations איפה זנים היו בתחילה מעורב 1:1, כל סוג זן צריך לכלול ~ 0.5 של האוכלוסייה ב T0 ולא צריך להיות מבחינה סטטיסטית שונה זה מזה באמצעות מבחן t של סטודנט (P > 0.05). אם הפרופורציה של זן אחד היא גדולה באופן משמעותי מזו של המתח השני ב T0, ולאחר מכן חזור על הניסוי עד להשגת יחס התחלתי של 1:1.
      4. קבע אם זן המתחרה כולל חלק גדול משמעותית מהאוכלוסייה לאחר 5 שעות. בצע מבחן t של סטודנט השוואת את הפרופורציה של כל זן בטיפול ניסיוני ב T0 ו T5. אם שיעור של זן מתחרה שונה באופן משמעותי מזה של זן ההתייחסות ב-T5 (P < 0.05), תוצאה זו מרמזת על תחרות המתח ייתכן שהתרחשו. . המשך לשלב 4.2.1.5
      5. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה הקטינה את הפרופורציה של זן ההתייחסות לאחר 5 שעות, לבצע מבחן t של סטודנט השוואת את הפרופורציה של זן ההפניה בפקד עם הפרופורציה של זן ההפניה ב טיפול ניסיוני (מתח התייחסות v מתחרה זן).
        הערה: אם החלק של מאמץ ההתייחסות הוא מבחינה סטטיסטית נמוכה יותר בטיפול ניסיוני יחסית לפקד (P < 0.05), המתח המתחרה הפחית באופן משמעותי את הפרופורציה של זן ההפניה לאחר 5 h ו התחרו מאמץ הייחוס.
    2. חישוב ערך RCI של יומן הרישום עבור כל טיפול (כולל הפקד)
      הערה: האינדקס התחרותי היחסי, או RCI, הוא ערך בודד המשווה את האופן שבו יחס הסיום של סוגי הזנים שונה מיחס ההתחלה. ערך ה-RCI משתנה ככזה שערך RCI של יומן רישום גדול מאפס מציין שמתח המתחרה (CS) מחוץ למתח ההפניה (RS), ערך RCI של יומן קטן מאפס מציין שמתח ההפניה התחרה במתח המתחרה וביומן הרישום RCI ערך אפס מעיד על כך שלא היתה התחרתה במתח.
      1. חשב ערכי RCI של יומן עבור כל פקד וטיפול ניסיוני באמצעות המשוואה הבאה:
        יומן רישום [(CST5 cfu ̧ rsT5 cfu) ̧ (csT0 cfu ̧ rsT0 cfu)] = התחבר rci
      2. ערכי ה-RCI של הגרף משתמשים בתיבה מופרדת & מגרש שפפם שבו נתונים מרוגרפים בכיוון האופקי (איור 3B).
      3. קבע אם כל טיפול היה שונה באופן משמעותי מאפס על-ידי ביצוע מבחן t של סטודנט המשווה בין ערכי RCI של היומן בכל טיפול (כולל הפקד) לערכת נתונים המשווה את אותו מספר של שכפול בערך אפס. אם ערכי RCI היומן עבור הטיפול הניסיוני הם מבחינה סטטיסטית גדול יותר מאפס (P < 0.05), אז המתח המתחרה החוצה את המתח ההפניה.
        הערה: הפקד לא צריך להיות מבחינה סטטיסטית שונה מאפס (P > 0.05), כי מתויג התייחסות באופן הדיפרנציאלי הם איזוגניים.
      4. בצע מבחן t של סטודנט כדי לקבוע אם ערכי הרישום של RCI עבור הטיפול הניסיוני היו גדולים באופן משמעותי מהפקד (P < 0.05). אם ערכי ה-RCI של היומן מהטיפול הניסיוני הם גדולים מבחינה סטטיסטית מטיפול הבקרה, המתח המתחרה החוצה את המתח ההפניה.
  3. בצע את הניתוח הסטטיסטי הבא כדי לקבוע את המנגנון שבו המתח מתחרה מתחרה את זן ההפניה: (אני) לנתח נתונים גולמיים CFU הכולל, או (ii) לבחון אחוז התאוששות של זן התייחסות. מנתח אלה יכול להיות מסורבל יותר כדי להציג ביחס לאלה משלב 4.2, אבל יזהה אם מתחרה מאמץ להערים על זן ההפניה על-ידי הגדלת אותו, עיכוב התייחסות מאמץ גדילה, או באופן פעיל ביטול זן ההפניה.
    1. ניתוח נתוני CFU כולל גולמיים
      1. גרף raw הכולל נתוני CFU עבור שני הזנים באמצעות מגרש פיזור משולב, כאשר משכפל מוצגים כנקודות נתונים בודדות (איור 4A). הצגת נתונים בקנה מידה של יומן רישום והוספת קו אופקי המציין את T0 CFUs הממוצע עבור שני הזנים.
      2. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה השפיע לרעה על מאמץ ההפניה, בצע בדיקה t של סטודנט השוואת מאמץ התייחסות CFUs עבור הבקרה וטיפולים ניסיוניים ב T5. אם מאמץ ההתייחסות CFUs בטיפול ניסיוני הם נמוך מבחינה סטטיסטית מאשר בפקד (P < 0.05), אז הנוכחות של זן המתחרה השפיעו באופן משמעותי את המתח ההפניה.
      3. כדי לקבוע אם הנוכחות של זן המתחרה או עכבות את הצמיחה של או ביטלה את המתח ההפניה, לבצע מבחן t של סטודנט השוואת זן ההפניה CFUs ב T0 ו T5 עבור השליטה והניסוי טיפולים.
        הערה: בהעדר מתחרה, זן ההתייחסות צריך להראות עלייה משמעותית ב-CFU בעת השוואת T0 ו-T5 לטיפול בבקרה. כאשר לנתח את הטיפול הניסיוני, אם ההתייחסות למתח CFUs ב T5 הם לא שונים מבחינה סטטיסטית לעומת T0 (P > 0.05), אז זן המתחרה עכבות את הצמיחה של זן ההתייחסות. אם התייחסות זן T5 CFUs נמוך באופן משמעותי מ T0 CFUs (P < 0.05), אז המתח המתחרה הרג את זן ההפניה.
    2. חישוב אחוז שחזור של זן ההפניה
      1. הפוך נתוני CFU כולל עבור זן ההפניה (RS) לנתוני שחזור אחוזים באמצעות המשוואה להלן:
      2. (RST5 cfus ̧ RST0 cfus) x 100 =% שחזור של זן ייחוס
      3. הצג את אחוז השחזור של זן ייחוס באמצעות גרף עמודות מופרד שבו כל סרגל מייצג את הפקד או הטיפול הניסיוני (איור 4B). הוסף קו מקווקו ב-y = 100 כדי לציין 100% שחזור של זן התייחסות (אין להגדיל או להקטין את המתח ההפניה CFUs מ-0 h עד 5 h).
      4. כדי לקבוע אם זן המתחרה השפיע באופן שלילי על מאמץ ההפניה, בצע בדיקה t של סטודנט השוואת מאמץ התייחסות אחוז שחזור לטיפול בבקרה לטיפול ניסיוני. אם אחוז השחזור הוא קטן באופן משמעותי מהפקד (P < 0.05), המתח המתחרה השפיע לרעה על זן ההפניה.
      5. כדי לזהות אם זן המתחרה עכבות את התפתחותם של או ביטלה את מאמץ ההפניה, בצע מבחן t של סטודנט השוואת התייחסות מאמץ שחזור לטיפול ניסיוני וערכת נתונים עם מספר זהה של הכפלת כל עם ערך של 100.
        הערה: אם הטיפול הניסיוני הוא לא שונה מבחינה סטטיסטית מ 100 (P > 0.05), אז זן המתחרה עכבות את הצמיחה של מאמץ ההתייחסות. אם זן ההתייחסות אחוז שחזור בטיפול ניסיוני הוא נמוך באופן משמעותי מ 100 (P < 0.05), אז המתח המתחרה הרג את זן ההפניה.
    3. פענוח תמונות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
      1. לאחר תמונות מיקרוסקופ הזריחה נלקחים, לקבוע אם כל זן הוא בעליל לזיהוי בנקודה coincubation. עבור בקרת coincubation (התייחסות זן pVSV102 + התייחסות זן pVSV208), הן GFP ו-RFP צריך להיות גלוי מנקודה coincubation אחת. אם זה לא המקרה, להגדיר את הניסוי שוב להבטיח זנים מתויגים כראוי coדגירה על לוחות ללא אנטיביוטיקה.
      2. עבור כל נקודת הדגירה הניסיונית, בדוק אם יש תוצאות אפשריות.
        הערה: אם זן המתחרה גלוי, אך זן ההפניה אינו מזוהה, המרמז שהמתחרה נהרג או עכבות את התפתחותם של מאמץ ההפניה. אם שני הזנים הם נוכחים אחיד מעורב (GFP ו RFP הנוכחי לאורך הנקודה coincubation), הנתונים האלה מצביעים על זן מתחרה לא להתחרות עם זן התייחסות ושני זנים יחד. אם שני הזנים הם נוכחים אבל הם מופרדים באופן מידי (מיקרומושבות של או GFP או RFP נמצאים לאורך הנקודה coincubation), כי מציע זן ההתייחסות זן מתחרה עשוי להיות מרתק אינטראקציות תחרותי ושינויים מאמץ ההפניה או יחס הקוגנציה הראשונית עשוי להידרש. עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים.

5. קביעה אם קשר גומלין תלוי במגע

הערה: אם אתה מגלה כי מאמץ אחד הורג או מעכב את מאמץ ההפניה, האינטראקציה עלולה להיות מאוד הדדית או תלוית קשר. כדי לקבוע אם האינטראקציה תלויה בקשר בין תאי תא, בצע שיטת דגירה כמתואר לעיל עבור שלבים 1-2 עם השינויים הבאים.

  1. בצע את שלבים 1.1-2.2.
  2. לאחר זנים הם מנורמלת, זנים נפרדים פיזית באמצעות מסנן ניטרוצלולוזה עם גודל 0.22 מילימטר הנקבוביות. זה גודל נקבובית מאפשר דיפוזיה של antimicrobials ומולקולות קטנות אבל מונע מגע פיזי בין התאים V. פישרי .
    הערה: אם האינטראקציה תלויה במגע תא תא, הפרדה של זן ההפניה מתוך מאמץ מתחרה עם המסנן צריך לחסל את ההרג או העכבות להתאמץ ומאמץ ההתייחסות לא צריך להפחית את CFUs. אם האינטראקציה אינה תלויה במגע תא תא, והיא מנגנון מאוד מונע, הפרדת הזנים לא צריכה למנוע את המתח המתחרה מלהרוג את מאמץ ההפניה.
    1. ספוט 5 מ ל של מתח ההתייחסות על מרכז מסנן וספוט 5 מ ל של מתח מתחרה על המרכז של מסנן אחר. מניחים את המסנן המכיל את המתח ההפניה על פני השטח של צלחת ליברות אגר. הצב את המסנן המכיל את זן המתחרה ישירות מעל המסנן עם המתח ההפניה.
      הערה: כל זן הוא הבחין על מסננים במקום הזן התחתון הבחין ישירות על הצלחת אגר כך זנים יכולים להיות בקלות רבה יותר ממוקם ישירות על גבי זה.
    2. אם יש חשש כי זנים אינם מוערמים ישירות על גבי זה, להקטין את עוצמת הקול של מאמץ התייחסות הבחין על המסנן. פעולה זו תבטיח את האזור של נקודת המתח ההפניה הוא קטן יותר ובאופן מלא מעל או מתחת למתח המתחרה. חלופה אשר המתח הוא על גבי ובתחתית כדי להסביר את ההבדלים בדיפוזיה של חומרים מזינים ממדיום אגר.
    3. כדי להבטיח את המסנן מאפשר דיפוזיה של מולקולות קטנות, כוללים טיפול בקרה שבו זן ההתייחסות הוא הבחין על מסנן ואנטיביוטיקה כי הוא רגיש (כלוראמננול) הוא הבחין על השני. מחסנית את המסננים ישירות אחד על השני ומניחים על צלחת ליברות אגר. אנטיביוטיקה צריך להיות מסוגל לפזר דרך המסנן וצריך להרוג את זן ההתייחסות.
  3. מודאת הצלחות עם מסננים ב 24 ° c עבור 5 h. אל להפוך את הצלחת אגר כאשר הדגירה כדי למנוע הזזת המסננים.
  4. בצעו דילול סדרתי לצורך ההתחלה בהתאם לשלב 2.4.
  5. לקיחת מדידות אחרונות
    1. שימוש בפינצטה סטרילית, העברת כל סט של מסננים לצינורית הבז 50 mL המכילה 5 מ ל של מרק ליברות. ודא כי המסננים מופרדים פיזית בתוך הצינור כדי לאפשר השעיה מלאה של כל סוג מאמץ.
    2. השהה מחדש את זני מסננים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עד המסננים ברורים של כל התאים. השתמש בפינצטה כדי לסובב את המסננים ולנקות את חומר התאים משני הצדדים. לעקר מלקחיים עם. אתנול בין דגימות
    3. בצע דילול סדרתי עבור הסופי T לפי שלב 2.5. בעת חישוב CFUs הכולל עבור T סופי, להתאים את "הנפח הכולל של מדגם לא מדולל" מ-1 מ ל ל 5 mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנאספו מתוך שיטת הדגירה, ניתן לזהות את התוצאה התחרותית של אינטראקציה ומנגנון האינטראקציה. כדוגמה, הניסויים הבאים בוצעו באמצעות V. פישרי בבודד. זנים מודדתיים המתעמדים אחד משני פלמיונים יציבים: pVSV102 ביטוי התנגדות kanamycin ' ו-GFP +, או pVSV208 ביטוי התנגדות כלוראמאנקול ו-DsRed +. בנתונים לדוגמה, זנים היו מעורבים ביחס 1:1 ו מודב על צלחות ליברות אגר עבור 5 h. כטיפול בקרת, גרסאות מתויגות הדיפרנציאלי של זן ההתייחסות היו coמודבטים אחד עם השני. הטיפולים הניסיוניים בוצעו עם זן התייחסות (מחסה pVSV102) או מתחרה זן 1 או מתחרה זן 2 (מחסה pVSV208). תרבויות של כל זן היו מוכנים, coמודבטים כפי שתוארו לעיל, כפי שמוצג באיור 1 ואיור 2.

