Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Coincubation analysen for kvantifisere konkurrerende interaksjoner mellom Vibrio fischeri isolerer

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Bakterier kode ulike mekanismer for å engasjere seg i interbacterial konkurranse. Her presenterer vi en kultur-basert protokoll for karakteriserer konkurransedyktige interaksjoner mellom bakteriell isolerer og hvordan de påvirker den romlige strukturen i en blandet befolkning.

Abstract

Dette manuskriptet beskriver en kultur BAS ert, coincubation analyse for å påvise og karakteriserer konkurrerende interaksjoner mellom to bakterie populasjoner. Denne metoden sysselsetter stabile plasmider som gjør at hver populasjon skal differensielt merket med distinkte antibiotikaresistens evner og fluorescerende proteiner for valg og visuell diskriminering av hver populasjon, henholdsvis. Her beskriver vi utarbeidelse og coincubation av konkurrerende Vibrio fischeri stammer, fluorescens mikroskopi Imaging, og kvantitativ dataanalyse. Denne tilnærmingen er enkel, gir raske resultater, og kan brukes til å avgjøre om en befolkning dreper eller hemmer veksten av en annen befolkning, og om konkurransen er formidlet gjennom et ekstremt molekyl eller krever direkte celle-celle kontakt. Fordi hver bakterie befolkning uttrykker et annet fluorescerende protein, tillater analysen den romlige diskriminering av konkurrerende populasjoner i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metodene utføres med symbiotisk bakterien V. fischeri ved hjelp av betingelser som er optimalisert for denne arten, kan protokollen tilpasses for de fleste culturable bakteriell isolat.

Introduction

Dette manuskriptet skisserer en kultur-basert metode for å avgjøre om to bakterielle isolerer er i stand til konkurransedyktige interaksjoner. Når man studerer blandede populasjoner, er det viktig å vurdere i hvilken grad bakteriell isolerer samhandle, spesielt om isolat er direkte konkurrerer gjennom forstyrrelser mekanismer. Interferens konkurransen refererer til interaksjoner der en befolkning direkte hemmer veksten eller dreper en konkurrent befolkning1. Disse interaksjoner er viktig å identifisere fordi de kan ha dyptgripende virkninger på en mikrobiell samfunnets struktur og funksjon2,3.

Mekanismer for mikrobiell konkurranse har blitt oppdaget grovt i genomer av bakterier fra ulike miljøer, inkludert både vert-assosiert og fri-levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En rekke konkurranse strategier har blitt beskrevet10,11 , inkludert ekstremt mekanismer, slik som bakteriedrepende kjemikalier1,12 og skilles ut antimikrobielle peptider13 , i tillegg til kontakt avhengige mekanismer som krever celle kontakt for å overføre en hemmende effektor til målcellene9,14,15,16,17 ,18.

Selv om kultur-baserte coincubations brukes ofte i mikrobiologi5,8,19, dette manuskriptet skisserer hvordan du bruker analysen til å karakterisere mekanismen av konkurransen, samt forslag for å tilpasse protokollen for bruk med andre bakteriearter. Videre beskriver denne metoden flere tilnærminger for å analysere og presentere data for å svare på ulike spørsmål om arten av konkurrerende interaksjoner. Selv om teknikkene som beskrives her ble brukt tidligere til å identifisere interbacterial drap mekanismen underliggende intraspesifikk konkurranse mellom symbiotisk stammer av coisolated Vibrio fischeri bakterier19, de er egnet for mange bakterielle arter, inkludert miljømessige isolerer og menneskelige patogener, og kan utnyttes til å evaluere både kontakt-avhengige og ekstremt konkurransedyktige mekanismer. Trinn i protokollen kan kreve optimalisering for andre bakterielle arter. Gitt at flere modellsystemer utvider sine studier utover bruk av isogenic organismer å inkludere ulike genotyper10,16,20,21, vil denne metoden være en verdifull ressurs for forskere som søker å forstå hvordan konkurransen påvirker multi-stamme eller multi-arter systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered stammer for Coincubation

  1. Velg en passende referanse stamme som vil tjene som mål for bakteriell konkurranse under coincubation analysen. Se diskusjon for gode fremgangsmåter når du velger en referanse belastning og hvordan referanse belastningen vil påvirke resultatene. I denne protokollen, V. fischeri stamme ES114 vil tjene som referanse belastning.
  2. Bestemme hvilke valg og screening metoder vil bli brukt til å skille mellom isolerer i coincubation
    1. Vanligvis transformere stammer med stabile plasmider inneholder ulike antibiotikaresistens gener (f. eks kanamycin eller kloramfenikol) for å velge for hver stamme, samt gener koding ulike fluorescerende proteiner (f. eks GFP eller RFP) for visuelt ulike belastningstyper i coculture.
      Merk: Bruk av stabile plasmider er nødvendig fordi hvis en belastning mister plasmider i fravær av valg, da denne belastningen er tall vil bli undervurdert når kvantifisert, og vil ikke bli visuelt synlig ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
    2. Tag coincubated V. fischeri stammer differensielt slik at en belastning inneholder plasmider pVSV102, som uttrykker et grønt fluorescerende PROTEIN (GFP) og resistens mot antibiotika kanamycin (kanR), og den andre belastningen inneholder plasmider pVSV208, som uttrykker et rødt fluorescerende protein (dsRed) og resistens mot antibiotika kloramfenikol (cmR)22.
      Merk: Andre differensial valg kan brukes til å skille coincubating stammer. Se diskusjon for flere metoder.
    3. Ta med følgende kontroll under første optimalisering av coincubation analysen for å sikre at valget er robust. Plate hver stamme som er differensielt tagget på agar plater som inneholder antibiotikaresistens som bør velge mot det (dvs. plate belastning 1 på medier som velger for stamme 2, og vice versa).
  3. To dager før coincubation analysen, stripe referanse belastning pVSV102, referanse belastning pVSV208, og hver konkurrent stamme pVSV208 fra-80 ° c aksjer på LBS agar plater som inneholder riktig antibiotika (f. eks, 100 μg/mL kanamycin eller 2 μg/mL kloramfenikol) og ruge over natten ved 24 ° c. Antibiotika er nødvendig for å sikre at alle cellene inneholder plasmider i begynnelsen av eksperimentet.
  4. En dag før analysen, plukke og restreak fire individuelle kolonier per stamme type (biologiske replikerer) på fersk LBS agar plater med passende antibiotika og inkubert over natten ved 24 ° c.
    Merk: Dette trinnet kan kreve optimalisering for andre bakterielle arter, som lengre eller kortere inkubasjons ganger kan være nødvendig å skaffe tilstrekkelige celler avhengig av vekstraten av organismen av interesse.

2. Coincubate bakteriell stammer

  1. Utarbeidelse av hver bakterie belastning for inkubasjons (figur 1a)
    1. Ved hjelp av en steril tannpirker, skrape cellene fra agar plate (så mye som størrelsen på et korn av ris) og re-suspendere cellene i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube inneholder 1 mL LBS buljong. Bryt opp celle klumper ved å trykke dem inn i siden av røret og pipettering opp og ned kraftig.
    2. Cap røret og Vortex for 1-2 s. Hvis cellen klumper fortsatt er synlige, fortsetter å Vortex eller pipette opp og ned til prøven er visuelt uniform.
    3. Gjenta trinn 2.1.1-2.1.2 for alle prøvene.
  2. Mål og registrere den optiske tettheten ved 600 NM (OD600) for alle prøvene. Prøvene vil sannsynligvis må fortynnes opp til ti-fold bruker LBS buljong for å få en nøyaktig OD måling. Normalisere hver prøve til ønsket OD600. Stammer er vanligvis normalisert til en OD600 ~ 1,0, som kan oversettes til ~ 106 bakterier/ml for V. fischeri.
    Merk: Dette trinnet kan kreve optimalisering for ulike bakterielle arter som inokulum celle tetthet virkninger coincubation resultater avhengig av mekanismen av konkurransen. Se diskusjon for optimalisering.
  3. Coincubating stammer (figur 1B, C)
    1. Bland referanse belastningen og konkurrent belastningen i et 1:1-forhold (v/v) ved å tilsette 100 mL av hver stamme (normalisert til OD 1,0) til et merket 1,5 mL sentrifugerør. Som en kontroll, bland referanse belastningen med en differensielt kodet versjon av seg selv (referanse belastning pVSV102 + referanse belastning pVSV208). Denne kontrollen er nødvendig for senere statistisk analyse for å fastslå om tilstedeværelsen av en konkurrent belastning påvirker veksten av referanse belastningen. Vortex den blandede belastningen kultur for 1-2 s.
      Merk: Dette trinnet kan kreve optimalisering som start forholdet kan påvirke resultatene og må kanskje justeres. Se diskusjon for optimalisering.
    2. Gjenta trinn 2.3.1 for hver biologiske replikere. Etter å ha fullført dette trinnet, bør det være totalt åtte blandet belastning rør: fire biologiske replikerer med differensielt-Tagged referansestammer (kontroll), og fire biologiske replikerer med differensielt-merket referanse og konkurrent stammer ( eksperimentell).
    3. Spot 10 mL av hver kontroll og eksperimentell blanding på Petri plater som inneholder LBS agar; disse kultur flekkene vil bli brukt til fluorescens mikroskopi etter inkubasjons.
    4. La flekkene tørke helt på benken til all væsken har blitt absorbert inn i agar og ruge de Petri platene ved 24 ° c for 24 h. Minimum 15 h er nødvendig for V. fischeri stammer merket med PVSV102 og pVSV208 å vokse til en høy nok celle tetthet for å visualisere GFP og RFP, henholdsvis på befolkningsnivå ved hjelp av en fluorescens dissekere mikroskop. Her bruker vi en 24 h inkubasjons for Imaging blandede flekker.
      Merk: Det er viktig å bruke plater som ikke er for fuktige eller for tørre. Hvis platene er for fuktig, vil coincubation flekker ikke bli absorbert inn i agar plate; unngå å bruke platene helles på samme dag. Hvis platene er for tørre, små bølger eller sprekker kan danne på agar overflaten, noe som gjør coincubation flekker uregelmessig i form.
    5. Ved hjelp av samme bakteriell suspensjoner som i trinn 2.3.3, spot 10 mL av hver kontroll og eksperimentelle blandinger i 24-brønn plater som inneholder 1 mL LBS agar per brønn. Som i trinn 2.3.3, sikre agar i 24-brønn platene har riktig fuktighet. La flekkene tørke helt og ruge ved 24 ° c i 5 timer. Disse kultur flekker vil bli brukt til å kvantifisere kolonien forming enheter (CFUs) for hver belastning på slutten av eksperimentet.
      Merk: Spotting bakteriell suspensjoner for vekst i enkelte brønner gir enklere blanding på slutten tidspunkt punkt. Dette trinnet kan oppnås ved hjelp av firkantet sterilt filter brikker som en mer økonomisk tilnærming til å bruke 24-brønn plater. Firkantet sterilt filter brikker kan plasseres på en agar plate og 10 mL av hver eksperimentell blanding kan bli oppdaget på disse filtrene, snarere enn på 24-brønn plater. Etter coincubation tid kan filtrene overføres til et 1,5 mL sentrifugerør og coincubation punktet kan resuspendert ved virvlingen eller pipettering opp og ned. En 5 h inkubasjonstid er nok til å oppdage interbacterial drap mellom V. fischeri isolerer19, men denne coincubation tiden må kanskje være kortere eller lengre for andre arter eller konkurrerende mekanismer. Se diskusjonen for flere detaljer.
  4. Seriell fortynning for start inokulum
    1. For å utføre en seriell fortynning av Start coincubation blandinger, Roter en 96-brønn plate 90 ° slik at det er åtte kolonner og tolv rader. Hver rad vil inneholde et utvalg av ufortynnet blanding i den første kolonnen etterfulgt av 7 10-fold seriell fortynninger over de resterende brønnene i raden (figur 2a).
    2. Merk hver rad med belastnings-ID, replikere nummer og klokkeslett (starter inokulum = T0). Label LBS agar platene supplert med riktig antibiotikum som å få øye på fortynning serien. Sørg for å identifisere hvilken belastning hver antibiotika plate er å velge for.
    3. Bruke en flerkanals pipette, tilsett 180 mL av LBS buljong til hver brønn, slik at den første kolonnen tom for ufortynnet coincubation blanding.
      Merk: Forskere kan velge å bruke fosfat bufret saltvann (PBS) til å resuspend coincubation flekker og utføre seriell fortynning hvis du arbeider med en spesielt raskt voksende bakteriearter eller konsekvent utføre store eksperimenter der seriell fortynninger kan ta lang tid å utføre. Bruke PBS i disse tilfellene vil hindre betydelig utvekst av bakterier under prosessen med å utføre seriell fortynninger. Det er imidlertid viktig å være konsekvent med hvilken løsning som brukes (for eksempel PBS eller LBS) på tvers av alle eksperimenter, uavhengig av størrelse eller varighet.
    4. Ved hjelp av en 200 mL enkeltkanals pipette, Overfør 100 mL av den coincubation blandingen fra røret til den første søylen godt. Kast tuppen og gjenta for alle coincubation blandinger.
    5. Bruk en flerkanals pipette, og Overfør 20 mL fra spalte 1 til 2 og bland ved pipettering opp og ned. Forkast tips og gjenta for hver kolonne slik at på slutten, hver rad inneholder en ti-fold seriell fortynning av den første coincubation blandingen.
      Merk: Være forenlig med det antallet av timene fortynninger er Pipet tert opp og ned. Du kan for eksempel trykke ned pipette håndtaket fem ganger for hver fortynning for å være konsekvent i hele fortynning-serien.
    6. Ved hjelp av en flerkanals pipette utstyrt med åtte tips, aspirer 5 mL fra hver brønn i en fortynning serie (dvs. en rad av åtte brønner) og spot den på LBS agar plate som velger for referanse belastningen (supplert med kanamycin). Gjenta dette trinnet spotting på platen velge for konkurrenten belastningen (supplert med kloramfenikol) (figur 2b). La flekkene tørke helt før plassering i inkubator.
      Merk: De samme tipsene kan brukes til å oppdage en replikere fortynning serie på plater velge for referanse og konkurrent belastning, men må endres mellom replikerer. Unngå å berøre slutten av pipette spissen til LBS agar platene som dette kan skape en depresjon som kan ligne en bakteriell koloni og skew resultater under plate teller. Hvis spissen berører platen, lage et notat og ikke inkludere depresjon i kolonien teller.
  5. Ta T endelige målinger
    1. Etter coincubation flekker i 24-brønn platene har blitt inkubert for 5 t ved 24 ° c, tilsett 1 mL av LBS buljong til hver brønn og resuspend coincubation flekker ved pipettering opp og ned til alle cellene er resuspendert. Vær konsekvent med vigor der cellene er resuspendert på tvers av alle replikerer. Du kan for eksempel trykke ned pipette-håndtaket åtte ganger for å resuspend hvert eksemplar fullt ut.
    2. Når hver coincubation spot er resuspendert, utarbeide en 96-brønn plate for en seriell fortynning og LBS agar plater med riktig antibiotika som å få øye på fortynning på samme måte som trinn 2.4.1.
    3. Utfør trinn 2.4.2-2.4.6 for å fullføre den serielle fortynning for T endelige målinger.
      Merk: En viktig kontroll bør inkluderes ved første optimalisering av coincubation analysen. På slutten av coincubation perioden, plate blandede stammer på medier som omfatter både antibiotika. Verken belastning bør være i stand til å vokse med mindre 1) en spontan mutasjon oppstår, eller 2) valgbar markører utveksles mellom stammene.

3. visualisere Coincubations bruke fluorescens mikroskopi

  1. Image hver coincubation flekk opp på LBS agar Petri tallerken fra skritt 2.3.3 og 2.3.4 benytter en stereoplaten mikroskop utstyrt med for grønn og rød fluorescens oppdagelsen, hvilke korresponderer med det fluorescens proteiner tilværelse uttrykt på stabile plasmider.
  2. Begynn med å ta bilder av kontroll coincubation punktet (referanse belastning pVSV102 + referanse belastning pVSV208).
    1. Juster forstørrelsen slik at punktet er i fokus.
    2. Bruke riktig eksitasjon lys og filter for å observere GFP, justere eksponeringstid slik at bare fluorescens fra coincubation stedet er synlig og eventuelle bakgrunns fluorescens fra Media er lav eller ikke synlig.
    3. Bytt eksitasjon lys og filter for å observere RFP, justere eksponeringstid for å minimere bakgrunnen fra mediet.
  3. For hver coincubation flekk fra de eksperimentelle behandlingene, bildet for referanse belastningen ved hjelp av GFP filter og eksponeringstid bestemmes i trinn 3.2.2.
  4. Image konkurrenten belastningen ved hjelp av RFP-filter, justere eksponeringstid slik at fluorescens er bare observert fra coincubation spot og bakgrunn fluorescens fra mediet er minimal. Lagre både bilder og navngi dem for å inkludere både belastning IDer, replikere nummer, den inkubasjonstiden da bildet ble tatt (f. eks 24 h). Gjenta for alle replikeres.
    Merk: Coincubation tid må kanskje justeres for ulike plasmider eller bakterielle arter. Se diskusjon for optimalisering.

4. data analyse

  1. Beregning av CFUs for hver kontroll og eksperimentell behandling ved hver timepoint (T-start og T-finalen)
    1. Når koloniene er synlige på serielle fortynning plater (f. eks 24 h ved 24 ° c for V. fischeri), identifisere fortynning faktor der enkelte kolonier kan telles og har ikke vokst sammen i store, multi-koloni klynger (figur 2b). For hver replikere, telle og registrere antall individuelle kolonier for en gitt fortynning. Dette tallet representerer CFUs for denne replikering.
    2. Konverter CFUs for fortynning til total CFUs for hver stamme i coincubation ved hjelp av formelen nedenfor:
      [CFUs ÷ (fortynning faktor x Vol. av fortynning spot)] x Vol. av ufortynnet prøven = totalt CFUs
      Eksempel: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0,005 mL)] x [0,01 mL] = 1.2 E7 totalt CFUs av belastning 1 i det blandede punktet i begynnelsen av eksperimentet
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8.0 E5 totalt CFUs 1 på blandet punkt etter 5 h coincubation
      CFU-verdiene for hver belastning på hvert tids punkt er rådata som kan brukes til flere ulike analyser og statistiske tester (se avsnitt 4,2 nedenfor).
  2. Utfør følgende data transformasjoner for å avgjøre om en konkurrent belastning outcompetes referanse belastningen ved å: (i) avgjøre om andelen av referanse belastningen avtar i nærvær av konkurrent belastningen, eller (II) beregning av log relativ konkurransedyktig indeks (RCI). Disse analysene konverterer rådata til prosenter og kan være nyttig for å bestemme det konkurransedyktige utfallet av en interaksjon, men kan ikke bestemme mekanismen for konkurranse (dvs. drap vs veksthemming).
    1. Beregning av andelen av hver belastning for hvert tidspunkt under coincubation
      1. Konverter CFU-data til andelen av hver belastning i en behandling. For referanse belastningen (RS) ved T0, deler du den totale CFUs for referanse belastningen ved T0 med summen av total CFUs for referanse belastningen og konkurrenten (CS) på T0:
        RST0 CFUs ÷ (RST0 CFUs + csT0 CFUs) = andel referanse belastning ved T0.
        Utfør samme beregning for å bestemme andelen av konkurrenten belastningen på T0:
        CST0 CFUs ÷ (RST0 CFUs + csT0 CFUs) = andel referanse belastning ved T0
        Gjenta denne prosessen for hver gang punkt og replikere for både eksperimentell behandling og kontroll behandling (differensielt-merket referanse belastning coincubation).
      2. Graf den gjennomsnittlige andelen av hver belastningstype på T0 og T5 i et stablet stolpediagram (figur 3a).
      3. Kontroller at ønsket Start ratio av stammer ble oppnådd. For coincubations hvor stammene i utgangspunktet var blandet med 1:1, bør hver belastningstype utgjøre ~ 0,5 av befolkningen på T0 og bør ikke være statistisk forskjellig fra hverandre ved hjelp av en student t-test (P > 0,05). Hvis andelen av en stamme er betydelig større enn den andre belastningen på T0, gjentar du eksperimentet til det oppnås et start forhold på 1:1.
      4. Bestem om konkurrenten belastningen omfatter en betydelig større andel av befolkningen etter 5 h. Utfør en student t-test som sammenligner andelen av hver belastning i den eksperimentelle behandlingen på T0 og T5. Hvis andelen av konkurrent belastningen er signifikant forskjellig fra referanse belastningen ved T5 (P < 0,05), antyder dette resultatet strekk konkurranse kan ha forekommet. Fortsett til trinn 4.2.1.5.
      5. For å avgjøre om tilstedeværelsen av konkurrent belastningen reduserte andelen av referanse belastningen etter 5 timer, Utfør en student t-test som sammenligner andelen av referanse belastningen i kontrollen med andelen av referanse belastningen i eksperimentell behandling (referanse belastning v konkurrent belastning).
        Merk: Hvis andelen av referanse belastningen er statistisk lavere i den eksperimentelle behandlingen i forhold til kontrollen (P < 0,05), vil konkurrent belastningen signifikant redusere andelen av referanse belastningen etter 5 timer og outcompeted referanse belastningen.
    2. Beregning av loggen RCI verdi for hver behandling (inkludert kontroll)
      Merk: Den relative konkurrerende indeksen, eller RCI, er en enkelt verdi som sammenligner hvordan slutt forholdet mellom belastningstyper er forskjellig fra Start forholdet. Den RCI verdien er log-forvandlet slik at en logg RCI verdi større enn null indikerer konkurrenten belastning (CS) outcompeted referanse belastningen (RS), en logg RCI verdi mindre enn null indikerer referanse belastningen outcompeted konkurrenten belastningen, og en logg RCI verdi på null indikerer at ingen belastning var outcompeted.
      1. Beregn Logg RCI verdier for hver kontroll og eksperimentell behandling ved hjelp av følgende ligning:
        Logg [(CST5 CFU ̧ RST5 CFUS) ̧ (csT0 CFU ̧ RST0 CFUs)] = Logg RCI
      2. Graph Logg RCI verdier ved hjelp av en separert boks & kinnskjegg tomten der data er grafisk i horisontal retning (figur 3b).
      3. Bestem om hver behandling var signifikant forskjellig fra null ved å utføre en student t-test sammenligne loggen RCI verdiene av hver behandling (inkludert kontroll) til et datasett sammenligne samme antall replikerer alle med en nullverdi. Hvis loggen RCI verdier for eksperimentell behandling er statistisk større enn null (P < 0,05), deretter konkurrent belastningen outcompeted referanse belastningen.
        Merk: Kontrollen bør ikke være statistisk forskjellig fra null (P > 0,05), fordi differensielt kodede referansestammer er isogenic.
      4. Utfør en student t-test for å avgjøre om loggen RCI verdier for eksperimentell behandling var betydelig større enn kontrollen (P < 0,05). Hvis loggen RCI verdier fra eksperimentell behandling er statistisk større enn kontroll behandling, deretter konkurrenten belastningen outcompeted referanse belastningen.
  3. Utfør følgende statistisk analyse for å bestemme mekanismen som konkurrenten belastningen outcompetes referanse belastningen: (i) analysere rå total totalt CFU data, eller (II) undersøke prosentandel utvinning av referanse belastningen. Disse analysene kan være mer tungvint å vise i forhold til de fra trinn 4,2, men vil identifisere om konkurrenten belastningen outcompetes referansen belastningen ved outgrowing det, hemme referanse belastning vekst, eller aktivt eliminerer referanse belastningen.
    1. Analysere rå totalt CFU data
      1. Graf rå totalt CFU-data for begge belastninger ved hjelp av et sammenflettet punktdiagram, der replikeres vises som individuelle datapunkter (figur 4a). Vis data på en logg skala, og Legg til en horisontal linje som indikerer gjennomsnittlig T0 CFUs for begge stammene.
      2. For å fastslå om tilstedeværelsen av konkurrent belastningen negativt påvirket referanse belastningen, Utfør en student t-test som sammenligner referanse belastningen CFUs for kontroll og eksperimentelle behandlinger hos T5. Hvis referanse belastningen CFUs i eksperimentell behandling er statistisk lavere enn i kontroll (P < 0,05), deretter tilstedeværelsen av konkurrenten belastningen betydelig påvirket referanse belastningen.
      3. For å avgjøre om tilstedeværelsen av konkurrenten belastningen enten hemmet veksten av eller eliminert referanse belastningen, utføre en student t-test sammenligne referanse belastningen CFUs på T0 og T5 for kontroll og eksperimentelle behandlinger.
        Merk: I fravær av en konkurrent, bør referanse belastningen vise en betydelig økning i CFU når man sammenligner T0 og T5 for kontroll behandlingen. Når analysere eksperimentell behandling, hvis referanse belastning CFUs i T5 er ikke statistisk forskjellig sammenlignet med T0 (P > 0,05), deretter konkurrent belastningen hemmet veksten av referanse belastningen. Hvis referanse belastning T5 CFUs er betydelig lavere enn T0 CFUs (P < 0,05), deretter konkurrent belastningen drepte referanse belastningen.
    2. Beregner prosent gjenoppretting av referanse belastningen
      1. Transformer totale CFU-data for referanse belastningen (RS) i prosent gjenopprettingsdata ved hjelp av ligningen nedenfor:
      2. (RST5 CFUS ̧ RST0 CFUs) x 100 =% gjenvinning av referanse belastning
      3. Vis prosent gjenopprettingen av referanse belastningen ved hjelp av et atskilt stolpediagram der hver linje representerer enten kontrollen eller den eksperimentelle behandlingen (figur 4b). Legg til en stiplet linje ved y = 100 for å indikere 100% gjenvinning av referanse belastningen (ingen økning eller reduksjon i referanse belastningen CFUs fra 0 t til 5 timer).
      4. For å finne ut om konkurrenten belastningen negativt påvirket referanse belastningen, utføre en student t-test sammenligne referanse belastning prosent utvinning for kontroll behandling til eksperimentell behandling. Hvis prosent utvinningen er betydelig mindre enn kontrollen (P < 0,05), deretter konkurrent belastningen negativt påvirket referanse belastningen.
      5. For å identifisere om konkurrent belastningen hemmet veksten av eller eliminert referanse belastningen, utføre en student t-test sammenligne referanse belastning prosent gjenoppretting for eksperimentell behandling og et datasett med samme antall replikerer alle med en verdien på 100.
        Merk: Hvis eksperimentell behandling er ikke statistisk forskjellig fra 100 (P > 0,05), deretter konkurrent belastningen hemmet veksten av referanse belastningen. Hvis referanse belastningen prosent utvinning i eksperimentell behandling er betydelig lavere enn 100 (P < 0,05), deretter konkurrent belastningen drepte referanse belastningen.
    3. Tolke fluorescens mikroskopi bilder
      1. Når fluorescens mikroskopi bilder er tatt, finne ut om hver stamme er synlig synlig i coincubation stedet. For kontroll coincubation (referanse belastning pVSV102 + referanse belastning pVSV208), bør både GFP og RFP være synlig fra ett coincubation sted. Hvis dette ikke er tilfelle, konfigurerer du eksperimentet på nytt for å sikre at belastninger er riktig merket og coincubated på plater uten antibiotika.
      2. For hver eksperimentelle coincubation spot, sjekk for mulige utfall.
        Merk: Hvis konkurrenten belastningen er synlig, men referansen belastningen ikke oppdages, som tyder på konkurrent belastningen drept eller hemmet veksten av referanse belastningen. Hvis begge stammer er til stede og jevnt blandet (GFP og RFP stede i hele coincubation spot), disse dataene tyder konkurrenten belastningen ikke konkurrere med referanse belastningen og begge stammer eksistere. Hvis begge stammer er til stede, men er romlig separert (microcolonies av enten GFP eller RFP er til stede i hele coincubation spot), som antyder referanse belastningen og konkurrent belastning kan engasjere seg i konkurransedyktige interaksjoner og modifikasjoner til Referanse belastningen eller innledende coincubation forhold kan være nødvendig. Se diskusjonen for flere detaljer.

5. avgjøre om samhandling er kontakt avhengig

Merk: Hvis du finner ut at en belastning dreper eller hemmer referanse belastningen, kan interaksjonen være ekstremt eller kontakt avhengig. Hvis du vil finne ut om samhandlingen er avhengig av celle-celle-kontakt, kan du utføre en coincubation-analysen som beskrevet ovenfor for trinn 1-2 med følgende endringer.

  1. Utfør trinn 1.1-2.2.
  2. Når stammene er normalisert, fysisk separate stammer ved hjelp av en nitrocellulose filter med en 0,22 mm pore størrelse. Denne størrelsen på porene gir mulighet for diffusjon av antimikrobielle stoffer og små molekyler, men hindrer fysisk kontakt mellom V. fischeri celler.
    Merk: Hvis samspillet er avhengig av celle-celle kontakt, separasjon av referanse belastningen fra konkurrenten belastningen med filteret skal oppheve drapet eller hemmende fenotype og referanse belastningen bør ikke ha redusert CFUs. Hvis samspillet ikke er avhengig av celle-celle-kontakt, og er en ekstremt mekanisme, skille stammene bør ikke hindre konkurrenten belastningen fra å drepe referanse belastningen.
    1. Spot 5 mL av referanse belastningen på midten av et filter og flekk 5 mL av konkurrent belastningen på midten av et annet filter. Plasser filteret som inneholder referanse belastningen på overflaten av en LBS agar plate. Plasser filteret som inneholder konkurrent belastningen direkte på toppen av filteret med referanse belastningen.
      Merk: Hver stamme er oppdaget på filtre i stedet for bunnen belastningen flekket direkte på agar plate slik at stammer kan lettere plasseres direkte på toppen av hverandre.
    2. Hvis det er bekymring for at stammer ikke er stablet direkte oppå hverandre, redusere volumet av referanse belastningen inokulum flekket på filteret. Dette vil sikre at området for referanse belastnings punktet er mindre og fullstendig over eller under konkurrent belastningen. Alternative hvilken belastning er på toppen og på bunnen for å gjøre rede for forskjeller i diffusjon av næringsstoffer fra agar medium.
    3. For å sikre at filteret gir mulighet for diffusjon av små molekyler, inkluderer en kontroll behandling der referanse belastningen er observert på et filter og et antibiotikum som det er følsom for (kloramfenikol) er observert på den andre. Stable filtrene direkte oppå hverandre og plasser på en LBS agar plate. Antibiotika bør være i stand til å spre gjennom filteret og bør drepe referanse belastningen.
  3. Ruge platene med filter ved 24 ° c i 5 timer. Ikke Inverter agar plate når incubating for å unngå å flytte filtrene.
  4. Utfør seriell fortynninger for start inokulum i henhold til trinn 2,4.
  5. Ta T endelige målinger
    1. Ved hjelp av steril pinsett, overføre hvert sett med filtre til en 50 mL Falcon tube inneholder 5 mL av LBS buljong. Sørg for at filtrene er fysisk adskilt i røret for å muliggjøre full blanding av hver belastningstype.
    2. Resuspend stammene fra filtre ved pipettering opp og ned til filtrene er klare for alle celler. Bruk pinsett til å rotere filtrene og fjerne celle materiale fra begge sider. Sterilisere pinsett med etanol mellom prøvene.
    3. Utfør seriell fortynning for T-finalen i henhold til trinn 2,5. Ved beregning av total CFUs for T-finalen, Juster "totalvolumet av ufortynnet sample" fra 1 mL til 5 mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å kunne vurdere konkurrerende interaksjoner mellom bakterie populasjoner, ble en coincubation analyse protokoll utviklet og optimalisert for V. fischeri. Denne metoden utnytter stabile plasmider som koder antibiotikaresistens gener og fluorescerende proteiner, noe som åpner for differensial valg og visuell diskriminering av hver stamme. Ved å analysere data samlet inn fra coincubation analysen, kan den konkurransedyktige utfallet av en interaksjon og mekanismen av samspillet identifiseres. Som et eksempel, ble følgende eksperimenter utført ved hjelp av V. fischeri isolat. Coincubated stammer næret en av to stabile plasmider: pVSV102 uttrykker kanamycin motstand og GFP +, eller pVSV208 uttrykker kloramfenikol motstand og DsRed +. I eksempelet data, stammer ble blandet i en 1:1 ratio og inkubert på LBS agar plater for 5 h. Som kontroll behandling ble differensielt kodede versjoner av referanse belastningen coincubated med hverandre. De eksperimentelle behandlingene ble utført med referanse belastningen (harboring pVSV102) og enten konkurrent stamme 1 eller konkurrent belastning 2 (harboring pVSV208). Kulturer av hver stamme ble utarbeidet og coincubated som beskrevet ovenfor, og som vist i figur 1 og figur 2.

I Figur 3, data analysert for å fastslå om konkurrent belastning 1 eller 2 outcompeted referanse belastningen er presentert på to måter. I figur 3able andelen av hver belastningstype for hvert tids punkt under eksperimentet beregnet i henhold til trinn 4.2.1. I de eksperimentelle behandlingene viser eksempeldataene referanse belastningen og konkurrent belastningen 1 i en andel på 0,5 i begynnelsen (0 h) og slutten (5 timer) av eksperimentet, som er i overensstemmelse med det som er observert i kontroll behandlingen. Disse dataene viser andelen av stammene endret ikke etter en 5 h coincubation, og derfor ingen konkurranse ble observert. Derimot, når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 2, var referanse belastningen tilstede på en andel av 0,5 i begynnelsen (0 h), og en andel < 0,01 ved slutten (5 h) av eksperimentet, som var betydelig lavere enn kontrollen behandling (student ' s t-test: P < 0,001). Disse dataene tyder på at andelen av referanse belastningen redusert i nærvær av konkurrent belastning 2, og derfor antyder konkurranse mellom konkurrent belastning 2 og referanse belastningen inntraff. Denne typen analyse bør brukes når man skal bestemme hvordan andelen av stammer i et samfunn endres over tid, men kan ikke brukes til å bestemme mekanismen for konkurrerende interaksjon, og derfor bør kombineres med ytterligere analyse. For eksempel kan andelen av referanse belastningen synkende i nærvær av konkurrent belastning 2 tilskrives flere typer interaksjoner: (i) belastning 2 vokste raskere enn referanse belastningen, (II) belastning 2 hemmet veksten av henvisningen belastning, eller (III) stamme 2 eliminert referanse belastningen gjennom drap.

I figur 3bble loggen relativ konkurransedyktig indeks (RCI) beregnet for hver behandling i henhold til trinn 4.2.2. Når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 1, log RCI verdier var ikke statistisk forskjellig fra null eller fra kontroll behandling (P > 0,05), antyder konkurranse mellom stammene ble ikke observert. Når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 2, men log RCI verdier var betydelig større enn null og kontroll behandling (student t-test: P < 0,001). Disse dataene tyder på belastning 2 outcompeted referanse belastningen. Analysere loggen RCI verdier gir en enkel metode for å avgjøre om en belastning outcompeted den andre i løpet av inkubasjonsperioden. Fordi denne analysen inkorporerer forholdet mellom stammene på slutten (5 h) og begynnelsen (0 h) av eksperimentet, kan Start forholdet dramatisk påvirke resultatet. Derfor bør Start forholdet undersøkes og vurderes når avledet konklusjoner fra loggen RCI data. Videre denne analysen ikke gir informasjon om konkurrerende mekanismen og bare rapporterer hvordan forholdet mellom stammene endres under inkubasjons.

Figur 4 viser to metoder for dataanalyse for å bestemme mekanismen av konkurranse for en gitt interaksjon. I figur 4avises totalt CFUs for hver belastning på hvert tids punkt i eksperimentet. Når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent stamme 1, CFUs av begge stammene økning i løpet av 5 h og CFUs for referanse belastningen var ikke signifikant forskjellig fra stamme 1 eller kontrollen ved 5 h (P > 0,05). Disse dataene tyder på at referanse belastningen vokste i nærvær av stamme 1, og tyder på at ingen konkurranse inntraff. Men når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 2, økt belastning 2 CFUs etter 5 timer, men CFUs for referanse belastningen redusert. Referanse belastning CFUs var signifikant lavere enn belastningen 2 CFUs og kontroll ved 5 h (student t-test: P < 0,002). Disse dataene tyder på at referanse belastningen CFUs nedgang i nærvær av stamme 2, og foreslå stamme 2 dreper referanse strekk celler. Hvis referanse belastningen ikke viste en nedgang i CFUs, men heller ingen endring (ingen statistisk forskjell mellom referanse belastningen CFUs på 0 h og 5 h), ville disse dataene foreslå belastning 2 outcompeted referanse belastningen ved å hemme veksten av referanse belastningen. Analysere transformert totale CFU data er spesielt informativ, som CFUs for både belastninger på hvert tidspunkt vises uavhengig og kan brukes til å identifisere mekanismen av konkurransen.

Figur 4b viser prosent gjenopprettingen av referanse belastningen for å finne ut hvordan en konkurrent belastning påvirker referanse belastningen. Når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 1, ble en ~ 3 200 prosent utvinning observert, som ikke var statistisk forskjellig fra kontroll og indikerer stamme 1 ikke påvirke prosent utvinningen av referanse belastningen. Når referanse belastningen ble inkubert med konkurrent belastning 2, ble det observert en utvinning på ~ 4 prosent, noe som var betydelig lavere enn kontrollen (student t-test: P < 0,002). Prosenten utvinning var også betydelig mindre enn 100 (student t-test: P < 0,002), indikerer stamme 2 outcompeted referanse belastningen ved å drepe referanse belastningsceller. Hvis prosent oppgangen ikke var statistisk forskjellig fra 100, ville disse dataene foreslå belastning 2 hemmet veksten av referanse belastningen. Prosent gjenopprettingsdata gir en forenklet måte å karakterisere konkurranse mekanismen på ved å undersøke hvordan referanse belastningen befolkningen reagerer på tilstedeværelsen av en konkurrent belastning. Hvis du imidlertid viser dataene på denne måten, ekskluderes informasjon om Start forholdet og hvordan den mange konkurrent belastningen endret seg i løpet av inkubasjons.

