Summary
Этот протокол описывает создание опухолевой мыши модели для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени двойной биолюминесценции изображений.
Abstract
Ангиогенез, как решающий процесс прогрессирования опухоли, стал горячей точкой исследования и мишенью противоопухолевой терапии. Однако, нет надежной модели для отслеживания прогрессирования опухоли и ангиогенеза одновременно в визуальной и чувствительной манере. Биолюминесценция изображения отображает свое уникальное превосходство в живой визуализации из-за его преимущества высокой чувствительности, сильная специфичность, и точные измерения. Представлено здесь протокол для создания опухолевых мыши модели путем введения Renilla luciferase помечены морин рака молочной железы линии 4T1 в трансгенной мыши с ангиогенезом индуцированной светлячок выражение. Эта модель мыши обеспечивает ценный инструмент для одновременного мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в режиме реального времени путем двойной биолюминесценции изображения в одной мыши. Эта модель может быть широко применена в скрининге противоопухолевого препарата и онкологических исследованиях.
Introduction
Ангиогенез является важным процессом в прогрессировании рака от небольших, локализованных неоплазм ы на большие, потенциально метастатические опухоли1,2. Корреляция между ростом опухоли и ангиогенезом становится одной из точек внимания в области онкологических исследований. Однако традиционные методы измерения морфологических изменений не контролируют прогрессирование опухоли и ангиогенез одновременно у живых животных с помощью визуализированного подхода.
Биолюминесценция (BLI) опухолевых клеток является особенно подходящим экспериментальным методом для мониторинга роста опухоли из-за его неинвазивности, чувствительности и специфичности3,4,5,6 . Технология BLI основана на принципе, что люцифераза может катализировать окисление конкретного субстрата при испускании биолюминесценции. Люцифераза, выраженная в имплантированных опухолевых клетках, реагирует с инъекционным субстратом, который может быть обнаружен живой системой визуализации, и сигналы косвенно отражают изменения в количестве клеток или локализации клеток in vivo6,7.
За исключением роста опухоли, опухолевый ангиогенез (критический шаг в прогрессии рака) также может быть визуализирована с помощью технологии BLI с использованием Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей8,9,10. Сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vegf) рецептор 2 (Vegfr2), один тип рецептора Vegf, в основном выражается в сосудистых эндотелиальных клетках взрослых мышей11. В Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей, последовательность ДНК светлячок (Fluc) постучал в первый экзон эндогенной последовательности Vegfr2. В результате, Fluc выражается (который появляется как сигналы BLI) таким образом, что идентична уровню ангиогенеза у мышей. Чтобы вырасти за несколько миллиметров в размерах, опухоль набирает новые сосуды из существующих кровеносных сосудов, которые высоко выражают Vegfr2 вызвано факторами роста из опухолевых клеток1. Это открывает возможность использования Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей неинвазивно контролировать ангиогенез опухоли BLI.
В этом протоколе, опухолевые мыши модель установлена для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза в одной мыши через Светлячок люциферазы (Fluc) и Ренилья luciferase (Rluc) изображений, соответственно (Рисунок 1). 4T1 клеточной линии (4T1-RR) создается, что стационарно выражает Rluc и красный флуоресцентный белок (RFP) для отслеживания роста клеток Rluc изображений. Для дальнейшего изучения динамических изменений ангиогенеза в прогрессии и регрессии опухоли, другой 4T1 клеточной линии (4T1-RRT) создается, что выражает самоубийство гена простого герпеса вирус усеченный тимидин киназы (HSV-ttk), Rluc, и RFP. При администрации ганцикловира (GCV), HSV-ttk выражающие клетки избирательно абляции. На основе этих клеточных линий построена модель опухолевых мышей Vegfr2-Fluc-KI, которая служит экспериментальной моделью, преодолевая прогрессирование опухоли и опухолевой ангиогенез in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты должны соответствовать национальным и институциональным нормам, касающимся использования животных в исследовательских целях. Разрешения на проведение экспериментов должны быть получены. Обработка животных и экспериментальные процедуры исследования придерживаются Руководящих принципов Комитета по уходу и использованию животных Университета Нанкай, которые соответствуют Руководящим принципам по уходу за животными, утвержденным Национальными институтами здравоохранения (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) и LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) лентивирусная упаковка и производство
ПРИМЕЧАНИЕ: PLV-RR несет генные последовательности Renilla luciferase (Rluc) и красного флуоресцентного белка (RFP) под промоутер EF1, в то время как pLV-RRT несет генные последовательности кодирования Rluc, RFP, и вирус простого герпеса усеченный тимидин киназы (HSV-ttk) ( Рисунок 2).
- Семена 1 х 106 из 293T клеток на хорошо в 6 хорошо пластины и культуры на ночь в увлажненный инкубатор с 5% CO2 при 37 КС с Dulbecco в модифицированных орла среды (DMEM), содержащий 10% плода сыворотки крупного рогатого скота (FBS).
- Подготовьте липосомную суспензию: смешайте 7,5 л липосомы и 0,25 мл минимальной основной среды (MEM) в трубку 1,5 мл после инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) для равномерного разгона липосом.
- Подготовьте раствор DNAs (DNAs-RR): отдельно, добавьте вектор pLV-RR и хелсерплазмы до 0,25 мл MEM в трубке 1,5 мл, как описано в таблице 1.
- Получить липосомы / DNAs-RR соединения: осторожно добавить DNAs-RR раствор в подготовленные липосомы суспензии падение за падением и инкубировать в течение 20 минут на RT так ДНК связей с липидной мембраны.
- Замените среду 293T-клеток 1 мл DMEM, содержащего 10% FBS, и аккуратно добавьте соединение липосомы/ДНК-RR к среде 293T-клеток.
- После инкубации в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию на 12-16 ч замените соединение липосомы/ДНК-Р, содержащее среду 293T-клеток, 1 мл DMEM, содержащий 10% FBS и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин.
- Продолжить культивирование 293T клеток в увлажненный инкубатор в течение 48 ч после трансфекции. Затем соберите супернатант из 293T клеток и центрифуги среды на 300 х г в течение 5 минут, чтобы гранулы 293T клеток. Перенесите лентивирусно-RR (LV-RR)-содержащий супернатант в стерильные полипропиленовые трубки и храните при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для работы с рекомбинантным лецивирусом требуется объект уровня биобезопасности 2 (BSL-2). - Повторите шаги 1.1-1.7 и используйте вектор pLV-RRT вместо вектора pLV-RR в шаге 1.3 для получения лентивирусного-РРТ (LV-RRT). Храните LV-RRT при -80 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неочищенный лентивирусный запас может препятствовать росту клеток в некоторых случаях. Лентивирусный запас, возможно, потребуется очистить. Лентивирусные запасы, содержащие частицы LV-RR или LV-RRT, следует разделить на 1,5 мл труб (1 мл на трубку) для хранения, чтобы избежать нескольких циклов свободной оттепели.
2. LV-RR и LV-RRT лентивирусная трансдукция для экспрессии генов в клетках 4T1
- Семена 4T1 клетки в 6-колодец пластины (5 х 105 клеток / хорошо) и культуры с Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среды, содержащей 10% FBS ночь в увлажненный инкубатор с 5% CO2 при 37 градусов по Цельсию.
- Удалите носитель с культурной тарелки и замените ее 1 мл свежей RPMI 1640 среды, а также 1 мл лентивирного запаса (LV-RR или LV-RRT) для каждой скважины. Добавьте 8 мкг/мл полибрена и аккуратно смешайте среду, содержащую лецивиральные частицы, трубачавверхвверхие вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, имейте в виду, что среда содержит лентивирусные частицы, которые могут преобразовывать клетки человека. - Раствор трансдукции спина в центрифуге на 1000 г в течение 60 мин на RT, чтобы помочь повысить эффективность трансдукции. После центрифугации, культура 4T1 клеток для 4-12 ч и поддерживать в увлажненный инкубатор с 5% CO2 при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых клеточных линий, полибрен может быть токсичным для долгосрочной культуры. Таким образом, время инкубации для преобразовывания различных клеток может быть изменяемым. Проверьте состояние ячейки несколько раз, чтобы найти подходящее время инкубации. - Освежите среду трансиндуцированных 4T1 клеток с 2 мл RPMI 1640 среды, содержащей 10% FBS и 100 U/mL пенициллин-стрептомицин для удаления лентивирусных частиц и полибрена.
3. Скрининг на наркотики и идентификация лВ-RR и LV-RRT трансиндуцированных 4T1 клеток
- Выберите трансиндуцированные клетки со средой, содержащей бласцидин (BSD) в соответствии с геном BSD-резистентности, переносимым LV-RR или LV-RRT в качестве следующих описанных шагов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, транс-индуцированных клеток, которые RFP-положительные могут быть выбраны поток цитометрии в соответствии с геном RFP осуществляется LV-RR или LV-RRT. - 48 ч после трансдукции, прохождение 4Т1 ячеек в соотношении 1:3 к 1:4 со средой отбора (RPMI 1640 среда, содержащая 10% FBS, 100 U/mL пенициллин-стрептомицин, и 5 мкг/мЛ BSD). Изменение среды каждые 2 или 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация BSD может варьироваться от клеточной линии к линии клеток. Поэтому, экспериментальный эксперимент кривой убийства должен быть выполнен, чтобы определить оптимальную концентрацию BSD до первоначального эксперимента. - 7 дней после медикаментозного скрининга, наблюдать LV-RR трансиндуцированных 4T1 клеток (4T1-RR) и LV-RRT трансиндуцированных 4T1 клеток (4T1-RRT) под флуоресценцией перевернутый фазово-контрастный микроскоп. Подсчитайте количество ячеек RFP 4T1 и все 4T1 ячейки в трех полях зрения, чтобы оценить соотношение RFP-положительное, соответственно (рисунок2).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, RFP-положительное соотношение трансиндуцированных 4T1 клеток может быть определена цитометрии потока. - Измерьте сигналы рениллы 4T1-RR-клеток и 4T1-RRT клеток с помощью живой системы визуализации для обнаружения линейной связи между числами клеток и сигналами рениллы (Рисунок 3).
- Расширьте BSD-экранированные 4T1-RR и 4T1-RRT-клетки со средой отбора при разделенных соотношений между 1:3 и 1:4 и храните запасы клеточной линии в жидком азоте.
4. Vegfr2-Fluc-KI мышей и опухолевых мыши модели
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные vegfr2-Fluc-KI мышей, 6-8 недель и женщины, используются в этом эксперименте для неинвазивного мониторинга ангиогенеза in vivo по BLI.
- Культура 4T1-RR-клеток и 4T1-RRT клеток в 60 мм Петри блюда в увлажненный инкубатор с 5% CO2 при 37 градусов по Цельсию, соответственно. Когда клетки находятся на 80% слияния, удалить среду и промыть фосфатами буферного соливого раствора (PBS).
- Удалить PBS и добавить дополнительные 2 мл 0,25% трипсин-0,53 мм EDTA решение соответственно. Держите блюдо на RT (или при 37 градусах Цельсия) до тех пор, пока клетки не отсоединят.
- Добавьте 5-10 мл свежей среды, содержащей 10% FBS, затем аспирировать и распределить клетки, чтобы переприимлять 4T1-RR и 4T1-RRT клетки в 15 мл центрифуговых труб, соответственно. Подсчитайте два типа 4Т1 ячеек с помощью счетной камеры и подготовьте суспензии клеток в концентрации 1 х 106 на 100 л в среде RPMI 1640.
- Анестезия Vegfr2-Fluc-KI мышей с 1%-3% изофлуран в 100% кислорода в наркозной индукционной камере с скоростью потока 1 л / мин. Монитор до щепотки ответ мыши, чтобы подтвердить состояние анестезии. Затем нанесите офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Удалите мышь из камеры и положение в nosecone. Полностью удалить волосы плеча мыши с помощью электрической бритвы и крем для удаления волос, которые могли бы обеспечить хороший вид хирургического поля и избежать блокирования сигналов BLI в последующих экспериментах.
- Подкожно вводят 4T1-RR-клетки (1 х 106 клеток при общем объеме 100 л) и 4T1-RRT-клетки (1 х 106 ячеек при общем объеме 100 л) в левом и правом плечах каждой мыши, соответственно (запись как День 0). Поместите мышей в зону восстановления с тепловой поддержкой до полного выздоровления.
- После имплантации 4T1-RR и 4T1-RRT клеток, коснуться опухолевых масс, чтобы проверить, что мыши опухоли подшипников каждый день(Рисунок S1). На 7-й день после имплантации интраперитонез вводят 50 мг/кг ганцикловир (ГКВ) опухолевым мышам два раза в день до окончания эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим экспериментом следует обнаружить цитотоксический ГКВ на 4T1-RRT-клетках. Эффективность убийства GCV может быть оценена по подсчету клеток с разной концентрацией GCV(Рисунок S2). - В день 0, 3, 7, 14 и 21 после имплантации 4T1, контролировать рост опухоли и ангиогенез опухолевых мышей и оценить как Rluc и Fluc изображений (Рисунок 4).
5. Двойная биолюминесценция опухоли (Rluc) и ангиогенеза (Fluc)
- Откройте живую систему визуализации, инициализуя программное обеспечение для живой визуализации, а затем инициализировать систему.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инициализация системы займет несколько минут, чтобы охладить заряд-связанных устройств (CCD) камеры до -90 градусов по Цельсию, прежде чем в состоянии начать изображения. Температура позеленеет, когда камера CCD охладится. - Используйте следующие настройки камеры:
Проверьте Люминесценцию и фотографию.
Проверьте Оверлай.
Настройки люминесценции:
Время экспозиции устанавливает AUTO в нормальных условиях.
Binning наборы до 8.
F/Stop устанавливает до 1.
Фильтр выбросов устанавливает открыть.
Настройки фотографии:
Binning наборы к среднему.
F/Stop устанавливает до 8.
Настройки системы IVIS:
Поле зрения: вид мыши C-1, вид мышей Дз5.
Высота объекта устанавливается 1,5 см. - Взвешивать и записывать мышей и рассчитать объем коэлэнтеразин (КТЗ; 2,5 мг/кг) и D-люциферина (150 мг/кг) необходимо.
- Анестезия опухолевых мышей на 1%-3% изофлуран в 100% кислорода в наркозовой индукционной камере с скоростью потока 1 л/ мин. Мониторинг ног щепотку ответ мыши, чтобы подтвердить состояние анестезии. Затем, обойтись каплю смазки глаз мазь на оба глаза, чтобы избежать повреждения роговицы.
- Введите 2,5 мг КТЗ (3,33 мг/мл) на килограмм массы тела в ретробульбар мыши (например, для мыши 20 г, вводят 15 мкг КТЗ с помощью инсулиновой шприцевой иглы.
- Перемещение опухолевых мыши в камеру с носом в конусе анестезии мягко и приобрести несколько фотографий мыши дозасразу, чтобы получить сигналы Rluc от 4T1 клеток до BLI сигналы исчезают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Период полураспада КТЗ очень короткий, и сигналы Rluc падение стремительно 30 с. Для обеспечения того, чтобы любой остаточный сигнал Rluc рассеялся и интервал между Rluc и Fluc изображения должно быть более 10 мин. - Интраперитонеально вводят 150 мг/кг D-люциферина (30 мг/мл) с использованием иглы инсулинового шприца (например, для 20 г мыши, вводят 100 л, чтобы доставить 3 мг D-люциферина). Держите мышь на RT в течение 10 минут до изображения Fluc.
- Перемещение этой мыши в камеру камеры с носом в конус анестезии снова и приобрести несколько фотографий мыши дорсаль, чтобы получить сигналы Fluc от ангиогенеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кинетический монитор Fluc должен быть выполнен для каждой мыши, пока сигналы не достигнут максимума, а затем исчезают. - Повторите шаги процедуры 5.4-5.8 для каждой мыши.
- После визуализации, поддерживать мышей в теплой среде, пока животные не проснуться.
- В нужную точку времени (день 3, 7, 14 и 21), повторите выше процедур (шаг 5.3-5.10) для обнаружения прогрессирования опухоли и опухолевого ангиогенеза с течением времени.
- Проанализируйте Rluc и Fluc сигналы данных для изучения взаимосвязи между ростом опухоли и ангиогенез в прогрессии опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Регионы, представляющие интерес (ROI), которые охватывают сайт сигнала BLI, используются для анализа данных. Измерьте общее сияние (фотон) рентабельности инвестиций в единицу фотонов/секунд/см 2 /см2/см 2/sr) для каждой временной точки. - Проанализируйте rluc и Fluc сигналы окупаемого удовобимых с помощью графического программного обеспечения(рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом эксперименте, модель мыши рака молочной железы была создана с использованием 4T1 клеток для исследования взаимосвязи между ростом опухоли и ангиогенеза опухоли (Рисунок 1). Во-первых, были упакованы два лентивируса, которые перевозили генные последовательности, выражающие Rluc/RFP (LV-RR) и Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), соответственно, как сообщалось ранее7. Затем, две различные линии 4T1 ячейки, названные 4T1-RR и 4T1-RRT, были созданы путем преобразовывания LV-RR и LV-RRT соответственно. После скрининга препарата в течение 3 дней, 4T1-RR и 4T1-RRT наблюдались под флуоресценционным микроскопом для обнаружения эффективности трансдукции. Как показано на флуоресценции изображения, более 99% из 4T1-RR или 4T1-RRT клетки были RFP положительный, который предложил, что 4T1-RR и 4T1-RRT клеточные линии были созданы LV-RR и LV-RRT трансдукции(рисунок 2A,B). Между тем, не было никаких различий в морфологии клеток и роста между диким типом 4T1 и 4T1-RR или 4T1-RRT во время культуры. Таким образом, мы успешно построили 4T1-RR и 4T1-RRT клеточные линии, не влияя на клеточные состояния. Впоследствии биолюминесценция (BLI) 4T1-RR и 4T1-RRT клеток была захвачена для обнаружения сигналов Rluc. BlI изображения показали, что как 4T1-RR и 4T1-RRT клетки излучаются сильные биолюминесцентные сигналы той же силы (Рисунок 3A). Кроме того, линейные отношения между сигналами Rluc и числами клеток наблюдались как в 4T1-RR (R2 и 0,9974) и 4T1-RRT-клетках (R2 и 0.9989), что позволило предположить, что сигналы Rluc могут быть использованы для зеркального роста опухоли в vivo (Рисунок 3B ).
На этой основе, используя трансгенные Vegfr2-Fluc-KI мышей, опухолевые мыши модель была создана для исследования ангиогенеза, как рак молочной железы растет. В результате стучать Fluc последовательности в первый экзон последовательности Vegfr2 в мурине, Fluc был выражен (который появляется как биолюминесцентные сигналы) таким образом, идентичный ангиогенез у мышей во время прогрессирования опухоли. После подкожной инъекции 4T1-RR и 4T1-RRT клеток, рост клеток контролировался сигналами Rluc в присутствии КТЗ в дни 0, 3, 7, 14 и 21(Рисунок 4A). В то же время ангиогенез, вызванный ростом опухоли, оценивался сигналами Fluc в присутствии D-люциферина в одной и той же мыши. На 7-й день после имплантации 4T1-RR и 4T1-RRT, GCV вводили опухолевых мышей, что привело к смерти 4T1-RRT клеток. BlI изображения показали, что Rluc сигналы 4T1-RR и 4T1-RRT клеток увеличилось с той же скоростью до лечения GCV; однако, Rluc сигналы 4T1-RRT клеток резко сократилось после лечения GCV. в то время как Rluc сигналы 4T1-RR по-прежнему значительно увеличилось. Очевидно, что значительная теория относительности существовала между сигналами Rluc и размером опухоли(рисунок S1).
Между тем, согласно изображениям Fluc, сигналы Fluc увеличились в соответствии с ростом Rluc и снизились после снижения Rluc(рисунок 4B). Эти результаты свидетельствуют о том, что существует прямая корреляция между ангиогенезом опухоли и ростом опухоли. Гибель опухолевых клеток, индуцированных препаратом GCV может привести к ингибированию опухолевого ангиогенеза(рисунок 4C). Чтобы продемонстрировать, что сигнал Fluc действительно обнаружения ангиогенеза в опухолях, животные были принесены в жертву после окончания изображения на 21-й день для получения гистологических доказательств сосуды. Согласно изображениям анти-VEGFR2 иммуностоинга, микрососудистые структуры в 4T1-RR опухолевой ткани были значительно более очевидными, чем в 4T1-RRT опухолевой ткани, которые соответствовали сигналов Fluc (Рисунок 5). Таким образом, эта двойная стратегия визуализации биолюминесценции может быть использована для мониторинга прогрессирования опухоли и ангиогенеза, а также оценить противоопухолевое воздействие различных препаратов на рост опухоли и ангиогенез в микроокружении опухоли.
Рисунок 1: Схематическая карта двойной биолюминесценции изображения роста опухоли и ангиогенеза. 4T1 клетки, транс-RR и LV-RRT были имплантированы в Vegfr2-Fluc-KI трансгенных мышей. Во время роста опухоли, BLI Rluc и Fluc были одновременно выполнены в одной мыши, чтобы отразить рост опухоли и состояние ангиогенеза, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Эффективность трансдукции 4T1-RR и 4T1-RRT клеток, выявленных с помощью флуоресценции. (A) Схематический рисунок pLV-RR показал, что последовательности Rluc и RFP были выражены под промоутером EF1. Яркие и флуоресцентные изображения одного поля зрения показали, что 4T1-RR клетки были RFP-положительными. (B) Рисунок диаграммы pLV-RRT показал, что один промоутер EF1'активировал гены Rluc, RFP и HSV-ttk. Яркие и флуоресцентные изображения одного поля зрения показали, что 4T1-RRT клетки были RFP положительными. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Биолюминесценция для провращенных 4Т1-RR и 4T1-RRT-клеток. (A) Биолюминесценция 4T1-RR и 4T1-RRT клеток в присутствии КТЗ. (B) Измеренные сигналы Rluc 4T1-RR и 4T1-RRT-rrT поддерживали линейное отношение с номерами клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Визуализация динамических процессов роста опухоли и ангиогенеза у живого животного. (A) Диаграмма потока эксперимента и двойное обнаружение BLI Rluc и Fluc. (B) Представитель Rluc изображения прогрессирования опухоли и Fluc изображения ангиогенеза во время развития опухоли в трансгенной мыши. (C) Измерение сигналов Rluc показало, что имплантированные опухолевые клетки быстро росли, в то время как 4T1-RRT клетки были значительно регрессированы после введения GCV. (D) Количественная оценка сигналов Fluc показала, что ангиогенез произошел после имплантации опухолевых клеток, следуя параллельной тенденции с ростом опухоли и смертью, вызванной ГКВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: VEGFR2 иммуностоидинг 4T1-RR и 4T1-RRT тканей на 21 день. Репрезентативные изображения секций опухолевых тканей, окрашенных для VEGFR2 (зеленый) на 21-й день. Ядра были противопоставлены DAPI (синий). Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок S1: Кривая размера опухоли во время прогрессирования опухоли in vivo. Размер опухоли 4T1-RR и 4T1-RRT клеток увеличился после имплантации, но размер опухоли 4T1-RRT клеток начал уменьшаться после лечения GCV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S2: Цитотоксический эффект ГКВ на 4T1-RRT клетки. 4T1-RRT клетки умерли с повышенной концентрацией GCV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S3: BLI изображение 4T1-RR клеток в легких. После инъекции хвостовой вены 4T1-RR клеток, Rluc сигнал клеток был обнаружен BLI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Условия упаковки LV-RR и LV-RRT | |||
| Компоненты | MEM средний | 3-плазмидная система | 4-плазмедная система |
| pLV-RR/pLV-RRT векторA | 0,25 мл л. | 1,5 мкг | 1,5 мкг |
| Gag-Pol - вектор выраженияRev B | 1,0 мкг | ||
| Вектор экспрессии Gag-PolC | 0,75 мкг | ||
| Вектор репреликтораD | 0,3 мкг | ||
| Вектор выражения VSV-GE | 0,5 мкг | 0,45 мкг | |
| Липосома | 0,25 мл л. | 7,5 л л | 7,5 л л |
Таблица 1: Трансфекционные условия лентивирусной упаковочной системы для производства вирусных запасов LV-RR и LV-RRT в 293T-клетках. (A) Вектор pLV-cDNA был pLV-RR и pLV-RRT, соответственно. (B) Вектор экспрессии Gag-Pol и Rev может быть либо pCMV-deltaR8.91 (TRC) или psPAX2 (Addgene). (C) Вектор экспрессии Gag-Pol может выбрать любой из pMDLg/pRRE (Addgene), pLP1 (Invitrogen) и pPACKH1-GAG (SBI). (D) Вектор выражения rev должен быть pRSV-REV (Addgene), pLP2 (Invitrogen), или pPACKH1-REV (SBI). (E) вектор экспрессии VSV-G может выбрать pMD.G (TRC), pMD2.G (Addgene), pCMV-VSV-G (Addgene), pVSV-G (SBI), или pLP/VSVG (Инвитроген). В этом протоколе использовалась трехплазмидная система, включая psPAX2, pMD2.G и pLV-RR или pLV-RRT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описан неинвазивный двойной blI подход для мониторинга развития опухоли и ангиогенеза. Система репортеров BLI впервые разработана, содержащая ген самоубийцы HSV-ttk/GCV для отслеживания прогрессирования опухоли и регрессии in vivo с помощью rluc imaging. Между тем, опухолевый ангиогенез оценивается с помощью Vegfr2-Fluc-KI мышей с помощью визуализации Fluc. Эта модель опухолевой мыши способна обеспечить практическую платформу для непрерывного и неинвазивного отслеживания развития опухоли и опухолевого ангиогенеза двойной BLI в одной мыши с высокой ретранслятивностью, воспроизводимостью и переводом.
Ангиогенез относится к долгосрочной прогрессии опухоли и тем самым имеет высокое значение1. Необходимо изучить взаимосвязь между прогрессированием опухоли и ангиогенезом. Все большее число стратегий борьбы с ангиогенезом были исследованы для лечения рака, которые опираются на визуализированные подходы мониторинга для точной оценки результатов лечения. Далее, неоваскуляризация опухолевых тканей после традиционной лучевой терапии и химиотерапии является еще одной популярной областью онкологических исследований12,13,14. Эти исследования требуют животной модели, которые позволяют контролировать рост опухоли и ангиогенез в режиме реального времени. Патологические изменения опухолевых тканей в традиционных моделях животных обычно зависят от гистопатологического обследования, которое требует жертвоприношения животных. Эти двойные модели мыши BLI помогают решать проблемы больших диапазонов ошибок и более высоких затрат от жертвоприношения животных.
В этой двойной модели мыши BLI, наиболее важным шагом является использование двух типов люциферазы, в том числе Fluc и Rluc, соответственно, микроэлементы и ангиогенез в то же время. Специфика субстрата этих двух люциферазов позволяет выполнять два типа BLI в одном хосте. Кроме того, период полураспада coelenterazine (субстрат Rluc) очень короткий, что приводит к rluc сигналы исчезает быстро, не влияя на следующий Fluc обнаружения сигнала15. Таким образом, в операционном процессе, Rluc изображения должны быть реализованы до Fluc изображений из-за более длительного период истечения срока полураспада D-люциферина (субстрат Fluc). Кроме того, выяснение времени инкубации субстратов является ключом к приобретению идеальных изображений BLI. Метаболизм субстратов может изменить концентрацию субстратов in vivo, что приводит к изменению интенсивности сигнала BLI.
Владение достижениями в области технологий, другие методы визуализации для in vivo отслеживания некоторых клеточных и субклеточных событий были применены в доклинических и клинических исследованиях, таких как флуоресцентная томография, магнитно-резонансная томография (МРТ) и позитрон эмиссионная томография (ПЭТ)16,17. По сравнению с этими стратегиями визуализации, биолюминесценция изображения имеет высокую чувствительность, сильная специфичность, и точное измерение, показывая свое уникальное превосходство в области живых исследований изображений15. Применяемые изображения Rluc позволяют динамически визуализировать рост опухоли и противоопухолевые эффекты системы пролекарства HSV-ttk/GCV. За исключением мониторинга подкожных тканей, Rluc был использован для отслеживания клеток в легких по технологии BLI в других исследованиях. После инъекции хвостовой вены 4T1-RR в мышь, мы переместили эту мышь в живую систему визуализации для обнаружения сигналов Rluc после введения КТЗ. Изображение сигнала Rluc показало, что инъекционные клетки в основном расположены в легких(рисунок S3). Как уже упоминалось выше, ген отчета Rluc может отслеживать различные раковые клетки в разных местах, что поощряет полное использование этой модели мыши в исследованиях биологии рака.
В дополнение к этим преимуществам, технология BLI может быть использована для ощущения уровня экспрессии конкретных молекул. Ранее гены репортера флюорофоров, которые выражены под соответствующими промоторами, использовались для измерения развития сосудов при подкожных опухолях. Во время прогрессирования опухоли, сосудистой структуры и молекулы могут наблюдаться через хирургически имплантированных оконных камер у мышей. Тем не менее, этот метод по-прежнему имеет ограничения, в том числе неизбежное вторжение, закалка фторофора, и сильный фоновый шум. Модель опухолевой мыши, созданная в мыши Vegfr2-Fluc-KI, создает неинвазивное наблюдение уровня экспрессии Vegfr2, который является наиболее важной молекулой в опухолевом ангиогенезе. Между тем, BLI изображения отображают большую специфику без шума. Двойная модель мыши BLI может иметь более широкое применение в изучении потенциальных молекулярных механизмов в прогрессии и регрессии опухоли.
Технология BLI, основанная на экспрессии Rluc (выброс 480 нм) и Fluc (выброс 562 нм), была принята в ряде моделей in vivo. Широкое использование технологии BLI in vivo было ограничено из-за низкой чувствительности биолюминесценции на длинах волн ниже 600 нм при обнаружении глубоких тканей. Это вызвано поглощением и рассеянием света, что уменьшает обнаруживаемый сигнал до десяти раз на сантиметр ткани. Для решения этого вопроса, некоторые исследователи сосредоточили исследования на красных излучателей варианты Fluc, которые излучают свет выше 600 нм18. Потому что поглощение и рассеяние света может быть удивительно уменьшена с помощью этих вариантов Fluc18,19, применение люциферазы варианты будут распространяться этот протокол на более широкую область исследований онкологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFA0103200), Национальным фондом естественных наук Китая (81671734) и ключевыми проектами программы научно-технической поддержки Тяньцзиня (18YF-CSY00010), Фондам фундаментальных исследований для Центральные университеты (63191155). Мы признаем изменения Глории Нэнс, которые были полезны для улучшения качества нашей рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
References
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).
- Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC. Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).
- Wang, R., et al. Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence. Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).
- Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. Tumor angiogenesis, from foe to friend. Science. 349, 694-695 (2015).
- Zhang, K., et al. Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment. ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. , 70-81 (2017).
- Lee, S., et al. Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis. Cell. 130, 691-703 (2007).
- Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response. Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).
- Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).
- Wong, P. P., et al. Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread. Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).
- Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).
- Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy. Biochimie. 116, 43-51 (2015).
- Liu, J., et al. Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).
- Branchini, B. R., et al. Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments. Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing "red-shifted" luciferase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).