באיור 3, נתונים שנותחו כדי לקבוע אם זן מתחרה 1 או 2 החוצה את מאמץ ההפניה מוצגים בשתי דרכים. באיור 3A, הפרופורציה של כל סוג מאמץ לכל נקודת זמן במהלך הניסוי חושבה לפי שלב 4.2.1. בטיפולים ניסיוניים, הנתונים לדוגמה להראות את המתח התייחסות ואת זן מתחרה 1 נמצאים בפרופורציה של 0.5 בתחילת (0 h) ולסיים (5 h) של הניסוי, אשר עקבי עם מה שנצפה בטיפול בקרת. נתונים אלה מראים את הפרופורציה של זנים לא שינוי לאחר 5 שעות הדגירה, ולכן לא נצפתה תחרות. לעומת זאת, כאשר זן ההתייחסות היה מודח עם זן מתחרה 2, זן ההתייחסות היה נוכח בפרופורציה של 0.5 בתחילת (0 h), ושיעור < 0.01 בסוף (5 h) של הניסוי, שהיה נמוך באופן משמעותי מהפקד טיפול (t-test של סטודנט: P < 0.001). נתונים אלה מצביעים על הפרופורציה של זן ההתייחסות ירד בנוכחות של זן מתחרה 2, ולכן מציע תחרות בין זן מתחרה 2 לבין זן ההפניה אירעה. יש ליישם ניתוח מסוג זה בעת קביעת האופן שבו שיעור הזנים בתוך הקהילה משתנה לאורך זמן, אך לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את המנגנון של האינטראקציה התחרותית, ולכן יש לשלבו עם ניתוח נוסף. לדוגמה, הפרופורציה של זן ההפניה ירידה בנוכחותם של זן מתחרה 2 יכול להיות מיוחס למספר סוגים של אינטראקציות: (אני) להתאמץ 2 גדל מהר יותר מאשר מאמץ התייחסות, (ii) מאמץ 2 מעכבות את הצמיחה של ההפניה זן, או (iii) להתאמץ 2 לחסל את מאמץ ההפניה דרך הריגת.

באיור 3B, האינדקס התחרותי היחסי של יומן הרישום (rci) היה מחושב עבור כל טיפול בהתאם לשלב 4.2.2. כאשר זן ההתייחסות היה מודבטים עם זן מתחרה 1, ערכי RCI יומן לא היו מבחינה סטטיסטית שונה מאפס או מהטיפול בבקרה (P > 0.05), המציעה תחרות בין זנים לא נצפתה. כאשר זן ההתייחסות היה מודרט עם זן מתחרה 2, עם זאת, ערכי RCI יומן היו גדולים באופן משמעותי מאפס את הטיפול בשליטה (t-test של סטודנט: P < 0.001). הנתונים האלה להציע להתאמץ 2 להערים על מאמץ התייחסות. ניתוח ערכי RCI של יומן הרישום מספק שיטה פשוטה כדי לקבוע אם מאמץ אחד חוצה את האחר במהלך תקופת הדגירה. בגלל ניתוח זה משלבת את היחס של זנים בסוף (5 h) ואת ההתחלה (0 h) של הניסוי, היחס ההתחלתי יכול להשפיע באופן דרמטי את התוצאה. לפיכך, יש לבדוק את יחס ההתחלה ולהיחשב כאשר נובעות מסקנות מנתוני היומן של RCI. יתר על כן, ניתוח זה אינו מספק מידע על מנגנון תחרותי ופשוט מדווח כיצד היחס של זנים לשנות במהלך הדגירה.

