Summary
يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير الغمر الحيوي المزدوج.
Abstract
تكوين الأوعية الدموية، كعملية حاسمة من تطور الورم، أصبح نقطة ساخنة البحوث وهدفا للعلاج المضادة للورم. ومع ذلك، لا يوجد نموذج موثوق به لتتبع تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد بطريقة بصرية وحساسة. يعرض التصوير الإنارة الحيوية تفوقها الفريد في التصوير الحي بسبب مزاياه من الحساسية العالية، والخصوصية القوية، والقياس الدقيق. يقدم هنا بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم عن طريق حقن رينلا لوسيفيراز المسمى خط خلية سرطان الثدي مورين 4T1 في الماوس المعدلة وراثيا مع الأوعية الدموية الناجمة عن التعبير اليراعة لوسيفيراز. يوفر نموذج الماوس هذا أداة قيمة لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير ثنائي الإضاءة الحيوية في ماوس واحد. ويمكن تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وبحوث الأورام.
Introduction
تكوين الأوعية هو عملية أساسية في تطور السرطان من الأورام الصغيرة المترجمة إلى أكبر، يحتمل أن تكون الأورام النقيلية1،2. يصبح الارتباط بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية إحدى نقاط التركيز في مجال أبحاث الأورام. ومع ذلك، تفشل الطرق التقليدية لقياس التغيرات المورفولوجية في رصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد في الحيوانات الحية باستخدام نهج مرئي.
التصوير الإنارة الحيوية (BLI) من الخلايا السرطانية هو طريقة تجريبية مناسبة بشكل خاص لرصدنمو الورم بسبب عدم الغازية، والحساسية، والخصوصية 3،4،5،6 . وتستند تكنولوجيا BLI على مبدأ أن لوسيفيراز يمكن أن تحفز أكسدة الركيزة محددة في حين تنبعث منها الإنارة الحيوية. وluciferase أعرب في الخلايا السرطانية المزروعة يتفاعل مع الركيزة حقن، والتي يمكن الكشف عنها من قبل نظام التصوير الحي، وإشارات تعكس بشكل غير مباشر التغيرات في عدد الخلايا أو توطين الخلايا في الجسم الحي6،7.
باستثناء نمو الورم، يمكن أيضا تصور تكوين الأوعية الدموية الورم (الخطوة الحرجة في تطور السرطان) من خلال تكنولوجيا BLI باستخدام Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا8،9،10. عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (Vegf) مستقبلات 2 (Vegfr2)، وهو نوع واحد من مستقبلات Vegf، وأعرب في الغالب في الخلايا البطانية الوعائية من الفئران الكبار11. في Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا، يتم ضرب تسلسل الحمض النووي من لوسيفيراز اليراع (Fluc) في الطارد الأول من تسلسل Vegfr2 الذاتية. ونتيجة لذلك، يتم التعبير عن المداخن (التي تظهر كإشارات BLI) بطريقة مطابقة لمستوى تكوين الأوعية الدموية في الفئران. لتنمو أكثر من بضعة ملليمترات في الحجم، والورم يجند الأوعية الدموية الجديدة من الأوعية الدموية القائمة، والتي تعبر بشكل كبير عن Vegfr2 الناجمة عن عوامل النمو من الخلايا السرطانية1. وهذا يفتح إمكانية استخدام الفئران المعدلة وراثيا Vegfr2-Fluc-KI لمراقبة غير الغازية تكوين الأوعية الدموية الورم من قبل BLI.
في هذا البروتوكول، يتم إنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في ماوس واحد من خلال التصوير اليراعة لوسيفيراز (Fluc) ورينيلا لوسيفيراز (Rluc)، على التوالي (الشكل 1). يتم إنشاء خط خلية 4T1 (4T1-RR) الذي يعبر بشكل كبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر وRluc (RFP) لتتبع نمو الخلايا عن طريق التصوير Rluc. لمزيد من التحقيق في التغيرات الديناميكية في تكوين الأوعية الدموية في تطور وتراجع الورم، يتم إنشاء خط خلية 4T1 آخر (4T1-RRT) الذي يعبر عن الانتحار الجينات الهربس البسيط فيروس اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk)، Rluc، وRFP. بإدارة غانسيكلوفير (GCV)، يتم إلغاء الخلايا التعبير ية HSV-ttk بشكل انتقائي. استنادا ً إلى خطوط الخلايا هذه، تم بناء نموذج يحمل الورم في فئران Vegfr2-Fluc-KI التي تعمل كنموذج تجريبي لسد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويجب أن تمتثل التجارب للوائح الوطنية والمؤسسية المتعلقة باستخدام الحيوانات لأغراض البحث. يجب الحصول على أذونات لإجراء التجارب. وتلتزم معالجة الحيوانات والإجراءات التجريبية للدراسة بالمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نانكاي التي تتوافق مع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات التي أقرتها المعاهد الوطنية للصحة.
1. LV-Rluc-RFP (RR) و LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) تغليف وإنتاج المعضد
ملاحظة: يحمل pLV-RR التسلسلات الجينية لـ Renilla luciferase (Rluc) وبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) تحت المروج EF1α، في حين أن pLV-RRT يحمل تسلسل الجينات الترميز Rluc، RFP، وفيروس الهربس البسيط اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk) ( الشكل2).
- البذور 1 × 106 من الخلايا 293T في بئر في 6 لوحة جيدا والثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية مع دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
- إعداد تعليق liposome: مزيج 7.5 درجة مئوية من liposome و 0.25 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) في أنبوب 1.5 مل بعد الحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لتفريق liposomes على قدم المساواة.
- إعداد محلول السلطات الوطنية المعينة (DNAs-RR): بشكل منفصل، أضف متجه pLV-RR وباللازميدات المساعدة إلى 0.25 مل من MEM في أنبوب 1.5 مل كما هو موضح في الجدول 1.
- الحصول على مركب liposome / DNAs-RR: إضافة بلطف الحل DNAs-RR في إعداد قطرة تعليق liposome قطرة وحضانة لمدة 20 دقيقة في RT حتى روابط الحمض النووي إلى غشاء الدهون.
- استبدال وسط الخلايا 293T مع 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS وإضافة مركب liposome / DNAs-RR إلى وسط الخلايا 293T بلطف.
- بعد الحضانة في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 في 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة، استبدال مركب liposome / DNAs-RR التي تحتوي على وسط الخلايا 293T مع 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 100 U /mL البنسلين −ستربيتوميسين.
- الاستمرار في زراعة الخلايا 293T في حاضنة رطبة لمدة 48 ساعة بعد التغوط. ثم، وجمع supernatant من الخلايا 293T والطرد المركزي المتوسطة في 300 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الخلايا 293T. نقل لينتيفيروس-RR (LV-RR) التي تحتوي على supernatant في أنابيب تخزين البولي بروبلين المعقمة 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يلزم إنشاء مرفق للسلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2) من أجل العمل مع فيروس العدس المؤتلف. - كرر الخطوات 1.1-1.7 واستخدم متجه pLV-RRT بدلاً من متجه pLV-RR في الخطوة 1.3 للحصول على لينتيفيروس-RRT (LV-RRT). تخزين LV-RRT في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تمنع مخزون اللينفيروسيفيروسي غير النقي نمو الخلايا في بعض الحالات. قد تحتاج إلى تنقية مخزون لينتيفيروسي. وينبغي تقسيم المخزونات الفيروسية التي تحتوي على جسيمات LV-RR أو LV-RRT إلى أنابيب سعة 1.5 مل (1 مل لكل أنبوب) للتخزين لتجنب دورات ذوبان حرة متعددة.
2. LV-RR و LV-RRT انتقال الفيروسية لتعبير الجينات في الخلايا 4T1
- بذور 4T1 الخلايا في لوحة 6 جيدا (5 × 105 خلايا / جيدا) والثقافة مع معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
- إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة واستبدالها مع 1 مل الطازجة RPMI 1640 المتوسطة وكذلك 1 مل من الأسهم اللينفيروسي (LV-RR أو LV-RRT) إلى كل بئر. إضافة 8 ميكروغرام / مل بوليبرين ومزيج بلطف المتوسطة التي تحتوي على جزيئات لينتيفيروسي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
ملاحظة: يرجى أن تكون على علم بأن المتوسط يحتوي على جزيئات لينتيفيروسية، والتي يمكن أن تنتقل الخلايا البشرية. - تدور حل التحويل في جهاز طرد مركزي في 1000 × ز لمدة 60 دقيقة في RT للمساعدة في زيادة كفاءة التحويل. بعد الطرد المركزي، والثقافة 4T1 الخلايا لمدة 4-12 ساعة والحفاظ عليها في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة لبعض خطوط الخلايا، قد تكون البوليبرين سامة للثقافة طويلة الأجل. لذلك، قد يكون وقت الحضانة لنقل خلايا مختلفة قابلة للتغيير. تحقق من حالة الخلية عدة مرات للعثور على وقت الحضانة المناسب. - تحديث وسط الخلايا 4T1 المستحثة مع 2 مل من RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS و 100 U / مل البنسلين −العقديات لإزالة الجسيمات الفيروسية والبوليبرين.
3- فحص المخدرات وتحديد الخلايا المستحثة من 4T1 LV-RR وLV-RRT
- حدد الخلايا المستحثة مع المتوسطة التي تحتوي على blasticidin (BSD) وفقا لجين مقاومة BSD التي يحملها LV-RR أو LV-RRT كما هو موضح الخطوات التالية.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن اختيار الخلايا المستحثة التي تكون إيجابية RFP عن طريق قياس التدفق بمقدار السيتومترية وفقاً لجين RFP الذي يحمله LV-RR أو LV-RRT. - 48 ساعة بعد الانكل، مرور خلايا 4T1 بنسبة 1:3 إلى 1:4 مع مجموعة متوسطة (RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS، 100 U / مل البنسلين - العقديات، و 5 ميكروغرام / مل BSD). تغيير المتوسطة كل 2 أو 3 أيام.
ملاحظة: قد يختلف تركيز BSD الأمثل من خط الخلية إلى خط الخلية. ولذلك، ينبغي إجراء تجربة تجريبية لمنحنى القتل لتحديد التركيز الأمثل لـ BSD قبل التجربة الأولية. - 7 أيام بعد فحص المخدرات، ومراقبة الخلايا 4T1 المستحثة LV-RR (4T1-RR) وLV-RRT المستحثة الخلايا 4T1 (4T1-RRT) تحت المجهر المقلوب للمرحلة المقلوبة. عد عدد خلايا RFP+ 4T1 وجميع الخلايا 4T1 في ثلاثة مجالات للرؤية لتقدير نسبة RFP الإيجابية، على التوالي (الشكل2).
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن تحديد نسبة RFP الإيجابية للخلايا 4T1 المستحثة عن طريق قياس التدفق. - قياس إشارات رينيلا من خلايا 4T1-RR وخلايا 4T1-RRT باستخدام نظام التصوير الحي للكشف عنالعلاقة الخطية بين أرقام الخلايا وإشارات رينيلا (الشكل 3).
- قم بتوسيع خلايا 4T1-RR و4T1-RRT التي تم فحصها BSD مع وسيط التحديد عند نسب الانقسام بين 1:3 و1:4 وتخزين مخزون خط الخلية في النيتروجين السائل.
4. Vegfr2-Fluc-KI الفئران ونموذج الماوس الحاملة للورم
ملاحظة: تستخدم الفئران النباتية المعدلة وراثيا-Fluc-KI، 6-8 أسابيع من العمر والإناث، في هذه التجربة لرصد تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي من قبل BLI.
- ثقافة 4T1-RR الخلايا وخلايا 4T1-RRT في أطباق بيتري 60 ملم في حاضنة رطبة مع 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية، على التوالي. عندما تكون الخلايا عند التقاء 80٪، قم بإزالة المتوسط واشطفه بمحلول ملحي مُسحّن بالفوسفات (PBS).
- إزالة PBS وإضافة إضافية 2 مل من 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA الحل على التوالي. يُحفظ الطبق في RT (أو عند 37 درجة مئوية) حتى تنفصل الخلايا.
- إضافة 5-10 مل من المتوسطة الطازجة التي تحتوي على 10٪ FBS، ثم يستنشق والاستغناء عن الخلايا لإعادة تعليق خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT في أنابيب الطرد المركزي 15 مل، على التوالي. عد نوعين من الخلايا 4T1 باستخدام غرفة العد وإعداد تعليق الخلية بتركيز 1 × 106 لكل 100 ميكرولتر في RPMI 1640 المتوسطة.
- تخدير الفئران Vegfr2-Fluc-KI مع 1٪-3٪ isoflurane في الأكسجين 100٪ في غرفة التخدير التعريفي مع معدل تدفق 1 L / دقيقة. مراقبة استجابة قرصة اصبع القدم من الماوس لتأكيد حالة التخدير. ثم، وتطبيق مرهم العيون على عيون الماوس لمنع الجفاف.
- إزالة الماوس من الغرفة والموقف في أنفكوني. إزالة تماما شعر الكتف من الماوس باستخدام حلاقة كهربائية وكريم إزالة الشعر، والتي يمكن أن توفر وجهة نظر جيدة من المجال الجراحي وتجنب حجب إشارات BLI في متابعة التجارب.
- حقن خلايا 4T1-RR بنقص في الجلد (1 × 106 خلايا بحجم إجمالي 100 ميكرولتر) وخلايا 4T1-RRT (1 × 106 خلايا بحجم إجمالي 100 يورو) في الكتفين الأيسر والأيمن لكل فأر، على التوالي (سجل اليوم 0). وضع الفئران في منطقة الانتعاش مع الدعم الحراري حتى تعافى تماما.
- بعد زرع خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT، المس كتل الورم للتحقق من أن الفئران تحمل الورم كل يوم (الشكلS1). في اليوم 7 بعد الزرع، حقن داخل اقفارية 50 ملغ / كغ غانسيكلوفير (GCV) للفئران الحاملة للورم مرتين في اليوم حتى نهاية التجربة.
ملاحظة: قبل هذه التجربة، يجب الكشف عن السامة للخلايا GCV على خلايا 4T1-RRT. ويمكن تقييم كفاءة القتل من GCV عن طريق فحص عد الخلايا مع تركيز مختلف من GCV (الشكلS2). - في اليوم 0، 3، 7، 14، و 21 بعد زرع 4T1، ورصد نمو الورم وتكوين الأوعية الدمويةمن الفئران الحاملة للورم وتقييم من قبل كل من Rluc وFluc التصوير (الشكل 4).
5. التصوير الإنارة الحيوية المزدوجة للورم (Rluc) وتكوين الأوعية الدموية (Fluc)
- افتح نظام التصوير الحي، وتهيئة برنامج التصوير الحي، ثم قم بتهيئة النظام.
ملاحظة: سوف يستغرق تهيئة النظام بضع دقائق لتبريد كاميرا الجهاز المقترن ة (CCD) إلى -90 درجة مئوية قبل أن تتمكن من بدء التصوير. سوف تتحول درجة الحرارة الخضراء عندما يتم تبريد كاميرا CCD. - استخدم إعدادات الكاميرا التالية:
تحقق من الإنارة والصورة الفوتوغرافية.
تحقق من تراكب.
إعدادات الإضاءة:
وقت التعرض يحدد AUTO في الظروف العادية.
[بينّينغ] مجموعة إلى 8.
F / إيقاف مجموعات إلى 1.
تعيين تصفية الانبعاثات مفتوح.
إعدادات الصورة الفوتوغرافية:
مجموعات Binning إلى المتوسطة.
F / إيقاف مجموعات إلى 8.
إعدادات نظام IVIS:
مجال العرض: عرض الماوس C= 1، عرض الماوس D = 5.
يحدد ارتفاع الموضوع 1.5 سم. - وزن وتسجيل الفئران وحساب حجم الكويلينتيرازين (CTZ؛ 2.5 ملغ /كغ) وD-لوسيفيرين (150 ملغ /كغ) اللازمة.
- تخدير الفأر الحامل للورم بنسبة 1٪-3٪ isoflurane في الأكسجين 100٪ في غرفة التخدير التعريفي مع معدل تدفق 1 L / دقيقة. مراقبة استجابة قرصة اصبع القدم من الماوس لتأكيد حالة التخدير. ثم، الاستغناء عن قطرة من مرهم العين تشحيم على كلتا العينين لتجنب تلف القرنية.
- حقن 2.5 ملغ CTZ (3.33 ملغ / مل) لكل كيلوغرام من وزن الجسم في الرجعية من الماوس (على سبيل المثال، ل20 غرام الماوس، حقن 15 درجة مئوية لتقديم 50 ميكروغرام من CTZ) باستخدام إبرة حقنة الأنسولين.
- نقل الماوس الحاملة للورم في غرفة الكاميرا مع أنفه في مخروط التخدير بلطف والحصول على عدة صور من الظهرية الماوس على الفور للحصول على إشارات Rluc من الخلايا 4T1 حتى إشارات BLI تتلاشى.
ملاحظة: نصف عمر CTZ قصيرة جدا وإشارات Rluc انخفاض بسرعة ~ 30 s. لضمان تبديد أي إشارة Rluc المتبقية والفاصل الزمني بين Rluc وFluc التصوير يجب أن يكون أكثر من 10 دقيقة. - حقن داخل اقابي1 150 ملغ /كغ D-لوسيفيرين (30 ملغ / مل) باستخدام إبرة حقنة الأنسولين (على سبيل المثال، ل20 غرام من الماوس، حقن 100 ميكرولتر لتقديم 3 ملغ من D-لوسيفيرين). احتفظ بالماوس في RT لمدة 10 دقائق قبل تصوير المداخن.
- حرك هذا الفأر إلى غرفة الكاميرا مع أنفه في مخروط التخدير مرة أخرى والحصول على عدة صور للماوس الظهري للحصول على إشارات المداخن من تكوين الأوعية الدموية.
ملاحظة: يجب إجراء جهاز العرض الحركي Fluc لكل ماوس حتى تصل الإشارات إلى الحد الأقصى ثم تتلاشى. - كرر خطوات الإجراءات 5.4-5.8 لكل ماوس.
- بعد التصوير، والحفاظ على الفئران في بيئة دافئة حتى تستيقظ الحيوانات.
- عند النقطة الزمنية المطلوبة (اليوم 3 و7 و14 و21)، كرر الإجراءات المذكورة أعلاه (الخطوة 5.3-5.10) للكشف عن تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورممع مرور الوقت.
- تحليل بيانات إشارات Rluc وFluc للتحقيق في العلاقة بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية في تطور الورم.
ملاحظة: يتم استخدام المناطق ذات الأهمية (ROI) التي تغطي موقع إشارة BLI لتحليل البيانات. قياس التألق الكلي (الفوتونات) من عائد الاستثمار في وحدة الفوتونات / ثانية / سم2/ steradian (ع / ق / سم2/ ريال) لكل نقطة زمنية. - تحليل إشارات Rluc وFluc من عائدالاستثمار باستخدام برامج الرسومات (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة، تم إنشاء نموذج الماوس سرطان الثدي باستخدام خلايا 4T1 للتحقيق في العلاقة بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم (الشكل 1). أولاً، تم تعبئة فيروسين من فيروس اللانتي، يحملان تسلسلات جينية تعبر عن Rluc/RFP (LV-RR) وRluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT)، على التوالي، كما أُبلغ سابقاً عن7. ثم تم إنشاء خطين خلويين مختلفين من 4T1، اسم 4T1-RR و4T1-RRT، عن طريق تحويل LV-RR وLV-RRT على التوالي. بعد فحص المخدرات لمدة 3 أيام، لوحظ 4T1-RR و 4T1-RRT تحت المجهر الفلوري للكشف عن كفاءة التحويل. وكما هو مبين في التصوير الفلوري، فإن أكثر من 99 في المائة من خلايا 4T1-RR أو 4T1-RRT كانت إيجابية بالنسبة لـ RFP، مما يشير إلى أن خطوط الخلايا 4T1-RR و4T1-RRT تم إنشاؤها بواسطة LV-RR و LV-RRT transduction (الشكل2A,B). وفي الوقت نفسه، لم تكن هناك اختلافات في مورفولوجيا الخلايا والنمو بين النوع البري 4T1 و 4T1-RR أو 4T1-RRT خلال وقت الثقافة. وباختصار، قمنا بنجاح ببناء خطوط خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT دون التأثير على الحالات الخلوية. وفي وقت لاحق، تم التقاط التصوير بالإنارة الأحيائية (BLI) لخلايا 4T1-RR و4T1-RRT للكشف عن إشارات Rluc. وكشفت الصور BLI أن كلا من الخلايا 4T1-RR و 4T1-RRT تنبعث إشارات قوية الإنارة الحيوية من نفس القوة (الشكل3A). إلى جانب ذلك، لوحظت العلاقات الخطية بين إشارات Rluc وأرقام الخلايا في كل من 4T1-RR (R2 = 0.9974) و4T1-RRT الخلايا (R2 = 0.9989)، والتي تشير إلى أن إشارات Rluc يمكن استخدامها لعكس نمو الورم في الجسم الحي (الشكل3B ).
وعلى هذا الأساس، تم إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم للتحقيق في تكوين الأوعية الدموية مع نمو سرطان الثدي. نتيجة لضرب تسلسل المداخن في أول exon من تسلسل Vegfr2 في murine، تم التعبير عن المداخن (الذي يظهر كإشارات الإضاءة الحيوية) بطريقة مماثلة لتكوين الأوعية الدموية في الفئران أثناء تطور الورم. بعد حقن تحت الجلد من خلايا 4T1-RR و 4T1-RRT، تم رصد نمو الخلايا من قبل إشارات Rluc في وجود CTZ في الأيام 0 و 3 و 7 و 14 و 21 (الشكل4A). في الوقت نفسه ، تم تقييم تكوين الأوعية الدموية الناجم عن نمو الورم بواسطة إشارات المداخن في وجود D-luciferin في نفس الماوس. في اليوم 7 بعد زرع 4T1-RR و 4T1-RRT، تم إعطاء GCV للفئران الحاملة للورم، مما أدى إلى موت الخلايا 4T1-RRT. وكشفت الصور التي لـ BLI أن إشارات Rluc من خلايا 4T1-RR و4T1-RRT زادت بنفس المعدل قبل العلاج GCV؛ ومع ذلك، انخفضت إشارات Rluc من الخلايا 4T1-RRT بشكل حاد بعد العلاج GCV. في حين أن إشارات Rluc من 4T1-RR لا تزال تزيد بلطف. ومن الواضح أن هناك نسبية كبيرة بين إشارات Rluc وحجم الورم (الشكلS1).
وفي الوقت نفسه، وفقا لصور المداخن، زادت إشارات المداخن وفقا لارتفاع Rluc وانخفضت بعد انخفاض Rluc (الشكل4B). تشير هذه النتائج إلى أن هناك علاقة مباشرة بين تكوين الأوعية الدموية الورم ونمو الورم. قد يؤدي موت الخلايا السرطانية الناجمة عن عقار GCV إلى تثبيط تكوين الأوعية الدموية الورمي (الشكل4C). لإثبات أن إشارة المداخن كانت في الواقع الكشف عن تكوين الأوعية الدموية داخل الأورام، تم التضحية الحيوانات بعد الانتهاء من التصوير في اليوم 21 للحصول على الأدلة النسيجية من الأوعية الدموية. وفقا لصور المضادة للتباينات المناعية VEGFR2، كانت هياكل الأوعية الدموية الدقيقة في الأنسجة الورم 4T1-RR أكثر وضوحا بكثيرمما كانت عليه في 4T1-RRT الأنسجة السرطانية، والتي كانت متسقة مع إشارات المداخن (الشكل 5). وباختصار، يمكن استخدام هذه الاستراتيجية التصوير الإنارة الحيوية المزدوجة لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية، وكذلك تقييم الآثار المضادة للورم من الأدوية المختلفة على نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية في البيئة الدقيقة للورم.
الشكل 1: خريطة تخطيطية للتصوير الإنارة الحيوية المزدوجة لنمو الورم وتكوين الأوعية الدموية. تم زرع الخلايا 4T1 التي يسببها LV-RR وLV-RRT في الفئران المعدلة وراثيا Vegfr2-Fluc-KI. أثناء نمو الورم، تم تنفيذ BLI من Rluc وFluc في وقت واحد في ماوس واحد لتعكس نمو الورم وحالة تكوين الأوعية الدموية، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: كفاءة تحويل الخلايا 4T1-RR و4T1-RRT التي تم تحديدها بواسطة التصوير الفلوري. (أ) أظهر الرسم التخطيطي لـ pLV-RR أن تسلسلي Rluc وRFP قد تم التعبير عنهما تحت توجيه المروج EF1α. كشفت الصور الساطعة والفلورية لمجال واحد من مجالات الرؤية أن خلايا 4T1-RR كانت إيجابية RFP. (ب) أظهر الرسم التخطيطي لجينات pLV-RRT أن المروج الوحيد EF1α تنشيط Rluc، RFP، وHSV-ttk الجينات. كشفت الصور الساطعة والفلورية لمجال واحد من وجهات النظر أن خلايا 4T1-RRT كانت إيجابية RFP. شريط مقياس = 200 درجة.
الشكل 3: التصوير الإنارة الأحيائية لخلايا 4T1-RR و4T1-RRT المستحثة. (أ) التصوير بالإنارة الأحيائية لخلايا 4T1-RR و4T1-RRT في حضور CTZ. (ب) حافظت إشارات الرلوك المقاسة لخلايا 4T1-RR و4T1-RRT على علاقة خطية مع أرقام الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصور العمليات الديناميكية لنمو الورم وتكوين الأوعية الدموية في الحيوان الحي. (أ) رسم بياني لتدفق التجربة والكشف المزدوج لـ BLI عن الرلوك والمداخن. (ب) الصور التمثيلية Rluc من تطور الورم وصور المداخن من تكوين الأوعية الدموية أثناء تطور الورم في الماوس المعدلوراثيا. (ج) أظهر قياس إشارات الرلوك أن الخلايا السرطانية المزروعة نمت بسرعة، في حين تراجعت خلايا 4T1-RRT بشكل كبير بعد إدارة GCV. (د) أظهر القياس الكمي لإشارات المداخن أن تكوين الأوعية قد حدث بعد زرع الخلايا السرطانية، بعد اتجاه مواز مع نمو الورم والوفاة الناجمة عن GCV. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ مناعة VEGFR2 من أنسجة 4T1-RR و 4T1-RRT في اليوم 21. صور تمثيلية لأقسام أنسجة الورم ملطخة لVEGFR2 (الأخضر) في اليوم 21. كانت النوى ملطخة بـ DAPI (الأزرق). شريط مقياس = 100 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: منحنى حجم الورم أثناء تطور الورم في الجسم الحي. زاد حجم الورم من الخلايا 4T1-RR و 4T1-RRT بعد الزرع، ولكن حجم الورم من الخلايا 4T1-RRT بدأت انخفاض العلاج بعد GCV. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل S2: تأثير السمية الخلوية من GCV على الخلايا 4T1-RRT. ماتت الخلايا 4T1-RRT مع تركيز مرتفع من GCV. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل S3: صورة BLI لخلايا 4T1-RR في الرئة. بعد حقن الوريد الذيل من خلايا 4T1-RR، تم الكشف عن إشارة Rluc من الخلايا من قبل BLI. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
| شروط التعبئة والتغليف LV-RR و LV-RRT | |||
| مكونات | MEM المتوسطة | 3-نظام بلازميد | 4-نظام بلازميد |
| pLV-RR/pLV-RRT vectorA | 0.25 مل | 1.5 ميكروغرام | 1.5 ميكروغرام |
| هفوة-بول + Rev التعبير ناقلاتB | 1.0 ميكروغرام | ||
| الكمامة بول التعبير ناقلاتC | 0.75 ميكروغرام | ||
| ناقل تعبير RevD | 0.3 ميكروغرام | ||
| VSV-G التعبير المتجهE | 0.5 ميكروغرام | 0.45 ميكروغرام | |
| ليبوسوم | 0.25 مل | 7.5 ميكرولتر | 7.5 ميكرولتر |
الجدول1: شروط التغوط من نظام التعبئة والتغليف اللين لانتاج المخزونات الفيروسية LV-RR و LV-RRT في الخلايا 293T. (ألف) كان ناقل pLV-cDNA pLV-RR وpLV-RRT، على التوالي. (ب) يمكن أن يكون متجه التعبير Gag-Pol + Rev إما pCMV-deltaR8.91 (TRC) أو psPAX2 (Addgene). (C) يمكن لمتجه التعبير Gag-Pol تحديد أي واحد من pMDLg/pRRE (Addgene) وpLP1 (Invitrogen) وpPACKH1-GAG (SBI). (د) ينبغي أن يكون ناقل التعبير القس pRSV-REV (أدجين)، pLP2 (Invitrogen)، أو pPACKH1-REV (SBI). (E) يمكن لمتجه التعبير VSV-G تحديد pMD.G (TRC) وpMD2.G (Addgene) وpCMV-VSV-G (Addgene) أو pVSV-G (SBI) أو pLP/VSVG (Invitrogen). في هذا البروتوكول، تم استخدام نظام البلازميد الثلاثي، بما في ذلك psPAX2، pMD2.G، وpLV-RR أو pLV-RRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، يتم وصف نهج BLI المزدوج غير الغازية لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية. تم تطوير نظام مراسل BLI لأول مرة، الذي يحتوي على جين الانتحار HSV-ttk/GCV لتتبع تطور الورم والانحدار في الجسم الحي عن طريق التصوير Rluc. وفي الوقت نفسه، يتم تقييم تكوين الأوعية الدموية الورم باستخدام الفئران Vegfr2-Fluc-KI عن طريق التصوير المداخن. هذا النموذج الماوس الحاملة للورم قادرة على توفير منصة عملية لتطوير الورم تتبع مستمر وغير الغازية وتكوين الأوعية الورم من قبل BLI المزدوج في ماوس واحد مع أهمية عالية، واستنساخ، وقابلية الترجمة.
[أنجيوجينيس] يتعلّق طويل الأجل ورم تقدم وبذلك من أهمية عال1. من الضروري دراسة العلاقة بين تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية. وقد تم التحقيق في عدد متزايد من استراتيجيات مكافحة تكوين الأوعية الدموية لعلاج السرطان، والتي تعتمد على نهج رصد تصور لتقييم نتائج العلاج بدقة. وعلاوة على ذلك، فإن الأوعية الدموية الجديدة من أنسجة الورم بعد العلاج الإشعاعي التقليدي والعلاج الكيميائي هو مجال آخر شعبية من أبحاث الأورام12،13،14. تتطلب هذه الدراسات نموذج ًا حيوانيًا يسمح بمراقبة نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي. التغيرات المرضية في أنسجة الورم في النماذج الحيوانية التقليدية عادة ما تعتمد على الفحص الأنسجة المرضية ، الأمر الذي يتطلب التضحية الحيوانية. تساعد نماذج الماوس BLI المزدوجة هذه في معالجة مشاكل نطاقات الأخطاء الأكبر والتكاليف الأعلى من تضحية الحيوانات.
في هذا النموذج الماوس BLI المزدوج، والخطوة الأكثر أهمية هو استخدام نوعين من لوسيفيرازس، بما في ذلك المداخن وRluc، لتتبع الخلايا على التوالي وتكوين الأوعية الدموية في نفس الوقت. خصوصية الركيزة من هذه luciferases اثنين يجعل من الممكن إجراء نوعين من BLI في مضيف واحد. إلى جانب ذلك، فإن نصف عمر كويلينتيرازين (الركيزة من Rluc) قصيرة جدا، مما يؤدي إلى إشارات Rluc يتلاشى بسرعة دون التأثير على الكشف عن إشارة المداخن المقبل15. وبالتالي، في عملية التشغيل، ينبغي تنفيذ التصوير Rluc قبل التصوير المداخن بسبب أطول نصف عمر D-لوسيفيرين (الركيزة من المداخن). وبالإضافة إلى ذلك، فإن معرفة وقت الحضانة من الركائز هو المفتاح للحصول على صور BLI الكمال. يمكن لعملية التمثيل الغذائي للركائز تغيير تركيز الركائز في الجسم الحي، مما يؤدي إلى الاختلاف في كثافة إشارة BLI.
امتلاك للتقدم في التكنولوجيا، وطرائق التصوير الأخرى لتتبع في الجسم الحي لبعض الأحداث الخلوية ودون الخلوية قد طبقت في البحوث ما قبل السريرية والسريرية، مثل التصوير الفلورسنت، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، والبوزيترون التصوير المقطعي بالإصدار (PET)16،17. بالمقارنة مع استراتيجيات التصوير هذه، التصوير الإنارة الحيوية لديه حساسية عالية، وخصوصية قوية، وقياس دقيق، مما يدل على تفوقها الفريد في مجال دراسات التصوير الحي15. يسمح التصوير Rluc المستخدمة لنمو الورم والآثار المضادة للورم من نظام prodrug HSV-ttk/GCV ليتم تصورها بشكل حيوي في الحيوان الحي. باستثناء رصد الأنسجة تحت الجلد، وقد استخدمت Rluc لتتبع الخلايا في الرئتين من قبل تكنولوجيا BLI في بحوث أخرى. بعد حقن الوريد الذيل من 4T1-RR في الماوس، قمنا بنقل هذا الماوس إلى نظام التصوير الحي للكشف عن إشارات Rluc بعد إدارة CTZ. وأظهرت صورة إشارة Rluc أن الخلايا المحقونة كانت تقع أساسا في الرئة (الشكلS3). كما ذكر أعلاه، يمكن للجين تقرير Rluc تتبع الخلايا السرطانية المختلفة في مواقع مختلفة، مما يشجع على الاستخدام الكامل لهذا النموذج الماوس في بحوث بيولوجيا السرطان.
بالإضافة إلى هذه المزايا، يمكن استخدام تقنية BLI للإحساس بمستويات التعبير لجزيئات محددة. في السابق، تم استخدام جينات مراسل الفلوروفوريس، التي يتم التعبير عنها تحت المحركات ذات الصلة، لقياس تطور الأوعية في الأورام تحت الجلد. أثناء تطور الورم، يمكن ملاحظة بنية الأوعية الدموية والجزيئات من خلال غرف النوافذ المزروعة جراحيًا في الفئران. ومع ذلك، لا تزال هذه الطريقة لديها قيود، بما في ذلك الغزو الذي لا مفر منه، وتبريد الفلوروفوري، والضوضاء الخلفية القوية. نموذج الماوس الحامل للورم الذي تم إنشاؤه في فأر Vegfr2-Fluc-KI يخلق ملاحظة غير الغازية لمستوى التعبير من Vegfr2، وهو أهم جزيء في تكوين الأوعية الدموية الورم. وفي الوقت نفسه، تظهر صور BLI خصوصية كبيرة دون ضوضاء. نموذج الماوس BLI المزدوج قد يكون لها تطبيقات أوسع في دراسة الآليات الجزيئية المحتملة في تطور الورم والانحدار.
وقد اعتمدت تكنولوجيا BLI، التي تستند إلى التعبير عن Rluc (الانبعاثات 480 نانومتر) وFluc (الانبعاثات 562 نانومتر)، في عدد من نماذج الأمراض الحية. وقد تم تقييد الاستخدام الواسع النطاق لتكنولوجيا BLI في الجسم الحي بسبب انخفاض حساسية الإضاءة الحيوية في أطوال موجية أقل من 600 نانومتر في الكشف عن الأنسجة العميقة. ويحدث ذلك عن امتصاص وتشتت الضوء، مما يقلل من الإشارة القابلة للكشف تصل إلى عشرة أضعاف في سنتيمتر من الأنسجة. لمعالجة هذا السؤال، ركز بعض الباحثين الدراسات على المتغيرات الحمراء باعث من المداخن التي تنبعث منها الضوء فوق 600 نانومتر18. لأن امتصاص وتشتت الضوء يمكن أن تنخفض بشكل ملحوظ باستخدام هذه المتغيرات من Fluc18،19، فإن تطبيقات المتغيرات لوسيفيراز توسيع هذا البروتوكول إلى مجال أكبر من بحوث الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0103200)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81671734)، والمشاريع الرئيسية لبرنامج تيانجين لدعم العلوم والتكنولوجيا (18YFZCSY00010)، وصناديق البحوث الأساسية ل الجامعات المركزية (63191155). نحن نعترف بمراجعات غلوريا نانس، التي كانت قيمة في تحسين نوعية مخطوطتنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
