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Biochemistry

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

doi: 10.3791/59760 Published: March 10, 2020

Summary

우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

Abstract

선형 mRNA 이외에, 많은 진핵 유전자는 원형 RNA를 생성합니다. 대부분의 원형 RNA는 5' 스플라이스 사이트와 사전 mRNA 내의 스플라이스 사이트, 백 스플라이싱이라는 프로세스를 결합하여 생성됩니다. 이 순환은 스플라이스 사이트를 근접으로 가져오는 pre-mRNA에 있는 이차 구조물에 의해 아마 원조됩니다. 인간 유전자에서, Alu 요소는 이러한 이차 RNA 구조를 촉진하는 것으로 생각된다, 알루 요소는 풍부하고 사전 mRNA에서 반대 방향으로 존재 할 때 서로 기본 상보성을 전시. 여기서, 우리는 원형 RNA를 형성하는 리포터 유전자를 포함하는 큰, Alu 요소의 생성 및 분석을 기술한다. 복제 프로토콜의 최적화를 통해 최대 20kb 의 삽입 길이의 리포터 유전자를 생성할 수 있습니다. 공동 형질감염 실험에서의 분석을 통해 규제 요인을 식별할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 원형 RNA 형성에 관여하는 RNA 서열 및 세포 성분을 식별할 수 있다.

Introduction

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원형 RNA
원형 RNA (circRNAs)는 대부분의 유기체에서 발현되는 공유폐쇄된 단일 가닥 RNA입니다. 이들은 다운스트림 5' 스플라이스 사이트를 업스트림 3' 스플라이스 사이트로 결합하여 생성되며, 백스플라이싱(그림1A)이라고불리는 프로세스입니다. 30-40 nt만큼 짧은 염기 상보를 나타내는 pre-mRNA의 서열은 circRNA 형성을 위한 적당한 정렬로 역 스플라이스 사이트를가져온다 2. 인간에서, 알루 원소1은,게놈3의약 11%를 나타내며, 그들의 자기 상보성4,5로 인해 pre-mRNA에서 광범위한 이중 좌초 RNA 구조를 형성하고 따라서 circRNAs1의형성을 촉진한다.

현재, circRNAs의 3개의 중요한 기능은 기술되었습니다. 일부 circRNAs 는 miRNA (miRNAs)를 결합하고 miRNA 스폰지6과같은 격리 행위를 통해 . CircRNAs는 전사 및 사후 전사 조절에 연루되어 있으며, 선형 접합7과의 경쟁 또는 전사 인자 활성의 변조를 통해8. 마지막으로, circRNAs는 짧은 오픈 독서 프레임과 원리 연구의 증거를 포함 그들은9,10번역 될 수 있음을 보여줍니다 . 그러나 대부분의 circRNAs의 기능은 수수께끼로 남아 있습니다. 원형 RNA의 대부분은 차세대 염기서열 분석법11을사용하여 검출되었습니다. 표적으로 한 RT-PCR 접근을 사용하여 개별 적인 유전자의 상세한 분석은 원형 RNA의 다수가 발견될 남아 있다는 것을12를밝힙입니다.

리포터 유전자를 사용하여 전 mRNA 처리를 분석합니다.
세포내로 형질감염된 DNA 리포터 구조에서 유래된 mRNA의 분석은 원형 RNA에 적용될 수 있는 대체 사전 mRNA 접합을 연구하는 잘 확립된 방법이다. 일반적으로, 대안 엑손, 그 주변 인트론 및 구성 엑손은 진핵 발현 벡터로 증폭되고 복제된다. 인트론은 종종 단축됩니다. 구성은 진핵 세포로 형질 감염되고 일반적으로 RT-PCR13,14에의해 분석됩니다. 이 접근법은 공동 형질전환 실험13,15,16,17,18에서규제 스플라이스 사이트 및 트랜스 행동 요인을 매핑하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 또한, 단백질 발현 미니유전자의 생성은 대체 스플리팅19,20을변화시키는 물질의 스크리닝을 허용한다.

이 방법은 원형 RNA에 적용되었습니다. 현재, 적어도 12개의 미니진 백본이 문헌에 기재되어 있으며 표 1에요약되어 있다. tRNA 기반 발현시스템(21,22)을제외하고, 이들은 모두 폴리머라제 II 프로모터에 의존한다. 여기서, 우리는 순환 RNA의 생성에 관여하는 시스 및 트랜스 연기 인자를 결정하기 위해 인간 리포터 미니유전자를 생성하는 방법을 설명한다. 게시된 리포터유전자(23)의 서열을 사용하는 방법의 개요는 도 1에도시되어 있다.

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Protocol

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1. 구문 설계

  1. UCSC 게놈 브라우저24를 사용하여 원형 RNA 형성에 필요한 반복적 요소를 식별하고 이를 구성에 통합합니다. 중요한 것은, 증폭을 위한 프라이머는 반복적인 요소 외부에 있어야 합니다.
  2. 원형 RNA 서열(보충도1은 시험 서열)을 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start 넣고 올바른 유기체를 선택한다. 시퀀스를 제출하고 브라우저 보기로 이동하여 1.5배 또는 적절하게 축소합니다(그림2A).
    참고: 검색 순서가 맨 위 줄에나타납니다(그림 2A, 1). 원형 RNA의 엑온의 순서에 따라 BLAT는 모든 엑소온을 연결하지 않습니다. 이 예에서, 엑온12(도 2A, 4)는11에 연결되지 않음(도 2A, 2, 3),왜냐하면 엑온(12)은 원형 RNA 서열에서 엑온(11)의 상류이기 때문이다(보충도1). 반복요소는 상자로 표시된 '반복 마스크' 트랙에 있으며, 여기서 검은색에서 회색으로 는 진화적 보존을나타냅니다(그림 2A, 5).
  3. 반복 요소 위에 마우스를 사용하여 부동 창에서 하위 유형을 식별합니다. Alu 요소는 SINE (짧은 산재 핵 원소) 라인에 있습니다. 그림 2와 다른 그림을 가져온 경우 창 아래의 '기본 트랙' 버튼을 사용하여 브라우저를 재설정합니다.
    참고 : 유전자 디스플레이의 엑온을 통해 mousing는 컴퓨터가 생성되는 엑온 번호와 창을 생성합니다. 이 숫자는 문헌에 설정된 엑슨 번호매기기와 일치하지 않으며 이소폼 간에도 변경됩니다.

2. 표현 벡터에서 복제할 시퀀스를 선택합니다.

  1. UCSC 게놈 브라우저의 상단 라인에서 보기 → DNA로 이동하여 창에 표시된 DNA 서열을 다운로드한다. 시퀀싱 서식 지정 옵션에서 확장 대/면/색상 옵션을선택합니다.
  2. 기본 케이스를 Lower로 선택하고 NCBI refseq에대해 대/소문자를 선택합니다. 반복 마스크에 대해 밑줄을 선택하고 굵게 및 기울임꼴을 선택합니다. 제출을 클릭합니다. 작은 글자로 대문자와 인트론으로 엑손이있을 것입니다. 엑손/인트론 테두리를 확인합니다.
  3. 이 예제에서는 브라우저가 역보수를 보여 주는 'ccctttacCTTTTTTTTTTT' 시퀀스가 있습니다. 이 경우, 돌아가서 올바른 엑손 인트론 테두리 (agEXONgt)를 볼 때까지 역보수 상자를 선택, 이 예에서 AAAAAGgtaaaggg.
  4. 올바른 방향으로 파일을 복사 (내부 엑소온은 인트로닉 ag에 둘러싸여 있습니다 ... gt) 워드 프로세싱 문서에 넣고 엑시온을 강조 표시합니다(추가그림 2).
    참고: 이 예에서는, 엑소9-12를 포괄하는 게놈 단편은 약 24 kb이고 따라서 게놈 DNA에서 증폭되기에는 너무 큽합니다. 따라서 약 1kb 의 인트로닉 영역으로 둘러싸인 각 엑온은 개별적으로 증폭되고 이들 4개의 단편은 복제 벡터로 조립된다.
  5. 증폭될 단편을 선택한다(엑손±500 nt 인트론). 이 지역의 프라이머가 특정 서열을 증폭시키지 않으므로 인트론이 반복적 인 영역에서 시작하거나 끝나지 않도록하십시오. 선택한 영역은 그림 2B에표시되고 해당 서열은 추가 그림 3에표시됩니다.
    참고: 일반적으로 구문이 클수록 복제가 더 어려워집니다. 단편은 단계 현명한 조립될 수 있다(즉, 엑온 9는 벡터와 결합되고 다음 단계에서 엑온(10)은 모든 엑소온이 제자리에 있을 때까지 복제를 통해 이 구안에 도입되거나, 대안적으로, 모든 단편들이 동시에 조립된다. 단계별 접근 방식은 항상 작동하지만 더 많은 시간이 필요합니다. 동시 어셈블리는 항상 작동하지 않으며 개별 단편이 게놈 DNA에서 얼마나 잘 증폭될 수 있는지, 그리고 구성물의 전체 크기에 따라 달라집니다. 따라서 우리는 일반적으로 동시에 두 가지 접근 법으로 시작합니다.

3. 복제를 위한 디자인 프라이머

  1. 도구(https://nebuilder.neb.com/#!/)를사용하여 복제용 프라이머를 디자인합니다. 예를 들어, 이 도구에 조각 9, 10, 11 및 12 및 벡터 서열(보충도 3)을입력합니다.
  2. 벡터 서열의 경우 삽입 부위를 마지막 뉴클레오티드로 추가하고 이후에 단편을 추가합니다. 벡터 번호 매기기는 지정된 삽입 사이트로 시작되지 않으므로 벡터에 삽입된 사이트가 위치하고 다운스트림 부분이 업스트림 시퀀스 앞에 배치됩니다. 이 예에서 삽입은 HindIII [AAGCTT] 사이트 직후에 시작되고 pcDNA3.1의 PmeI [GTTTAAAC] 사이트 직후에 종료됩니다. cccgctgatcag에서 시퀀스 ... ccgtaaaaggcc는 pcDNA3.1 서열에서 위치 1 앞에 붙여 넣습니다 (gttgctggttttttcc ...).
  3. 융점이 4 °C 이상 떨어져 있는 경우 프라이머를 조정합니다. 설계된 조각 및 프라이머 서열의 조립은 보충 그림 4에나와 있습니다. 복제용 프라이머도수동으로 25를설계할 수 있습니다.

4. PCR 및 앰플리곤 감지

  1. 표준 PCR 반응: 반응당 총 부피 50 μL에 대한 반응 혼합을 만듭니다. 다음은 폴리머라제 1을 사용한 한 가지 반응에 대한 레시피입니다.
    5x 반응 버퍼의 10 μL
    1μL 의 10 mM dNTP
    2.5 μL 10 μM 포워드 프라이머
    2.5 μL 10 μM 리버스 프라이머
    0.5 μL 의 폴리머라제 1
    32.5 μL 의 뉴클레아제 프리 H2O
    1. 선택적으로, 제품에 높은 GC 함량이있는 경우 5x GC 인핸서의 10 μL을 추가하십시오. PCR 반응을 테스트하기 위해 GC 인핸서를 포함하는 별도의 믹스를 확인합니다.
  2. 반응 샘플당 PCR 튜브내로 혼합의 49 μL을 Aliquot.
  3. PCR에 DNA 1 μL을 추가하면 양은 10 pg에서 1 ng까지 다양합니다.
  4. 샘플을 스핀다운하여 측면의 잔류물을 제거하고 PCR 기계에 넣습니다. PCR 조건을 최적화할 때 동일한 장비와 동일한 장비 스팟을 사용하십시오.

5. 다른 폴리머라제의 사용을 위한 더 긴 DNA 단편을 위한 최적화

  1. 온도
    1. 장거리 폴리머라제 2를 최적화합니다.
      1. 더 낮은 변성 온도(폴리머라제 1: 98°C, 폴리머라제 2: 94°C)를 사용한다.
      2. 더 긴 변성 시간 (폴리머 라제 1 : 10 s, 폴리머 라제 2 : 30 s)를 사용하십시오.
      3. 더 긴 어닐링 시간(폴리머라제 1: 30s, 폴리머라제 2: 60s)을 사용하십시오.
      4. 연장 시간(폴리머라제 1: 30s/kb, 폴리머라제 2: 50s/kb)을 사용하십시오.
      5. 낮은 확장 온도(폴리머라제 1: 72°C, 폴리머라제 2: 65°C)를 사용한다.
      6. 프라이머의 Tm 아래 5 °C 의 어닐링 온도를 사용하십시오.
    2. 프라이머 농도를 최적화합니다(원래 프라이머 농도보다 5배 더 적은 5배). 10 pg에서 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng까지 DNA 농도를 최적화합니다.
    3. 폴리머라제 2를 사용하여 15kb 제품 크기를 증폭시키는 PCR 프로그램의 예로, 30초 동안 94°C에서 초기 변성, 30초 동안 94°C에서 DNA 변위를 수행한 다음 30초 동안 58°C에서 어닐링을 수행하고, DNA 확장을 65°C에서 12분 30초동안 수행합니다. 최종 4°C 홀드로 10분 동안 65°C에서 최종 연장을 수행합니다.
      참고: 각 폴리머라제에 특정한 웹 기반 온도 계산에 의해 결정된 프라이머에 대한 어닐링 온도(Ta)입니다. 확장 시간은 다를 수 있으며 조각이 10kb보다 큰 경우 최적화해야 합니다.
  2. 연장 시간 및 DNA 농도
    1. 6kb 이상 DNA 조각에 대해 더 긴 연장 시간을 사용하십시오: 1kb당 1분. 더 긴 단편은 더 적은 DNA를 이용해야 합니다.
    2. 증폭을 위한 최적 DNA 농도를 찾기 위하여 DNA의 희석을 능력을 발휘합니다, 일반적으로 플라스미드를 위한 1 pg to 1 ng 또는 게놈 DNA를 위한 1 ng 1 μg.
      참고: 대부분의 복제용 폴리머라제 1은 Sso7d DNA 결합 도메인을 독점적인 열안정 DNA 폴리머라제26에융합하여 설계한다. 중합효소는 낮은 오차율을 가지며 Sso7d 도메인으로 인해 높은 공정성을 가지며, 대형(10-15 kb) 게놈 단편을 증폭하는 데 필요하다. 이러한 큰 단편 크기로 인해, DNA분자(27)의 효소 조립은 제한 효소를 필요로 하지 않기 때문에 벡터내로 삽입하는데 사용된다. 15kb 보다 긴 파편의 증폭은 폴리머라제 1을 사용하면 점점 더 어려워집니다. 큰 조각 증폭을 위해 사용 폴리머 라제 2 는 sso7d에 융합 된 교정 폴리머 라제 또는 더 높은 오류 율을 제공하는 장거리 PCR 키트와 같은 파이로 코커스로만든 폴리머 라제 2를 사용합니다.

6. 복제를위한 PCR 제품의 정화

  1. 인터칼레이팅 핵산 얼룩을 함유한 1% 아가로즈 젤(예를 들어, 1x GelGreen)에 PCR 제품의 절반을 실행합니다. 다크 리더 트랜스일루미에이터에서 스테인드 젤을 시각화합니다. 이 염색된 DNA는 크기에 충실하게 실행되지 않습니다.
    참고 : GelGreen은 에티듐 브로마이드와 유사한 DNA로 인터케이터링하지만 DNA를 손상시키지 않는 파장인 약 500 nm (시안)의 빛에 의해 흥분되어 복제를 매우 향상시킵니다.
  2. 병행하여 PCR 제품의 절반을 에티듐 브로마이드로 염색한 후 염색된 1% 겔로 실행한다(그림3A, B).
  3. 스테인드 겔(step 6.1)으로부터 적당한 크기의 밴드를 소비하고 겔 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 DNA를 분리한다. 표준 프로토콜에서 편차에서, 일반적으로 DNA 농도가 낮기 때문에, 이중 증류수의 단지 20 μL에서 DNA를 용해합니다.
  4. 복제하기 전에, 농축 및 무결성을 위해 아가로즈 겔에 단리된 DNA를 확인한다(그림3B). 벡터 비율에 대한 2:1 어금니 삽입을 목표로 합니다. 여러 인서트를 사용하는 경우 비율은 2:2:2:1입니다.

7. DNA 조립 및 복제 검출

참고: 복제는 효소 DNA 조립 키트를 사용하여 사소한 수정으로 수행됩니다. 조립체는 50°C에서 60분 동안 수행되며 일반적으로 더 낮은 범위의 DNA가 조립(20-100 fmol/20 μL 반응)에 사용된다. 전체 반응 혼합은 화학 적 유능한 세포에 첨가되고 전체 세포는 6cm 한천 접시에 도금됩니다.

  1. 벡터를 결합하고 10 μL의 물에 1:2 몰 비(각각 20-500 fmol)로 삽입합니다.
  2. DNA 어셈블리 마스터 믹스 10 μL을 추가합니다.
  3. 50°C에서 60분 동안 샘플을 배양한다.
  4. 다음으로, 전체 조립 반응으로 유능한 세포를 변형시킵니다. 여기서, 대장균 균주 1 세포를 더 긴 또는 불안정한 구성을 위해 더 짧은 구수 또는 대장균 변형 2 세포를 사용한다. 세포는 50 μL 부피에 있어야 합니다.
  5. 얼음에 세포를 해동하고 유능한 세포에 냉각 조립 된 제품의 2 μL을 추가합니다. 튜브를 4-5회 가볍게 두드려 섞습니다. 소용돌이를 하지 마십시오.
  6. 혼합물을 얼음 위에 30 분 동안 놓습니다.
  7. 30s에 대한 42 °C에서 열 충격. 섞지 마십시오.
  8. 튜브를 다시 얼음으로 2분 동안 옮김을 옮김.
  9. 튜브에 실온 SOC 용지 950 μL을 추가합니다.
  10. 반응 튜브를 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
  11. 37°C에서 배양하는 동안 적절한 항생제로 따뜻한 선택 플레이트.
  12. 원심분리 (10,000 x g, 30 s)를 통해 세포를 펠렛하고 두 개의 선택 플레이트에 세포의 1/4 및 3/4을 플레이트화하고 밤새 37 °C에서 배양합니다.

8. 클론의 유효성 검사

  1. 감지를 위해 조립 부위에 걸쳐 PCR 프라이머를 사용하는 콜로니 PCR을사용합니다(그림 1C).
  2. 멸균 이쑤시개를 가지고 하나의 세균 성 식민지를 터치합니다.
  3. 식민지를 가진 이쑤시개를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 터치한 다음 항생제 한천 판에 이쑤시개를 줄무늬를 만들고, 37°C 또는 실온에서 줄무늬 플레이트를 배양하여 민감한 구조물을 하룻밤 동안 배양합니다.
  4. 콜로니와 접촉한 PCR 튜브를 검출 프라이머를 포함하는 PCR 혼합물로 오버레이합니다. 이들은 프라이머 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)를사용 하 여 설계 되었습니다. 이 프로그램에는 "[ccc]" 기호를 사용하여 정의된 시퀀스에서 프라이머 설계를 강제로 사용하여 어셈블리 접합부에서 프라이머를 선택하는 옵션이 있습니다. 양성 균주의 DNA는 시퀀싱에 의해 분리되고 검증됩니다.

9. 원형 RNA 발현 리포터 유전자 분석

  1. 분석을 위해, 진핵 세포로 기자 유전자를 transfect. 여기서 HEK293 셀(ATTC #CRL-1573)을 사용하여 높은 형질 감염 효율을 제공합니다. 비용을 절감하려면 PEI (폴리에틸렌 민) 솔루션을 사용하십시오.
  2. PEI 용액의 경우, 낮은 pH, pH2에서 물에 1 mg/mL에서 선형 폴리에틸렌하이민 염산염(PEI)을 용해시다. NaOH와 함께 pH를 7로 올입니다. 0.22 μm 필터가 있는 멸균 필터를 4°C에서 보관하십시오.
  3. 세포를 6개의 우물(우물당 약 150,000개의 세포)으로 분할하고 DMEM 미디어에서 10% FBS에서 하룻밤 사이에 자랍니다.
  4. 알리쿼트 1 μg의 리포터 유전자를 멸균 튜브에 넣고 150 mM NaCl을 여과한 멸균 균의 200 μL을 추가한다. 소용돌이에 의해 DNA와 혼합.
  5. 이 혼합물과 소용돌이에 PEI 용액을 추가하고 잠시 원심 분리기를 사용하여 튜브 바닥에 샘플을 수집합니다. PEI 3 μL당 1 μg의 DNA 비율을 사용하십시오.
  6. 실온에서 10분 동안 배양한 다음 HEK 293 세포에 직접 추가합니다.
  7. 37°C, 5%CO2,하룻밤에 HEK293 세포를 배양한다.
  8. RNA 절연 키트를 통해 RT-PCR용 RNA를 분리합니다.

10. 선형 RNA를 제거하는 RNase R 치료

  1. RNase가 없는 튜브에 총 RNA 10 μg를 사용하십시오.
  2. RNA에 10 μL의 10 μL을 추가합니다(0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2)를RNA에 추가합니다.
  3. RNA에 RNase R을 추가합니다 (1 μl = 20U).
  4. RNA에 1 μL의 글리콜 블루를 넣고 멸균수로 최대 100 μL의 부피를 가져옵니다.
  5. 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
  6. 페놀/클로로포름과 와류 100 μL을 1분 동안 넣으세요.
  7. 21,000 x g의 원심분리기를 1분 간 분리하여 위상을 분리합니다.
  8. 상수 (수성 상)를 취하고 1 개의 볼륨 (클로로포름 약 80 μL)을 추가하십시오.
  9. 소용돌이 1 분, 다음 1 분 동안 원심 분리단계를 분리합니다.
  10. 상급을 취하고, 1:10 vol KAc 및 2.5 vol 에탄올을 추가하고, 최고 속도 (21,000 x g)에서30 분 동안 4 °C에서 원심 분리기에서 -20 °C에서 침전하십시오. 하단에 작은 파란색 펠릿이있을 것입니다.
  11. 상급제를 제거하고 80 % 에탄올로 씻으하십시오. 실온에서 5분 동안 공기건조시키고 10 μL의 물에 녹입니다.

11. RT-PCR 분석

  1. RT 반응당 RNA 1 μg를 사용하십시오.
  2. 반응당 최종 총 부피 20 μL에 대한 반응 혼합을 확인합니다. 한 반응의 경우, 1 μL의 1 0mM dNTP, 0.1 M 디티오스레이톨 (DTT), 4 μL의 5 x 첫 번째 스트랜드 버퍼, 및 0.5 μL의 역 전사효소를 사용하십시오.
  3. Aliquot 6.5 μL의 반응 혼합물을 새로운 PCR 튜브로 혼합합니다.
  4. 프라이머를 한 믹스에 최대 5개까지 섞으세요. 그러나, 일부 프라이머는 PCR에서 다른 프라이머와 잘못 페어링될 수있다(도 5). 프라이머 서열은 표 2에있습니다. 우리는 일상적으로 유전자 특정 엑슨 접합 프라이머를 사용하지만 무작위 hexamers로 프라이밍도 가능합니다.
  5. 원하는 RT 반응 튜브에 1 μL 1μL의 1 μL을 추가합니다.
  6. PCR 반응 튜브에 RNA 1 μg를 추가합니다.
  7. RNase 프리 H2O를 총 부피 20 μL까지 추가하십시오.
  8. 튜브를 아래로 회전하여 튜브 측면의 잔류물을 제거하고 열순환기에서 놓습니다.
  9. 50°C에서 열전자전거에서 RT 반응을 50분 동안 실행합니다.
  10. RT cDNA를 -20°C에서 저장하거나 PCR 반응을 진행한다.

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Representative Results

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리포터 유전자는 원형 RNA 형성에 영향을 미치는 규제 요인의 결정을 허용합니다. 그러나, 이 리포터 유전자는 크고 수시로 DNA 구조물을 불안정하게 하는 반복적인 요소를 포함합니다. 큰 크기로 인해 종종 엑손과 작은 측면 내향성 부품을 포함하는 게놈 조각을 증폭시킴으로써 달성되는 인트론의 일부를 삭제해야합니다. 이 DNA 조각은 효소로 조립되어 제한 효소없이 시공할 수 있습니다.

마이크로투튜불 관련 단백질 타우(MAPT)로부터 생성된 원형 RNA의 예는 원형 RNA를 분석하기 위한 미니유전자 접근법의 적용을 나타낸다. 본 예에서 사용된 타우 9→12 미니유전자는 상이한 접합 인자로 공동 형질감염되었고 이러한 접합 인자의 효과는 RT-PCR에 의해 검출되었다(도6). 상이한 트랜스-행동 인자는 원형 RNA 및 선형 pre-mRNA 형성 둘 다에 영향을 미칩니다. 실험은 또한 원형 RNA 형성에 필요한 모든 서열 요소가 복제 된 단편에 국한되어 있음을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 기술의 개요입니다. (A)가상 유전자가 나타난다. 인트론은 라인, 엑손은 상자, Alu 요소는 작은 줄무늬 상자입니다. 엑시온 C에서 A로 의 백스플리싱은 원형 RNA를 생성한다. 이러한 원형 RNA의 구조는패널(E)에도시된다. (B)리포터 유전자를 생성하기 위해, 엑손 및 주변 인트론(각 면에 적어도 500 nt)이 증폭된다. 구문에는 일반적으로 인간에서 Alu 요소인 반복적인 요소가 포함되어야 합니다. 엑온 A의 업스트림은 추가적인 Alu 엘리먼트를 제공하기 위해 포함되었다. 게놈 파편은 그들의 측면 25 nts와 겹칩니다. (C)단편은 CMV 프로모터에 의해 구동되는 발현 벡터로 복제된다. 성공적인 재조합은 검출 프라이머에 의해 감지되고 시퀀싱에 의해 검증됩니다. (D)세포가 이 구문으로 트랜스시드됩니다. (e)원형 RNA는 원형 RNA 특이적 프라이머를 사용하여 증폭되고,바람직한 엑손 접합 프라이머이다. PCR 증폭 동안, 선형 RNA는 또한 증폭될 수 있다(G). (G)원형 RNA를 검출하는 데 사용되는 프라이머의 방향. 순방향 프라이머는 센스 배향(즉, RNA와 동일한 서열을 가짐)이고 역입문서는 안티센스 배향(즉, RNA의 역보체)이다. 선형 mRNA에 대한 RT-PCR과 는 달리, 역방향 프라이머는 정방향 프라이머의 상류이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 미니유전자 시공을 위한 시퀀스 선택. (a) 보충 도 1에 도시된 서열 후 브라우저 디스플레이는 BLAT를 사용하여 인간 게놈 데이터베이스에 대해 실행된다. 문헌 엑슨번호(36)는 유전자 디스플레이에 나타내며, 이들은 브라우저에 의해 주어진 수치와 상이하다.
1. 정렬 된 시퀀스는 'YourSeq'에 표시됩니다.
2-4. RNA의 원형으로 인해 BLAT는 선형 RNA에서와 마찬가지로 모든 엑소온을 선과 연결하지 않습니다. 엑온(10) 및 11(2 및 3에 해당)은 연결되지만, 엑소온(4)은 엑온(11)에 연결되지 않는다.
5. Alu 요소는 반복요소 트랙에 표시됩니다.
(B)계획된 구성과 게놈 DNA 사이의 서열 정렬.
6. 계획된 구문은 BLAT를 사용하여 데이터베이스에 대해 실행되었습니다.
7. 구문에 여러 Alu 요소가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 복제 전에 앰플리온의 예. (A)1x GelGreen을 함유한 1% 아가로즈 젤로 분리된 최적화된 PCR 제품. 개별 대역은 효소 DNA 어셈블리에 사용될 PCR 제품을 나타냅니다. (B)(A)에서밴드를 젤에서 잘라 정제하였다. 정제된 PCR 제품은 1% 아가로즈 겔상에 분리되었고, 이어서 에티듐 브로마이드로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 리포터 유전자의 제한 분석. 예로 사용된 타우 9-12 미니유전자는 주요 재조합을 배제하기 위해 지시된 제한 효소로 절단하였다. 레인 1: NcoI 예상 크기 735bp로 절단, 3345 bp, 6266 bp, XbaI 예상 크기 10346 bp, HindIII 예상 크기 3951 bp, 6395 bp, 레인 4 컷 SmaI 예상 크기 1168 bp, 1688 bp, 2708 bp, 4782 bp.

Figure 5
도 5: 프라이머 멀티플렉싱 및 RNase R 처리가 원형 RNA 검출에 미치는 영향. (A)인간 뇌 조직으로부터 유래된 샘플 A 및 B로부터의 cDNA를 원형 RNA 프라이머로 증폭시켰고, exon12_10 역및 exon10_11 순환타우를 순환시켰다. cDNA에 대한 역전사를 선형 및 원형 타우 RNA에 대한 프라이머와 함께 수행하였습니다. 타우 원형 RNA에 대응하는 예상 대역은 삼각형에 의해 도시된다. 다른 강한 밴드는 인간 게놈과 일치하지 않는 유물이다. (B)실험은 동일한 PCR 조건으로 반복하였으나, 역전사는 exon12_10 역프라이머로만 수행하였다. 시퀀싱을 통해 예상되는 밴드만 증폭되고 검증되었습니다. (C)RNA를 선형 RNA를 제거하는 RNase R로 처리하였다. 원형 RNA는 치료 후 검출 가능(왼쪽) 반면 선형 RNA는 더 이상 검출 가능한 신호를 제공하지 않습니다(오른쪽)이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: circRNA 리포터 유전자의 분석의 예. 1 μg의 타우9→1237리포터 유전자를 1 μg의 접합 인자로 형질감염하였다. RNA는 24시간 후 트랜스펙션을 분리하고 RT-PCR에 의해 분석되었다. (a)선형 타우 mRNA의 증폭. 로 인해 엑온의 대안 접합 10 두 밴드가 관찰된다. 이들의 비율은 접합 인자38,39의과발현으로 인해 변경됩니다. (B)원형 12→10타우RNA(23)의증폭. 일부 접합 인자, 특히 키나아제 clk2 및 SR 단백질 9G8과 같은 cdc2의 발현에 대한 타우 circRNA 발현의 의존성을 주목한다. (C)HIPK3의 원형 RNA를 동등한 하중을 나타내는 양성 대조군으로 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 원형 RNA를 발현하는 현재 의 미니유전자 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

원형 HIPK3 컨트롤 프라이머
HIPK3 역방향
HIPK3 포워드
TGCTTTCTACTTTTTTC
TCGGCCAGTCATGTATAA
선형 프라이머
타우 엑슨 12 리버스
타우 엑슨 9 포워드
CCCAATCTTCGACTACTC
TGTCAAGTCCAAGATGCT
원형 프라이머
서커스 exon12_10 리버스
서커스 exon10_11 앞으로
카카트타타타타타트GCACCTTTT
가그그그카그트GCAA

표 2: 프라이머 목록.

Supplemental Figure 1
보충 도 1: 타우 원형 RNA 시험 서열. MAPT 궤적으로부터의 원형 RNA에 대응하는 시험 서열. 다른 엑온은 밑줄, 작은 대문자 및 대형 캡으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Figure 2
보충 도 2: 계획된 미니유전자를 함유하는 게놈 서열. Exons는 색상으로 강조 표시되고 반복적인 요소는 밑줄, 기울임꼴 및 굵게 표시됩니다. 회색 차재는 프라이머를 생성하는 데 사용할 수 있는 복잡성이 낮은 측면 영역을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Figure 3
보충 도 3: 계획된 리포터 유전자의 서열. 벡터 서열 및 계획된 게놈 단편이 도시된다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Figure 4
추가 그림 4: 조립을 위한 프라이머 설계. 보조 도 3의 시퀀스가 빌더 도구에 입력되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Supplemental Figure 5
보충 도 5: 예로 사용된 타우 9->12 리포터 유전자의 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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일반적으로 원형 RNA는 낮은 풍부한1이며,이는 그들의 기능과 형성에 대한 연구를 복잡하게합니다. 선형 RNA13과유사하게, 리포터 미니유전자의 사용은 원형 RNA의 형성을 통제하는 시스 및 트랜스 행동 인자의 식별을 허용합니다. 따라서, 이 접근은 내인성 유전자를 사용하여 추가로 시험될 수 있는 가설을 생성합니다.

가장 중요한 단계는 리포터 유전자의 설계입니다. DNA 단편의 효소 조립 ("깁슨복제"27)은제한 부위와 무관한 대형 리포터 유전자의 구성을 허용하기 때문에이 설계를 용이하게합니다.

백 스플릿 사이트는 기자 유전자 구성에서 고려해야 할 측면 반전 반복을 통해 함께 가져온다. 반복은 게놈 브라우저 '반복 트랙'에 추가되고 이를 선택하면 방향이 표시됩니다. 단백질은 또한 원형 RNA 발현(28)에 필요한 보조 구조로 백 스립사이트를 강제할 수 있고 편향된 분석을 위해 1-2 kb의 측면 내향성 지구를 조사해야 한다는 것을 명심하십시오.

구성물의 안정성을 보장하기 위해 중요한 고려 사항은 박테리아 균주의 유형과 성장 조건입니다. 더 짧게, 간단한 구조 표준 복제 박테리아는 DH5 알파 (huA2 Δ (argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ (lacZ)M15 gyrA96 recA1 endA1 thi-1 hsdR17)과 거의 동일합니다. 6개 이상의 Alu 요소를 포함하는 긴 조각의 경우, "안정한" 유능한 세포는 재조합(recA) 및 엔도뉴클레아제(endA1)가 결여되어 있는 데 사용된다(F' proA+B+ lacIq □(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR)(아라-루) 7697 araD1 39 fhuA □lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacŹM15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR)rph spoT1 (mrr-hsdRMS-mcrBC). 낮은 변형 수로 표시된 재조합에 문제가 나타나면 변형 된 박테리아를 두 접시에 접시에 접시에 놓고 각각 30 ºC 및 37 ºC에서 성장하게하십시오. minigenes에 수많은 반복 요소의 존재로 인해, 그들은 완전히 2019 요금에서 플라스미드 당 약 $ 150에 대한 상업적으로 사용할 수있는 차세대 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱 할 필요가있다. 예제의 순서는 보충 그림 5에나와 있습니다. 또한, 구문의 새로운 더 큰 준비를 위한 제한 조각 길이 다형성 해석이 일상적으로 수행된다. 예를 들어, 1-4회 잘라낸 사이트를 사용하면 재조합을 배제하는 특성 밴드 패턴이 생성됩니다(그림4). 아가로즈 겔상에서 분리될 수 있는 단편의 특징적인 밴드 패턴을 제공하는 효소를 선택해야 한다.

원형 RNA는 백스플리케이팅 이벤트와 겹치는 엑온 정션 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석됩니다(그림1F). RNA의 원형 특성으로 인해, 역방향(즉, 안티센스) 프라이머는 전진(즉, 센스) 프라이머의상류(도 1G)이다. 풍부하게 발현된 동고도메인 상호작용 단백질 키나아제 3(HIPK3) 원형 RNA1을 검출하는 프라이머는 양성 대조군으로서 사용된다. HIPK3 및 minigene 특정 역프라이머는 동일한 튜브에 역으로 전사되어 비교가 가능합니다. PCR 반응은 원형 및 선형 pre-mRNAs의 처리 패턴을 비교하기 위해 선형 mRNAs를 증폭하는 프라이머로 수행됩니다. 선형 및 원형 RNA에 대한 프라이머가 혼합되었을 때 비정상적인 대역을 자주 관찰했습니다(도5),따라서 이들 샘플의 역전사를 분리하여 유지합니다.

원형 RNA의 RT-PCR 분석은 까다롭고 신중하게 제어해야 합니다. 민감하고 편리하지만 원형 RNA29에고유한 아티팩트를 생성할 수 있습니다. 역전사는 CONCATEmers를 생성하는 RNA 원 의 주위에 여러 번 움직일 수 있습니다. 대부분의 원형 RNA 리포터 유전자는 교차 혼성화할 수 있는 원형 RNA와 선형 RNA를 모두 생성하여 더 많은 PCR 아티팩트21,30,31을생성한다. 따라서 북부블롯(32) 또는 RNase보호(23)를사용하여 상이한 기술을 사용하여 PCR 제품을 시퀀싱하고 결과를 검증하는 것이 필수적이다.

설명되지 않은 밴드는 또한 선형 RNA의 비정상적인 증폭에서 비롯될 수 있다. 선형 RNA는 원형 RNA33 (도 5C)을풍부하게 하는 외핵성 RNase R을 사용하여 제거될 수 있다. RNase R 처리는 검출 프라이머의 초기 최적화에 도움이 되며 프라이머가 최적화되면 종종 생략될 수 있습니다.

대안적인 백스플리싱은 또한 게놈궤적(34)으로부터형성될 수 있는 다중 원형 RNA로서 설명되지 않은 밴드에 기여할 수 있다. 이러한 대안적인 백스플리싱은 종종 2개 이상의 반전된 반복 원소에 의해 형성된 경쟁적인 사전 mRNA 구조의 결과이다. 또한, 비밀 백 스플라이스 사이트는32,35. 실험 목표에 따라 Alu 요소를 반복하거나 구문에 추가할 수 있습니다. 상보성 영역 측면 백 스플릭 사이트로 짧을 수 있습니다 30-40 nt35 짧은 상보적 영역과 알루 요소의 교체는 원형 RNA 형성을 증가시킬 수있다2,이는 원형 RNA 형성을 개선하기 위해 테스트 할 수 있습니다. 백 스플리싱을 유발하는 사전 mRNA 서열이 확인되면, 원형 RNA 발현 구조를 단축할 수 있으며, 이는 경우에 따라 형질감염 효율을 향상시킬 수 있다.

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Disclosures

공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 국방부 국방부 보조금 AZ180075에 의해 지원되었다. 스테판 스엠 감사 재클린 누난 엔다우먼트. 안나 PawluchinD에 의해 지원되었다, 독일의 학술 교류 프로그램, 저스틴 R. 웰던 켄터키 맥스 Steckler 상 대학의 수상자였다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(PEI) Hydrochloride Polysciences 24765-1
Builder tool NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator. Clare Chemical Research
Enzymatic DNA assembly kit NEB E2621S
Gel and PCR cleanup kit Promega A9282
Glyco Blue Thermo Fisher AM9516
pcDNA3.1 cloning site Polycloning site https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1 NEB M0491L Q5 DNA polymerase
Polymerase 2 Biorad 1725310 Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2 Qiagen 206402 Qiagen long range polymerase kit
Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18080044
RNA isolation kit Life Technologies 12183025 Ambion by Life Technologies
RNAse R Lucigen RNR07250 Epicenter/Lucigen
Stable competent cells NEB C3040H NEB stable cells
Standard cloning bacteria NEB C2988J NEB5-alpha competent
Web tool to design primers NEB https://nebuilder.neb.com/#!/
Web-based temperature calculations NEB https://tmcalculator.neb.com/#!/main

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References

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원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 <em>Alu</em> 요소 사용
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Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).More

Welden, J. R., Pawluchin, A., van Doorn, J., Stamm, S. Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs. J. Vis. Exp. (157), e59760, doi:10.3791/59760 (2020).

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