איור 4 מציג שתי שיטות של ניתוח נתונים כדי לקבוע את מנגנון התחרות עבור אינטראקציה נתונה. באיור 4A, מוצגים הוראות כולל לכל מאמץ בכל נקודת זמן של הניסוי. כאשר זן ההתייחסות היה מודקרת עם זן מתחרה 1, CFUs של שני זנים להגדיל על המסלול של 5 h ו-CFUs עבור זן התייחסות לא היו שונים באופן משמעותי מן המתח 1 או את השליטה ב 5 h (P > 0.05). נתונים אלה מצביעים על כך זן ההפניה גדל בנוכחות של זן 1, ולהציע שום תחרות לא התרחשה. עם זאת, כאשר זן ההתייחסות היה מודח עם זן מתחרה 2, מאמץ 2 CFUs עלה לאחר 5 שעות אבל CFUs עבור זן ההתייחסות ירד. מאמץ התייחסות CFUs היו נמוכים באופן משמעותי מאשר המתח 2 CFUs ואת השליטה ב 5 h (מבחן t של סטודנט: P < 0.002). נתונים אלה מציינים כי זן ההפניה CFUs ירידה בנוכחות של זן 2, ומציע מתח 2 הורג התייחסות תאים זן. אם זן ההתייחסות לא הראה ירידה ב-CFUs, אבל לא שינוי (אין הבדל סטטיסטי בין החומר התייחסות CFUs ב 0 h ו 5 h), הנתונים האלה היו מציעים להתאמץ 2 להערים על מאמץ התייחסות על ידי עיכוב הצמיחה של זן התייחסות. ניתוח נתונים שאינם משתנים CFU אינפורמטיבי במיוחד, כמו Cfu עבור שני הזנים בכל נקודת זמן מוצגים באופן עצמאי, ניתן להשתמש כדי לזהות את המנגנון של התחרות.

איור 4B מראה את אחוז ההחלמה של זן ההפניה כדי לקבוע כיצד הנוכחות של זן מתחרה משפיע על זן ההפניה. כאשר זן ההתייחסות היה מודבטים עם זן מתחרה 1, a ~ 3,200 אחוז התאוששות נצפתה, אשר לא היה שונה מבחינה סטטיסטית מהפקד ומציין זן 1 לא השפיע על אחוז ההתאוששות של זן ההפניה. כאשר זן ההתייחסות היה מודרט עם זן מתחרה 2, התאוששות ~ 4 אחוז נצפתה, אשר היה נמוך באופן משמעותי מהפקד (t-test של סטודנט: P < 0.002). ההתאוששות אחוז היה גם משמעותית פחות מ 100 (מבחן t של סטודנט: P < 0.002), המציין את המתח 2 להערים על זן התייחסות על ידי הרג התייחסות בתאי מאמץ. אם התאוששות אחוז לא היה מבחינה סטטיסטית שונה מ 100, הנתונים האלה היו מציעים מתח 2 עכבות את הצמיחה של זן התייחסות. אחוז שחזור נתונים מספק דרך פשוטה לאפיין את מנגנון התחרות על ידי בחינת כיצד אוכלוסיית מאמץ הייחוס מגיב לנוכחות של זן מתחרה. עם זאת, הצגת הנתונים בדרך זו כוללת מידע על יחס ההתחלה, כמו גם את האופן שבו שפע של זן המתחרה השתנה במהלך הדגירה.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה משלב את שיטת הדגירה. (A) חיידקים זנים מחסה או pVSV102 (זן הפניה הצביעו Ref. זן או R.S.) או pVSV208 (זן מתחרה המצוין Comp. מאמץ או ח פוגל) גדלים בנפרד על מדיה סלקטיבית עבור מאמץ ההפניה (ליברות קאן) או מתח מתחרה (מצלמת ליברות). זנים הם לאחר מכן מושעה מחדש ציר ליברות מנורמל כדי OD = 1.0. (ב) זן ההפניה והמתח המתחרה מעורבבים ביחס 1:1 על ידי נפח. דילול סדרתי מבוצע עם תערובת זו כדי לקבוע את הלחץ עבור שני זנים ב 0 h. (ג) תערובת הזנים הוא הבחין אז על לוחות 24-היטב המכיל ליברות אגר. כל שכפול מזוהה לתוך הבאר שלו. כתמים מותר להתייבש ולאחר מכן מודבטים ב -24 ° c עבור 5 h. לאחר 5 שעות, דילול סדרתי מבוצע לכמת את הדפוס עבור כל זן. (ד) התערובת הנבג מלוח B מזוהה גם על לוחיות פטרי של ליברות, מותר להתייבש ולהדגירה ב -24 ° c במשך 24 שעות. ב 24 h, הכתם coincubation הוא התמונה באמצעות מיקרוסקופ מבתר פלואורסצנטית כי הוא מותאם לזהות ירוק (התייחסות להתאמץ) אדום (זן מתחרה) זריחה. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מייצגות של צלחות הנדרשות לדילול סדרתי. (א) 96-צלחת משמשת ביצוע דילול סדרתי. הצלחת מסובבת כך יש 12 שורות 8 עמודות. מתארי של כל טיפול כוללים את הזנים המשמשים את הפלמידים שהם הנמל (למשל, התייחסות להתאמץ עם pVSV102 ומתחרה להתאמץ עם pVSV208) ואת מספר שכפול עבור כל שורה (R1, R2, R3, או 4). העמודה הראשונה היא הדגימה הבלתי מדוללת וכל עמודה מימין מייצגת דילול של 10 קיפולים מהעמודה הקודמת (פקטור דילול המפורט לעיל). (ב) ליברות אגר צלחת המשמש כדי לקבוע את ה-cfus עבור מאמץ התייחסות על לוחות ליברות קאן (למעלה) ולמתח מתחרה על לוחות מצלמת ליברות (למטה) מהטיפול הניסיוני. כל שורה היא אחת לשכפל בטיפול (למשל, R1) ואת מקדם הדילול של כל נקודה מפורטת בראש הצלחת. מספר ה-CFUs שנספר עבור כל שכפול מופיע מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נתונים לדוגמה להערכת אם זנים מתחרה outcompete את זן ההפניה. (A) שיעור של זנים coדגירה מחסה או pVSV102 (אפור כהה) או pVSV208 (אפור בהיר). R.S. מציין את זן ההפניה ו-ח פוגל מציין את המתח של המתחרה. קו אופקי מקווקו מציין חלק מ0.5. אסטריסק מציין את זן התייחסות שנעשו ביחס מבחינה סטטיסטית קטן יותר של האוכלוסייה מאשר זן המתחרה או התייחסות זן בפקד ב 5 h (מבחן t של סטודנט: P < 0.001); ns מציין שלא משמעותי (P > 0.05). (ב) התחבר לאינדקס תחרותי יחסית (rci) עבור coincubation assays. קו אנכי מקווקו מציין שיומן הרישום RCI = אפס. אסטריסק מציין כי ערך RCI יומן הוא גדול מבחינה סטטיסטית מאפס את הפקד (t-test של סטודנט: P < 0.001). קווי שגיאה מציינים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: נתונים לדוגמה לקביעת מנגנון התחרות. (A) סה כ ספירות cfu עבור coincubation בחני שבוצעה עם V. פישרי מבודד כי היו מתויגים באופן מהותי עם או pVSV102 או pVSV208. הדפוס נאסף בתחילת הניסוי (0 h) ואחרי הדגירה של 5 שעות. R.S. מציין את זן ההפניה ו-ח פוגל מציין זן מתחרה. קו אופקי מקווקו מציין את הממוצע 0 h CFUs עבור שני הזנים; כוכבית מציין מאמץ הפניה CFUs היו נמוך מבחינה סטטיסטית בטיפול ניסיוני ביחס לטיפול בקרת ב 5 h (t-test של סטודנט: P < 0.002). (ב) אחוז שחזור של זן ההפניה. קו מקווקו אופקי מציין 100% שחזור (ללא הגדלה או ירידה ב-CFUs); כוכבית מציין אחוז שחזור היה מבחינה סטטיסטית נמוך יותר מ 100% ואת הטיפול בשליטה (t-test של סטודנט: P < 0.002). קווי שגיאה מציינים את SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: נתונים לדוגמה עבור דגירה זמן ואופטימיזציה הדמיה. (א) סה כ החלק הראשון של המחקר להדגירה, היכן שנאסף בתחילת הניסוי (0 h), אחרי 5, 12 ו-24 שעות דגירה. R.S. מצביע על זן הפניה ו-C. S .2 מציין זן מתחרה 2. קו אופקי מקווקו מציין את הממוצע 0 h CFUs עבור שני הזנים; כוכביות לציין זן התייחסות CFUs היו מבחינה סטטיסטית נמוך בטיפול ניסיוני ביחס לטיפול בקרת בנקודת זמן נתונה (t-test של סטודנט: P < 0.002). קווי שגיאה מציינים את SEM. (B) תמונות מיקרוסקופית פלורסנט המתאימות לנתוני cfu בלוח A. סרגל שינוי גודל = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. נתונים לדוגמה עבור אופטימיזציה של יחס coincubation. ניסויים coincubation בוצעו בין זן ההתייחסות (R.S.) מחסה pVSV102 (ירוק, בשורה העליונה) ואת המתח מתחרה (ח פוגל) מחסה pVSV208 (אדום, שורה תחתונה) ותמונות מיקרוסקופ פלורסנט צולמו ב 24 h. (א) זנים היו מעורבים ביחס 1:1 או (ב) יחס 1:5 שבו מאמץ ההפניה, המכיל pVSV102, היה במיעוט על ידי זן המתחרה המכיל pVSV208. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקיים אחרים, כולל מבודד קליני וסביבתי. חשוב לציין כי מנגנונים תחרותיים לעתים קרובות מוסדר מותנה5,6,23,24,25,26,27 , 28, ובכך הבדלים קטנים בתנאי הצמיחה (למשל, טלטול לעומת תרבות עמידה, טמפרטורה, וכו ') וסוג מדיה (למשל, תוכן מלח) יכול להשפיע באופן דרמטי את התוצאות. לכן, מיטוב מצבי הדגירה סביר להניח הכרחי עבור זנים חיידקיים שונים, כמו גם מנגנונים תחרותיים שונים. מומלץ לבחור תנאי תרבות המשקפים בקפדנות את הסביבה הטבעית של הבודד. לדוגמה, coincubation שאומר בין V. פישרי זנים בוצעו עם מדיה ליברות ב 24 ° c, כדי לשקף את המליחות ואת הטמפרטורה של הסביבה הימית. עם זאת, חיידקים מסוימים הם מוכשרים באופן טבעי בסביבה שלהם27,28 , ולכן יכול לקחת את החומר הגנטי שפורסמו על ידי תאים ליsed במהלך אינטראקציות העוינת29. כדי למנוע העברת דנ א מסוג זה להשפיע על תוצאות coincubation, חשוב להשתמש בתנאים שאינם מקדמים יכולת או זנים שאינם מוכשרים, או באופן טבעי או באמצעות הפעלה של מכונות ספיגת DNA. יתר על כן, פרמטרים ניסיוניים כגון שלב צמיחת התאים, צפיפות התרבות, זמן דגירה, או להתחיל יחס המתח עשוי גם לדרוש אופטימיזציה עבור מינים חיידקיים שונים או מנגנונים תחרותיים. לדוגמה, צפיפות התרבות הראשונית תכתיב את כמות המגע של תא התא בין זנים, שיכולים להשפיע על יכולתם של חיידקים לפרוס מנגנונים תלויי-מגע של תחרות.

איור 5a מציג את תהליך אופטימיזציה של coincubation בחני אומר עם V. פישרי בודד. כאן, מגוון של זמני דגירה עבור אוסף CFU והדמיה מיקרוסקופ פלורסנט הוערכו כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור כל מדד להיות נאסף. CFUs נאספו מיד לאחר התערובת של זן התייחסות מתחרה מאמץ 2 נצפתה על לוחות ליברות אגר (0 h), ו CFUS מדידות ותמונות מיקרוסקופ פלורסנט נלקחו מיד ואחרי 5, 12, ו 24 h. נתונים אלה לדוגמה להדגיש את החשיבות של אופטימיזציה יסודית לפני הרישום כל המסקנות על האינטראקציה בין שני זנים. לדוגמה, שתי מסקנות שונות לגבי מנגנון האינטראקציה ניתן להסיק על בסיס כאשר הם נאספו: CFUs מ 5 או 12 h מצביעים על מאמץ 2 הרג את זן ההתייחסות, בעוד CFUs שנאסף 24 h מציע זן 2 מעכב את הצמיחה של מאמץ התייחסות.

הזמן האופטימלי עבור ויזואליזציה של כתמי coincubation באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עשוי להיות שונה מאשר הזמן האופטימלי לאוסף CFU. איור 5B מציג תמונות מיקרוסקופ פלורסנט של כתמי coincubation ב 0, 5, 12, ו 24 h. בשעה 0 ו -5 שעות, כתמי הדגירה אינם גלויים עם מיקרוסקופ פלורסנט. עבור תמונות שצולמו ב 12 h, שני הזנים בטיפול בשליטה גלויים, עדיין RFP (התייחסות זן מחסה pVSV208) הוא דימר בעיקר. בטיפול ניסיוני ב 12 h, זן מתחרה 2 גלוי (עדיין עמום) ואת זן ההתייחסות לא ניתן לזיהוי. הבדלים ספציפיים לזנים בין מבודד חיידקי יכולים להשפיע על הביטוי של חלבונים פלורסנט, ובכך בהירות של התאים במקום מעורב. מכיוון RFP הוא דימר בעיקר מאשר GFP בפקד, כתמים coincubation צריך להמשיך להיות מודקרת ולהיות התמונה שוב במועד מאוחר יותר. בתמונות שצולמו 24 שעות, שני זנים הם לזיהוי בעליל בהירות דומה בניסוי בקרת. ב הטיפול הניסיוני המאמץ 2 הוא גלוי בעוד זן ההתייחסות לא נצפתה בתוך ספוט coincubation. 15-24 h הדגירה זמן מספיק כדי להמחיש את gfp ו rfp עבור V. פישרי באמצעות היציבה פלמידים pVSV102 ו pVSV208, בהתאמה, אבל זמן הדגירה יכול להיות צריך להיות מותאם עבור פלמידים שונים או מינים חיידקיים. למרות הזמן האופטימלי עבור ויזואליזציה של כתמים coincubation ואיסוף נתונים cfu שונים, הדמיה ב 24 h היא דרך טובה לבצע אינטראקציות במהירות עבור V. פישרי, כי התוצאה שהושג הדמיה ב 24 h (היעד גלוי או לא) משקף את הנתונים הכמותיים עתירי הזמן המתקבלים מציפוי הדפוס ב -5 או 12 h.

היחס ההתחלתי יכול להשפיע באופן משמעותי את התוצאות, במיוחד כאשר הדגירה שני זנים מעכבות, וייתכן שיהיה צורך לכוונן לחשבון עבור זן הבדלים ספציפיים להרוג יעילות או קצב צמיחה. לדוגמה, איור 6a מציג תמונות מיקרוסקופ פלורסנט של ניסויים שבהם זן ההפניה היה coדגירה עם עצמו (שליטה) ושלושה V. פישרי אחרים מבודד החל ביחס 1:1. בנתונים אלה לדוגמה, זן ההפניה זוהה בעליל כאשר מודבטים עם עצמו, זן מתחרה 1, ואת זן מתחרה 3 אחרי 24 h. עם זאת, כאשר היחס ההתחלתי הותאמה 1:5 (כלומר, 50 mL של זן התייחסות מעורבב עם 250 mL של זן מתחרה) את המתח ההתייחסות מזוהה רק כאשר coדגירה עם עצמו ואת זן 1, המציין כי הן זן 2 ו להתאמץ 3 outcompete זן ההפניה. התאמה זו מונעת את קצב הצמיחה מהר יותר של זן ההתייחסות מטשטש את ההשפעה של כל מנגנוני תחרות התערבות שהוצגו על ידי זנים המתחרים. בהתבסס על התוצאות באיור 6a, יחס של 1:5 (מאמץ התייחסות: זן מתחרה) יש להשתמש כדי למסך זנים נוספים V. פישרי עבור היכולת להרוג את זן התייחסות.

פרוטוקול זה מפלה בין זנים coדגירה על ידי הזנים התיוג הדיפרנציאלי עם פלאמידים המכיל קאנאמיצין או הגנים ההתנגדות כלוראמננול. עם זאת, אנטיביוטיקה שונים או שיטות אחרות של בחירה עשויים להיות מתאימים יותר למינים חיידקיים שונים. שיטות אחרות עבור בחירה דיפרנציאלית יכולות לכלול: 1) ניצול זן/מינים ספציפיים הגביע עבור גורמי גדילה ספציפיים (למשל, DAP או thymidine), 2) דרישות הגידול המותנה (למשל, זן אחד גדל ב 37 ° c בעוד השני לא), או 3) סמנים בחירה נגדית לחסל או לעכב את התפתחותם של זן מתויג כאשר גדל תחת תנאים מתאימים כדי לבטא "להרוג" גן (g., Ccdb או sacb).

בחירת מאמץ ההפניה המתאים היא קריטית להשגת ולפענוח תוצאות שאינן מתקבלות בתוך הצורך בדגירה. זן התייחסות צריך להיות לומד היטב (כלומר, יש גוף רחב של ספרות מדעית), אין לו הריגה לכאורה או יכולת מעכבות, ובאופן אידיאלי יש גנום רצף. לדוגמה, זנים מסוימים של es, החיידק הקולי הם זנים שכיחים התייחסות לניסויים בקטריאליים בקטריאלי רבים30,31. עם זאת, E. coli לא יכול להיות רלוונטי אקולוגי עבור מנגנון תחרותי נתון או מתחרה, אשר יכול להשפיע על התוצאות. לדוגמה, חיידקים מסוימים אולי התפתחו מנגנונים במיוחד התמקדות מינים הקשורים מקרוב או מתחרים עבור נישה אקולוגית זהה המנגנון התחרותי שלהם לא יהיה יעיל נגד E. coli התייחסות זן.

לסיכום, השיטה המתוארת כאן מטרתה לספק גישה שונה ואיתנה להערכת אינטראקציות בין-בקטריאלי ותחרות. ניתן להחיל שיטה זו על בקטריות הרלוונטיות למחקר סביבתי או קליני, וניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנונים שונים של אינטראקציה בין חיידקים, שכבר לא היו ידועים או קשים לחקירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 149 תחרות הפרעות מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית aliivibrio פישרי אינטראקציות בין זנים אינטראקציות בין-מינים הריגה בין-חיידקית
המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין <em>vibrio פישרי</em> מבודד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter