Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Koinkubations-analys för kvantifiering av konkurrerande interaktioner mellan Vibrio fischeri -isolat

Published: July 22, 2019 doi: 10.3791/59759
Automatic Translation
1, 1
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

Bakterier kodar för olika mekanismer för att bedriva interbakteriell konkurrens. Här presenterar vi ett kulturbaserat protokoll för att karakterisera konkurrensmässiga interaktioner mellan bakteriella isolat och hur de påverkar den rumsliga strukturen hos en blandad population.

Abstract

Detta manuskript beskriver en kulturbaserad, koinkubations analys för att upptäcka och karakterisera konkurrerande interaktioner mellan två bakterie populationer. Denna metod sysselsätter stabila plasmider som gör att varje population differentially märkta med distinkta antibiotikaresistens kapacitet och fluorescerande proteiner för urval och visuell diskriminering av varje population, respektive. Här beskriver vi förberedelserna och coinkubationen av konkurrerande Vibrio fischeri -stammar, fluorescensmikroskopi-avbildning och kvantitativ dataanalys. Denna metod är enkel, ger snabba resultat, och kan användas för att avgöra om en population dödar eller hämmar tillväxten av en annan population, och om konkurrensen förmedlas genom en diffus molekyl eller kräver direkt cell-cell kontakt. Eftersom varje bakterie population uttrycker ett annat fluorescerande protein, medger analysen rumslig diskriminering av konkurrerande populationer inom en blandad koloni. Även om de beskrivna metoderna utförs med symbiotiska bakterien V. fischeri med hjälp av villkor som optimerats för denna art, kan protokollet anpassas för de flesta odlingsbara bakteriella isolat.

Introduction

Detta manuskript beskriver en kulturbaserad metod för att avgöra om två bakteriella isolat klarar av konkurrerande interaktioner. Vid studier av blandade populationer är det viktigt att bedöma i vilken utsträckning de bakteriella isolaterna interagerar, särskilt om isolat konkurrerar direkt genom interferensmekanismer. Störning konkurrens hänvisar till interaktioner där en population direkt hämmar tillväxten eller dödar en konkurrent befolkning1. Dessa interaktioner är viktiga att identifiera eftersom de kan ha djupgående effekter på en mikrobiell gemenskap struktur och funktion2,3.

Mekanismer för mikrobiell konkurrens har i stort sett upptäckts i genomet av bakterier från olika miljöer, inklusive både värdassocierade och fritt levande bakterier4,5,6,7, 8,9. En rad olika konkurrensstrategier har beskrivits10,11 inklusive diffusbara mekanismer, såsom bakteriedödande kemikalier1,12 och utsöndras antimikrobiella peptider13 , samt kontaktberoende mekanismer som kräver cell-cell kontakt för att överföra en hämmande effekt till målceller9,14,15,16,17 ,18.

Även om kulturbaserade coincubations används ofta i mikrobiologi5,8,19, beskriver detta manuskript hur man använder analysen för att karakterisera mekanismen för konkurrens, samt förslag för att anpassa protokollet för användning med andra bakteriearter. Dessutom beskriver denna metod flera metoder för att analysera och presentera data för att besvara olika frågor om arten av de konkurrensmässiga interaktioner. Även om de tekniker som beskrivs här användes tidigare för att identifiera den interbakteriella mördande mekanismen bakom intraspecifika konkurrens mellan symbiotiska stammar av isolerade Vibrio fischeri bakterier19, de är lämpliga för många bakteriearter, inklusive miljöisolat och humana patogener, och kan utnyttjas för att utvärdera både kontakt-beroende och diffus konkurrenskraftiga mekanismer. Stegen i protokollet kan kräva optimering för andra bakteriearter. Med tanke på att fler modellsystem utökar sina studier utöver användningen av isogena organismer för att inkludera olika genotyper10,16,20,21, kommer denna metod att vara en värdefull resurs för forskare som vill förstå hur konkurrensen påverkar system med flera stammar eller flera arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered stammar för Koinkubation

  1. Välj en lämplig referensstam som kommer att fungera som mål för bakterie konkurrens under koinkubations analysen. Se diskussion för bästa praxis när du väljer en referensstam och hur referens stammen kommer att påverka resultaten. I detta protokoll kommer V. fischeri Strain ES114 att fungera som referensstam.
  2. Fastställa vilka urvals-och screeningmetoder som ska användas för att skilja mellan isolat i koinkubations-
    1. Typiskt, omvandla stammar med stabila plasmider som innehåller olika antibiotikaresistens gener (t. ex. kanamycin eller kloramfenikol) att välja för varje stam, samt gener kodning olika fluorescerande proteiner (t. ex. GFP eller RFP) för visuellt särskiljande stamtyper i samodling.
      Anmärkning: Användning av stabila plasmider krävs för om en stam förlorar plasmid i avsaknad av urval, då denna stam nummer kommer att underskattas när kvantifieras, och kommer inte att vara visuellt detekterbar med fluorescens mikroskopi.
    2. Tag coincubated V. fischeri stammar differentially sådan att en stam innehåller plasmid pVSV102, som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) och resistens mot antibiotikum kanamycin (kanR), och den andra stammen innehåller plasmid pVSV208, som uttrycker ett rött fluorescerande protein (dsred) och motståndskraft mot antibiotikum kloramfenikol (cmR)22.
      Anmärkning: Andra differential markeringar kan användas för att särskilja coincubating stammar. Se diskussion för ytterligare metoder.
    3. Inkludera följande kontroll under den initiala optimeringen av koinkubations analysen för att säkerställa att urvalet är robust. Platta varje stam som är differentially taggade på agar plattor som innehåller antibiotikum som ska välja mot det (dvs, plattan stam 1 på media som väljer för stam 2, och vice versa).
  3. Två dagar före koinkubations test, strimma referensstam pVSV102, referensstam pVSV208, och varje konkurrent stam pVSV208 från-80 ° c lager till LBS agar plattor som innehåller lämpligt antibiotikum (t. ex. 100 μg/mL kanamycin eller 2 μg/mL kloramfenikol) och inkubera över natten vid 24 ° c. Antibiotika val krävs för att säkerställa att alla celler innehåller plasmiden i början av experimentet.
  4. En dag före analysen, plocka och restreak fyra enskilda kolonier per stam typ (biologiska replikat) på färska LBS agar plattor med lämplig antibiotika och inkuberas över natten vid 24 ° c.
    Anmärkning: Detta steg kan kräva optimering för andra bakteriearter, eftersom längre eller kortare inkubationstider kan krävas för att få tillräckligt med celler beroende på tillväxttakten i organismen av intresse.

2. coincubate bakteriestammar

  1. Beredning av varje bakteriestam för inkubering (figur 1a)
    1. Med hjälp av en steril tandpetare, skrapa cellerna från agarplattan (så mycket som storleken på ett korn av ris) och återsuspendera cellerna i en 1,5 mL microcentrifug rör som innehåller 1 mL LBS buljong. Bryt upp cell klumpar genom att trycka in dem i sidan av röret och Pipettera upp och ner kraftigt.
    2. Locket röret och Vortex för 1-2 s. Om cell klumpar fortfarande är synliga fortsätter du att virvla eller Pipettera uppåt och nedåt tills provet är visuellt enhetligt.
    3. Upprepa steg 2.1.1-2.1.2 för alla prover.
  2. Mät och anteckna den optiska densiteten vid 600 Nm (OD600) för alla prover. Prover kommer sannolikt att behöva spädas upp till tio gånger med LBS buljong för att få en korrekt OD mätning. Normalisera varje prov till önskad OD600. Stammar är normalt normaliserade till en OD600 ~ 1,0, vilket översätter till ~ 106 bakterier/ml för V. fischeri.
    Anmärkning: Detta steg kan kräva optimering för olika bakteriearter som inokulum CELLTÄTHETEN påverkar koinkubations resultat beroende på mekanismen för konkurrens. Se diskussion för optimering.
  3. Coincubating stammar (figur 1b, C)
    1. Blanda referens stammen och konkurrentstammen i ett 1:1-förhållande (v/v) genom att tillsätta 100 mL av varje stam (normaliserad till OD 1,0) till ett märkt 1,5 mL centrifugerör. Som en kontroll, blanda referens stammen med en differentially Taggad version av sig själv (referensstam pVSV102 + referensstam pVSV208). Denna kontroll krävs för senare statistisk analys för att avgöra om förekomsten av en konkurrent stam påverkar tillväxten av referens stammen. Vortex den blandade stammen kulturen för 1-2 s.
      Anmärkning: Det här steget kan kräva optimering som utgångs förhållandet kan avsevärt påverka resultaten och kan behöva justeras. Se diskussion för optimering.
    2. Upprepa steg 2.3.1 för varje biologisk replikat. Efter avslutad detta steg bör det finnas totalt åtta blandade stam rör: fyra biologiska replikat med differentially-märkta referensstammar (kontroll), och fyra biologiska replikat med differentially-märkta referens och konkurrent stammar ( experimentell).
    3. Spot 10 mL av varje kontroll och experimentell blandning på petriskålar som innehåller LBS-agar. Dessa kultur fläckar kommer att användas för fluorescens mikroskopi efter inkubationen.
    4. Låt fläckarna torka helt på bänken tills all vätska har absorberats i agar och inkubera Petriskålarna vid 24 ° c i 24 timmar. Minst 15 h krävs för V. fischeri stammar märkta med PVSV102 och pVSV208 att växa till en tillräckligt hög celltäthet för att visualisera GFP och RFP, respektive, på populationsnivå med hjälp av en fluorescens dissekera Mikroskop. Här använder vi en 24 h inkubering för avbildning blandade fläckar.
      Anmärkning: Det är viktigt att använda plåtar som inte är för fuktiga eller för torra. Om plattorna är för fuktiga, kommer koinkubations punkter inte att absorberas i agarplattan; Undvik att använda plåtar som hälls på samma dag. Om plattorna är för torra, kan små vågor eller sprickor bildas på agarytan, vilket gör koinkubations fläckar oregelbundna i form.
    5. Med samma bakterie suspensioner som i steg 2.3.3, spot 10 mL av varje kontroll och experimentella blandningar i 24-väl plattor som innehåller 1 mL LBS agar per brunn. Som i steg 2.3.3, se till att agar i 24-brunn plattor har lämplig fukt. Låt fläckarna torka helt och inkubera vid 24 ° c i 5 timmar. Dessa kultur fläckar kommer att användas för att kvantifiera kolonin bildar enheter (CFUs) för varje stam i slutet av experimentet.
      Anmärkning: Spotting bakteriell suspensioner för tillväxt i enskilda brunnar möjliggör lättare resuspension vid sluttiden punkt. Detta steg kan åstadkommas med hjälp av kvadratiska sterila filter bitar som en mer ekonomisk metod för att använda 24-bra tallrikar. Kvadratiska sterila filter bitar kan placeras på en agarplatta och 10 mL av varje experimentell blandning kan upptäckas på dessa filter, snarare än på 24-väl plattor. Efter koinkubations tiden kan filtren överföras till ett 1,5 ml centrifugeringsrör och koinkubations platsen kan återsuspenderas genom vortexa eller pipettering upp och ner. En 5 h inkubationstid är tillräcklig för att detektera interbakteriell avlivning mellan V. fischeri isolat19, denna coinkubations tid kan dock behöva vara kortare eller längre för andra arter eller konkurrensmekanismer. Se diskussion för mer information.
  4. Serie utspädning för start av inokulum
    1. För att utföra en seriell utspädning av start koinkubations blandningar, rotera en 96-brunn plattan 90 ° så det finns åtta kolumner och tolv rader. Varje rad kommer att innehålla ett prov av den outspädda blandningen i den första kolumnen följt av 7 10-faldigt seriella utspädningar över de återstående brunnarna i raden (figur 2A).
    2. Märk varje rad med stam-ID, repliknummer och tid (starta inokulum = t0). Märk LBS-agarplattorna kompletterade med lämpligt antibiotikum för att upptäcka utspädnings serien. Var noga med att identifiera vilken stam varje antibiotikum plattan är att välja för.
    3. Med hjälp av en Multichannel pipett, tillsätt 180 mL LBS buljong till varje brunn, lämnar den första kolumnen tom för den outspädda koinkubation blandningen.
      Anmärkning: Forskare kan välja att använda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att Återsuspendera koinkubations punkter och utföra seriell utspädning om man arbetar med en särskilt snabbväxande bakterieart eller konsekvent utför stora experiment där seriella utspädningar kan ta lång tid att prestera. Använda PBS i dessa fall kommer att förhindra betydande utväxt av bakterier under processen att utföra seriella utspädningar. Det är dock viktigt att vara konsekvent med vilken lösning som används (t. ex. PBS eller LBS) över alla experiment, oavsett storlek eller varaktighet.
    4. Med en 200 mL enkelkanalspipett, överför 100 mL av koinkubations blandningen från röret till den första kolonnen väl. Kassera spetsen och upprepa för alla koinkubations blandningar.
    5. Använd en flerkanalspipett och överför 20 mL från kolumn 1 till 2 och blanda genom att Pipettera upp och ner. Kassera tipsen och upprepa för varje kolumn så att i slutet, varje rad innehåller en tiofaldig seriell utspädning av den initiala koinkubation blandningen.
      Anmärkning: Överensstämma med antalet gånger som spädningar pipetteras upp och ner. Du kan till exempel trycka in pipetthandtaget fem gånger för att varje utspädning ska vara konsekvent i utspädnings serien.
    6. Med hjälp av en flerkanalspipett försedd med åtta spetsar, aspirera 5 mL från varje brunn i en spädningsserie (dvs. en rad med åtta brunnar) och spot den på LBS-agarplattan som väljer för referens stammen (kompletterad med kanamycin). Upprepa detta steg spotting på plattan välja för konkurrentstammen (kompletteras med kloramfenikol) (figur 2b). Låt fläckarna torka helt innan de släpps ut i inkubator.
      Anmärkning: Samma tips kan användas för att upptäcka en replikat utspädningsserie på plåtar som väljs för referens-och konkurrentstammen, men måste ändras mellan replikat. Undvik att vidröra änden av pipettspetsen till LBS-agarplattorna eftersom detta kan skapa en depression som kan likna en bakteriell koloni och skeva resultat under plattan räknas. Om spetsen inte vidrör plattan, gör en anteckning och inte inkluderar depression i kolonin räknas.
  5. Ta slutliga mätningar
    1. Efter koinkubations punkterna i 24-brunnen plattorna har inkuberats för 5 h vid 24 ° c, tillsätt 1 mL LBS buljong till varje brunn och Omsuspendera koinkubations platserna genom att Pipettera upp och ner tills alla celler är återsuspenderade. Överensstämma med den kraft i vilken cellerna återsuspenderas över alla replikat. Tryck till exempel på pipetthandtaget åtta gånger för att fullständigt Omsuspendera varje prov.
    2. När varje koinkubations punkt är återsuspenderad, Förbered en 96-brunn platta för en seriell utspädning och LBS agar plattor med lämplig antibiotika för att upptäcka utspädning på samma sätt som steg 2.4.1.
    3. Utför steg 2.4.2-2.4.6 för att slutföra den seriella utspädningen för T slutliga mätningar.
      Anmärkning: En viktig kontroll bör inkluderas vid initial optimering av koinkubations analysen. I slutet av koinkubations tiden, platta de blandade stammar på media som innehåller både antibiotika. Ingen stam ska kunna växa om inte 1) en spontan mutation uppstår, eller 2) valbara markörer utbyts mellan stammar.

3. visualisera Coincubations med fluorescens mikroskopi

  1. Bild varje koinkubations plats på LBS-agar Petri-plattor från steg 2.3.3 och 2.3.4 med hjälp av ett stereomikroskop utrustat för grön och röd fluorescensdetektion, som motsvarar de fluorescensproteiner som uttrycks på de stabila plasmiderna.
  2. Börja med att ta bilder av kontroll koinkubations punkten (referensstam pVSV102 + referensstam pVSV208).
    1. Justera förstoringen så att platsen är i fokus.
    2. Använd lämplig exciteringslampa och filter för att iaktta GFP, justera exponeringstiden så att endast fluorescensen från koinkuberingspottet är detekterbar och all bakgrundfluorescens från mediet är låg eller inte synlig.
    3. Ändra excitation ljus och filter för att observera RFP, justera exponeringstiden för att minimera bakgrunden från mediet.
  3. För varje kokubations punkt från de experimentella behandlingarna, bild för referens stammen med hjälp av GFP-filtret och exponeringstiden bestämd i steg 3.2.2.
  4. Bild konkurrenten stam med hjälp av RFP filtret, justera exponeringstiden så att fluorescens observeras endast från koinkubations platsen och bakgrundsfluorescens från mediet är minimal. Spara båda bilderna och namnge dem så att de innehåller både stam-ID: n, det replikations nummer, inkuberingstiden när bilden togs (t. ex. 24 h). Upprepa för alla replikat.
    Anmärkning: Coinkubations tiden kan behöva justeras för olika plasmider eller bakteriearter. Se diskussion för optimering.

4. analys av data

  1. Beräkna CFUs för varje kontroll och experimentell behandling vid varje tidpunkt (T start och T Final)
    1. När kolonierna är synliga på seriella utspädnings plåtar (t. ex. 24 timmar vid 24 ° c för V. fischeri), identifiera utspädningsfaktorn där enskilda kolonier kan räknas och inte har vuxit samman till stora flerkolonikluster (figur 2b). Räkna och anteckna antalet enskilda kolonier för en given utspädning för varje replikat. Detta nummer representerar CFUs för att replikera.
    2. Konvertera CFUs för utspädning till total CFUs för varje stam i koinkubation med hjälp av formeln nedan:
      [CFUs ÷ (utspädningsfaktor x Vol. utspädning spot)] x Vol. av det outspädda provet = totalt CFUs
      Exempel: t0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0,005 mL)] x [0,01 mL] = 1,2 E7 totalt CFUs av stam 1 i blandad plats i början av experimentet
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8.0 E5 totalt CFUs av stam 1 i blandad fläck efter 5 h koinkubation
      CFU-värdena för varje stam vid varje tidpunkt är de rådata som kan användas för flera olika analyser och statistiska tester (se avsnitt 4,2 nedan).
  2. Utför följande dataomvandlingar för att avgöra om en konkurrentstam utkonkurrerar referens stammen genom att: (i) avgöra om andelen av referens stammen minskar i närvaro av konkurrentstammen, eller (II) beräkning av log relativ konkurrens index (RCI). Dessa analyser omvandlar rådata till nyckeltal och kan vara användbara för att fastställa det konkurrensmässiga utfallet av en interaktion, men kan inte bestämma mekanismen för konkurrens (dvs. att döda kontra tillväxthämning).
    1. Beräkning av andelen av varje stam för varje tidspunkt under koinkubations tiden
      1. Omvandla CFU-data till andelen av varje stam i en behandling. För referens stammen (RS) på t0, dividera den totala CFUs för referens stammen på t0 med summan av totalt CFUs för referens stammen och konkurrenten (CS) på t0:
        RSt0 cfus ÷ (RSt0 Cfus + cst0 cfus) = andel av referens stammen på t0.
        Utföra samma beräkning för att bestämma andelen av konkurrentstammen på t0:
        CSt0 cfus ÷ (RSt0 Cfus + cst0 cfus) = andel av referens stammen på T0
        Upprepa denna process för varje tidspunkt och replikera för både experimentell behandling och kontroll behandling (differentially-Tagged referensstam koinkubation).
      2. Diagram den genomsnittliga andelen av varje stam typ på t0 och T5 i ett staplat stapeldiagram (figur 3a).
      3. För att säkerställa att det önskade utgångs förhållandet för stammar erhölls. För coincubations där stammar var initialt blandade 1:1, varje stam typ bör bestå av ~ 0,5 av befolkningen på t0 och bör inte vara statistiskt olika från varandra med hjälp av en students t-test (P > 0,05). Om andelen av en stam är betydligt större än den andra stammen vid T0, upprepa sedan experimentet tills en 1:1 utgångs förhållandet uppnås.
      4. Avgöra om konkurrenten stammen består av en betydligt större andel av befolkningen efter 5 h. utför en students t-test jämföra andelen av varje stam i experimentell behandling på t0 och T5. Om andelen av konkurrentstammen skiljer sig markant från den som gäller för referens stammen vid T5 (P < 0,05), tyder detta på att det kan ha uppstått en stam konkurrens. Gå vidare till steg 4.2.1.5.
      5. För att avgöra om förekomsten av konkurrentstammen minskar andelen referens stammen efter 5 timmar, utför en students t-test för att jämföra den andel av referens stammen i kontrollen med den andel av referens stammen som finns i experimentell behandling (referensstam v konkurrentstam).
        Anmärkning: om andelen av referens stammen är statistiskt sett lägre i den experimentella behandlingen i förhållande till kontrollen (P < 0,05), minskade konkurrentstammen signifikant den andel av referens stammen som låg efter 5 timmar och överkonkurrerade referens stammen.
    2. Beräkna log RCI-värdet för varje behandling (inklusive kontroll)
      Anmärkning: Det relativa konkurrens indexet, eller RCI, är ett enda värde som jämför hur kvoten för belastnings typer skiljer sig från utgångs förhållandet. RCI-värdet är log-transformeras så att ett log RCI-värde som är större än noll anger konkurrentstammen (CS) outtävlade referens stammen (RS), ett log RCI-värde som är mindre än noll anger referens stammen utkonkurrerade konkurrentstammen och en logg RCI värdet noll indikerar att varken stammen konkurrerades ut.
      1. Beräkna log RCI värden för varje kontroll och experimentell behandling med hjälp av följande ekvation:
        Log [(CST5 CFU ̧ RST5 cfus) ̧ (cst0 CFU ̧ RSt0 cfus)] = log RCI
      2. Graph log RCI värden med hjälp av en separerad låda & polisongar tomt där data är graferade i horisontell riktning (figur 3b).
      3. Bestäm om varje behandling var signifikant annorlunda än noll genom att utföra en students t-test jämföra log RCI värden för varje behandling (inklusive kontroll) till en datauppsättning som jämför samma antal replikat alla med ett nollvärde. Om log RCI värden för experimentell behandling är statistiskt större än noll (P < 0,05), då konkurrenten stam konkurrerade referens stammen.
        Anmärkning: Kontrollen bör inte vara statistiskt annorlunda än noll (P > 0,05), eftersom den Differentiellt taggade referensstammar är isogena.
      4. Utför en students t-test för att avgöra om log RCI-värden för experimentell behandling var signifikant större än kontrollen (P < 0,05). Om log RCI värden från experimentell behandling är statistiskt större än kontroll behandling, då konkurrenten stam konkurrerade referens stammen.
  3. Utför följande statistiska analys för att fastställa den mekanism genom vilken konkurrentstammen utkonkurrerar referens stammen: (i) analysera rå total CFU-data, eller (II) undersöka procentuell återhämtning av referens stammen. Dessa analyser kan vara mer besvärliga att visa i förhållande till de från steg 4,2, men kommer att identifiera om konkurrenten stammen utkonkurrerar referens stammen genom att växa ur det, hämma referensstam tillväxt, eller aktivt eliminera referens stammen.
    1. Analysera rå total CFU-data
      1. Diagram rå total CFU-data för båda stammarna med hjälp av ett Interleaved spridningsdiagram, där replikat visas som enskilda datapunkter (figur 4a). Visa data på en loggskala och lägga till en horisontell linje som anger den genomsnittliga t0 CFUs för båda stammarna.
      2. För att avgöra om förekomsten av konkurrenten stammen negativt påverkat referens stammen, utföra en students t-test jämföra referensstam CFUs för kontroll och experimentella behandlingar på T5. Om referens stammen CFUs i den experimentella behandlingen är statistiskt lägre än i kontrollen (P < 0,05), påverkade närvaron av konkurrentstammen signifikant referens stammen.
      3. För att avgöra om närvaron av konkurrenten stammen antingen hämmade tillväxten av eller elimineras referens stammen, utföra en students t-test jämföra referens stammen CFUs på t0 och T5 för kontroll och experimentella behandlingar.
        Anmärkning: I avsaknad av en konkurrent bör referens stammen uppvisa en signifikant ökning av CFU när t0 och T5 jämförs för kontroll behandling. Vid analys av experimentell behandling, om referensstam CFUs på T5 inte är statistiskt olika jämfört med t0 (P > 0,05), då konkurrenten stammen hämmade tillväxten av referens stammen. Om referens stammen T5 CFUs är betydligt lägre än t0 CFUs (P < 0,05), då konkurrenten stammen dödade referens stammen.
    2. Beräkna procentuell återhämtning av referens stammen
      1. Omvandla totala CFU-data för referens stammen (RS) till procent återställningsdata med hjälp av nedanstående ekvation:
      2. (RST5 cfus ̧ RSt0 cfus) x 100 =% återvinning av referensstam
      3. Visa procent återvinningen av referens stammen med hjälp av ett separerat stapeldiagram där varje stapel representerar antingen kontroll eller experimentell behandling (figur 4b). Lägg till en streckad linje vid y = 100 för att indikera 100% återhämtning av referens stammen (ingen ökning eller minskning av referens stammen CFUs från 0 h till 5 h).
      4. För att avgöra om konkurrenten stammen negativt påverkat referens stammen, utföra en students t-test jämföra referensstam procent återhämtning för kontroll behandling till experimentell behandling. Om den procentuella återhämtningen är betydligt mindre än kontrollen (P < 0,05), då konkurrenten stammen negativt påverkat referens stammen.
      5. För att fastställa om konkurrenten stammen hämmade tillväxten av eller elimineras referens stammen, utföra en students t-test jämföra referens stammen procent återhämtning för experimentell behandling och en datamängd med samma antal replikat alla med en värdet 100.
        Anmärkning: Om den experimentella behandlingen inte är statistiskt olik 100 (P > 0,05), då konkurrenten stammen hämmade tillväxten av referens stammen. Om referens stammen procent återhämtning i den experimentella behandlingen är betydligt lägre än 100 (P < 0,05), då konkurrenten stammen dödade referens stammen.
    3. Tolka fluorescensmikroskopi bilder
      1. När fluorescensmikroskopi bilder tas, avgöra om varje stam är synligt detekterbar i koinkubations punkten. För kontrollen coinkubation (referensstam pVSV102 + referensstam pVSV208), både GFP och RFP bör vara synlig från en koinkubations punkt. Om så inte är fallet, ställa in experimentet igen säkerställa stammar är korrekt märkta och coincubated på antibiotika-fria plattor.
      2. För varje experimentell koinkubations plats, kontrollera möjliga utfall.
        Anmärkning: Om konkurrenten stammen är synlig, men referens stammen inte upptäcks, som antyder konkurrenten stammen dödade eller hämmade tillväxten av referens stammen. Om båda stammarna är närvarande och jämnt blandade (GFP och RFP närvarande hela koinkubations platsen), dessa uppgifter tyder på konkurrenten stammen konkurrerar inte med referens stammen och båda stammarna samexistera. Om båda stammarna förekommer, men är rumsligt åtskilda (mikrokolonier av antingen GFP eller RFP finns i hela koinkubations platsen), tyder det på att referens stammen och konkurrentstammen kan delta i konkurrensmässiga interaktioner och ändringar av referens stammen eller det initiala koinkubations förhållandet kan krävas. Se diskussion för mer information.

5. avgöra om interaktion är kontakt beroende

Anmärkning: Om du upptäcker att en stam dödar eller hämmar referens stammen, interaktionen kan vara diffusible eller kontakt-beroende. För att avgöra om interaktionen är beroende av cell-cell kontakt, utföra en koinkubations analys som beskrivs ovan för steg 1-2 med följande ändringar.

  1. Utför steg 1.1-2.2.
  2. När stammar är normaliserade, fysiskt separata stammar med ett nitrocellulosa filter med en 0,22 mm porstorlek. Denna porstorlek möjliggör diffusion av antimikrobiella medel och små molekyler, men förhindrar fysisk kontakt mellan V. fischeri celler.
    Anmärkning: Om interaktionen är beroende av cell-cell kontakt, separation av referens stammen från konkurrenten stam med filtret bör upphäva avlivning eller hämmande fenotyp och referens stammen bör inte ha minskat cfus. Om interaktionen inte är beroende av cell-cell kontakt, och är en diffus mekanism, separera stammarna bör inte hindra konkurrenten stammen från att döda referens stammen.
    1. Spot 5 mL av referens stammen på mitten av ett filter och plats 5 mL av konkurrenten stammen på mitten av ett annat filter. Placera filtret som innehåller referens stammen på ytan av en LBS-agarplatta. Placera filtret som innehåller konkurrentstammen direkt ovanpå filtret med referens stammen.
      Anmärkning: Varje stam är fläckig på filter snarare än botten stammen fläckig direkt på agarplattan så att stammar kan vara lättare placeras direkt ovanpå varandra.
    2. Om det finns farhågor om att stammar inte staplas direkt ovanpå varandra, minska volymen av referensstam inokulum fläckig på filtret. Detta kommer att säkerställa att området för referens stammen platsen är mindre och helt över eller under konkurrentstammen. Suppleant vilken stam är på toppen och på botten för att redogöra för skillnader i diffusion av näringsämnen från agarmediet.
    3. För att säkerställa att filtret tillåter diffusion av små molekyler, inkludera en kontroll behandling där referens stammen är fläckig på ett filter och ett antibiotikum som den är känslig för (kloramfenikol) är fläckig på den andra. Stapla filtren direkt ovanpå varandra och placera på en LBS-agarplatta. Antibiotikumet bör kunna diffusa genom filtret och bör döda referens stammen.
  3. Inkubera plattorna med filter vid 24 ° c i 5 h. Invertera inte agarplattan när du inkuberas för att undvika att flytta filtren.
  4. Utför seriella utspädningar för startinoculum enligt steg 2,4.
  5. Ta slutliga mätningar
    1. Använda sterila pincett, överföra varje uppsättning av filter till en 50 mL Falcon tub som innehåller 5 mL LBS buljong. Se till att filtren är fysiskt åtskilda i röret för att möjliggöra fullständig återfjädring av varje typ av stam.
    2. Omsuspendera stammar från filter genom att Pipettera upp och ner tills filtren är klara för alla celler. Använd pincett för att rotera filtren och rensa cell material från båda sidor. Sterilisera pincett med etanol mellan proverna.
    3. Utför seriell utspädning för T-finalen enligt steg 2,5. Vid beräkning av total CFUs för T slutlig, justera "total volym av outspädd prov" från 1 mL till 5 mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att kunna bedöma de konkurrensmässiga interaktionerna mellan bakterie populationer utvecklades och optimerades en koinkuberingstest för V. fischeri. Denna metod använder stabila plasmider som kodar antibiotikaresistens gener och fluorescerande proteiner, möjliggör differentiell urval och visuell diskriminering av varje stam. Genom att analysera data som samlats in från koinkubations analysen kan det konkurrensmässiga utfallet av en interaktion och Interaktionsmekanismen identifieras. Som ett exempel utfördes följande experiment med V. fischeri isolat. Coincubated stammar hyste en av två stabila plasmider: pVSV102 uttrycker kanamycin resistens och GFP +, eller pVSV208 uttrycker kloramfenikol resistens och DsRed +. I exempeldata, stammar blandades i en 1:1 förhållande och inkuberades på LBS agar plattor för 5 h. Som en kontroll behandling, differentially taggade versioner av referens stammen var coincubated med varandra. De experimentella behandlingarna utfördes med referens stammen (harboring pVSV102) och antingen konkurrentstam 1 eller konkurrentstam 2 (härborrning pVSV208). Kulturer av varje stam bereddes och coinkuberades enligt beskrivningen ovan och som visas i figur 1 och figur 2.

I figur 3, data analyseras för att avgöra om konkurrenten stam 1 eller 2 konkurrerade ut referens stammen presenteras på två sätt. I figur 3aberäknades andelen av varje typ av stam för varje tidspunkt under experimentet enligt steg 4.2.1. I de experimentella behandlingarna visar prov data referens stammen och konkurrentstammen 1 finns i en proportion av 0,5 i början (0 h) och (5 h) av experimentet, vilket är förenligt med vad som observeras vid kontrollbehandlingen. Dessa uppgifter visar att andelen stammar inte ändras efter en 5 h koinkubation, och därför observerades ingen konkurrens. När referens stammen inkuberades med konkurrentstam 2 var referens stammen däremot närvarande i en proportion av 0,5 i början (0 h), och en andel < 0,01 i slutet (5 h) av försöket, vilket var betydligt lägre än den kontroll som behandling (Students t-test: P < 0,001). Dessa uppgifter tyder på att andelen av referens stammen minskade i närvaro av konkurrentstam 2, och föreslår därför konkurrens mellan konkurrent stam 2 och referens stammen inträffade. Denna typ av analys bör tillämpas när man fastställer hur andelen stammar inom en gemenskap förändras över tiden men inte kan användas för att fastställa mekanismen för den konkurrensmässiga interaktionen, och bör därför kombineras med ytterligare analys. Till exempel kan den andel av referens stammen som minskar i närvaro av konkurrentstam 2 hänföras till flera typer av interaktioner: (i) stam 2 växte snabbare än referens stammen, (II) stam 2 hämmade tillväxten av referens stam, eller (III) stam 2 eliminerade referens stammen genom avlivning.

I figur 3bberäknades log relative Competitive index (RCI) för varje behandling enligt steg 4.2.2. När referens stammen inkuberades med konkurrentstam 1, var log RCI-värdena inte statistiskt skilda från noll eller från kontrollbehandlingen (P > 0,05), vilket tyder på att konkurrensen mellan stammar inte observerades. När referens stammen inkuberades med konkurrentstam 2 var dock log RCI-värdena signifikant större än noll och kontrollbehandlingen (Students t-test: P < 0,001). Dessa data tyder på stam 2 outkonkurrerade referens stammen. Analysera log RCI värden ger en enkel metod för att avgöra om en stam utkonkurrerade den andra under inkubationstiden. Eftersom denna analys innehåller förhållandet mellan stammar i slutet (5 h) och början (0 h) av experimentet, kan utgångs förhållandet dramatiskt påverka resultatet. Därför bör utgångs förhållandet undersökas och övervägas när man följer slutsatser från log RCI-data. Dessutom ger denna analys inte information om konkurrensmekanismen och rapporterar helt enkelt hur kvoten mellan stammar förändras under inkubationen.

Figur 4 visar två metoder för dataanalys för att fastställa mekanismen för konkurrens för en viss interaktion. I figur 4avisas totalt cfus för varje stam vid varje tidspunkt i experimentet. När referens stammen inkuberades med konkurrentstam 1, CFUs av båda stammarna öka under loppet av 5 h och CFUs för referens stammen var inte signifikant skiljer sig från stam 1 eller kontroll vid 5 h (P > 0,05). Dessa uppgifter tyder på att referens stammen ökade i närvaro av stam 1, och tyder på att ingen konkurrens inträffade. Emellertid, när referens stammen inkuberades med konkurrent stam 2, stam 2 CFUs ökade efter 5 h men CFUs för referens stammen minskade. Referensstam CFUs var signifikant lägre än stam 2 CFUs och kontroll vid 5 h (Students t-test: P < 0,002). Dessa data indikerar att referens stammen CFUs minskning i närvaro av stam 2, och föreslå stam 2 dödar referensstam celler. Om referens stammen inte visade en minskning av CFUs, utan snarare ingen förändring (ingen statistisk skillnad mellan referensstam CFUs vid 0 h och 5 h), dessa data skulle föreslå stam 2 outkonkurrerade referens stammen genom att hämma tillväxten av referens stammen. Analysera otransformerade totala CFU data är särskilt informativ, som CFUs för båda stammarna vid varje tidpunkt visas självständigt och kan användas för att identifiera mekanismen för konkurrens.

Figur 4b visar den procentuella återvinningen av referens stammen för att avgöra hur närvaron av en konkurrentstam påverkar referens stammen. När referens stammen var inkuberades med konkurrent stam 1, en ~ 3 200 procent återhämtning observerades, som inte var statistiskt skiljer sig från kontrollen och indikerar stam 1 påverkade inte den procentuella återhämtningen av referens stammen. När referens stammen inkuberades med konkurrentstam 2 observerades en återhämtning på ~ 4 procent, vilket var betydligt lägre än kontrollen (Students t-test: P < 0,002). Den procentuella återhämtningen var också betydligt mindre än 100 (Students t-test: P < 0,002), vilket indikerar stam 2 konkurrerade referens stammen genom att döda referensstam celler. Om procent återhämtningen inte var statistiskt annorlunda än 100, skulle dessa uppgifter tyder på stam 2 hämmade tillväxten av referens stammen. Procent återvinnings data ger ett förenklat sätt att karakterisera mekanismen för konkurrens genom att undersöka hur referens stammen populationen svarar på närvaron av en konkurrent stam. Men visar data på detta sätt utesluter information om utgångs förhållandet samt hur överflödet av konkurrenten stammen förändrats under inkubation.

Figure 1
Figur 1: flödesschema som illustrerar koinkubations analysen. A) bakteriestammar som härbärsar antingen pVSV102 (referensstam som anges Ref. stam eller R.S.) eller pVSV208 (konkurrentstam som anges comp. Strain eller C.S.) odlas separat på selektivt medium för antingen referens stammen (lbs kan) eller konkurrent stam (LBS Cam). Stammar sedan återsuspenderas i LBS buljong och normaliserade till en OD = 1,0. Breferens stammen och konkurrentstammen blandas med en volym på 1:1 volymprocent. En seriell utspädning utförs med denna blandning för att bestämma CFUs för båda stammarna vid 0 h. (C) stam blandningen sedan upptäckas på 24-väl plattor som innehåller lbs agar. Varje replikat är fläckig i sin egen brunn. Fläckar tillåts torka och sedan inkuberas vid 24 ° c i 5 h. Efter 5 h, en seriell utspädning utförs för att kvantifiera CFUs för varje stam. (D) stam blandningen från panel B är också fläckig på lbs agar petriskålar som får torka och inkuberas vid 24 ° c under 24 timmar. Vid 24 timmar, är koinkubations platsen avbildad med ett fluorescensdissekera Mikroskop som är anpassat för att detektera grönt (referensstam) och röd (konkurrentstam) fluorescens. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa bilder av plåtar som krävs för en seriell utspädning. (A) 96-brunn-plåt som används för att utföra seriell utspädning. Plattan roteras så att det finns 12 rader och 8 kolumner. Deskriptorer för varje behandling omfattar de stammar som används och plasmiderna de hyser (t. ex. referensstam med pVSV102 och Konkurrentstam med pVSV208) och replikat nummer för varje rad (R1, R2, R3 eller R4). Den första kolumnen är det outspädda provet och varje kolumn till höger representerar en 10-faldig utspädning från föregående kolumn (utspädningsfaktor som anges ovan). (B) lbs-agar platta som används för att bestämma cfus för referens stammen på lbs kan tallrikar (överst) och konkurrent stam på lbs Cam plattor (botten) från experimentell behandling. Varje rad är en replikat i en behandling (t. ex. R1) och utspädningsfaktorn för varje spot listas överst på plattan. Antalet CFUs räknas för varje replikat anges till höger. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: stickprovsdata för att bedöma huruvida konkurrentstammar konkurrerar med referens stammen. (A) andelen coincubating stammar hyser antingen pVSV102 (mörkgrå) eller pVSV208 (ljusgrå). R.S. indikerar referens stammen och C.S. indikerar konkurrentstammen. Streckad horisontell linje indikerar en andel på 0,5. Asterisk anger referens stammen består av en statistiskt mindre andel av befolkningen än konkurrenten stam eller referensstam i kontrollen vid 5 h (Students t-test: P < 0,001); ns indikerar inte signifikant (P > 0,05). (B) log relativ konkurrens index (RCI) för koinkubations analyser. Streckad vertikal linje indikerar log RCI = noll. Asterisk anger log RCI värdet är statistiskt större än noll och kontroll (Students t-test: P < 0,001). Felstaplarna indikerar SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: stickprovsdata för att fastställa mekanismen för konkurrens. A) totalt antal CFU-värden för koinkubations analyser utförda med V. fischeri -isolat som differentially märkts med antingen pVSV102 eller pVSV208. CFUs samlades in i början av experimentet (0 h) och efter 5 h inkubation. R.S. indikerar referensstam och C.S. indikerar konkurrentstam. Streckad horisontell linje indikerar genomsnittet 0 h CFUs för båda stammarna; asterisk indikerar referensstam CFUs var statistiskt lägre i experimentell behandling i förhållande till kontroll behandling vid 5 h (Students t-test: P < 0,002). B) procentuell återhämtning av referens stammen. Horisontell streckad linje indikerar 100% återhämtning (ingen ökning eller minskning av CFUs); asterisk indikerar procent återhämtning var statistiskt lägre än 100% och kontroll behandling (Students t-test: P < 0,002). Felstaplarna indikerar SEM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: exempeldata för inkubationstid och bild optimering. (A) totalt cfus för koinkubations test där cfus samlades in i början av experimentet (0 h), efter 5, 12, och 24 h inkubation. R.S. indikerar referensstam och C. S. 2 indikerar konkurrentstam 2. Streckad horisontell linje indikerar genomsnittet 0 h CFUs för båda stammarna; asterisker indikerar referensstam CFUs var statistiskt lägre i den experimentella behandlingen i förhållande till kontrollbehandlingen vid den givna tidpunkten (Students t-test: P < 0,002). Felstaplarna indikerar SEM. (B) fluorescerande mikroskopi bilder som motsvarar CFU-data i panel A. skalstapel = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Exempeldata för optimering av koinkubations grad. Coinkubations experiment utfördes mellan referens stammen (R.S.) pVSV102 (grön, övre raden) och konkurrentstam (C.S.) som härdade pVSV208 (röd, nedersta raden) och fluorescerande mikroskopi bilder togs vid 24 h. (a) stammar blandades i ett 1:1-förhållande eller (B) en 1:5-kvot där referens stammen, som innehöll pVSV102, var mer än en av de konkurrentstam som innehöll pVSV208. Scale bar = 1 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den coinkubations analys som beskrivs ovan ger en kraftfull metod för att upptäcka interbakteriell konkurrens. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde identifiering av intraspecifika konkurrens mellan V. fischeri isolat och karaktärisering av konkurrensmekanismen19. Även om den beskrivna metoden var optimerad för marin bakterien V. fischeri, kan den lätt modifieras för att rymma andra bakteriearter, inklusive kliniska och miljöisolerade isolat. Det är viktigt att notera att konkurrenshämmande mekanismer ofta regleras villkorligt5,6,23,24,25,26,27 , 28, således kan små skillnader i tillväxtförhållanden (t. ex. skakningar mot stående kultur, temperatur etc.) och medietyp (t. ex. salthalt) dramatiskt påverka resultaten. Därför är det sannolikt nödvändigt att optimera koinkubations förhållanden för olika bakteriearter samt olika konkurrensmekanismer. Det är bäst att välja odlingsförhållanden som nära återspeglar isolat naturliga miljö. Till exempel, coinkubations analyser mellan V. fischeri stammar utfördes med lbs media vid 24 ° c, för att återspegla salthalt och temperatur i den marina miljön. Men vissa bakterier är naturligtvis kompetenta i sin omgivning27,28 och kan därför ta upp genetiskt material som frigörs genom lyserade celler under antagonistiska interaktioner29. För att förhindra att sådan DNA-överföring påverkar koinkubations resultaten är det viktigt att använda villkor som inte främjar kompetens eller stammar som inte är kompetenta, antingen naturligt eller genom inaktivering av DNA-upptagningsmaskiner. Dessutom kan experimentella parametrar såsom celltillväxt fas, odlings täthet, inkubationstid, eller start stam förhållande också kräva optimering för olika bakteriearter eller konkurrenshämmande mekanismer. Till exempel kommer den initiala Odlingstätheten att diktera mängden cell cells kontakt mellan stammar, vilket kan påverka bakteriernas förmåga att driftsätta kontaktberoende mekanismer för konkurrens.

I figur 5a visas optimeringsprocessen för koinkubationsanalyser med V. fischeri -isolat. Här utvärderades en rad inkubationstider för CFU-insamling och fluorescerande mikroskopi-avbildning för att fastställa den optimala tiden för varje mätvärde som ska samlas in. CFUs samlades in omedelbart efter blandningen av referens stammen och konkurrent stam 2 sågs på LBS agar tallrikar (0 h), och CFU mätningar och fluorescerande mikroskopi bilder togs omedelbart och efter 5, 12 och 24 h. Dessa exempeldata belyser vikten av grundlig optimering innan man drar några slutsatser om samspelet mellan två stammar. Till exempel, två olika slutsatser om mekanismen för interaktion kan härledas baserat på när CFUs samlas: CFUs från 5 eller 12 h indikerar stam 2 dödade referens stammen, medan CFUs samlas vid 24 h föreslå stam 2 hämmar tillväxten av referens stammen.

Den optimala tiden för visualisering av koinkubations punkter genom fluorescerande mikroskopi kan vara annorlunda än den optimala tiden för CFU-insamling. Figur 5b visar fluorescerande mikroskopibilder av koinkubations punkter vid 0, 5, 12 och 24 timmar. Vid 0 och 5 h, är koinkubations punkterna inte synliga med fluorescerande mikroskopi. För bilder tagna vid 12 h, båda stammarna i kontrollbehandlingen är synliga, men RFP (referens stammen härborrning pVSV208) är särskilt dimmer. I den experimentella behandlingen vid 12 timmar är konkurrentstam 2 synlig (ännu dim) och referens stammen är inte detekterbar. Stam-specifika skillnader mellan bakteriella isolat kan påverka uttrycket av fluorescerande proteiner, och därmed ljusstyrka av cellerna i den blandade fläcken. Eftersom RFP är särskilt svagare än GFP i kontrollen, bör koinkubations punkterna fortsätta att inkuberas och avbildas igen vid ett senare tillfälle. I bilder tagna vid 24 h, båda stammarna är synligt detekterbara och vid en liknande ljusstyrka i kontroll experimentet. I den experimentella behandlings stammen är 2 synlig medan referens stammen inte observeras inom koinkubations platsen. 15-24 h inkubationstid är tillräcklig för att visualisera GFP och RFP för V. fischeri med stabila plasmider PVSV102 respektive pVSV208, men inkubationstiden kan behöva justeras för olika plasmider eller bakteriearter. Även om den optimala tiden för visualisering av koinkubations punkter och samla CFU-data är olika, är avbildning vid 24 h ett bra sätt att snabbt avskärma interaktioner för V. fischeri, eftersom resultatet från avbildning vid 24 h (målet är synligt eller inte) återspeglar mer tidskrävande kvantitativa data som erhållits från plätering CFUs vid 5 eller 12 h.

Utgångs förhållandet kan avsevärt påverka resultaten, särskilt när inkuberande två hämmande stammar, och kan behöva justeras för att ta hänsyn till stam specifika skillnader i avlivning effektivitet eller tillväxttakt. Till exempel visar figur 6a fluorescerande mikroskopi bilder av experiment där referens stammen var coincubated med sig själv (kontroll) och tre andra V. fischeri isolat med början på en 1:1 förhållande. I dessa exempeldata upptäcks referens stammen synligt när inkuberas med sig själv, konkurrent stam 1, och konkurrent stam 3 efter 24 h. När utgångs förhållandet justerades till 1:5 (dvs. 50 mL referensstam blandat med 250 mL konkurrentstam) är referens stammen endast synligt när den koinkuberas med sig själv och stam 1, vilket indikerar att både stam 2 och stam 3 utkonkurreras referens stammen. Denna justering förhindrar den snabbare ökningstakten av referens stammen från att skymma effekten av eventuella interferenskonkurrensmekanismer som ställs ut av konkurrentstammarna. Baserat på resultaten i figur 6a, ett förhållande på 1:5 (referensstam: konkurrent stam) bör användas för att avskärma ytterligare V. fischeri stammar för förmågan att döda referens stammen.

Detta protokoll diskriminerar mellan coincubating stammar genom Differentiellt märkning stammar med plasmider som innehåller antingen kanamycin eller kloramfenikol resistens gener. Däremot kan olika antibiotika eller andra urvalsmetoder vara bättre lämpade för olika bakteriearter. Andra metoder för differential val kan innefatta: 1) utnyttja en stam/artspecifika auxotrophy för specifika tillväxtfaktorer (t. ex., DAP eller thymidine), 2) villkorliga tillväxt krav (t. ex. en stam växer vid 37 ° c medan den andra inte), eller 3) counterselektion markörer som eliminerar eller hämmar tillväxten av den taggade stammen när de odlas under lämpliga förhållanden för att uttrycka en "Kill" gen (t. ex., CCDB eller SACB).

Att välja lämplig referensstam är avgörande för att erhålla och tolka reproducerbara resultat från koinkubations analysen. En referensstam bör vara väl studerat (dvs., har en bred kropp av vetenskaplig litteratur), har ingen uppenbar dödande eller hämmande förmåga, och helst ha en sekvenserade genomet. Till exempel, vissa stammar av Escherichia coli är vanliga referensstammar för många bakteriella koinkubations experiment30,31. E. coli kan dock inte vara ekologiskt relevant för en viss konkurrensmekanism eller konkurrent, vilket kan påverka resultaten. Vissa bakterier kan till exempel ha utvecklat mekanismer som specifikt riktar sig till närbesläktade arter eller konkurrenter för samma ekologiska nisch och deras konkurrensmekanism skulle inte vara effektiv mot en referensstam av E. coli .

Sammanfattnings, den metod som beskrivs här syftar till att ge en lätt modifierad och robust metod för att utvärdera interbakteriell interaktioner och konkurrens. Denna metod kan tillämpas på bakteriella isolat relevanta för miljö-eller klinisk forskning, och kan användas för att utforska olika mekanismer för mikrobiell interaktion som tidigare har varit okända eller svåra att undersöka.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka recensenter för deras hjälpsamma feedback. A.N.S. stöddes av Gordon och Betty Moore Foundation genom Grant GBMF 255,03 till Life Sciences Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

Tags

Immunologi och infektion störnings konkurrens fluorescens mikroskopi Aliivibrio fischeri interstrain interaktioner interaktioner mellan arter interbakteriell avlivning
Koinkubations-analys för kvantifiering av konkurrerande interaktioner mellan <em>Vibrio fischeri</em> -isolat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Speare, L., Septer, A. N.… More

Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter