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Medicine

大鼠中位神经再生评价的功能与生理方法

doi: 10.3791/59767 Published: April 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

呈现是一种在大鼠中产生不同类型的中位神经(MN)病变和修复的协议。此外,该协议演示如何使用几个非侵入性行为测试和生理测量来评估神经的功能恢复。

Abstract

本调查的主要目的是展示如何创建和修复大鼠中位神经(MN)病变。此外,还提出了模拟术后物理治疗的不同方法。使用MN模型评估运动和感觉恢复的多种标准化策略,从而便于比较结果。包括几个选项,为遭受MN损伤的大鼠提供术后物理治疗样的环境。最后,本文提供了一种方法,通过几种非侵入性测试(即抓握测试、针刺测试、梯形行走测试、绳索爬坡测试和行走轨迹分析)和生理测量(红外热成像、电子影像学、弯曲强度评估、弯曲卡皮径向肌肉重量测定)来评估MN的恢复情况。因此,这种模式似乎特别适合复制临床场景,促进结果推断给人类物种。

虽然坐骨神经是周围神经研究中研究最多的神经,但对大鼠MN的分析具有多种优点。例如,在MN病变研究中,受影响的肢体的关节收缩和自动切除的发生率降低。此外,MN不受肌肉质量的覆盖,使其解剖比坐骨神经更容易。此外,MN恢复的观察时间更快,因为MN比坐骨神经短。此外,MN 与手臂中的 ulnar 神经有平行路径。因此,ulnar神经可以很容易地用作神经移植修复MN损伤。最后,大鼠中的MN位于前肢,类似于人类上肢;在人类中,上肢是大多数周围神经病变的部位。

Introduction

外周神经病变经常发生由于创伤,感染,血管炎,自体免疫,恶性肿瘤和/或放射治疗11,2。2不幸的是,外周神经修复继续呈现临床上不可预测和经常令人失望的结果33,4。4人们普遍认为,仍须进行大量基础及翻译研究,以改善受影响者44、5、6、75,6,7的前景。

大鼠MN与人类的MN表现出很大的相似性88,9(9图1)。这种神经源自关节区域的胸腔丛,下降到手臂的中部,到达肘部,并分支到前臂腹腔室的大部分肌肉。MN到达手,在那里它内化的肌肉和前两个发光肌肉,以及部分大鼠的手皮9(图1)。

使用大鼠MN,可以充分复制人类10,11,1211,1210周围神经病变。这种神经与常用的坐骨神经相比具有几个潜在的研究优势。由于MN位于大鼠的前肢(类似于人类上肢),与盆腔神经相比,它实验性地受到损伤,对大鼠福祉的影响要小得多,而坐骨神经的内侧部分会损伤。此外,在人类中,大多数临床病变发生在上肢,这对应于大鼠的前肢10,11,12,14,15,16。10,11,12,14,15,16

本文展示了如何在大鼠中产生不同类型的MN病变。此外,还提出了模拟术后物理治疗的不同方法。最后,描述了评估 MN 功能恢复的测试。有多种标准化策略可用于使用外围神经病变和修复的 MN 模型来评估运动和感觉恢复,从而便于比较结果。MN模型特别适合复制临床场景,便于将结果推断为人类物种。

Protocol

涉及动物主题的所有程序均获得葡萄牙里斯本新大学医学院机构动物护理和使用委员会和道德委员会的批准(08/2012/CEFCM)。

1. 中位神经手术

注:在手术过程中遵循无菌技术。使用个人防护仪器(PPE)和穿无菌手术礼服17。手术前自动扣下所有必需的手术器械(参见材料表)。

  1. 使用12周大的威斯塔老鼠。在手术前7天,为他们提供12小时浅暗循环,为他们提供食物和水。麻醉前,称量大鼠以确定所需的麻醉量。
  2. 用氯胺酮(40~80毫克/千克体重)和锡拉辛(5~10毫克/千克体重)的混合物对大鼠进行麻醉。检查麻醉的深度,如对脚趾捏缺乏反应,以及在整个过程中观察呼吸率,19如果呼吸速率超过110个周期/分钟或运动对脚趾捏的反应被观察到18、20,18,提供额外的性痛。
  3. 注射1毫克/千克的旋律,提供先发制人的肛门20,21。20,
  4. 为了避免手术期间的角膜磨损,在两只眼睛上涂抹眼膜凝胶。
  5. 使用脱毛霜去除右侧中毛上的头发。一旦完成,用温暖的盐水清洗,以去除奶油17。
  6. 将大鼠放在加热垫上的上位。在手术部位涂抹碘或氯西丁手术磨砂。离开它至少15s,然后用乙醇擦拭。重复应用程序 3 倍。在继续手术之前,确保磨砂与皮肤接触至少 2 分钟。
    注:联系您的研究单位的感染控制当局,寻找替代协议,以防止手术部位感染19。
  7. 切除手术区域17
    注:在严格的无菌条件下执行所有程序19
  8. 使用编号 15 的手术刀刀片,将右臂和胸腔区域中部的皮肤与深胸平面倾斜。使用电烧灼热小心地烧灼任何出血血管。
  9. 小心地划分胸膜,它呈现为覆盖肌肉的尖刀护套,使用热灼热或一把钝剪刀,注意不要损坏手臂中部方面的血管和神经结构。
  10. 在胸腔主要肌肉的终端插入下直白打开一把剪刀,以挑逗这种肌肉远离底层的关节动脉和静脉,以及从胸腔丛的终端分支。
  11. 用电烧灼分插入胸肌主要肌肉。暴露和节胸小肌肉。
  12. 从胸血管和从关节神经开始从关节区域到肘部,从大孔中直接解剖MN。这允许接触骨骼丛的不同终端分支,即中位、ulnar、径向、关节和肌肉神经(图2)。
  13. 分离不同的实验组,如下所述。
    1. 仅通过解剖 MN 创建Sham组。
    2. 使用数字5显微外科钳子或类似仪器22、23,23压缩手臂中间部分的MN,以15s压缩MN,创建粉碎组。
    3. 使用一对显微外科剪刀创建切除组,从臂中 MN 的中心部分切除一个 10 mm 长的段。用8/0尼龙缝合线将神经的近端树桩进行修理,以防止斧头生长。
    4. 使用后一步中描述的 MN 的 10 mm 长段创建Graft组,并将其旋转 180°。使用中断的 10/0 尼龙缝将分段 MN 的近端和远端树桩缝合到神经移植物中。
  14. 使用中断的 5/0 尼龙缝10,,24关闭皮肤伤口.
  15. 提供术后甘蓝症与7 mL樱桃味对乙酰氨基酚与43 mL的自来水25混合,以获得浓度4.48毫克/mL在50 mL塑料水瓶提供给大鼠的内脏3天25。

2. 住房和物理治疗

  1. 允许大鼠在手术前2-4周与物理治疗器械接触,以确保更容易和更快地适应运动环境。按照下面详述的程序执行练习。
  2. 每天一次,将每只老鼠放在一个单独的物理治疗球内,然后把球体放在一个几乎没有障碍物的房间里。让老鼠畅游房间,自由探索半小时。
  3. 将老鼠单独放在单独的笼子里,用装有轮子的轮子来帮助它们锻炼。
  4. 形成4~5只动物群,并将这些动物安置在个性化的笼子里。通过包括梯子、绳索、运行轮和其他环境丰富元素来个性化笼子。
  5. 手术后的第二天,将单个大鼠送回个性化的笼子。
  6. 手术后3天恢复物理治疗练习。

3. 功能测试

  1. 在开始进行功能测试前一周,让大鼠熟悉食物,作为积极的强化。在成功完成每次测试后,在手术前后提供此强化。在3周的初始训练期后,在手术后1周恢复所有检查。
  2. 在晚上进行测试,当老鼠自然更活跃。手术后1周恢复检查。
  3. 执行抓取测试,把老鼠放在网格上,用尾巴抬起它,让它用它前爪11,26,26抓住网格。如果大鼠能用两个前爪抓住网格,则分配一个"正"分数。如果老鼠不能用受伤的爪子抓住网格,则分配一个"负"的分数。
    注:正抓取测试表明 MN 的电机部件运行16、,27
  4. 执行针刺测试28,,29.
    1. 制作具有 4 mm x 4 mm 方形网格图案的塑料平台。使用 21 厘米长的金属框架支持此网格。
    2. 将大鼠放在平台上,用 15.5 厘米 x 15.5 厘米 x 11 厘米透明塑料盒盖住网格。等待几分钟,直到正常活动(例如,探索和主要梳理)消退。
    3. 当老鼠静止时,站在它的四只爪子上,开始测试。
    4. 在镜子的帮助下,插入一个麻醉仪(例如,弯曲力为25克的4号Von Frey头发),并在MN的皮肤区域戳出前爪的帕马面(图1)。在每个前爪上重复评估 5 倍,每次评估后等待几秒钟。
    5. 检查 Von Frey 灯丝30的弯曲是否正确。对退出反应进行评分如下:"0",无退缩反应,"1",如果大鼠慢慢地从灯丝中取出爪子,"2",如果老鼠迅速响应刺激,取出爪子或舔爪子。
      注:如果观察到细丝的混点和咬,重复刺激,因为这些被认为是模棱两可的反应。
  5. 训练
    注意:每天训练大鼠3周,晚上在低光环境下做手术。特别推荐参加绳索攀岩、梯形梯和步行道测试的培训课程。这些可以按照之前介绍的顺序进行,从绳索攀爬测试开始,梯级运行,最后进行行走轨道测试。在新的测试之前,让同一动物休息几分钟。
    1. 在第一周,把老鼠放在梯子/绳索/走廊的最后三分之一,靠近盒子的入口。通过轻轻触摸和/或拉其尾巴的尖端,使动物向盒子打开的方向移动。一旦老鼠进入盒子,就给予它食物治疗,在重复测试之前,让老鼠休息几秒钟。每天重复5次,为期5天。
    2. 在第二周,把动物放在梯子/绳索/走廊的第二三分之二上重复步骤在3.5.1。
    3. 在第三周,将老鼠放在梯子/绳索/走廊的底部,放在盒子入口的对面。在 3.5.1 中重复这些步骤,但仅在动物正确完成测试后才奖励它。
  6. 执行梯形梯级测试。
    注:此测试用于评估前肢强度、步进、放置和协调31
    1. 将大鼠放在梯子底部(120 厘米 x 9 厘米 x 2 厘米,18 步 1.5 厘米厚,间隔 4 厘米),轻轻触摸大鼠的尾巴。确保梯子置于 10° 的倾斜度,并在深色木制 31.5 厘米 x 35 厘米 x 35 厘米的盒面上打开 13.20 厘米 x 11 厘米。
    2. 一旦老鼠开始爬梯子,一旦老鼠的鼻塞穿过盒子的入口,就启动计时器。
    3. 记录时间并重复测试 3 倍,每个测试至少间隔 1 分钟。
  7. 绳索攀爬
    注:此测试用于评估抓握强度,这依赖于 MN 恢复32
    1. 把老鼠放在绳子的底部,轻轻触摸尾巴,说服它爬起来。一旦动物开始攀爬,一旦老鼠的鼻线穿过平台的入口,就启动计时器。"
    2. 每次测试时,记录爬到平台所走的时间以及大鼠爬起绳索时受伤爪子的滑倒次数。如果动物在执行任务时没有犹豫或不会停止攀爬,则认为测试有效。正确执行任务后,为大鼠提供零食。
    3. 记录时间并重复测试 3 倍,每个测试至少间隔 1 分钟。
  8. 步行道
    注:本测试用于评估前肢运动恢复33,34。33,
    1. 设置一个设备,由16.5厘米的封闭走道组成,高度x8.7厘米的宽度x43厘米长。确保这导致一个矩形 8.8 厘米 x 8.2 厘米打开在黑色木质 23 厘米 x 36 厘米 x 28 厘米盒的墙壁之一。包括一个垂直滑动门,以快速关闭盒子的入口。包括一个可拆卸的顶部,用于检索大鼠33,34。33,
    2. 在走廊的地板上放一张图形纸。抓住老鼠的尾巴,让它拿着一个浸在亚甲蓝色油漆刷。将老鼠放在走廊的入口处,让它在箱子里行走。从走廊的地板上取下图形纸,重复测试,直到获得两个前爪的良好代表性印象。
    3. 从获得的打印件中,选择具有清晰连续前爪打印件的打印件,以 tiff 或 jpeg 格式拍摄它们,并使用开放访问软件 FIJI35测量以下参数。
      注:首先,使用图形纸中的标记校准每个图像(分析 |设置比例) 第二,将每个图像转换为 8 位格式 (图像 |类型 |8 位。随后,使用矩形选择工具选择爪打印。裁剪图像的这一部分(图像 |裁剪)。在每个图像中,通过阈值图像(图像 |调整 |阈值
      1. 通过测量爪印面积测量姿势因子。使用矩形选择工具选择爪打印,然后按"控制 + M"。
      2. 测量打印长度因子,测量爪印的最长长度(对于步骤 3.8.3.2*3.8.3.6,使用直线选择工具选择两个最远点,然后按"控制 + M"。
      3. 通过测量爪印最宽的宽度来测量手指扩散因子。
      4. 通过测量第二和第三根手指之间的最宽宽度来测量中间手指扩散因子。
      5. 通过测量给定侧连续爪印的同源点之间的距离来测量步幅长度。
      6. 测量支撑的底座,测量爪印象中心部分与运动方向29、33、36之间的垂直距离。,33,36
        注:在两对具有代表性的连续双边爪印33中执行最后两个测量。

4. 生理测量

  1. 红外热成像(IRT)373839.
    1. 使用热分辨率为0.1°C的普通数字水温计,确保进行测量的房间温度在18°C~25°C之间。确保不存在重要的热源(例如计算机或冰箱)。
    2. 在评估前 2 小时将大鼠带到评估室,使大鼠适应。在开始实验之前,按照上述步骤(步骤1.3_1.6)或按照机构的协议对大鼠进行麻醉。在开始实验之前,检查脚趾捏的响应不足。
    3. 在采集前 15 分钟打开红外热像摄像机,在评估期间不要将其关闭。设置相机的发射参数,以匹配大鼠皮肤的发射参数 (+ = 0.98)37,,40,,41
    4. 用聚乙烯海绵将大鼠放在其多糖上,放在干净、稳定的表面上。确保没有反射材料和其他可能的文物来源。用双面胶胶带小心地固定前爪。在直肠内插入 2 厘米的数字温度计,以在所有评估期间监控大鼠的中心温度。
    5. 将热像相机保持 90° 角,距离大鼠 30 厘米。将相机聚焦整个动物的身体。获取间隔 30 s 的三张红外热成像图像。
    6. 将采集的热像传输到计算机,并使用分析软件进行分析。使用 MN 的平面区域(例如,9 x 11 像素)中的固定矩形区域(例如,在 MN 的块状脚垫中心)定义两个前爪的木板表面的温度(图 1)。使用免费的FLIR工具软件,通过双击选择热成像。在左侧工具栏上,选择按钮"添加框测量工具",并在两个前爪的平面区域上绘制 9*11 像素的矩形。在调整矩形时,可以确认其尺寸(以像素为单位)。在两个前爪上执行。在图像的右侧找到最大、最小和平均温度。
    7. 在之前绘制的投资回报率上,右键单击并选择导出。然后,将 ROI 的温度平均值、最大值和最小温度以及温度矩阵导出到 .csv 文档中。这些数据以后可以使用数据分析软件进行浏览。
  2. 电子学学 (ENMG) 评价
    1. 设置电气刺激器。胶带一对一次性针灸针针(0.25毫米x25毫米),阻抗可忽略不计[<1 Ω]),两者之间25毫米,形成刺激电极。现在,将刺激器和电极连接到数据采集单元,以接收传入信号并将其转换为数字信号,这些信号可以使用计算机软件进行处理。
    2. 在同一房间进行评估,并始终在相同的受控环境条件下进行 42、43、44 。42,43,44在开始数据采集之前,捏住前爪,确保大鼠被深度麻醉。
      注:深度麻醉对于尽量减少与大鼠自发自愿和/或非自愿运动相关的变异性至关重要。
    3. 在手术显微镜下暴露两侧的 MN,如步骤 1.8_1.13 所述。使用数字 15 手术刀刀片延长胸腔切口到前臂与心室中线切口。
    4. 通过使用虹膜剪刀直接分离上覆的骨筋膜,暴露屈肌数字升华肌肉的肤浅方面。将接地针插入左后肢的四头肌中,以连接信号接地塞。
    5. 从右前爪开始,将记录电极放入前爪的屈变器数字潜质肌肉腹部和刺激电极接近 MN 中的病变部位。用盐水润湿这些电极。
    6. 确保软件的设置如下:通道输入端口 1 (CH1) = 刺激器至 0-10 V;通道输入端口 2 (CH2) - EMG 至 30~1,000 Hz。首先选择 10 mV 的刺激振幅,并记录复合肌肉作用电位 CMAP 采样速率为 50 kHz,持续时间为 40,000 ms。以 10 mV 步长逐渐增加刺激振幅,直至达到 2,000 mV。,对左爪42、43、44,43重复相同。44
      注: 信号放大到 1,000 倍,并使用 30-1,000 Hz 频段进行过滤。刺激输出设置为单个脉冲,持续时间为 1 ms42,,43,,44
    7. 打开录音设备软件中记录的文件。
      注:默认情况下,屏幕将以红色、刺激器脉冲和下面的蓝色显示拖窗。记录器 ENMG。在时间刻度下方滑动水平滚动条可以可视化完整记录。两个主要工具,缩放工具和 I-Beam 工具,位于面板的右下角。使用缩放工具,可以优化 CMAP 的可视化效果并浏览图形。为了保证可视化屏幕上的配合良好,缩放后可能需要调整显示屏。为此,请选择"显示" |自动缩放波形I-beam 工具允许选择图形的特定区域以及所需测量的性能。在图形的顶部,有三个小窗口显示测量值。P-P以伏为单位显示所选区域的平均振幅值(在刺激器记录中和 ENMG 中),而Delta-T显示该选择的时间间隔。
    8. 使用软件插头中的"EMG中无监督分类的表格和作用电位工具"中的同质测量工具,测量复合肌肉作用电位(CMPA,表1所述)的参数。
    9. 对于每只大鼠,确定刺激电压的最小值,之后 CMAP 振幅不会进一步增加。从 0.05 mV 刺激开始,在 0.05 mV 的增量电压下连续增加刺激。
    10. 在此电压以上应用 20% 的刺激,以获得超值刺激值。
    11. 确定后一个值并应用相应的刺激后,记录下一个 CmAP 参数。
  3. 弹性强度评估
    1. 使用与步骤 4.2 相同的刺激器和刺激电极来电刺激 MN。将输入通道 CH1 设置为刺激器 (0~10 V)和 30 s 的刺激持续时间为 30 s 的输出设置,脉冲持续时间为 1 ms,频率为 1 Hz。将分辨率为 d = 0.001 N 的测功机连接到计算机。
      注:数据的实时可视化可以通过使用以前安装在计算机上的软件并将其链接到测功机46来构建每次力图 (N/s) 来获得。
    2. 放置步骤 4.1.4 中描述的大鼠。在两个前爪的第二个隔层空间放置一个5/0丝缝合环。将缝合环连接到测功机的钩子和前爪与测功机对齐,而不会对缝合线造成过大的压力。
    3. 用胶带固定反面爪子,以避免测功机读数中的杂散运动干扰。
    4. 单击"零"按钮将测功机设置为零。
    5. 通过调整电压结,将刺激器调整到 1.5 V 的超前振幅刺激。
    6. 在 PC 上,打开软件 AFH-01。打开分隔符"设备"并选择设备FH5。创建新文件("度量值1"是默认给出的名称)并重命名该文件。
    7. 将电极放在 MN 的近端,单击程序底部的播放,记录测功机上的拉取 30 s。
    8. 将获取的值导入数据分析软件。计算每次评估的强度 x 时间图的最大和平均力值以及曲线 (AUC) 下的面积。
    9. 对左前爪重复上述步骤。
  4. 肌肉重量
    1. 在一般麻醉下,通过排泄47,48,使47,大鼠安乐死。
    2. 从两个前臂收获弯曲的鲤鱼径向肌肉,从其起源解剖肌肉,直到其远端肌腱插入,使用数字15手术刀刀片。
    3. 用精确刻度9,49,49的重量来称量肌肉。

Representative Results

共有34只大鼠被随机分为以下几组:Sham(n = 17)、切除(n = 17)和神经移植(n = 10) 进行手术。所有的老鼠在手术和术后时期都安然无期地存活下来。手术后一周和随后的100天里,所有动物每周接受上述功能测试一次。下面将介绍每个测试的代表性结果。

抓取测试

在抓取测试中反应积极的老鼠比例对Sham组来说最高。此值逐渐增加在大鼠从粉碎神经移植组(图3)。

针刺测试

神经移植组的老鼠相比,Sham组的老鼠在累积针刺测试中得分最高。两者的得分都比切除组中的老鼠好(图4)。

梯式运行测试

沙姆组中,大鼠在梯级运行测试中的速度比提交MN病变的大鼠的速度最高。在后者中,运行阶梯的时间往往随着时间的推移而减少,与 MN 恢复并行(图5)。.

绳索测试

与梯级运行测试一样,与MN受伤的组相比,在沙姆组爬绳的老鼠的时间要短。当允许MN恢复时,大鼠的速度提高了(图6)。

步行道分析

对行走轨迹的分析往往显示爪印的形态变化(图7)。这些变化在挤压损伤中往往比在段神经病变50更明显。

红外热成像

在手术后的前30天检查前爪之间的温差时,造影术非常有用。在MN较重的大鼠中,温度差异更为明显,例如切除组(图8图9)。

电子影像学

表1总结了电子影像学测量的生物学重要性,为不同的实验组提供了具有代表性的结果。电子学学观察到各种模式。正常的CMAP是Sham组中的老鼠的典型,而多相CMAP与MN的可变病变程度有关,如在粉碎组和神经移植组(图10)。切除组,未观察到CAP。

手腕弹性强度

鉴于手腕弯曲主要依赖于MN,此测试用于评估该神经区域的电机恢复。手腕弯曲强度最接近正常水平时,恢复是最大(图11)。.

肌肉重量和形态学

弯曲木质径向肌肉的重量和形态取决于MN恢复,因为这种肌肉完全由MN99,1010内侧。因此,在沙姆组中观察到正常重量和形态学。在粉碎神经移植切除组观察到体重减轻和肌肉萎缩(图12)。

Figure 1
图1:大鼠中位神经解剖图的图解表示。
1) 大鼠大脑中中位神经的起源和终止(绿色区域 = 主要运动区;蓝色区域 = 主要感觉区域)。(2) 在C7段水平的脊髓横向部分;(3) 神经;(4) 肌肉神经;(5) 径向神经;(6) 中位神经;(7) 乌尔纳尔神经;(8) 手臂的中皮分支;(9) 前臂的中皮分支;(10) 动脉;(11) 胸动脉;(12) 中位动脉;(13) 表面径向动脉;(14) 乌尔纳尔动脉;(15) 运动分支的中位神经到前列腺肌;(16) 运动分支的中位神经对弯曲的卡皮斯径向肌肉;(17) 运动分支的中位神经到屈肌数字表面是肌肉;(18) 运动分支的中位神经到屈肌前胸肌;(19) 中位神经的感官分支到纳区域;(20) 第一个间体空间的共同帕马动脉;(21) 第一个数字的径向帕尔玛数字动脉;(22) 运动分支的中位神经到神经的肌肉;(23) 帕尔玛动脉拱门;(24) 径向帕尔玛数字神经的第一个数字;(25) 乌尔纳尔帕尔玛数字神经的第一个数字;(26) 第三间空间的共同帕马动脉;(27) 运动分支的中位神经的终端分支到前三个发光肌肉;(28) 乌尔纳尔帕尔玛数字神经的第二位、第三位和第四位数字;(29) 乌尔纳尔帕尔玛数字动脉至第四位和第五位;(30) 第二、第三和第四位数字神经的径向帕尔玛数字神经;(31) 第五位径向帕玛数字动脉;(32) 前爪中位神经的皮肤区域(蓝阴影区域)。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:大鼠右前肢照片,显示手臂和腹部中枢神经的外科解剖结构。
Cr, 颅骨;我,媒体请点击这里查看这个数字的较大版本。

Figure 3
图3:手术后100天内不同实验组进行阳性抓取测试的大鼠百分比。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4:在操作中的前爪中,使用累积针刺试验结果对不同实验组中的反面爪进行共分评估。
垂直条代表 95% 置信区间。图上部的水平线表示实验组之间的统计显著差异,_p<0.001。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 5
图 5:不同实验组中梯级运行测试的平均速度。
垂直条代表 95% 置信区间。图上部中的星号表示各组之间的统计显著差异,\p<0.001。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 6
图6:沙姆切除组绳索试验的平均爬坡速度。
垂直条代表 95% 置信区间。图上部的星号显示各组之间的统计显著差异,[p<0.05;\p<0.01。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 7
图 7:不同实验组中的步行轨道参数。
手术肢体上的值表示为与相反肢体规范化的均值百分比。(A) 姿态因子;(B) 打印长度;(C) 手指扩散因子;(D) 中间手指扩散因子;(E) 步长;(F) 支持基础。垂直条代表 95% 置信区间。图上部的水平线表示实验组之间的统计显著差异。D30、D60、D90 = 手术后 30、60 和 90 天,[p<0.05;*p<0.01;p<0.001.请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 8
图8:红外热成像记录的平均温差。
框图表示操作侧(右侧)中位神经的帕尔玛区域与Sham(n = 17) 和切除(n = 17) 组中的反面(左)之间的温差,[p<0.05;\p<0.01。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 9
图9:手术后头45天,切除组动物的典型红外造影模式。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 10
图10:手术后90天,来自沙姆神经移植群的动物的复合肌肉作用潜力(CMAP)的典型模式。请点击这里查看这个数字的较大版本。

Figure 11
图11:评估两个前爪在术后90天在不同的实验组手腕弯曲强度。
手腕弯曲强度使用曲线(AUC)下方的区域在30s的时间段内使用超酸盐刺激来评估。垂直线表示 95% 置信区间。图上部的水平线突出显示了组之间的统计显著差异,+p<0.01。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 12
图12:手术后100天,弯曲鲤鱼径向肌肉重量和宏观外观。
A) 框图描绘标准化屈肌鲤鱼径向肌肉重量在不同的实验组, _p<0.01;p<0.001.(B沙姆切除实验组左右两侧的肌肉照片。请点击此处查看此图形的较大版本。

参数 参数显著性 沙姆组 切除组 NG 组
神经刺激阈值 (%) 神经再生的评估,因为有少量的神经纤维需要产生CMAP或可见的肌肉收缩12 281.63 × 271.65 5359.98 = 3466.52 2108.12 = 2115.13
电机刺激阈值 (%) 神经再生的评估,因为有少量的神经纤维需要产生CMAP或可见的肌肉收缩12 462.52 × 118.91 1694.10 × 503.24 1249.50 × 503.24
延迟 (%) 评估神经传导速度在最快的神经纤维,也就是说最大的骨髓纤维44 113.55 × 25.04 不适用 132.80 × 69.95
神经肌肉转导速度 (%) 评估神经传导速度在最快的神经纤维,也就是说最大的骨髓纤维44 92.01 × 20.88 不适用 91.30 × 26.51
CmAP 振幅 (%) 重新化电机单元数量评估34 110.63 ±45.66 不适用 41.60 × 24.84
CmAP 持续时间 (%) 肌肉内侧同步评估,取决于肌肉内侧化和内化运动纤维的髓化程度44,,45 101.12 × 23.92 不适用 151.06 × 54.52
NG, 神经移植
CMAP,复合肌肉作用潜力。
不适用
所有参数均以平均反边值的百分比表示。
数值变量表示为平均值 = 标准差。

表1:实验结束时的电子学评估。

Discussion

本文提出了在大鼠中创建不同类型的MN病变和修复的协议。此外,它还说明了如何使用几个非侵入性行为测试和生理测量来评估这种神经的功能恢复。

值得注意的是,本文中描述的几个功能测试,即梯运行测试和绳索测试,都在很大程度上取决于大鼠是否愿意执行任务,期望获得食物奖励51,52,53。51,52,53应该指出的是,某些大鼠菌株更适合训练和在这类测试中表现,52,更可重复。例如,刘易斯大鼠在训练阶段和随后的51、52、5352,53测试中表现不佳51

老鼠壳应允许足够的行动自由,符合他们的自然探索行为,除了允许实验动物熟悉功能测试19中存在的一些元素。因此,显示了允许更高行动自由的不同形式的住房。大笼子采用浓缩元件进行个性化设置,这些元素后来用于功能测试(例如绳索和梯子)。

可以说,这些丰富的元素,以及笼子与结合运行轮和个别训练领域提供了一种形式的术后物理治疗类似于提供给人类患者在周围神经系统10手术。

值得注意的是,虽然一些作者主张直接解剖皮下组织和肌肉筋膜,或者用15号手术刀进行清洁切割,但建议在解剖这些结构时使用热牛,以尽量减少术后造气的风险。

应该指出的是,已经设计了许多测试来测试大鼠周围神经修复的不同方面,即斧面再生、靶子再生和功能恢复,其中一些超出本研究的范围29、54、55、56。29,54,55,56例如,运动学分析29、36、55和形态学评估29,36,5529、36、5736,57被多位作者广泛使用。29此外,其中几个测试涉及变化,以最大限度地提高效率和/或可重复性54。例如,机械等分量测定(即对机械疼痛刺激的反应的评估)可以使用给定的von Frey细丝进行定性评估,如本文所述,或半定量地使用连续强的von Frey灯丝,甚至定量使用电子设备,施加增加的压力,直到观察到退出反应30,54。30,

同样,尽管一些作者使用行走轨迹分析来评估大鼠的前肢神经修复,但其他作者认为,单一MN病变往往不能产生可重复的变化,在爪印10,58,59。10,58,59此外,有些人指出,这些变化可能不会与肌肉恢复10,60,60成正比。考虑到这一点,一些研究人员主张在评估压碎内静脉病变后恢复时,而不是在段神经重建10、50、6150,61之后,在前爪使用步行10道分析。

抓握测试被广泛用于评估由MN16,,27控制的肌肉的运动恢复。为了保证通过此测试获得的数据的均匀性和可重复性,建议使用 Bertelli 等人提出的既定方法应用抓取测试。然而,目前的协议不同之处在于,它不经常固定的对侧爪子,以防止不必要的压力11,27。11,还应注意的是,其他作者在固定未受伤的爪子后,使用测功机或27,56,56级定量评估抓取测试。然而,这种定量评价可能受研究人员对大鼠尾巴26的强度的影响。此外,很难区分数字屈肌肌肉产生的强度(完全由大鼠中的MN和抓取测试9的对象)与手腕屈肌产生的强度,其中包括从ulnar神经99,10,2710,27接收其内侧的弯曲器。为了规避这些潜在的偏见,该协议使用类似于医学研究委员会规模,通常用于分级肌肉力量在人类10,11,62。10,11,62另外,其他作者也描述了使用视频分析和基于视频的评分系统11,63,63进行详细的抓取评估。

与坐骨神经相比,使用MN的潜在缺点是,关于后一神经的信息量更大。这反过来又可以使与MN获得的数据与以前的实验工程的数据进行比较,难度更大46,48,64。48,6446此外,与坐骨神经相比,MN的体积较小,使得手术操作更具挑战性8,12,27,56,65。,12,27,56,65

与本文所述的方法相反,电子学学评价可以使用放置在手臂和纳区域51的截皮单极电极进行。尽管侵入性较小,但由于手臂区域99、5151中ulnar神经可能受到刺激,这种方法有潜在的混淆风险。

大多数作者同意,并非所有大鼠使用的测试都提供协调的结果,因为外周神经修复取决于一系列复杂的因素,包括神经元生存、合六伸长和修剪、突触生成、成功夺回变性的感官器官和运动单元,以及大脑可塑性7,107、10、50、66、67。,50,66,67

最后,应该指出,啮齿动物模型的一个重要警告是,大鼠周围神经更接近其末端器官,其横截面区域比同源人类结构要小得多。然而,这种大小差异保证了啮齿动物的实验数据更快,与人类相比,大鼠的整体效果有望达到68倍。事实上,一些作者警告说,在试图推断使用啮齿动物在外周神经修复中获得的实验数据时,必须7,小心谨慎。灵长类动物模型被认为更可比70。然而,它们的使用与道德、后勤和预算限制有关。

尽管坐骨神经是周围神经研究中最常用的神经,但大鼠MN具有多重优点。例如,MN病变与受影响爪子11、12、16、5612的联合收缩和自动切除发生率11较小有关。,16,56值得注意的是,继坐骨神经截断之后的自切除会折磨着11-70%的老鼠。这可能使得目前的评估,如西亚指数不可能14。这反过来又使得对获得给定统计能力所需的动物数量的估计变得十分繁琐。

此外,由于MN比坐骨神经短,神经恢复观察到更快58,72,73,74,75,76。58,72,73,74,75,76此外,MN不受肌肉质量覆盖,使其解剖在技术上比坐骨神经16更容易。此外,MN 与手臂中的 ulnar 神经有平行路径。因此,ulnar神经可以很容易地用作神经移植,以修复MN损伤。最后,在人类中,大多数周围神经病变发生在上肢,这进一步支持在大鼠77,78,78中使用这种神经。

可以说,啮齿动物是实验动物最常用于周围神经修复领域48,79。48,如图所示,大鼠MN是一个方便的外周神经病变和修复模型。事实上,有多个标准化策略可用于评估运动和感官恢复,从而更容易比较结果36、46、60、80、81、82。36,46,60,80,81,82这些方法中有许多是非侵入性的,允许日常评估。

此外,物理治疗是从周围神经损伤中恢复的患者护理标准的一部分。如本文所示,为提交MN损伤44、55的大鼠提供术后物理治疗环境有多种策略。因此,这个模型特别适合复制临床场景,便于将结果外推给人类物种12、27、48、56、58、83。12,27,48,56,58,83

如本文所示,在大鼠的MN模型中,有多种标准化策略可用于评估大鼠的电机和感觉恢复。其中大部分是非侵入性程序,允许频繁评估。此外,由于人类物种中大多数外周神经病变发生在上肢,上述实验物理治疗设置可以更恰当地模仿临床环境中的恢复。可以说,这有利于将结果外推给人类物种,进一步验证了这种神经在大鼠中的使用。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

Diogo Casal从高级医学教育方案获得赠款,该方案由葡萄牙的卡卢斯特·古尔本基安基金会、尚帕利莫基金会、西班牙圣萨乌伊基金会赞助。作者非常感谢菲利佩·佛朗哥先生在图1中描绘的插图。作者感谢阿尔贝托·塞韦里诺先生在拍摄和编辑该视频方面提供的技术帮助。最后,作者要感谢Sara Marques女士在与动物获取和维护有关的所有后勤方面的帮助。

Materials

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Acetaminophen Amazon https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG
Acland clamps Fine Science Tools 00398 V http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf
Acland Single Clamps B-1V (Pair) Fine Science Tools 396 http://www.merciansurgical.com
Biogel Surgical Gloves Medex Supply 30465 https://www.medexsupply.com
BSL Analysis BIOPAC Systems https://www.biopac.com/
Castroviejo needle holders Fine Science Tools 12565-14 http://s-and-t.ne
Clamp applicator Fine Science Tools CAF-4 http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Constante voltage stimulator BIOPAC Systems STM200 https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/
Cutasept skin disinfectant Bode Chemie http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php
Dafilon 10-0 G1118099 http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816
Derf Needle Holders 12 cm TC Fine Science Tools 703DE12 http://www.merciansurgical.com
Dry heat sterilizer Quirumed 2432 http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores
Dynamometer SAUTER FH5 https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/
Electroneuromiography setup BIOPAC Systems MP36 https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/
Ethilon 5-0 W1618 http://www.farlamedical.co.uk/
FLIR Software FLIR
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved Fine Science Tools 11052-10 http://www.finescience.de
Graph paper Ambar
Heat Lamp HL-1 Harvard Apparatus 727562 https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) Universal Drugstore http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml
High-Temperature Cautery Fine Science Tools AA03 http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe Harvard Apparatus 507220F https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Infrared camera FLIR E6 http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/
Instrapac - Adson Toothed Forceps (Extra Fine) Fine Science Tools 7973 http://www.millermedicalsupplies.com
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT Fine Science Tools EA7613-11 http://www.merciansurgical.com
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution Sigma- Aldrich K113 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt&region=PT
Lacri-lube Eye Ointment 5g Express Chemist LAC101F http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT Fine Science Tools EA7652-14 http://www.merciansurgical.com
Meloxicam Recropharma Mobic https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam
Methylene Blue solution Sigma- Aldrich https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 Fine Science Tools JF-5 http://www.merciansurgical.com
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 Fine Science Tools JFA-5b http://www.merciansurgical.com
Micro retractor Fine Science Tools RS-6540 http://www.finescience.de
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight Fine Science Tools 67 http://www.merciansurgical.com
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 Fine Science Tools D-5a.2 http://www.merciansurgical.com
Monosyn 5-0 15423BR http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php
Normal saline for irrigation Hospira, Inc. 0409-6138-22 http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts
Operating microscope Leica Surgical Microsystems http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/
Skin Skribe Surgical Skin Marker Moore Medical 31456 https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1
Snacks Versele-Laga Complete Crock-Berry http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry
Straight mosquito forcep Fine Science Tools 91308-12 http://www.finescience.de
Surgical drapes Barrier 800430 http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml Veet http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/

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大鼠中位神经再生评价的功能与生理方法
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Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., Pais, D., Farinho, A., Alves, S., Pen, C., Mascarenhas-Lemos, L., Ferreira-Silva, J., Ferraz-Oliveira, M., Vassilenko, V., Videira, P. A., Goyri-O'Neill, J. Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat. J. Vis. Exp. (158), e59767, doi:10.3791/59767 (2020).More

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