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Immunology and Infection

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

I batteri codificano diversi meccanismi per impegnarsi in una competizione interbatterica. Qui, presentiamo un protocollo basato sulla cultura per caratterizzare le interazioni competitive tra gli isolati batterici e come influenzano la struttura spaziale di una popolazione mista.

Abstract

Questo manoscritto descrive un saggio di coincubazione basato sulla cultura per rilevare e caratterizzare le interazioni competitive tra due popolazioni batteriche. Questo metodo utilizza plasmidi stabili che consentono a ogni popolazione di essere etichettata in modo differenziale con capacità di resistenza agli antibiotici distinte e proteine fluorescenti per la selezione e la discriminazione visiva di ogni popolazione, rispettivamente. Qui, descriviamo la preparazione e la coincubazione dei ceppi Vibrio fischeri concorrenti, l'imaging a microscopia a fluorescenza e l'analisi quantitativa dei dati. Questo approccio è semplice, produce risultati rapidi e può essere utilizzato per determinare se una popolazione uccide o inibisce la crescita di un'altra popolazione e se la concorrenza è mediata attraverso una molecola diffusiva o richiede un contatto diretto tra le cellule. Poiché ogni popolazione batterica esprime una diversa proteina fluorescente, l'analizzatore consente la discriminazione spaziale delle popolazioni concorrenti all'interno di una colonia mista. Anche se i metodi descritti vengono eseguiti con il batterio simbiotico V. fischeri utilizzando condizioni ottimizzate per questa specie, il protocollo può essere adattato per la maggior parte degli isolati batterici culturable.

Introduction

Questo manoscritto delinea un metodo basato sulla cultura per determinare se due isolati batterici sono in grado di interazioni competitive. Quando si studiano le popolazioni miste, è importante valutare la misura in cui gli isolati batterici interagiscono, in particolare se gli isolati competono direttamente attraverso meccanismi di interferenza. La competizione di interferenza si riferisce alle interazioni in cui una popolazione inibisce direttamente la crescita o uccide una popolazione concorrente1. Queste interazioni sono importanti da identificare perché possono avere effetti profondi sulla struttura e sulla funzione di una comunità microbica2,3.

Meccanismi per la concorrenza microbica sono stati scoperti ampiamente in genomi di batteri provenienti da ambienti diversi tra cui batteri associati all'ospite e liberi viventi4,5,6,7 8,9. Una varietà di strategie di concorrenza sono state descritte10,11 compresi i meccanismi diffusibili, come le sostanze chimiche battericide1,12 e peptidi antimicrobici secreti13 , così come i meccanismi dipendenti dal contatto che richiedono il contatto cellulare per trasferire un effettore inibitorio nelle cellule bersaglio9,14,15,16,17 ,18.

Sebbene le coincubazioni basate sulla cultura siano comunemente utilizzate in microbiologia5,8,19, questo manoscritto descrive come utilizzare il saggio per caratterizzare il meccanismo della concorrenza, nonché suggerimenti per l'adattamento il protocollo per l'uso con altre specie batteriche. Inoltre, questo metodo descrive più approcci per l'analisi e la presentazione dei dati per rispondere a diverse domande sulla natura delle interazioni competitive. Sebbene le tecniche qui descritte siano state utilizzate in precedenza per identificare il meccanismo di uccisione interbatterico alla base della concorrenza intraspecifica tra ceppi simbiotici di batteri Vibrio fischeri coisolati19, sono adatti per molte specie batteriche, tra cui isolati ambientali e patogeni umani, e possono essere utilizzate per valutare meccanismi competitivi sia dipendenti dal contatto che diffusi. I passaggi del protocollo possono richiedere l'ottimizzazione per altre specie batteriche. Dato che più sistemi modello stanno espandendo i loro studi oltre all'uso di organismi isogenici per includere genotipi diversi10,16,20,21, questo metodo sarà una risorsa preziosa per i ricercatori che cercano di capire in che modo la concorrenza influisce sui sistemi multi-ceppo o multispecie.

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Protocol

1. Preparare le tensioni per Coincubation

  1. Scegli un ceppo di riferimento appropriato che servirà come bersaglio per la competizione batterica durante il saggio di coincubation. Vedere Discussione per le procedure consigliate per la selezione di un ceppo di riferimento e il modo in cui il ceppo di riferimento influirà sui risultati. In questo protocollo, ceppo V. fischeri ES114 servirà come ceppo di riferimento.
  2. Determinazione dei metodi di selezione e screening da utilizzare per distinguere tra gli isolati nella coincubation
    1. Tipicamente, trasformare ceppi con plasmidi stabili contenenti diversi geni di resistenza agli antibiotici (ad esempio kanamycin o cloramhenicol) da selezionare per ogni ceppo, così come i geni che codificano diverse proteine fluorescenti (ad esempio GFP o RFP) per visivamente tipi di ceppo distintivi nella cocultura.
      NOT: L'uso di plasmidi stabili è necessario perché se un ceppo perde il plasmide in assenza di selezione, i numeri di questo ceppo saranno sottovalutati quando quantificati e non saranno rilevabili visivamente utilizzando la microscopia a fluorescenza.
    2. Tag coincubated V. fischeri ceppi differenziale tale che un ceppo contiene il plasmidpVSV102, che esprime una proteina fluorescente verde (GFP) e resistenza alla kanamicina antibiotica (KanR), e il secondo ceppo contiene plasmide pVSV208, che esprime una proteina fluorescente rossa (dsRed) eresistenza al clorammidenico antibiotico (Cm R)22.
      NOT: Altre selezioni differenziali possono essere utilizzate per distinguere i ceppi di cubatura delle monete. Vedere Discussione per altri metodi.
    3. Includere il seguente controllo durante l'ottimizzazione iniziale del saggio coincubation per garantire che la selezione sia robusta. Piastrare ogni ceppo che è placcato in modo differenziale su piastre di agar contenenti l'antibiotico che deve selezionare contro di esso (cioè, ceppo piastra 1 su supporti che seleziona per ceppo 2, e viceversa).
  3. Due giorni prima dell'analisi della coincubazione, la deformazione di riferimento della striscia pVSV102, il ceppo di riferimento pVSV208 e ogni ceppo concorrente pVSV208 da -80 stock di cchi su piastre di agar LBS contenenti l'antibiotico appropriato (ad es., 100 g/mL di kanamycin o 2 g/mL cloramphenicol) e incubare durante la notte a 24 gradi centigradi. La selezione degli antibiotici è necessaria per garantire che tutte le cellule contengano il plasmide all'inizio dell'esperimento.
  4. Un giorno prima del saggio, scegliere e restreak quattro colonie individuali per tipo di ceppo (repliche biologiche) su piastre fresche di agar LBS con antibiotico appropriato e incubato durante la notte a 24 .
    NOT: Questo passaggio può richiedere l'ottimizzazione per altre specie batteriche, poiché possono essere necessari tempi di incubazione più lunghi o più brevi per ottenere cellule sufficienti a seconda del tasso di crescita dell'organismo di interesse.

2. Coincubate ceppi batterici

  1. Preparazione di ogni ceppo batterico per l'incubazione (Figura 1A)
    1. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, raschiare le cellule dalla piastra di agar (quanto le dimensioni di un chicco di riso) e ri-sospendere le cellule in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1 mL di brodo LBS. Rompere i grumi delle cellule premendoli nel lato del tubo e pipetting su e giù vigorosamente.
    2. Pompiotrare il tubo e il vortice per 1-2 s. Se i grumi cellulari sono ancora visibili, continuare a vorticare o pipetta su e giù fino a quando il campione è visivamente uniforme.
    3. Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.2 per tutti i campioni.
  2. Misurare e registrare la densità ottica a 600 nm (OD600) per tutti i campioni. I campioni dovranno probabilmente essere diluiti fino a dieci volte utilizzando il brodo LBS per ottenere una misurazione OD accurata. Normalizzare ogni campione a OD600desiderato. I ceppi sono in genere normalizzati a un OD600 , che si traduce in 106 batteri / mL per V. fischeri.
    NOT: Questo passaggio può richiedere l'ottimizzazione per diverse specie batteriche come la densità delle cellule inoculo impatta risultati di coincubation a seconda del meccanismo di competizione. Vedere la discussione per l'ottimizzazione.
  3. Ceppidi cubatura di monete (Figura 1B, C)
    1. Mescolare la deformazione di riferimento e la deformazione concorrente in un rapporto 1:1 (v/v) aggiungendo 100 mL di ogni ceppo (normalizzato a OD 1.0) a un tubo di centrifuga da 1,5 mL etichettato. Come controllo, mescolare la deformazione di riferimento con una versione con tag differenziali di se stessa (deformazione di riferimento pVSV102 e deformazione di riferimento pVSV208). Questo controllo è necessario per una successiva analisi statistica per determinare se la presenza di una deformazione concorrente influisce sulla crescita del ceppo di riferimento. Vortice la coltura a ceppo misto per 1-2 s.
      NOT: Questo passaggio può richiedere l'ottimizzazione in quanto il rapporto iniziale può influire in modo significativo sui risultati e potrebbe essere necessario regolare. Vedere la discussione per l'ottimizzazione.
    2. Ripetere il passaggio 2.3.1 per ogni replica biologica. Dopo aver completato questa fase, dovrebbero esserci un totale di otto tubi a ceppo misto: quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento con tag differenziali (controllo) e quattro repliche biologiche con riferimento con tag differenziali e ceppi concorrenti ( sperimentale).
    3. Individuare 10 mL di ogni controllo e miscela sperimentale su piastre Petri contenenti agar LBS; questi punti di coltura saranno utilizzati per la microscopia a fluorescenza dopo l'incubazione.
    4. Lasciare asciugare completamente le macchie sul banco fino a quando tutto il liquido è stato assorbito nell'agar e incubare le piastre Petri a 24 gradi centigradi per 24 ore. Un minimo di 15 h è necessario per i ceppi di V. fischeri etichettati con pVSV102 e pVSV208 per crescere fino a una densità di cellule abbastanza alta per visualizzare GFP e RFP, rispettivamente, a livello di popolazione utilizzando un microscopio di dissecting a fluorescenza. Qui, usiamo un'incubazione di 24 h per l'imaging di macchie miste.
      NOT: È importante utilizzare piatti non troppo umidi o troppo asciutti. Se le piastre sono troppo umide, le macchie di coincubazione non saranno assorbite nella piastra di agar; evitare l'uso di piatti versati lo stesso giorno. Se le piastre sono troppo asciutte, possono formarsi piccole onde o crepe sulla superficie dell'agar, rendendo le macchie di coincubation irregolari.
    5. Utilizzando le stesse sospensioni batteriche del passo 2.3.3, individuare 10 mL di ogni controllo e miscele sperimentali in 24 pozzetti contenenti 1 mL di LBS agar per pozzo. Come nel passo 2.3.3, assicurarsi che l'agar in piastre 24-well ha l'umidità appropriata. Lasciare asciugare completamente le macchie e incubare a 24 gradi centigradi per 5 ore. Questi punti di coltura saranno utilizzati per quantificare le unità formanti colonia (CFU) per ogni ceppo alla fine dell'esperimento.
      NOT: Avvistare le sospensioni batteriche per la crescita nei singoli pozzi consente una più facile sospensione nel punto finale. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando pezzi di filtro sterili quadrati come approccio più economico all'utilizzo di piastre di 24 pozzetti. I pezzi quadrati del filtro sterile possono essere posizionati su una piastra di agar e 10 mL di ogni miscela sperimentale possono essere individuati su questi filtri, piuttosto che su piastre da 24 pozzetti. Dopo il tempo di coincubation, i filtri possono essere trasferiti in un tubo di centrifuga di 1,5 mL e il punto di coincubazione può essere risospeso vortice o pipetting su e giù. Un tempo di incubazione di 5 h è sufficiente per rilevare l'uccisione interbatterica tra V. fischeri isola19, tuttavia, questo tempo di coincubazione potrebbe essere necessario essere più breve o più lungo per altre specie o meccanismi competitivi. Vedere la discussione per ulteriori dettagli.
  4. Diluizione seriale per l'avvio dell'inoculum
    1. Per eseguire una diluizione seriale di miscele di coincubazione iniziali, ruotare una piastra di 96 pozzetto di 90 gradi in modo che ci siano otto colonne e dodici righe. Ogni riga conterrà un campione della miscela non diluita nella prima colonna seguita da sette diluizioni seriali decuplate nei restanti pozze nella riga (Figura 2A).
    2. Etichettare ogni riga con l'ID deformazione, il numero di replica e l'ora (a partire da inoculum - T0). Etichettare le piastre di agar LBS integrate con l'antibiotico appropriato su cui individuare la serie di diluizione. Assicurarsi di identificare il ceppo per cui ogni piastra antibiotica sta selezionando.
    3. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 180 mL di brodo LBS ad ogni pozzo, lasciando la prima colonna vuota per la miscela di coincubation non diluita.
      NOT: I ricercatori possono scegliere di utilizzare la salina tampina tampina tamponata da fosfato (PBS) per risospendere i punti di coincubazione ed eseguire la diluizione seriale se si lavora con una specie batterica a crescita particolarmente rapida o in modo coerente grandi esperimenti in cui le diluizioni seriali possono richiedere molto tempo per eseguire. L'utilizzo di PBS in questi casi impedirà una significativa fuoriuscita di batteri durante il processo di esecuzione delle diluizioni seriali. Tuttavia, è importante essere coerenti con la soluzione utilizzata (ad esempio, PBS o LBS) in tutti gli esperimenti, indipendentemente dalle dimensioni o dalla durata.
    4. Utilizzando una pipetta a canale singolo da 200 mL, trasferire bene 100 mL della miscela di coincubation dal tubo alla prima colonna. Scartare la punta e ripetere per tutte le miscele di coincubation.
    5. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 mL dalla colonna 1 alla 2 e mescolare con la pipistratura su e giù. Scartare le punte e ripetere per ogni colonna in modo che entro la fine, ogni riga contiene una diluizione seriale decuplata della miscela di coincubazione iniziale.
      NOT: Essere coerenti con il numero di volte in cui le diluizioni vengono scandite su e giù. Ad esempio, premere la maniglia della pipetta cinque volte affinché ogni diluizione sia coerente in tutta la serie di diluizione.
    6. Utilizzando una pipetta multicanale dotata di otto punte, aspirare 5 mL da ogni pozzo in una serie di diluizione (cioè una fila di otto pozzetti) e spotrlo sulla piastra agar LBS che seleziona per il ceppo di riferimento (completato con kanamycin). Ripetere questo passaggio individuando la piastra selezionando per la ceppo concorrente (completata con cloramramenicol) (Figura 2B). Lasciare asciugare completamente le macchie prima di essere collocate nell'incubatrice.
      NOT: Gli stessi suggerimenti possono essere utilizzati per individuare una serie di diluizione di replica sulle piastre che selezionano per la deformazione di riferimento e concorrente, ma devono essere cambiate tra le repliche. Evitare di toccare l'estremità della punta pipetta per le piastre di agar LBS come questo può creare una depressione che può assomigliare a una colonia batterica e risultati di inclinazione durante il conteggio delle piastre. Se la punta tocca la piastra, prendere nota e non includere la depressione nei conteggi delle conote.
  5. Prendendo T misurazioni finali
    1. Dopo che i punti di coincubazione nelle piastre a 24 pozzetti sono stati incubati per 5 h a 24 gradi centigradi, aggiungere 1 mL di brodo LBS ad ogni pozzo e risospendere nuovamente le macchie di coincubation pipetting su e giù fino a quando tutte le cellule vengono risospese. Essere coerenti con il vigore in cui le cellule vengono risospese in tutte le repliche. Ad esempio, premere la maniglia della pipetta otto volte per sospendere completamente ogni campione.
    2. Una volta che ogni punto di raccolta delle monete viene risospeso, preparare una piastra da 96 pozzetto per una diluizione seriale e piastre di agar LBS con gli antibiotici appropriati su cui individuare la diluizione nello stesso modo come il passo 2.4.1.
    3. Eseguire i passaggi 2.4.2-2.4.6 per completare la diluizione seriale per le misurazioni finali T.
      NOT: Un importante controllo dovrebbe essere incluso durante l'ottimizzazione iniziale del saggio di coincubation. Alla fine del periodo di coincubation, placcare i ceppi misti su supporti che includono entrambi gli antibiotici. Nessuno dei due ceppi dovrebbe essere in grado di crescere a meno che 1) non si verifichi una mutazione spontanea, o 2) marcatori selezionabili vengono scambiati tra i ceppi.

3. Visualizzazione delle coincubazioni mediante la microscopia a fluorescenza

  1. Immagine di ogni punto di coincubation su LBS agar petri piastre da passi 2.3.3 e 2.3.4 utilizzando un microscopio stereo attrezzato per il rilevamento della fluorescenza verde e rossa, che corrispondono con le proteine di fluorescenza espresse sui plasmidi stabili.
  2. Iniziare prendendo immagini del punto di coincubazione di controllo (ceppo di riferimento pVSV102 - ceppo di riferimento pVSV208).
    1. Regolare l'ingrandimento in modo che il punto sia a fuoco.
    2. Utilizzando la luce di eccitazione e il filtro appropriati per osservare la GFP, regolare il tempo di esposizione in modo che solo la fluorescenza dal punto di coincubazione sia rilevabile e qualsiasi fluorescenza di fondo dal supporto sia bassa o non visibile.
    3. Modificare la luce di eccitazione e il filtro per osservare la richiesta di offerta, regolando il tempo di esposizione per ridurre al minimo lo sfondo dal mezzo.
  3. Per ogni punto di coincubazione dai trattamenti sperimentali, immagine per il ceppo di riferimento utilizzando il filtro GFP e il tempo di esposizione determinato al punto 3.2.2.
  4. Immaginare la deformazione concorrente utilizzando il filtro RFP, regolando il tempo di esposizione in modo che la fluorescenza sia osservata solo dal punto di coincubazione e la fluorescenza di fondo dal mezzo è minima. Salvare entrambe le immagini e denominarle per includere entrambi gli ID di deformazione, il numero di replica, il tempo di incubazione in cui è stata scattata l'immagine (ad esempio, 24 h). Ripetere l'operazione per tutte le repliche.
    NOT: Potrebbe essere necessario regolare il tempo di coincubazione per diversi plasmidi o specie batteriche. Vedere la discussione per l'ottimizzazione.

4. Analisi dei dati

  1. Calcolo delle CFU per ogni controllo e trattamento sperimentale in ogni momento (inizio T e Finale T)
    1. Una volta che le colonie sono visibili su piastre di diluizione seriali (ad esempio, 24 h a 24 gradi centigradi per V. fischeri), identificano il fattore di diluizione in cui le singole colonie possono essere conteggiate e non sono cresciute insieme in grandi cluster multicolonia (Figura 2B). Per ogni replica, contare e registrare il numero di singole colonie per una determinata diluizione. Questo numero rappresenta le CCU per la replica.
    2. Convertire Le CFU per la diluizione in CFU totali per ogni ceppo nella coincubazione utilizzando la formula seguente:
      [ CCU (fattore di diluizione x vol. di punto di diluizione)] x vol. del campione non diluito - CFU totali
      Esempio: T0: [(6 CFU) - (10-6 x 0.005 mL)] x [0,01 mL] : 1,2E7 CFU totali di ceppo 1 nel punto misto all'inizio dell'esperimento
      T5: [(4 CFU) - (10-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] - 8,0E5 CBR totali di ceppo 1 nel punto misto dopo la coincubazione 5 h
      I valori CFU per ogni ceppo in ogni momento sono i dati grezzi che possono essere utilizzati per diverse analisi e test statistici (vedi sezione 4.2 di seguito).
  2. Eseguire le seguenti trasformazioni dei dati per determinare se un concorrente supera la deformazione di riferimento: (i) determinando se la proporzione della deformazione di riferimento diminuisce in presenza della deformazione concorrente, o (ii) calcolando il registro dell'indice concorrenziale relativo (RCI). Queste analisi convertono i dati grezzi in rapporti e possono essere utili per determinare l'esito competitivo di un'interazione, ma non possono determinare il meccanismo della concorrenza (cioè uccidere contro inibizione della crescita).
    1. Calcolo della proporzione di ogni ceppo per ogni punto temporale durante la coincubation
      1. Convertire i dati CFU nella proporzione di ogni ceppo in un trattamento. Per la deformazione di riferimento (RS) a T0, dividere le CPU totali per la deformazione di riferimento a T0 per la somma delle CFU totali per il ceppo di riferimento e del concorrente (CS) a T0:
        RPU RST0 (RCURS T0 - CCU CST0) - Proporzione di ceppo di riferimento a T0.
        Eseguire lo stesso calcolo per determinare la proporzione della deformazione concorrente a T0:
        CPU CST0 - (RCURS T0 - CCU CST0) - Proporzione di ceppo di riferimento a T0
        Ripetere questo processo per ogni punto temporale e replicare sia per il trattamento sperimentale che per il trattamento di controllo (coincubation di ceppo di riferimento con marcatura differenziale).
      2. Rappresentare graficamente la proporzione media di ogni tipo di deformazione in T0 e T5 in un grafico a barre in pila (Figura 3A).
      3. Assicurarsi che sia stato ottenuto il rapporto iniziale desiderato di ceppi. Per le concubazioni in cui i ceppi sono stati inizialmente mescolati 1:1, ogni tipo di ceppo deve comprendere 0,5 dollari della popolazione a T0 e non dovrebbe essere statisticamente diverso l'uno dall'altro utilizzando un test t dello Studente (P > 0,05). Se la proporzione di un ceppo è significativamente maggiore di quella dell'altro ceppo a T0, ripetere l'esperimento fino a raggiungere un rapporto iniziale 1:1.
      4. Determinare se il ceppo concorrente comprende una percentuale significativamente maggiore della popolazione dopo 5 h. Eseguire il test t di uno studente confrontando la proporzione di ogni ceppo nel trattamento sperimentale a T0 e T5. Se la percentuale di ceppo concorrente è significativamente diversa da quella del ceppo di riferimento a T5 (P < 0,05), questo risultato suggerisce che potrebbe essersi verificata una concorrenza di deformazione. Procedere al passaggio 4.2.1.5.
      5. Per determinare se la presenza della deformazione concorrente ha ridotto la proporzione della deformazione di riferimento dopo 5 h, eseguire un test t di Student confrontando la proporzione della deformazione di riferimento nel controllo con la proporzione della deformazione di riferimento trattamento sperimentale (ceppo di riferimento contro ceppo concorrente).
        NOTA: se la proporzione del ceppo di riferimento è statisticamente inferiore nel trattamento sperimentale rispetto al controllo (P < 0,05), la deformazione concorrente ha ridotto significativamente la proporzione del ceppo di riferimento dopo 5 h e superato il ceppo di riferimento.
    2. Calcolo del valore RCI del registro per ogni trattamento (compreso il controllo)
      NOT: L'indice concorrenziale relativo, o RCI, è un singolo valore che confronta il modo in cui il rapporto finale dei tipi di deformazione differisce dal rapporto iniziale. Il valore RCI viene trasformato da log in modo che un valore RCI di log maggiore di zero indichi che la deformazione del concorrente (CS) ha superato la deformazione di riferimento (RS), un valore RCI di log inferiore a zero indica la deformazione di riferimento che ha superato la deformazione del concorrente, e un log RCI valore pari a zero indica che nessuno dei due ceppi è stato superato.
      1. Calcolare i valori RCI di log per ogni controllo e trattamento sperimentale utilizzando la seguente equazione:
        Registro [(CST5 CFU - RST5 CCU) (CST0 CFU RST0 CCU)]
      2. Grafici registrano i valori RCI utilizzando una casella separata e i baffi tracciano dove i dati sono rappresentati graficamente nella direzione orizzontale (Figura 3B).
      3. Determinare se ogni trattamento era significativamente diverso da zero eseguendo il test t di uno studente confrontando i valori RCI di log di ogni trattamento (incluso il controllo) con un set di dati che confronta lo stesso numero di repliche tutte con un valore zero. Se i valori RCI di log per il trattamento sperimentale sono statisticamente maggiori di zero (P < 0,05), la tensione del concorrente ha superato la deformazione di riferimento.
        NOT: Il controllo non deve essere statisticamente diverso da zero (P > 0,05), perché i ceppi di riferimento contrassegnati in modo differenziale sono isogenici.
      4. Eseguire un test t di Student per determinare se i valori RCI di log per il trattamento sperimentale erano significativamente maggiori del controllo (P < 0,05). Se i valori RCI di tronchi del trattamento sperimentale sono statisticamente maggiori del trattamento di controllo, il ceppo concorrente ha superato il ceppo di riferimento.
  3. Eseguire la seguente analisi statistica per determinare il meccanismo con cui il concorrente esegue la deformazione di riferimento: (i) analizzare i dati CFU totali grezzi o (ii) esaminare il recupero percentuale della deformazione di riferimento. Queste analisi possono essere più ingombranti da vedere rispetto a quelle del passo 4.2, ma identificheranno se la tensione concorrente supera la varietà di riferimento superando la crescita, inibendo la crescita della deformazione di riferimento o eliminando attivamente la deformazione di riferimento.
    1. Analisi dei dati CFU totali non elaborati
      1. Grafico dei dati CFU totali non elaborati per entrambi i ceppi che utilizzano un grafico a dispersione interfogliato, in cui le repliche vengono visualizzate come singoli punti dati (Figura 4A). Visualizzare i dati su una scala di log e aggiungere una linea orizzontale che indica le FFU T0 medie per entrambi i ceppi.
      2. Per determinare se la presenza del ceppo concorrente ha influenzato negativamente il ceppo di riferimento, eseguire un test t di Student confrontando le FFU di deformazione per il controllo e i trattamenti sperimentali a T5. Se il ceppo di riferimento FFU nel trattamento sperimentale è statisticamente inferiore a quello del controllo (P < 0,05), la presenza del ceppo concorrente ha influenzato in modo significativo il ceppo di riferimento.
      3. Per determinare se la presenza del ceppo concorrente ha inibito la crescita o eliminato il ceppo di riferimento, eseguire un test t di Student confrontando il ceppo di riferimento CFU a T0 e T5 per il controllo e i trattamenti sperimentali.
        NOT: In assenza di un concorrente, il ceppo di riferimento dovrebbe mostrare un aumento significativo della CFU quando si confrontano T0 e T5 per il trattamento di controllo. Quando si analizza il trattamento sperimentale, se il ceppo di riferimento CFU a T5 non sono statisticamente diversi rispetto a T0 (P > 0,05), allora il ceppo concorrente ha inibito la crescita del ceppo di riferimento. Se la deformazione di riferimento Le CFU Sono significativamente inferiori alle TFU (P< 0,05), la deformazione concorrente ha interrotto il ceppo di riferimento.
    2. Calcolo della percentuale di recupero del ceppo di riferimento
      1. Trasformare i dati CFU totali per la deformazione di riferimento (RS) in dati di recupero percentuale utilizzando l'equazione seguente:
      2. (RST5 CFUs - RST0 CCU) x 100 - % di recupero della deformazione di riferimento
      3. Visualizzare la percentuale di recupero del ceppo di riferimento utilizzando un grafico a barre separato in cui ogni barra rappresenta il controllo o il trattamento sperimentale (Figura 4B). Aggiungere una linea tratteggiata a y - 100 per indicare il recupero al 100% della deformazione di riferimento (nessun aumento o diminuzione della deformazione di riferimento CFU da 0 h a 5 h).
      4. Per determinare se il ceppo concorrente ha influenzato negativamente il ceppo di riferimento, eseguire un test t di Student confrontando la percentuale di recupero del deformazione di riferimento per il trattamento di controllo con il trattamento sperimentale. Se il recupero percentuale è significativamente inferiore al controllo (P < 0,05), la sollecitazione del concorrente ha influenzato negativamente la sollecitazione di riferimento.
      5. Per identificare se il ceppo concorrente ha inibito la crescita o eliminato il ceppo di riferimento, eseguire un test t di Student confrontando il recupero percentuale di deformazione di riferimento per il trattamento sperimentale e un set di dati con lo stesso numero di repliche valore di 100.
        NOT: Se il trattamento sperimentale non è statisticamente diverso da 100 (P > 0,05), il ceppo concorrente ha inibito la crescita del ceppo di riferimento. Se il recupero percentuale di ceppo di riferimento nel trattamento sperimentale è significativamente inferiore a 100 (P < 0,05), allora il ceppo concorrente ha ucciso il ceppo di riferimento.
    3. Interpretazione delle immagini di microscopia a fluorescenza
      1. Una volta scattate le immagini della microscopia a fluorescenza, determinare se ogni ceppo è visibilmente rilevabile nel punto di coincubazione. Per la coincubazione di controllo (ceppo di riferimento pVSV102 - ceppo di riferimento pVSV208), sia GFP che RFP dovrebbero essere visibili da un punto di coincubazione. In caso contrario, impostare nuovamente l'esperimento assicurando che i ceppi siano etichettati correttamente e concubati su piastre senza antibiotici.
      2. Per ogni punto sperimentale di raccolta delle monete, verificare la presenza di possibili esiti.
        NOT: Se la deformazione del concorrente è visibile, ma la deformazione di riferimento non viene rilevata, ciò suggerisce che la deformazione concorrente ha ucciso o inibito la crescita della deformazione di riferimento. Se entrambi i ceppi sono presenti e uniformemente miscelati (GFP e RFP presenti in tutto lo spot di coincubation), questi dati suggeriscono che la deformazione concorrente non compete con il ceppo di riferimento ed entrambi i ceppi coesistono. Se entrambi i ceppi sono presenti ma sono separati spazialmente (le microcolonie di GFP o RFP sono presenti in tutto il punto di coincubation), ciò suggerisce che la deformazione di riferimento e la deformazione del concorrente possono essere impegnate in interazioni concorrenziali e modifiche il ceppo di riferimento o il rapporto di coincubazione iniziale. Vedere la discussione per ulteriori dettagli.

5. Determinare se l'interazione dipende dal contatto

NOT: Se si scopre che un ceppo uccide o inibisce il ceppo di riferimento, l'interazione può essere diffusiva o dipendente dal contatto. Per determinare se l'interazione dipende dal contatto cellulare-cellula, eseguire un'ipotesi di coincubation come descritto in precedenza per i passaggi 1-2 con le seguenti modifiche.

  1. Eseguire i passaggi 1.1-2.2.
  2. Una volta che i ceppi sono normalizzati, ceppi fisicamente separati utilizzando un filtro di nitrocellulosa con una dimensione porosa di 0,22 mm. Questa dimensione dei pori consente la diffusione di antimicrobici e piccole molecole, ma impedisce il contatto fisico tra le cellule Di. fischeri.
    NOT: Se l'interazione dipende dal contatto cellulare-cellula, la separazione del ceppo di riferimento dal ceppo concorrente con il filtro dovrebbe abrogare il fenotipo dell'uccisione o dell'inibitorio e il ceppo di riferimento non dovrebbe avere CFU ridotti. Se l'interazione non dipende dal contatto cellulare ed è un meccanismo diffuso, la separazione dei ceppi non dovrebbe impedire al ceppo concorrente di uccidere il ceppo di riferimento.
    1. Individuare 5 mL della deformazione di riferimento al centro di un filtro e spot 5 mL della ceppo concorrente sul centro di un filtro diverso. Posizionare il filtro contenente la deformazione di riferimento sulla superficie di una piastra di agar LBS. Posizionare il filtro contenente la deformazione concorrente direttamente sopra il filtro con la deformazione di riferimento.
      NOT: Ogni ceppo è individuato su filtri piuttosto che sulla deformazione inferiore macchiata direttamente sulla piastra di agar in modo che i ceppi possano essere posizionati più facilmente uno sopra l'altro.
    2. Se c'è preoccupazione che i ceppi non siano impilati direttamente l'uno sopra l'altro, diminuire il volume di deformazione di riferimento inoculum macchiato sul filtro. Ciò garantirà che l'area del punto di deformazione di riferimento sia più piccola e completamente al di sopra o al di sotto della deformazione concorrente. Alternare quale ceppo è in cima e in basso per spiegare le differenze nella diffusione dei nutrienti dal mezzo agar.
    3. Per garantire che il filtro consenta la diffusione di piccole molecole, includere un trattamento di controllo in cui il ceppo di riferimento viene individuato su un filtro e un antibiotico a cui è sensibile (cloramenico) viene individuato sull'altro. Impilare i filtri direttamente uno sopra l'altro e posizionare su una piastra LBS agar. L'antibiotico deve essere in grado di diffondersi attraverso il filtro e deve uccidere il ceppo di riferimento.
  3. Incubare le piastre con filtri a 24 gradi centigradi per 5 h. Non invertire la piastra di agar durante l'incubazione per evitare di spostare i filtri.
  4. Eseguire diluizioni seriali per l'inoculum iniziale in base al punto 2.4.
  5. Prendendo T misurazioni finali
    1. Utilizzando pinzette sterili, trasferire ogni set di filtri su un tubo Falcon da 50 mL contenente 5 mL di brodo LBS. Assicurarsi che i filtri siano fisicamente separati all'interno del tubo per consentire la sospensione completa di ogni tipo di deformazione.
    2. Risospendere i ceppi dai filtri pipettando su e giù fino a quando i filtri non sono liberati da tutte le celle. Utilizzare una pinzetta per ruotare i filtri e cancellare il materiale cellulare da entrambi i lati. Sterilizzare le pinzette con etanolo tra i campioni.
    3. Eseguire la diluizione seriale per Finale T secondo il punto 2.5. Quando si calcolano le CPU totali per T finale, regolare "volume totale del campione non diluito" da 1 mL a 5 mL.

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Representative Results

Al fine di valutare le interazioni competitive tra popolazioni batteriche, è stato sviluppato e ottimizzato un protocollo di analisi della coincubation per V. fischeri. Questo metodo utilizza plasmidi stabili che codificano geni di resistenza agli antibiotici e proteine fluorescenti, consentendo la selezione differenziale e la discriminazione visiva di ogni ceppo. Analizzando i dati raccolti dal saggio di coincubation, è possibile identificare l'esito competitivo di un'interazione e il meccanismo dell'interazione. Ad esempio, i seguenti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando isolare V. fischeri. Le varietà con cubatura di monete ospitavano uno dei due plasmidi stabili: pVSV102 che esprimeva la resistenza alla kanamica e la GFP, o pVSV208 che esprimeva resistenza al clorammidenico e DsRed. Nei dati di esempio, i ceppi sono stati miscelati in un rapporto 1:1 e incubati su piastre di agar LBS per 5 h. Come trattamento di controllo, le versioni contrassegnate in modo differenziale del ceppo di riferimento sono state concatenate tra loro. I trattamenti sperimentali sono stati eseguiti con il ceppo di riferimento (che ospita pVSV102) e con il ceppo concorrente 1 o con ceppo concorrente 2 (che ospita pVSV208). Le colture di ogni ceppo sono state preparate e coniate come descritto sopra e come mostrato nella Figura 1 e nella Figura 2.

Nella Figura 3, i dati analizzati per determinare se la tensione del concorrente 1 o 2 ha superato la deformazione di riferimento sono presentati in due modi. Nella figura 3A, la proporzione di ogni tipo di deformazione per ogni punto temporale durante l'esperimento è stata calcolata in base al passaggio 4.2.1. Nei trattamenti sperimentali, i dati del campione mostrano che il ceppo di riferimento e il ceppo concorrente 1 sono presenti a una proporzione di 0,5 all'inizio (0 h) e alla fine (5 h) dell'esperimento, che è coerente con quanto osservato nel trattamento di controllo. Questi dati mostrano che la proporzione dei ceppi non è cambiata dopo una coincubazione di 5 h, e quindi non è stata osservata alcuna concorrenza. Al contrario, quando la deformazione di riferimento è stata incubata con la deformazione concorrente 2, la deformazione di riferimento era presente a una proporzione di 0,5 all'inizio (0 h) e una proporzione <0.01 alla fine (5 h) dell'esperimento, che era significativamente inferiore al controllo trattamento (test t dello studente: P < 0.001). Questi dati indicano che la proporzione della deformazione di riferimento è diminuita in presenza di ceppo concorrente 2, e quindi suggeriscono la concorrenza tra la deformazione concorrente 2 e la tensione di riferimento si è verificata. Questo tipo di analisi dovrebbe essere applicato quando si determina come la proporzione di ceppi all'interno di una comunità cambia nel tempo, ma non può essere utilizzata per determinare il meccanismo dell'interazione competitiva, e pertanto dovrebbe essere combinata con un'analisi aggiuntiva. Ad esempio, la proporzione della deformazione di riferimento in diminuzione in presenza di ceppo concorrente 2 potrebbe essere attribuita a diversi tipi di interazioni: (i) la tensione 2 è cresciuta più rapidamente della deformazione di riferimento, (ii) la deformazione 2 ha inibito la crescita del riferimento ceppo 2 eliminato il ceppo di riferimento attraverso l'uccisione.

Nella figura 3B, l'indice concorrenziale relativo del log (RCI) è stato calcolato per ogni trattamento in base al passaggio 4.2.2. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 1, i valori di rcic di log non erano statisticamente diversi da zero o dal trattamento di controllo (P > 0,05), suggerendo che la concorrenza tra i ceppi non è stata osservata. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 2, tuttavia, i valori di log RCI erano significativamente maggiori di zero e il trattamento di controllo (test t di Student: P < 0.001). Questi dati suggeriscono che la tensione 2 ha superato la deformazione di riferimento. L'analisi dei valori RCI del log fornisce un metodo semplice per determinare se un ceppo ha superato l'altro durante il periodo di incubazione. Poiché questa analisi incorpora il rapporto di ceppi alla fine (5 h) e l'inizio (0 h) dell'esperimento, il rapporto iniziale può avere un impatto drammatico sul risultato. Pertanto, il rapporto iniziale dovrebbe essere esaminato e considerato quando si traeno conclusioni dai dati RCI di log. Inoltre, questa analisi non fornisce informazioni sul meccanismo competitivo e indica semplicemente come cambia il rapporto dei ceppi durante l'incubazione.

Nella figura 4 sono riportati due metodi di analisi dei dati per determinare il meccanismo di concorrenza per una determinata interazione. Nella Figura 4A,vengono visualizzate le CFU totali per ogni ceppo a ogni punto dell'esperimento. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 1, le CFU di entrambe le varietà aumentano nel corso di 5 h e le CTU per la deformazione di riferimento non erano significativamente diverse dalla deformazione 1 o dal controllo a 5 h (P > 0,05). Questi dati indicano che il ceppo di riferimento è cresciuto in presenza di ceppo 1, e suggeriscono che non si è verificata alcuna competizione. Tuttavia, quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 2, le CFU di sforzo 2 sono aumentate dopo 5 h, ma le CFU per la deformazione di riferimento sono diminuite. Le CFU di riferimento erano significativamente inferiori a quelle delle FFU di ceppo 2 e il controllo era di 5 h (test t di Student: P < 0,002). Questi dati indicano che le FFU di deformazione di riferimento diminuiscono in presenza di ceppo 2 e suggeriscono che la deformazione 2 uccide le cellule di deformazione di riferimento. Se la deformazione di riferimento non mostrasse una diminuzione delle CFU, ma piuttosto nessun cambiamento (nessuna differenza statistica tra Le FFU di deformazione di riferimento a 0 h e 5 h), questi dati suggerirebbero che la deformazione 2 superasse la deformazione di riferimento inibendo la crescita del ceppo di riferimento. L'analisi dei dati CFU totali non trasformati è particolarmente informativa, in quanto le CFU per entrambi i ceppi in ogni momento vengono visualizzate in modo indipendente e possono essere utilizzate per identificare il meccanismo di competizione.

La figura 4B mostra la percentuale di recupero del ceppo di riferimento per determinare in che modo la presenza di un ceppo concorrente influisce sulla deformazione di riferimento. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 1, è stato osservato un recupero di 3.200 per cento, che non era statisticamente diverso dal controllo e indica che la tensione 1 non ha influenzato il recupero percentuale del ceppo di riferimento. Quando il ceppo di riferimento è stato incubato con ceppo concorrente 2, è stato osservato un recupero del 4%, che è stato significativamente inferiore al controllo (test t di Student: P < 0.002). Il recupero percentuale è stato significativamente inferiore a 100 (test t di Student: P < 0,002), indicando che il ceppo 2 ha superato il ceppo di riferimento uccidendo le cellule di deformazione di riferimento. Se il recupero percentuale non fosse statisticamente diverso da 100, questi dati suggerirebbero che il ceppo 2 inibirebbe la crescita del ceppo di riferimento. I dati di recupero percentuale forniscono un modo semplificato per caratterizzare il meccanismo della concorrenza esaminando il modo in cui la popolazione di ceppo di riferimento risponde alla presenza di un ceppo concorrente. Tuttavia, la visualizzazione dei dati in questo modo esclude le informazioni sul rapporto di partenza e come l'abbondanza della tensione del concorrente è cambiata durante l'incubazione.

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso che illustra il saggio di coincubation. (A) I ceppi batterici che ospitano sia pVSV102 (ceppo di riferimento indicato Ref. Strain o R.S.) o pVSV208 (tensione concorrente indicata Comp. Strain o C.S.) vengono coltivati separatamente sui media selettivi per il ceppo di riferimento (LBS Kan) o pressione concorrente (LBS Cam). Le sollecitazioni vengono quindi risospese nel brodo LBS e normalizzate in un OD - 1,0. (B) La deformazione di riferimento e la deformazione concorrente sono mescolate ad un rapporto 1:1 per volume. Viene eseguita una diluizione seriale con questa miscela per determinare le CFU per entrambi i ceppi a 0 h. (C) La miscela di deformazione viene poi individuata su 24 piastre contenenti agar LBS. Ogni replica è avvistata nel proprio pozzo. Le macchie sono lasciate asciugare e poi incubate a 24 gradi centigradi per 5 h. Dopo 5 h, viene eseguita una diluizione seriale per quantificare le CFU per ogni ceppo. (D) La miscela di deformazione del gruppo B è anche avvistata sulle piastre LBS agar Petri lasciate asciugare e incubate a 24 gradi centigradi per 24 ore. A 24 h, lo spot di coincubazione viene immagine utilizzando un microscopio sezionato a fluorescenza che si adatta per rilevare la fluorescenza verde (ceppo di riferimento) e rosso (ceppo concorrente). Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini rappresentative delle lastre necessarie per una diluizione seriale. (A) Piastra 96-po ' utilizzata per eseguire la diluizione seriale. La piastra è ruotata in modo che ci siano 12 righe e 8 colonne. I descrittori di ciascun trattamento includono i ceppi utilizzati e i plasmidi che ospitano (ad esempio, ceppo di riferimento con pVSV102 e ceppo concorrente con pVSV208) e il numero di replica per ogni riga (R1, R2, R3 o R4). La prima colonna è il campione non diluito e ogni colonna a destra rappresenta una diluizione di dieci volte dalla colonna precedente (fattore di diluizione sopra elencato). (B) Piastra di agar LBS utilizzata per determinare le CFU per la deformazione di riferimento sulle piastre LBS Kan (in alto) e sulla varietà concorrente sulle piastre LBS Cam (in basso) dal trattamento sperimentale. Ogni riga è una replica in un trattamento (ad esempio, R1) e il fattore di diluizione di ogni punto è elencato nella parte superiore della piastra. Il numero di CCU conteggiati per ogni replica è elencato a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dati di esempio per valutare se le tensioni dei concorrenti superano la deformazione di riferimento. (A) La percentuale di ceppi di coniatura che ospitano pVSV102 (grigio scuro) o pVSV208 (grigio chiaro). R.S. indica la deformazione di riferimento e C.S. indica la deformazione concorrente. La linea orizzontale tratteggiata indica una proporzione di 0,5. L'asterisco indica che la deformazione di riferimento costituiva una percentuale statisticamente inferiore della popolazione rispetto alla deformazione o al ceppo di riferimento concorrente nel controllo a 5 h (test t di Student: P < 0,001); ns indica che non è significativo (P > 0,05). (B) Registrare l'indice concorrenziale relativo (RCI) per i saggi di coincubation. La linea verticale tratteggiata indica il log RCI - zero. Asterisk indica che il valore rcito è statisticamente maggiore di zero e il controllo (Student's t-test: P < 0.001). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Dati di esempio per determinare il meccanismo di concorrenza. (A) La CFU totale conta per i saggi di coincubation eseguiti con gli isolati di V. fischeri che sono stati etichettati in modo differenziale con pVSV102 o pVSV208. Le CFU sono state raccolte all'inizio dell'esperimento (0 h) e dopo 5 h di incubazione. R.S. indica il ceppo di riferimento e C.S. indica la deformazione concorrente. La linea orizzontale tratteggiata indica la media 0 h CFU per entrambi i ceppi; asterisco indica che il ceppo di riferimento delle FFU è stato statisticamente inferiore nel trattamento sperimentale rispetto al trattamento di controllo a 5 h (test t di Student: P < 0,002). (B) Percentuale di recupero della deformazione di riferimento. La linea tratteggiata orizzontale indica un recupero del 100% (nessun aumento o diminuzione delle CFU); l'asterisco indica che il recupero percentuale è stato statisticamente inferiore al 100% e il trattamento di controllo (test t di Student: P < 0,002). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Dati di esempio per il tempo di incubazione e l'ottimizzazione delle immagini. (A) Totale CFU per i saggi di coincubazione in cui sono stati raccolti i CFU all'inizio dell'esperimento (0 h), dopo l'incubazione di 5, 12 e 24 h. R.S. indica la deformazione di riferimento e C.S.2 indica la deformazione concorrente 2. La linea orizzontale tratteggiata indica la media 0 h CFU per entrambi i ceppi; gli asterischi indicano che le CFU di riferimento erano statisticamente inferiori nel trattamento sperimentale rispetto al trattamento di controllo al momento specificato (test t di Student: P < 0.002). Le barre di errore indicano le immagini di microscopia fluorescente SEM. (B) corrispondenti ai dati CFU nel pannello A. Barra di scala n. 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
come illustrato nella Figura 6. Dati di esempio per l'ottimizzazione del rapporto di coincubation. Sono stati effettuati esperimenti di coincubation tra il ceppo di riferimento (R.S.) che ospita pVSV102 (verde, fila superiore) e la deformazione concorrente (C.S.) che ospita le varietà pVSV208 (rosso, riga inferiore) e le immagini di microscopia fluorescente sono state scattate a ceppi di microscopia 24 h. (A) sono stati mescolati in un rapporto 1:1 o (B) un rapporto 1:5 in cui la deformazione di riferimento, contenente pVSV102, è stata in inferiorità numerica rispetto alla deformazione concorrente contenente pVSV208. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'analisi della coincubazione descritta sopra fornisce un potente metodo per scoprire la concorrenza interbatterica. Questo approccio ha permesso l'identificazione della concorrenza intraspecifica tra gli isolati di V. fischeri e la caratterizzazione del meccanismo competitivo19. Anche se il metodo descritto è stato ottimizzato per il batterio marino V. fischeri, può essere facilmente modificato per ospitare altre specie batteriche tra cui isolati clinici e ambientali. È importante notare che i meccanismi competitivi sono spesso regolati in modo condizionale5,6,23,24,25,26,27 , 28, quindi piccole differenze nelle condizioni di crescita (ad esempio, agitazione vs cultura in piedi, temperatura, ecc.) e il tipo di supporto (ad esempio, il contenuto di sale) possono influenzare notevolmente i risultati. Pertanto, è probabile che l'ottimizzazione delle condizioni di coincubazione sia necessaria per diverse specie batteriche e per diversi meccanismi competitivi. È meglio scegliere condizioni di coltura che riflettano da vicino l'ambiente naturale degli isolati. Ad esempio, i saggi di coincubation tra i ceppi di V. fischeri sono stati eseguiti con i media LBS a 24 gradi centigradi, per riflettere la salinità e la temperatura dell'ambiente marino. Tuttavia, alcuni batteri sono naturalmente competenti nel loro ambiente27,28 e quindi potrebbero assumere materiale genetico rilasciato da cellule lismizzate durante le interazioni antagoniste29. Per impedire che tale trasferimento di DNA influisca sui risultati della coincubazione, è importante utilizzare condizioni che non promuovano competenze o ceppi non competenti, né in modo naturale né attraverso l'inattivazione di macchinari di assorbimento del DNA. Inoltre, i parametri sperimentali come la fase di crescita cellulare, la densità della coltura, il tempo di incubazione o il rapporto di deformazione iniziale possono richiedere anche l'ottimizzazione per diverse specie batteriche o meccanismi competitivi. Ad esempio, la densità di coltura iniziale determinerà la quantità di contatto cellulare tra ceppi, che può influenzare la capacità dei batteri di implementare meccanismi di competizione dipendenti dal contatto.

Figura 5A mostra il processo di ottimizzazione dei saggi di coincubation con V. fischeri isola. In questo caso, è stata valutata una serie di tempi di incubazione per la raccolta della CFU e l'imaging microscopia fluorescente per determinare il tempo ottimale per ogni metrica da raccogliere. Le CFU sono state raccolte immediatamente dopo che la miscela del ceppo di riferimento e del ceppo concorrente 2 è stata avvistata su piastre di agar LBS (0 h), e le misurazioni CFU e le immagini microscopia fluorescente sono state scattate immediatamente e dopo 5, 12 e 24 h. Questi dati di esempio evidenziano l'importanza di un'ottimizzazione approfondita prima di trarre conclusioni sull'interazione tra due ceppi. Ad esempio, due diverse conclusioni sul meccanismo di interazione possono essere dedotte in base a quando vengono raccolte le CPU: le CPU da 5 o 12 h indicano che la ceppo 2 ha ucciso il ceppo di riferimento, mentre le CFU raccolte a 24 h suggeriscono che la tensione 2 inibisce la crescita del ceppo di riferimento.

Il tempo ottimale per la visualizzazione dei punti di raccolta delle monete attraverso la microscopia fluorescente può essere diverso dal momento ottimale per la raccolta CFU. Figura 5B mostra immagini microscopia fluorescente di punti di coincubation a 0, 5, 12 e 24 h. A 0 e 5 h, le macchie di coincubazione non sono visibili con microscopia fluorescente. Per le immagini scattate a 12 h, entrambi i ceppi nel trattamento di controllo sono visibili, ma l'RFP (ceppo di riferimento che ospita pVSV208) è notevolmente dimmer. Nel trattamento sperimentale a 12 h, il ceppo concorrente 2 è visibile (ancora dim) e il ceppo di riferimento non è rilevabile. Le differenze specifiche di deformazione tra gli isolati batterici possono influenzare l'espressione delle proteine fluorescenti, e quindi la luminosità delle cellule nel punto misto. Poiché la RFP è notevolmente dimmer rispetto a GFP nel controllo, i punti di coincubazione dovrebbero continuare ad essere incubati e essere ripresi in un secondo momento. Nelle immagini scattate a 24 h, entrambi i ceppi sono visibilmente rilevabili e ad una luminosità simile nell'esperimento di controllo. Nel ceppo di trattamento sperimentale 2 è visibile mentre il ceppo di riferimento non è osservato all'interno del punto coincubation. 15 - 24 h tempo di incubazione è sufficiente per visualizzare GFP e RFP per V. fischeri utilizzando plasmidi stabili pVSV102 e pVSV208, rispettivamente, ma il tempo di incubazione potrebbe essere necessario regolare per diversi plasmidi o specie batteriche. Anche se il momento ottimale per la visualizzazione di punti di raccolta delle monete e la raccolta di dati CFU sono diversi, l'imaging a 24 h è un buon modo per vagliare rapidamente le interazioni per V. fischeri, perché il risultato ottenuto dall'imaging a 24 h (il bersaglio è visibile o meno) dati quantitativi che richiedono un uso intensivo del tempo ottenuti dalle FCU placcatura a 5 o 12 ore.

Il rapporto iniziale può avere un impatto significativo sui risultati, in particolare quando si incubano due ceppi inibitori, e potrebbe essere necessario regolare per tenere conto delle differenze specifiche di sforzo nell'efficienza dell'uccisione o nel tasso di crescita. Ad esempio, la figura 6A mostra immagini microscopiche fluorescenti di esperimenti in cui il ceppo di riferimento è stato coincubato con se stesso (controllo) e altri tre isolati V. fischeri a partire da un rapporto 1:1. In questi dati di esempio, la deformazione di riferimento viene rilevata in modo visibilmente quando viene incubata con se stessa, la deformazione concorrente 1 e la deformazione concorrente 3 dopo 24 h. Tuttavia, quando il rapporto di partenza è stato regolato a 1:5 (cioè 50 mL di deformazione di riferimento mescolata con 250 mL di deformazione concorrente) la deformazione di riferimento viene rilevata solo in modo visibile quando si è coincubana con se stessa e la tensione 1, indicando che sia la deformazione 2 che la tensione 3 superano la il ceppo di riferimento. Questa regolazione impedisce che il tasso di crescita più rapido del ceppo di riferimento offusca l'effetto di qualsiasi meccanismo di concorrenza di interferenza mostrato dalle tensioni concorrenti. Sulla base dei risultati nella Figura 6A, un rapporto di 1:5 (ceppo di riferimento : ceppo concorrente) dovrebbe essere utilizzato per vagliare ulteriori ceppi V. fischeri per la capacità di uccidere il ceppo di riferimento.

Questo protocollo discrimina tra i ceppi di cubatura delle monete etichettando in modo differenziale i ceppi con plasmidi contenenti geni di resistenza della kanamicina o del cloramramenico. Tuttavia, diversi antibiotici o altri metodi di selezione possono essere più adatti per diverse specie batteriche. Altri metodi per la selezione differenziale potrebbero includere: 1) sfruttare un'auxotrophy specifica di ceppo/specie per fattori di crescita specifici (ad esempio, DAP o timidina), 2) requisiti di crescita condizionale (ad esempio, un ceppo cresce a 37 gradi centigradi mentre l'altro no), o 3) marcatori di controselezione che eliminano o inibiscono la crescita del ceppo marcato quando sono cresciuti in condizioni appropriate per esprimere un gene "uccidere" (ad esempio, ccdB o sacB).

La scelta del ceppo di riferimento appropriato è fondamentale per ottenere e interpretare i risultati riproducibili dal test di coincubation. Un ceppo di riferimento dovrebbe essere ben studiato (cioè avere un ampio corpo di letteratura scientifica), non avere apparenti capacità di uccisione o inibitoria e idealmente avere un genoma sequenziato. Ad esempio, alcuni ceppi di Escherichia coli sono ceppi di riferimento comuni per molti esperimenti di coincubation batterica30,31. Tuttavia, E. coli potrebbe non essere ecologicamente rilevante per un determinato meccanismo competitivo o concorrente, che può influenzare i risultati. Ad esempio, alcuni batteri potrebbero aver sviluppato meccanismi mirati specificamente a specie o concorrenti strettamente correlati per la stessa nicchia ecologica e il loro meccanismo competitivo non sarebbe efficace contro un ceppo di riferimento E. coli.

In sintesi, il metodo qui descritto mira a fornire un approccio facilmente modificato e robusto per valutare le interazioni interbatteriche e la concorrenza. Questo metodo può essere applicato agli isolati batterici rilevanti per la ricerca ambientale o clinica e può essere utilizzato per esplorare diversi meccanismi di interazione microbica che sono stati precedentemente sconosciuti o difficili da studiare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare i recensori per il loro feedback utile. A.N.S. è stato sostenuto dalla Gordon and Betty Moore Foundation attraverso Grant GBMF 255.03 alla Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologia e Infezione Numero 149 concorso di interferenza microscopia a fluorescenza Aliivibrio fischeri interazioni tra vincolo interazioni interspecie uccisione interbatterica
Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra <em>Vibrio fischeri</em> Isolates
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Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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