Figure 1
Figur 1: flytskjema som illustrerer coincubation analysen. (A) bakteriestammer harboring enten pVSV102 (referanse belastningen indikerte REF. belastning eller R.S.) eller pVSV208 (konkurrent belastning angitt comp. belastning eller CS) dyrkes separat på Media selektiv for enten referanse BELASTNINGEN (lbs kan) eller en konkurrent belastning (LBS cam). Stammer blir deretter resuspendert i LBS buljong og normalisert til en OD = 1,0. (B) referanse belastningen og konkurrent belastningen blandes ved en 1:1 ratio etter volum. En seriell fortynning er utført med denne blandingen til å bestemme CFUs for både stammer ved 0 h. (C) belastningen blandingen er da oppdaget på 24-brønn plater som inneholder lbs agar. Hver replikere er oppdaget i sin egen brønn. Flekker er tillatt å tørke og deretter inkubert ved 24 ° c for 5 h. Etter 5 timer utføres en serie fortynning for å kvantifisere CFUs for hver belastning. (D) belastningen blanding fra panel B er også OBSERVERT på lbs agar Petri plater lov til å tørke og inkubert ved 24 ° c for 24 h. Ved 24 h blir det coincubation stedet avbildet ved hjelp av et fluorescens dissekere mikroskop som er tilpasset for å detektere grønn (referanse belastning) og rød (konkurrent belastning) fluorescens. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative bilder av plater som kreves for en seriell fortynning. (A) 96-brønn plate som brukes til å utføre seriell fortynning. Platen roteres slik at det er 12 rader og 8 kolonner. Beskrivelsene av hver behandling inkluderer belastninger som brukes og plasmider de havner (for eksempel referanse belastning med pVSV102 og konkurrent belastning med pVSV208) og replikere nummeret for hver rad (R1, R2, R3 eller R4). Den første kolonnen er ufortynnet prøven og hver kolonne til høyre representerer en 10-fold fortynning fra forrige kolonne (fortynning faktor nevnt ovenfor). (B) lbs agar plate brukes til å bestemme CFUs for referanse BELASTNINGEN på lbs kan plater (øverst) og konkurrent belastning på lbs cam plater (nederst) fra eksperimentell behandling. Hver rad er en replikere i en behandling (f. eks R1) og fortynning faktor på hvert sted er oppført på toppen av platen. Antallet CFUs som telles for hver replikering, vises til høyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksempel data for vurdering av om konkurrerende stammer outcompete referanse belastningen. (A) andelen coincubating stammer harboring enten pVSV102 (mørk grå) eller pVSV208 (lys grå). R.S. angir referanse belastningen og CS indikerer konkurrent belastningen. Stiplet vannrett linje angir en andel på 0,5. Asterisk indikerer referansen belastningen gjort opp en statistisk mindre andel av befolkningen enn konkurrenten belastning eller referanse belastningen i kontrollen på 5 h (student t-test: P < 0,001); NS indikerer ikke signifikant (P > 0,05). (B) log relativ konkurransedyktig indeks (RCI) for coincubation analyser. Stiplet loddrett linje angir Logg RCI = null. Asterisk indikerer loggen RCI verdien er statistisk større enn null og kontroll (student t-test: P < 0,001). Feilfelt angir SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel data for fastsettelse av konkurranse mekanismen. (A) totalt CFU tellinger for coincubation analyser utført med V. fischeri -isolat som ble Differensielt merket med enten pVSV102 eller pVSV208. CFUs ble samlet i begynnelsen av eksperimentet (0 h) og etter 5 timer inkubasjons. R.S. angir referanse belastning og CS angir konkurrent belastning. Stiplet horisontal linje indikerer gjennomsnittlig 0 h CFUs for begge stammer; stjerne indikerer referanse belastning CFUs var statistisk lavere i eksperimentell behandling i forhold til kontroll behandling på 5 h (student t-test: P < 0,002). (B) prosent gjenvinning av referanse belastningen. Vannrett stiplet linje indikerer 100% gjenoppretting (ingen økning eller reduksjon i CFUs); stjernen indikerer prosent utvinning var statistisk lavere enn 100% og kontroll behandling (student t-test: P < 0,002). Feilfelt angir SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: eksempel data for inkubasjonstid og bildeoptimalisering. (A) total CFUs for coincubation-analyser der CFUs ble samlet i begynnelsen av eksperimentet (0 h), etter 5, 12 og 24 h inkubasjons. R.S. indikerer referanse belastning og C. S. 2 indikerer konkurrent belastning 2. Stiplet horisontal linje indikerer gjennomsnittlig 0 h CFUs for begge stammer; stjernene indikerer referanse belastning CFUs var statistisk lavere i eksperimentell behandling i forhold til kontroll behandling på det gitte tidspunkt (student t-test: P < 0,002). Feilfelt indikerer SEM. (B) fluorescerende mikroskopi bilder tilsvarende med CFU-data i panel A. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Eksempel data for optimalisering av coincubation forhold. Coincubation eksperimenter ble utført mellom referanse belastningen (R.S.) harboring pVSV102 (grønn, øverste rad) og konkurrent stamme (CS) harboring pVSV208 (rød, nederste rad) og fluorescerende mikroskopi bilder ble tatt ved 24 h. (A) stammer ble blandet i en 1:1 ratio eller (B) a 1:5 ratio der referanse belastningen, som inneholder pVSV102, var mindretall av konkurrenten belastningen som inneholder pVSV208. Scale bar = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den coincubation analysen beskrevet ovenfor gir en kraftig metode for å oppdage interbacterial konkurranse. Denne tilnærmingen er tillatt for identifisering av intraspesifikk konkurranse mellom V. fischeri isolerer og karakterisering av konkurranse mekanismen19. Selv om metoden beskrevet var optimalisert for den marine bakterien V. fischeri, kan det enkelt endres for å imøtekomme andre bakterielle arter, inkludert klinisk og miljømessige isolerer. Det er viktig å merke seg at konkurransedyktige mekanismer er ofte betinget regulert5,6,23,24,25,26,27 , 28, dermed små forskjeller i vekstforhold (f. eks, risting vs stående kultur, temperatur, etc.) og medietype (f. eks, saltinnhold) kan dramatisk påvirke resultatene. Derfor, optimalisere coincubation forhold er sannsynligvis nødvendig for ulike bakterielle arter samt ulike konkurrerende mekanismer. Det er best å velge kultur forhold som tett reflekterer det naturlige miljøet i isolat. For eksempel, coincubation analyser mellom V. fischeri stammer ble utført med lbs medier ved 24 ° c, for å gjenspeile saltinnhold og temperaturen i det marine miljøet. Men noen bakterier er naturlig kompetent i sitt miljø27,28 og derfor kunne ta opp genetisk materiale utgitt av lysert celler under fiendtlige interaksjoner29. For å hindre slik DNA-overføring fra påvirker coincubation resultater, er det viktig å bruke forhold som ikke fremmer kompetanse eller stammer som ikke er kompetente, enten naturlig eller gjennom deaktivering av DNA-opptak maskiner. Videre kan eksperimentelle parametre som cellevekst fase, kultur tetthet, inkubasjonstid eller Start belastningsforhold også kreve optimalisering for ulike bakteriearter eller konkurrerende mekanismer. For eksempel vil innledende kultur tetthet diktere mengden celle-celle kontakt mellom stammer, noe som kan påvirke evnen til bakterier å distribuere kontakt avhengige mekanismer for konkurranse.

Figur 5a viser prosessen med optimalisering av coincubation analyser med V. fischeri isolat. Her ble en rekke inkubasjons tider for CFU samling og fluorescerende mikroskopi Imaging evaluert for å bestemme den optimale tiden for hver beregning som skal samles inn. CFUs ble samlet inn umiddelbart etter blanding av referanse belastningen og konkurrent belastning 2 ble oppdaget på LBS agar plater (0 h), og CFU målinger og fluorescerende mikroskopi bilder ble tatt umiddelbart og etter 5, 12 og 24 h. Disse eksempel data markere viktigheten av grundig optimalisering før trekke noen konklusjoner om samspillet mellom to stammer. For eksempel kan to forskjellige konklusjoner om mekanismen for samhandling utledes basert på når CFUs er samlet inn: CFUs fra 5 eller 12 h indikere stamme 2 drept referanse belastningen, mens CFUs samlet på 24 h foreslår stamme 2 hemmer veksten av Referanse belastning.

Den optimale tiden for visualisering av coincubation flekker gjennom fluorescerende mikroskopi kan være annerledes enn den optimale tiden for CFU samling. Figur 5B viser fluorescerende mikroskopi bilder av coincubation flekker ved 0, 5, 12 og 24 timer. Ved 0 og 5 h, coincubation flekker er ikke synlig med fluorescerende mikroskopi. For bilder tatt på 12 h, begge stammer i kontroll behandling er synlige, men RFP (referanse belastning harboring pVSV208) er spesielt dimmer. I eksperimentell behandling ved 12 h, konkurrent belastning 2 er synlig (ennå svak) og referanse belastningen er ikke synlig. Belastnings spesifikke forskjeller mellom bakterielle isolerer kan påvirke uttrykket av fluorescerende proteiner, og dermed lysstyrken i cellene i blandet flekk. Fordi RFP er særlig dimmer enn GFP i kontrollen, bør coincubation flekker fortsette å være inkubert og bli avbildet igjen på et senere tidspunkt. I bilder tatt på 24 h, begge stammer er synlig oppdages og på en lignende lysstyrke i kontroll eksperimentet. I eksperimentell behandling stamme 2 er synlig mens referanse belastningen er ikke observert innenfor coincubation stedet. 15-24 h inkubasjonstid er tilstrekkelig til å visualisere GFP og RFP for V. fischeri bruke stabile plasmider PVSV102 og pVSV208, henholdsvis, men inkubasjonstiden må kanskje justeres for ulike plasmider eller bakterielle arter. Selv om den optimale tiden for visualisering av coincubation flekker og samle inn CFU data er forskjellige, Imaging ved 24 h er en god måte å raskt skjermen interaksjoner for V. fischeri, fordi resultatet innhentet fra Imaging ved 24 h (målet er synlig eller ikke) reflekterer mer tidkrevende kvantitative data innhentet fra plating CFUs på 5 eller 12 h.

Start forholdet kan signifikant påvirke resultatene, spesielt når incubating to hemmende stammer, og kan må justeres for å gjøre rede for belastningen spesifikke forskjeller i drap effektivitet eller vekstrate. Figur 6a viser for eksempel fluorescerende mikroskopi bilder av eksperimenter der referanse belastningen ble coincubated med seg selv (kontroll) og tre andre V. fischeri isolerer fra et 1:1-forhold. I disse eksempeldataene oppdages referanse belastningen tydelig når inkubert med seg selv, konkurrent belastning 1 og konkurrent belastning 3 etter 24 timer. Men når Start forholdet ble justert til 1:5 (dvs. 50 mL referanse belastning blandet med 250 mL konkurrent belastning) er referanse belastningen bare synlig oppdaget når den coincubated med seg selv og stamme 1, noe som indikerer at både stamme 2 og belastning 3 outcompete Referanse belastningen. Denne justeringen hindrer raskere vekstrate av referanse belastningen fra skjule effekten av eventuelle forstyrrelser konkurranse mekanismer utstilt av konkurrenten stammer. Basert på resultatene i figur 6a, et forhold på 1:5 (referanse belastning: konkurrent belastning) bør brukes til skjermen ytterligere V. fischeri stammer for evnen til å drepe referanse belastningen.

Denne protokollen diskriminerer mellom coincubating stammer ved differensielt merking stammer med plasmider inneholder enten kanamycin eller kloramfenikol resistens gener. Imidlertid, annerledes antibiotika eller annet utvalg metoder kanskje være bedre Suite for annerledes bakteriell art. Andre metoder for differensial valg kan være: 1) utnytte en stamme/arter-spesifikke auxotrophy for bestemte vekstfaktorer (for eksempel DAP eller tymidin), 2) betingede vekst krav (for eksempel en stamme vokser ved 37 ° c, mens den andre ikke), eller 3) counterselection markører som eliminerer eller hemmer veksten av den kodede belastningen når de dyrkes under egnede forhold for å uttrykke et "Kill"-gen (f.eks. ccdB eller sacB).

Velge riktig referanse belastningen er avgjørende for å oppnå og tolke reproduserbar resultater fra coincubation analysen. En referanse stamme bør være godt studert (dvs. har en bred kropp av vitenskapelig litteratur), har ingen åpenbare drap eller hemmende evne, og ideelt sett har en sekvensert Genova. For eksempel er visse stammer av Escherichia coli vanlige referansestammer for mange bakterielle coincubation eksperimenter30,31. Imidlertid kan E. coli ikke være økologisk relevant for en gitt konkurransedyktig mekanisme eller konkurrent, som kan påvirke resultatene. For eksempel kan noen bakterier har utviklet mekanismer spesielt rettet mot tett relaterte arter eller konkurrenter for samme økologiske nisje og deres konkurransedyktige mekanismen ville ikke være effektiv mot en E. coli referanse belastning.

Oppsummert beskriver metoden her for å gi en lett modifisert og robust tilnærming for å evaluere interbacterial interaksjoner og konkurranse. Denne metoden kan anvendes på bakteriell isolerer relevant for miljø-eller klinisk forskning, og kan brukes til å utforske ulike mekanismer for mikrobiell interaksjon som tidligere har vært ukjent eller vanskelig å undersøke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke anmeldere for deres hjelpsomme tilbakemeldinger. A.N.S. ble støttet av Gordon og Betty Moore Foundation gjennom Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon interferens konkurranse fluorescens mikroskopi Aliivibrio fischeri interstrain interaksjoner interspecies interaksjoner interbacterial drap
Coincubation analysen for kvantifisere konkurrerende interaksjoner mellom <em>Vibrio fischeri</em> isolerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter