Summary
Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.
Abstract
A angiogênese, como um processo crucial de progressão tumoral, tornou-se um ponto de pesquisa e alvo de terapia antitumoral. Entretanto, não há nenhum modelo de confiança para traçar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em uma maneira visual e sensível. A imagem latente de bioluminescence indica sua superioridade original na imagem latente viva devido a suas vantagens da sensibilidade elevada, da especificidade forte, e da medida exata. É apresentado aqui um protocolo para estabelecer um modelo do rato do tumor-rolamento injetando um renilla luciferase-etiquetou a linha de pilha do cancro da mama murino 4T1 no rato transgênicas com expressão angiogénese-induzida do luciferase do Firefly. Este modelo do rato fornece uma ferramenta valiosa para monitorar simultaneamente a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência em um único rato. Este modelo pode ser amplamente aplicado na triagem de drogas antitumorais e na pesquisa oncológica.
Introduction
A angiogênese é um processo essencial na progressão do câncer de neoplasias pequenas e localizadas para tumores maiores e potencialmente metastáticos1,2. A correlação entre o crescimento tumoral e a angiogênese torna-se um dos pontos de ênfase no campo da pesquisa oncológica. Entretanto, os métodos tradicionais de medir mudanças morfológicas não conseguem monitorar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em animais vivos usando uma aproximação visualizada.
A imagem de bioluminescência (bli) de células tumorais é um método experimental particularmente apropriado para monitorar o crescimento tumoral por causa de sua não-invasividade, sensibilidade e especificidade3,4,5,6 . A tecnologia de BLI é baseada no princípio que o luciferase pode catalisar a oxidação de um substrato específico ao emitir o bioluminescence. A luciferase expressa em células tumorais implantadas reage com o substrato injetado, que pode ser detectado por um sistema de imagem vivo, e os sinais refletem indiretamente as alterações no número de células ou na localização da célula in vivo6,7.
Com exceção do crescimento tumoral, a angiogênese tumoral (o passo crítico na progressão do câncer) também pode ser visualizada através da tecnologia bli usando camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-Ki8,9,10. O receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 2 (Vegfr2), um tipo de receptor de VEGF, é expressado na maior parte nas pilhas endothelial vasculares de ratos adultos11. Em camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, a seqüência de DNA de Firefly luciferase (Fluc) é derrubado no primeiro exon da seqüência Vegfr2 endógena. Como resultado, o Fluc é expresso (que aparece como sinais de BLI) de uma forma que é idêntica ao nível de angiogênese em camundongos. Para crescer além de alguns milímetros de tamanho, o tumor recruta novas vasculaturas de vasos sanguíneos existentes, que expressam altamente o Vegfr2 desencadeado por fatores de crescimento das células tumorais1. Isso abre a possibilidade de usar camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorar não invasivamente a angiogênese tumoral por BLI.
Neste protocolo, um modelo do rato do tumor-rolamento é estabelecido para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor em um único rato através da imagem latente do luciferase de Firefly (Fluc) e do luciferase de Renilla (Rluc), respectivamente (Figura 1). Uma linha de pilha 4T1 (4T1-RR) é criada que expressa estàvel Rluc e a proteína fluorescente vermelha (RFP) para traçar o crescimento da pilha por imagem latente de Rluc. Para investigar mais as mudanças dinâmicas da angiogênese na progressão e na regressão do tumor, uma outra linha celular 4T1 (4T1-RRT) é criada que expressa o vírus de herpes simplex do gene do suicídio truncado timidina kinase (HSV-TTK), rluc, e RFP. Pela administração de ganciclovir (GCV), as células de expressão de HSV-TTK são seletivamente abladas. Baseado nestas linhas de pilha, um modelo do tumor-rolamento em ratos de Vegfr2-Fluc-KI é construído que sere como um modelo experimental que ponte a progressão do tumor e a angiogênese do tumor in vivo.
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Protocol
Os experimentos devem obedecer aos regulamentos nacionais e institucionais relativos ao uso de animais para fins de pesquisa. As permissões para realizar experimentos devem ser obtidas. O tratamento dos animais e os procedimentos experimentais do estudo aderem às diretrizes da Comissão de cuidados e uso de animais da Universidade Nankai, que estão em conformidade com as diretrizes para a assistência aos animais aprovadas pelos institutos nacionais de saúde (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) e LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) embalagem e produção de Lentivirus
Nota: o pLV-RR transporta as sequências genéticas de Renilla luciferase (Rluc) e proteína vermelha fluorescente (RFP) o promotor EF1α, enquanto o pLV-RRT carrega as sequências genéticas codificando Rluc, RFP, e vírus herpes simplex truncado timidina quinase (HSV-TTK) ( Figura 2).
- Semente 1 x 106 de células de 293T por poço em uma placa de 6 poços e cultura durante a noite em uma incubadora humidificada com 5% co2 a 37 ° c com o meio de águia modificada de DULBECCO (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS).
- Prepare a suspensão do lipossomas: misture 7,5 μl do lipossomas e 0,25 ml do meio essencial mínimo (MEM) em um tubo de 1,5 ml que segue a incubação por 5 minutos na temperatura ambiente (RT) para dispersar lipossomas ingualmente.
- Prepare a solução DNAs (DNAs-RR): separadamente, adicione o vetor pLV-RR e os plasmídos auxiliares a 0,25 mL de MEM em um tubo de 1,5 mL, conforme descrito na tabela 1.
- Obtenha o composto de lipossomas/DNAs-RR: Adicione delicadamente a solução de DNAs-RR na gota de suspensão lipossomas preparada pela gota e incubar por 20 minutos no RT assim que as ligações do ADN à membrana do lipido.
- Substitua o meio das células 293T por 1 mL de DMEM contendo 10% de FBS e adicione o composto liposome/DNAs-RR ao meio das células 293T suavemente.
- Após a incubação em uma incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° c por 12 – 16 h, substitua o composto liposome/DNAs-RR contendo meio das células 293T com 1 ml de DMEM contendo 10% de FBS e 100 U/ml de penicilina − estreptomicina.
- Continue cultivando as pilhas 293T na incubadora humidificada para 48 h após o transfection. Em seguida, recolher o sobrenadante das células 293T e centrifugar o meio em 300 x g por 5 min para pellet as células 293T. Transfira o supernatante de Lentivirus-RR (LV-RR) para 1,5 mL de tubos de armazenamento estéreis de polipropileno e armazene a-80 ° c.
Nota: uma instalação do nível 2 de biossegurança (BSL-2) é exigida a fim trabalhar com o Lentivirus de recombinação. - Repita as etapas 1.1 – 1.7 e use o vetor pLV-RRT em vez do vetor pLV-RR na etapa 1,3 para obter o Lentivirus-RRT (LV-RRT). Armazene o LV-RRT em-80 ° c.
Nota: o estoque lentivirais não purificado pode inibir o crescimento celular em alguns casos. O estoque de Lentivirus pode precisar ser purificado. Os estoques de lentivirais contendo partículas de LV-RR ou LV-RRT devem ser divididos em tubos de 1,5 mL (1 mL por tubo) para armazenamento para evitar vários ciclos de descongelamento livre.
2. transdução lentivirais de LV-RR e LV-RRT para expressão gênica em células 4T1
- Semente 4T1 células em uma placa de 6 poços (5 x 105 células/poço) e cultura com Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 meio contendo 10% FBS durante a noite em uma incubadora humidificada com 5% co2 em 37 ° c.
- Retire o meio da placa de cultura e substitua-o por 1 mL de meio RPMI 1640 fresco, bem como 1 mL de estoque de Lentivirus (LV-RR ou LV-RRT) a cada poço. Adicione 8 μg/mL de polibreno e misture suavemente o meio que contém partículas de Lentivirus, introduzindo a pipetagem para cima e para baixo.
Nota: por favor, esteja ciente de que o meio contém partículas lentivirais, que poderiam transduce células humanas. - Solução de transdução de centrifugação em centrífuga a 1.000 × g por 60 min em RT para ajudar a aumentar a eficiência de transdução. Após a centrifugação, as pilhas 4T1 da cultura para 4 – 12 h e mantêm-se em uma incubadora humidificada com 5% CO2 em 37 ° c.
Nota: para algumas linhas celulares, o polibreno pode ser tóxico para a cultura de longo prazo. Portanto, o tempo de incubação para transmófica de diferentes células pode ser mutável. Verifique o status da célula várias vezes para encontrar o tempo de incubação apropriado. - Atualize o meio das células 4T1 transvadas com 2 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e 100 U/mL de penicilina − estreptomicina para remover partículas de Lentivirus e polibreno.
3. triagem de fármacos e identificação de células 4T1 transvadas com LV-RR e LV-RRT
- Selecione células transvadas com meio contendo blasticidina (BSD) de acordo com o gene da BSD-Resistance transportado por LV-RR ou LV-RRT como os seguintes passos descritos.
Nota: Alternativamente, as células transvadas que são RFP-positivas podem ser selecionadas por citometria de fluxo de acordo com o gene RFP transportado por LV-RR ou LV-RRT. - 48 h após a transdução, células de passagem 4T1 na proporção de 1:3 a 1:4 com meio de seleção (meio RPMI 1640 contendo 10% FBS, 100 U/mL de penicilina − estreptomicina e 5 μg/mL BSD). Altere o meio a cada 2 ou 3 dias.
Nota: a concentração óptima de BSD pode variar da linha celular à linha celular. Conseqüentemente, um experimento piloto da curva da matança deve ser executado para determinar a concentração óptima de BSD antes do experimento inicial. - 7 dias de triagem pós-fármaco, observar as células 4T1 transvadas LV-RR (4T1-RR) e LV-RRT transtradas 4T1 células (4T1-RRT) o microscópio de contraste de fase invertido de fluorescência. Contar o número de células de RFP+ 4T1 e todas as células 4T1 em três campos de visão para estimar a relação RFP-positiva, respectivamente (Figura 2).
Nota: Alternativamente, a relação RFP-positiva de células 4T1 transvadas pode ser identificada por citometria de fluxo. - Meça os sinais de renilla de células 4T1-RR e células 4T1-RRT usando um sistema de imagens vivas para detectar a relação linear entre números de células e sinais de renilla (Figura 3).
- Expanda as células 4T1-RR e 4T1-RRT selecionadas com BSD com meio de seleção em proporções divididas entre 1:3 e 1:4 e armazene os estoques de linha celular em nitrogênio líquido.
ratos 4. Vegfr2-Fluc-KI e modelo do rato do tumor-rolamento
Nota: os camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, com 6-8 semanas de idade e fêmeas, são utilizados neste experimento para monitorar não-invasivamente a angiogênese in vivo pela BLI.
- Células 4T1-RR de cultura e células 4T1-RRT em pratos de Petri de 60 mm em uma incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° c, respectivamente. Quando as células estão em 80% confluência, remover o meio e enxaguar com fosfato tampão salina (PBS).
- Retire o PBS e adicione um adicional de 2 mL de 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA solução respectivamente. Mantenha o prato em RT (ou a 37 ° c) até que as células se desanexem.
- Adicionar 5 – 10 mL de meio fresco contendo 10% FBS, em seguida, aspirar e dispensar células para ressuscitar 4T1-RR e 4T1-RRT células em 15 mL tubos de centrífuga, respectivamente. Conte dois tipos de células 4T1 usando uma câmara de contagem e prepare as suspensões celulares em uma concentração de 1 x 106 por 100 μl no meio rpmi 1640.
- Anestesiar os camundongos Vegfr2-Fluc-KI com 1% – 3% de isoflurano em 100% de oxigênio na câmara de indução anestésica com vazão de 1 L/min. Monitore a resposta da pinça do dedo do mouse para confirmar o status da anestesia. Em seguida, aplique pomada oftálmico aos olhos do mouse para evitar a desidratação.
- Remover o mouse da câmara e posição em nosecone. Remova inteiramente o cabelo do ombro do rato usando o creme elétrico da remoção do Shaver e do cabelo, que poderia fornecer uma boa vista do campo cirúrgico e para evitar obstruir os sinais de BLI em seguir-acima dos experimentos.
- Injete subcutaneously as pilhas 4T1-RR (1 x 106 pilhas em um volume total de 100 μL) e as pilhas 4T1-RRT (1 x 106 pilhas em um volume total de 100 μL) nos ombros esquerdos e direito de cada rato, respectivamente (registro como o dia 0). Coloc ratos na área da recuperação com sustentação térmica até recuperado inteiramente.
- Após a implantação das células 4T1-RR e 4T1-RRT, toque nas massas tumorais para verificar se os camundongos são portadores de tumor todos os dias (Figura S1). No borne-implante do dia 7, injete via intraperitoneal 50 Magnésio/quilograma ganciclovir (GCV) aos ratos do tumor-rolamento duas vezes por o dia até a extremidade do experimento.
Nota: antes deste experimento, o citotóxico de GCV em células 4T1-RRT deve ser detectado. A eficiência de morte do GCV pode ser avaliada por ensaio de contagem de células com diferentes concentrações de GCV (Figura S2). - No dia 0, 3, 7, 14 e 21 após a implantação do 4T1, monitore o crescimento tumoral e a angiogênese dos camundongos portadores de tumor e avalie a imagem de Rluc e Fluc (Figura 4).
5. imagem de bioluminescência dupla do tumor (Rluc) e angiogênese (Fluc)
- Abra o sistema de imagens vivas, inicialize o software de imagens vivas e, em seguida, inicialize o sistema.
Observação: a inicialização do sistema levará alguns minutos para esfriar a câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) para-90 ° c antes de poder iniciar a imagem. A temperatura ficará verde quando a câmera CCD for arrefecida. - Utilize as seguintes definições da câmara:
Verifique a luminescência e fotografia.
Verifique a sobreposição.
Definições de luminescência:
Tempo de exposição define AUTO em condições normais.
Binning ajusta-se a 8.
F/stop define como 1.
Os conjuntos de filtros de emissão abrem.
Configurações de fotografia:
Binning define para médio.
F/stop define para 8.
Definições do sistema IVIS:
Campo de visão: C = 1 vista do mouse, D = 5 ratos vista.
A altura do assunto ajusta 1,5 cm. - Pesar e registrar os camundongos e calcular o volume de Coelenterazina (CTZ; 2,5 mg/kg) e D-luciferina (150 mg/kg) necessário.
- Anestesiar o rato do tumor-rolamento por 1%-isoflurano de 3% no oxigênio de 100% na câmara da indução da anestesia com uma taxa de fluxo de 1 L/min. Monitore a resposta da pitada do dedo do pé do rato para confirmar o status da anestesia. Em seguida, dispensar uma gota de lubrificante olho pomada em ambos os olhos para evitar danos na córnea.
- Injete 2,5 mg CTZ (3,33 mg/mL) por quilograma de peso corporal no retrobulbar do rato (por exemplo, para um rato de 20 g, injectar 15 μL para entregar 50 μg de CTZ) utilizando uma agulha de seringa de insulina.
- Mova o rato do tumor-rolamento na câmara da câmera com seu nariz no cone da anestesia delicadamente e adquira diversas retratos do dorsal do rato imediatamente para começ os sinais de Rluc das pilhas 4T1 até que os sinais BLI desvaneçam-se afastado.
Nota: a meia-vida de ctz é muito curto e os sinais de rluc cair vertiginosamente ~ 30 s. Para garantir que qualquer sinal residual de Rluc tenha se dissipado e o intervalo entre a imagem de Rluc e Fluc deve ser superior a 10 min. - Injectar intraperitonealmente 150 mg/kg D-luciferina (30 mg/mL) utilizando uma agulha de seringa de insulina (por exemplo, para um rato de 20 g, injete 100 μL para fornecer 3 mg de D-luciferina). Mantenha o mouse em RT por 10 min antes da imagem de Fluc.
- Mova este rato na câmara da câmera com seu nariz no cone da anestesia outra vez e adquira diversos retratos do dorsal do rato para começ os sinais de Fluc da angiogênese.
Nota: o monitor cinético de Fluc deve ser executado para cada rato até que os sinais alcancem o máximo e então desvaneça-se. - Repita as etapas de procedimentos 5.4 – 5.8 para cada mouse.
- Após a imagem, manter os ratos em um ambiente quente até que os animais acordar.
- No ponto de tempo desejado (dia 3, 7, 14 e 21), repita os procedimentos acima (etapa 5.3 – 5.10) para detectar a progressão do tumor e a angiogênese tumoral ao longo do tempo.
- Analise os dados dos sinais de Rluc e Fluc para investigar a relação entre o crescimento tumoral e a angiogênese na progressão tumoral.
Observação: as regiões de interesse (ROI) que cobrem o site de sinal BLI são usadas para analisar os dados. Meça a luminosidade total (fótons) de ROI na unidade de fótons/segundos/cm2/steradian (p/s/cm2/Sr) para cada ponto temporal. - Analise os sinais Rluc e Fluc de ROI usando softwares gráficos (Figura 4).
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Representative Results
Neste experimento, foi estabelecido um modelo de camundongo de câncer de mama utilizando células 4T1 para investigar a relação entre o crescimento tumoral e a angiogênese tumoral (Figura 1). Primeiramente, dois Lentivirus foram empacotados, que carregaram seqüências do gene que expressam Rluc/RFP (LV-RR) e Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), respectivamente, como relatado previamente7. Em seguida, duas linhas de células 4T1 diferentes, denominadas 4T1-RR e 4T1-RRT, foram criadas por transvagem LV-RR e LV-RRT, respectivamente. Após a triagem da droga por 3 dias, o 4T1-RR e o 4T1-RRT foram observados um microscópio de fluorescência para detectar a eficiência da transdução. Como mostrado na imagem latente da fluorescência, mais de 99% das de 4T1-RR ou 4T1-RRT pilhas eram positivo do RFP, que sugeriram que as linhas de pilha 4T1-RR e 4T1-RRT estiveram estabelecidas pela transdução do LV-RR e do LV-RRT (Figura 2a, B). Entretanto, não houve diferenças encontradas na morfologia celular e no crescimento entre o tipo selvagem 4T1 e 4T1-RR ou 4T1-RRT durante o tempo de cultivo. Em resumo, nós construímos com sucesso as linhas de célula 4T1-RR e 4T1-RRT sem influenciar os Estados celulares. Subseqüentemente, a imagem latente do bioluminescência (bli) de 4T1-RR e de pilhas 4T1-RRT foi capturada para detectar os sinais de rluc. As imagens de BLI revelaram que as pilhas 4T1-RR e 4T1-RRT emitiram sinais bioluminescentes fortes da mesma força (Figura 3a). Além disso, as relações lineares entre os sinais de Rluc e os números das células foram observadas nas células 4T1-RR (R2 = 0,9974) e 4T1-RRT (r2 = 0,9989), o que sugeriu que os sinais de rluc pudessem ser utilizados para espelhar o crescimento tumoral in vivo (Figura 3B ).
Nesta base, usando os ratos transgénicos do Vegfr2-Fluc-KI, um modelo do rato do tumor-rolamento foi estabelecido para investigar a angiogênese enquanto o cancro da mama cresce. Em conseqüência de bater a seqüência de Fluc no primeiro exon da seqüência Vegfr2 no murine, o Fluc foi expressado (que aparece como sinais bioluminescentes) em uma maneira idêntica à angiogênese nos ratos durante a progressão do tumor. Após injeção subcutânea de células 4T1-RR e 4T1-RRT, o crescimento celular foi monitorado pelos sinais de Rluc na presença de CTZ nos dias 0, 3, 7, 14 e 21 (figura 4a). Ao mesmo tempo, a angiogênese induzida pelo crescimento tumoral foi avaliada pelos sinais de Fluc na presença de D-luciferina no mesmo camundongo. No dia 7 borne-implante de 4T1-RR e de 4T1-RRT, GCV foi administrado aos ratos tumor-tendo, que conduziram as pilhas 4T1-RRT para morrer. As imagens de BLI revelaram que os sinais de Rluc das pilhas 4T1-RR e 4T1-RRT aumentaram na mesma taxa antes do tratamento de GCV; Entretanto, os sinais de Rluc de pilhas 4T1-RRT diminuíram agudamente o tratamento do borne GCV. enquanto os sinais de Rluc de 4T1-RR ainda aumentaram suavemente. Obviamente, existia uma relatividade significativa entre os sinais de Rluc e o tamanho do tumor (Figura S1).
Entretanto, de acordo com as imagens de Fluc, os sinais de Fluc aumentaram de acordo com o aumento de Rluc e diminuíram após o declínio de Rluc (Figura 4B). Esses resultados sugerem que houve correlação direta entre angiogênese tumoral e crescimento tumoral. A morte de células tumorais induzidas pela medicina GCV pode levar à inibição da angiogênese tumoral (Figura 4C). Para demonstrar que o sinal de Fluc estava de fato detectando a angiogênese dentro dos tumores, os animais foram sacrificados após o término da imagem no 21º dia para obtenção de evidências histológicas de vasculatura. De acordo com as imagens de imunocoloração VEGFR2, as estruturas microvasculares no tecido tumoral 4T1-RR foram significativamente mais evidentes do que no tecido tumoral 4T1-RRT, que foram consistentes com os sinais de Fluc (Figura 5). Em resumo, esta estratégia dupla da imagem latente do bioluminescência pode ser usada para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor assim como avalia efeitos antitumorais de drogas diferentes no crescimento e na angiogênese do tumor no microambiente do tumor.
Figura 1: Mapa esquemático da imagem de bioluminescência dupla do crescimento tumoral e angiogênese. As células 4T1 transvadas por LV-RR e LV-RRT foram implantadas em camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI. Durante o crescimento do tumor, BLI de Rluc e Fluc foram executados simultaneamente em um único rato para refletir o crescimento do tumor e o status da angiogênese, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: eficiência da transdução das células 4T1-RR e 4T1-RRT identificadas por imagem por fluorescência. (A) o desenho diagramático de pLV-RR mostrou que as sequências de Rluc e RFP foram expressas o promotor EF1α. As imagens brilhantes e fluorescentes de um campo de visão revelaram que as pilhas 4T1-RR eram RFP-positivas. (B) o desenho do diagrama de PLV-RRT mostrou que o promotor único EF1α ativou os genes RLUC, RFP e HSV-TTK. As imagens brilhantes e fluorescentes de um campo de visão revelaram que as pilhas 4T1-RRT eram positivo do RFP. Barra de escala = 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem de bioluminescência de células 4T1-RR e 4T1-RRT transvadas. (A) imagem de bioluminescência de células 4T1-RR e 4T1-RRT na presença de ctz. (B) os sinais medidos de rluc das pilhas 4T1-RR e 4T1-RRT mantiveram uma relação linear com números de pilha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: visualização dos processos dinâmicos de crescimento tumoral e angiogênese em um animal vivo. (A) fluxograma do experimento e detecção de bli dupla de Rluc e Fluc. (B) imagens representativas de rluc da progressão do tumor e de imagens de Fluc da angiogênese durante o desenvolvimento do tumor em um rato transgênicas. (C) a medida de sinais de rluc demonstrou que as pilhas implantadas do tumor cresceram rapidamente, quando as pilhas 4T1-RRT foram regresed significativamente após a administração de GCV. (D) a quantificação dos sinais de Fluc mostrou que a angiogênese ocorreu após o implante de células tumorais, seguindo uma tendência paralela com o crescimento tumoral e a morte induzida pelo GCV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: VEGFR2 imunocoloração dos tecidos 4T1-RR e 4T1-RRT no dia 21. Imagens representativas de secções de tecidos tumorais coradas por VEGFR2 (verde) no dia 21. Os núcleos foram contracorados com DAPI (azul). Barra de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: curva do tamanho do tumor durante a progressão do tumor in vivo. O tamanho do tumor das pilhas 4T1-RR e 4T1-RRT aumentou após a implantação, mas o tamanho do tumor de pilhas 4T1-RRT começou a diminuir o tratamento pós-GCV. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S2: efeito citotóxico da GCV nas células 4T1-RRT. As pilhas 4T1-RRT morreram com a concentração elevada de GCV. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura S3: imagem BLI de células 4T1-RR no pulmão. Após a injeção da veia da cauda de pilhas 4T1-RR, o sinal de Rluc das pilhas foi detectado por BLI. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
| Condições de empacotamento LV-RR e LV-RRT | |||
| Componentes | Meio MEM | sistema de 3 plasmídeo | sistema de 4 plasmídeo |
| vetor pLV-RR/pLV-RRTA | 0,25 mL | 1,5 μg | 1,5 μg |
| Gag-pol + Rev expressão vetorB | 1,0 μg | ||
| VetorC da expressão gag-pol | 0,75 μg | ||
| VetorD da expressão do Rev | 0,3 μg | ||
| VetorE da expressão de VSV-G | 0,5 μg | 0,45 μg | |
| Lipossoma | 0,25 mL | 7,5 μL | 7,5 μL |
Tabela 1: condições de transfecção do sistema de empacotamento lentivirais para produção de estoques virais LV-RR e LV-RRT em células de 293T. (A) o vetor PLV-cDNA foi PLV-RR e PLV-RRT, respectivamente. (B) o vetor de expressão gag-pol + Rev pode ser Pcmv-deltar 8.91 (TRC) ou PsPAX2 (addgene). (C) o vetor da expressão gag-pol pode selecionar qualquer um dos pMDLg/prre (addgene), PLP1 (Invitrogen) e PPACKH1-gag (SBI). (D) o vetor da expressão do Rev deve ser prsv-Rev (addgene), PLP2 (Invitrogen), ou PPACKH1-Rev (SBI). (E) o vetor da expressão de VSV-g pode selecionar PMD. g (TRC), PMD2. g (addgene), PCMV-VSV-g (addgene), pvsv-g (SBI), ou PLP/Vsvg (Invitrogen). Neste protocolo, utilizou-se o sistema de três plasmídeo, incluindo psPAX2, pMD2. G e pLV-RR ou pLV-RRT.
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Discussion
Neste protocolo, uma aproximação dupla não invasora de BLI é descrita para monitorar o desenvolvimento e a angiogênese do tumor. O sistema do repórter de BLI é desenvolvido primeiramente, contendo o gene do suicídio de HSV-TTK/GCV para seguir a progressão do tumor e a regressão in vivo pela imagem latente de Rluc. Enquanto isso, a angiogênese tumoral é avaliada usando camundongos Vegfr2-Fluc-KI via imagem Fluc. Este modelo do rato do tumor-rolamento é capaz de fornecer uma plataforma prática para o desenvolvimento de seguimento contínuo e não invasor do tumor e a angiogênese do tumor por BLI duplo em um único rato com relevância elevada, reprodutibilidade, e translatability.
O angigenesis concerne a progressão a longo prazo do tumor e é desse modo da importância elevada1. É necessário estudar a relação entre a progressão tumoral e a angiogênese. Um número crescente de estratégias de antiangiogênese tem sido investigado para o tratamento do câncer, que dependem de abordagens de monitor visualizadas para avaliar com precisão os resultados do tratamento. Além disso, a neovascularização do tecido tumoral após radioterapia e quimioterapia tradicionais é outra área popular da pesquisa oncológica12,13,14. Estes estudos exigem um modelo animal que permita a monitoração do crescimento e da angiogênese do tumor no tempo real. As alterações patológicas dos tecidos tumorais em modelos animais tradicionais são geralmente dependentes do exame histopatológico, o que requer sacrifício animal. Estes modelos duplos do rato de BLI ajudam a endereçar os problemas de escalas de erro maiores e de uns custos mais elevados do sacrifício dos animais.
Neste modelo duplo do rato de BLI, a etapa a mais crítica está usando dois tipos de luciferases, incluindo Fluc e Rluc, às pilhas e à angiogênese respectivamente de traço ao mesmo tempo. A especificidade da carcaça destas duas luciferases torna possível executar dois tipos de BLI em um único anfitrião. Além disso, a meia-vida de Coelenterazina (o substrato de Rluc) é muito curta, o que resulta em sinais Rluc desaparecendo rapidamente sem influenciar a próxima detecção de sinal Fluc15. Daqui, no processo de funcionamento, a imagem latente de Rluc deve ser executada antes da imagem latente de Fluc por causa da meia vida mais longa de D-luciferin (o substrato de Fluc). Além disso, descobrir o tempo de incubação dos substratos é a chave para a aquisição de imagens BLI perfeitas. O metabolismo de substratos pode alterar a concentração de substratos in vivo, levando à variação na intensidade do sinal de BLI.
Possuindo aos avanços na tecnologia, outras modalidades da imagem latente para o seguimento in vivo de determinados eventos celulares e subcellular foram aplicadas em pesquisas pré-clínicas e clínicas, tais como a imagem latente fluorescente, a imagem latente de ressonância magnética (MRI), e o positrão tomografia por emissão (PET)16,17. Comparado com estas estratégias da imagem latente, a imagem latente do bioluminescência tem a sensibilidade elevada, a especificidade forte, e a medida exata, mostrando sua superioridade original no campo de estudos vivos da imagem latente15. A imagem latente de rluc empregada permite o crescimento do tumor e os efeitos antitumorais do sistema do pró-fármaco de HSV-TTK/GCV a ser visualizado dinâmicamente em um animal vivo. Exceto para monitorar os tecidos subcutâneos, Rluc tem sido usado para rastrear células em pulmões pela tecnologia BLI em outras pesquisas. Após a injeção da veia da cauda de 4T1-RR em um rato, nós movemos este rato no sistema vivo da imagem latente para detectar os sinais de Rluc após a administração de CTZ. A imagem do sinal de Rluc mostrou que as células injetadas estavam localizadas principalmente no pulmão (Figura S3). Como mencionado acima, o gene do relatório Rluc pode rastrear várias células cancerosas em diferentes locais, o que incentiva a plena utilização deste modelo de mouse na pesquisa de biologia do câncer.
Além dessas vantagens, a tecnologia BLI pode ser usada para perceber os níveis de expressão de moléculas específicas. Previamente, os genes do repórter dos fluoróforos, que são expressos promotors relevantes, foram usados para medir o desenvolvimento da embarcação em tumores subcutaneous. Durante a progressão do tumor, a estrutura vascular e as moléculas podem ser observadas através das câmaras de janela implantadas cirùrgica nos ratos. No entanto, este método ainda tem limitações, incluindo invasão inevitável, têmpera por fluoróforo e forte ruído de fundo. O modelo do rato do tumor-rolamento estabelecido no rato de Vegfr2-Fluc-KI cria uma observação não invasora do nível da expressão de Vegfr2, que é a molécula a mais importante na angiogênese do tumor. Enquanto isso, as imagens BLI exibem grande especificidade sem ruído. O modelo duplo do rato de BLI pode ter umas aplicações mais amplas em estudar os mecanismos moleculars potenciais na progressão e na regressão do tumor.
A tecnologia de BLI, baseada na expressão de Rluc (emissão 480 nanômetro) e em Fluc (emissão 562 nanômetro), foi adotada em um número de modelos in vivo da doença. O uso generalizado da tecnologia de BLI in vivo foi restringido por causa da baixa sensibilidade da bioluminescência em comprimentos de onda abaixo de 600 nanômetro em detectar o tecido profundo. Isto é causado pela absorção e dispersão da luz, o que diminui o sinal detectável até dez vezes por centímetro de tecido. Para abordar esta questão, alguns pesquisadores têm focado estudos sobre as variantes do emissor vermelho de Fluc que emitem luz acima de 600 nm18. Porque a absorção e dispersão de luz pode ser notavelmente reduzida usando essas variantes de Fluc18,19, as aplicações de variantes luciferase irá estender este protocolo para um campo maior de pesquisa oncológica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de chave nacional R & D da China (2017YFA0103200), Fundação Nacional de ciência natural da China (81671734), e projetos-chave do programa de apoio à ciência e tecnologia de Tianjin (18YFZCSY00010), fundos de pesquisa fundamentais para Universidades centrais (63191155). Reconhecemos as revisões da Gloria Nance, que foram valiosas para melhorar a qualidade do nosso manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
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