Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Funktionelle og fysiologiske metoder til evaluering af median nerveregenerering i rotten

Published: April 18, 2020 doi: 10.3791/59767
Automatic Translation
*1,2, *3, 4,5, 1, 6, 7, 7, 7, 7, 7, 3, 4,5, 1
1Anatomy Department, NOVA Medical School, 2Plastic and Reconstructive Surgery Department and Burn Unit, Centro Hospitalar de Lisboa Central, 3Physics Department, Faculty of Sciences and Technology, LIBPhys, 4Glycoimmunology, CEDOC, NOVA Medical School, 5UCIBIO, Life Sciences Department, Faculty of Sciences and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 6Tissue Repair Unit, CEDOC, NOVA Medical School, 7Pathology Department, Centro Hospitalar de Lisboa Central
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret er en protokol til at producere forskellige typer af median nerve (MN) læsioner og reparation i rotten. Derudover, protokollen viser, hvordan man vurderer den funktionelle genopretning af nerven ved hjælp af flere noninvasive adfærdsmæssige tests og fysiologiske målinger.

Abstract

Hovedformålet med denne undersøgelse er at vise, hvordan man skaber og reparere forskellige typer af median nerve (MN) læsioner i rotten. Desuden præsenteres forskellige metoder til simulering af postoperativ fysioterapi. Flere standardiserede strategier bruges til at vurdere motoriske og sensoriske opsving ved hjælp af en MN model af perifernervelæsion og reparation, hvilket gør det nemt sammenligning af resultaterne. Flere muligheder er inkluderet for at give en postoperativ fysioterapi-lignende miljø til rotter, der har gennemgået MN skader. Endelig papiret giver en metode til at evaluere inddrivelse af MN ved hjælp af flere noninvasive test (dvs. gribe test, pin prik test, stigen rung walking test, reb klatring test, og vandresti analyse), og fysiologiske målinger (infrarød termografi, elektroneuromyografi, flexion styrke evaluering, og flexor carpi radialis muskel vægt bestemmelse). Derfor forekommer denne model særlig velegnet til at gentage et klinisk scenario, hvilket letter ekstrapolering af resultater til den menneskelige art.

Selv om iskiasnerven er den mest studerede nerve i perifer nerve forskning, analyse af rotte MN præsenterer forskellige fordele. For eksempel er der en reduceret forekomst af fælles kontrakturer og automutilation af de berørte lemmer i MN læsionundersøgelser. Endvidere, MN er ikke omfattet af muskelmasser, hvilket gør dens dissektion lettere end iskiasnerven. Desuden, MN opsving er observeret hurtigere, fordi MN er kortere end iskiasnerven. Også, MN har en parallel vej til ulnar nerve i armen. Derfor kan ulnar nerven let bruges som nervetransplantat til reparation af MN skader. Endelig mn i rotter er placeret i forben, beslægtet med den menneskelige øvre lemmer; hos mennesker, er den øvre del af euforiserstedet stedet for de fleste perifere nervelæsioner.

Introduction

Perifere nervelæsioner opstår regelmæssigt som følge af traumer, infektion, vaskulitis, autoimmunitet, malignitet og/eller strålebehandling1,2. Desværre, perifernerve reparation fortsætter med at præsentere klinisk uforudsigelige og ofte skuffende resultater3,4. Der er bred enighed om , at der stadig er behov for betydelig grund- og oversættelsesforskning for at forbedre udsigten til de berørte4,5,6,7.

Rotten MN viser store ligheder med mennesker8,9 (Figur 1). Stammer fra brachialplexus i aksillær regionen, denne nerve ned i den mediale aspekt af armen, nå albuen, og forgrening ud til de fleste af musklerne i ventrale rum i underarmen. MN når hånden, hvor den innervates thenar muskler og de første to lumbrical muskler samt til en del af rottens hånd hud9 (Figur 1).

Ved hjælp af rotte MN, er det muligt at tilstrækkeligt replikere perifere nervelæsioner hos mennesker10,,11,12. Denne nerve har flere potentielle forskningsfordele i forhold til den sædvanligvis anvendte iskiasnerven. Fordi MN er placeret i forbenet af rotter (beslægtet med den menneskelige øvre lemmer), kan det blive beskadiget eksperimentelt med en meget mindre indvirkning på rottens velbefindende, sammenlignet med iskiasnerven, som innervates en betydelig del af bækkenbenet13. Desuden forekommer de fleste kliniske læsioner hos mennesker i overekstremiteterne, hvilket svarer til rottens forben10,11,12,14,15,16.

Dette papir viser, hvordan man producerer forskellige typer af MN læsioner i rotten. Desuden præsenteres forskellige måder at simulere postoperativ fysioterapi. Endelig er der beskrevet test til vurdering af den funktionelle genvinding af mn'en. Der er flere standardiserede strategier til rådighed til at vurdere motoriske og sensoriske opsving ved hjælp af en MN model af perifernerve læsion og reparation, hvilket giver mulighed for en nem sammenligning af resultater. MN-modellen er særligt velegnet til at kopiere det kliniske scenario og lette ekstrapolering af resultater til den menneskelige art.

Protocol

Alle procedurer vedrørende dyreforsøg blev godkendt af Udvalget for Hudpleje og Brug af InstitutionelT Foder og Etisk Udvalg på Nova University Medical School, Lissabon, Portugal (08/2012/CEFCM).

1. Median nervekirurgi

BEMÆRK: Følg aseptisk teknik under operationen. Brug personlige beskyttelsesinstrumenter (PPE) og bære en steril kirurgisk kjole17. Autoklave alle de nødvendige kirurgiske instrumenter før operationen (se materialetabellen).

  1. Brug 12 uger gamle Wistar rotter. Giv dem ad libitum mad og vand med 12 h lys-mørke cykler 7 dage før operationen. Før anæstesi, vejes rotten til at bestemme mængden af bedøvelse kræves.
  2. Bedøve raten med en intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin (40-80 mg/kg kropsvægt) og xylazin (5-10 mg/kg kropsvægt). Kontroller, om anæstesidybden er inde, fordi der ikke er respons på en tåknivspids , og ved at observere respirationshastigheden under hele proceduren18,19. Giv yderligere analgesi , hvis der observeres en respirationsfrekvens på over 110 cyklusser/min. eller motorisk reaktion på tåklemning18,20.
  3. Injicer 1 mg/kg meloxicam subkutant for at give forebyggende analgesi20,21.
  4. For at undgå hornhinde slid under operationen, anvende oftalmologiske gel til begge øjne.
  5. Brug en hårfjerningcreme til at fjerne håret over det mediale aspekt til højre. Når det er gjort, vaskes med varmt saltvand for at fjerne cremen17.
  6. Læg rotten i supine position på en varmepude. Påfør en jod eller chlorhexidin-baseret kirurgisk krat over det operative sted. Lad det i mindst 15 s og derefter tørres med ethanol. Gentag ansøgningen 3x. Sørg for, at krat er i kontakt med huden i mindst 2 minutter, før du fortsætter med operationen.
    BEMÆRK: Kontakt infektionskontrolmyndigheden på din forskningsenhed for at få alternative protokoller for at forebygge infektion på operationsstedet19.
  7. Drapere det kirurgiske område17.
    BEMÆRK: Udfør alle procedurer under strenge aseptiske betingelser19.
  8. Incise huden i den mediale aspekt af højre arm og brystfinne region til den dybe fascial plan, ved hjælp af en række 15 skalpel klinge. Forsigtigt ætse eventuelle blødende fartøjer ved hjælp af en elektrisk ætse.
  9. Forsigtigt opdele brachialske fascia, der præsenterer som en hvidlig kappe, der dækker musklerne, ved hjælp af en thermocautery eller et par stumpsaks, passe på ikke at beskadige vaskulære og nerve strukturer i den mediale aspekt af armen.
  10. Åbn en saks rent ud under den terminale indsættelse af pectoralis større muskel, for at drille denne muskel væk fra den underliggende aksillær arterie og vene, samt fra terminalen grene af brachialis plexus.
  11. Opdel indsættelsen af pectoralis større muskel med en elektrisk ætse. Eksponere og sektion brystfinnen mindre muskel.
  12. Rent ud dissekere MN fra brachialfartøjer og fra ulnar nerven starter fra aksillær regionen op til albuen. Dette giver mulighed for eksponering af de forskellige terminalgrene af brachialplexus, nemlig medianen, ulnaren, radialen, aksillærogen og de muskuokutane nerver (Figur 2).
  13. Adskil forskellige forsøgsgrupper som beskrevet nedenfor.
    1. Opret Sham-gruppen ved kun at dissekere MN.
    2. Opret Crush-gruppen ved at komprimere MN i den midterste del af armen i 15 s ved hjælp af et tal 5 mikrokirurgi pincet, eller et lignende instrument22,23.
    3. Opret Excision-gruppen ved hjælp af et par mikrokirurgi saks til punktafgifter en 10 mm lang segment fra den centrale del af MN i armen. Ligat den proksimale stump af nerven med en 8/0 Nylon sutur for at forhindre axonal vækst.
    4. Opret Graft-gruppen ved hjælp af det 10 mm lange segment af MN, der er beskrevet i sidstnævnte trin, og drej den 180°. Suture de proksimale og distale stubbe af den opdelte MN til nervetransplantatet ved hjælp af afbrudte 10/0 Nylon sting.
  14. Luk hudsåret ved afbrudt 5/0 Nylonsting10,24.
  15. Giv postoperativ analgesi med 7 ml kirsebær-flavored acetaminophen blandet med 43 ml postevand25 for at opnå en koncentration på 4,48 mg/ml i 50 ml plast vandflasker stilles til rådighed for rotter ad libitum i 3 dage25.

2. Boliger og fysioterapi

  1. Lad rotter have kontakt med fysioterapi apparater 2-4 uger før operationen, for at sikre en lettere og hurtigere tilpasning til motion indstillinger. Udfør øvelserne ved at følge de procedurer, der er beskrevet nedenfor.
  2. En gang om dagen placeres hver rotte inde i en individuel fysioterapisfære, og placer derefter kuglen i et rum med få forhindringer. Lad rotten ambulate og udforske rummet frit i en halv time.
  3. Hus rotterne individuelt i ensomme bure med indbyggede løbehjul for at hjælpe dem med at udøve.
  4. Form grupper af 4-5 dyr og hus disse grupper i personlige bure. Tilpas burene ved at inkludere stiger, reb, løbehjul og andre miljømæssige berigende elementer.
  5. Returner individuelle rotter til personlige bure dagen efter operationen.
  6. Genoptag fysioterapi øvelser 3 dage efter operationen.

3. Funktionelle prøvninger

  1. En uge før du begynder at udføre de funktionelle tests, gøre rotterne fortrolige med de fødevaregodbidder, der skal anvendes som positiv forstærkning. Giv denne forstærkning efter den vellykkede afslutning af hver test, før og efter operationen. Efter den indledende træningsperiode på 3 uger genoptages alle test 1 uge efter operationen.
  2. Udfør testene om aftenen, når rotterne er naturligt mere aktive. Genoptage test 1 uge efter operationen.
  3. Udfør gribeprøven ved at placere rotten på et gitter og løfte den med halen, så den kan gribe fat i gitteret med sine forpoter11,,26. Tildel en "positiv" score, hvis rotten kan få fat i nettet med begge forpoter. Tildel en "negativ" score, hvis rotten ikke kan få fat i nettet med den skadede pote.
    BEMÆRK: En positiv gribeprøvning indikerer, at motorkomponenten i MN fungerer16,27.
  4. Udfør en Pin Prick Test28,29.
    1. Lav en plastplatform med et 4 mm x 4 mm kvadratisk gittermønster. Sørg for at støtte dette gitter med en 21 cm lang metallisk ramme.
    2. Placer rotten på platformen og dæk risten med en 15,5 cm x 15,5 cm x 11 cm gennemsigtig plastkasse. Vent i nogle minutter, indtil normale aktiviteter (f.eks. sonderende og større grooming) aftager.
    3. Start testen, når rotten holder stille og står på sine fire poter.
    4. Ved hjælp af et spejl, indsætte et æteren (f.eks nummer 4 Von Frey hår med en bøjende kraft på 25 g) gennem masken og stikke palmar aspekt af forpoten i huden område af MN (Figur 1). Gentag vurderingen 5x på hver forpote alternativt, venter et par sekunder efter hver evaluering.
    5. Kontroller for bøjning af Von Frey filament30 for den korrekte evaluering. Score tilbagetrækning svar som følger: "0" for ingen tilbagetrækning svar, "1", hvis rotten langsomt fjerner poten fra glødetråden, "2", hvis rotten hurtigt reagerer på stimulus og fjerner poten eller slikker poten.
      BEMÆRK: Hvis der observeres ambulation og bidende af glødetråden, gentages stimulusen, da disse betragtes som tvetydige reaktioner.
  5. Træningssessioner
    BEMÆRK: Træn rotterne dagligt i 3 uger, før du udfører operationen om aftenen i et svagt lysmiljø. Træningssessionerne anbefales specielt til reb klatring, stigen rung, og vandrestier tests. Disse kan gøres i den rækkefølge, der præsenteres før, begyndende med rebet klatring test, stigen rung, og endelig vandrestier test. Lad det samme dyr hvile et par minutters hvile før en ny test.
    1. I løbet af den første uge placeres rotten på den sidste tredjedel af stigen/rebet/gangen tæt på boksens indgang. Dyret skal bevæge sig mod kasseåbningen ved forsigtigt at røre ved og/eller trække i spidsen af halen. Giv rotten en fødevare behandle, når den kommer ind i kassen, så det nogle sekunders hvile, før du gentager testen. Gentag det 5x hver dag i 5 dage.
    2. I løbet af den anden uge placeres dyret på den anden tredjedel af stigen/rebet/gangen Gentag trinene i 3.5.1.
    3. I løbet af den tredje uge placeres rotten på bunden af stigen/rebet/gangen på den modsatte side af kassens indgang. Trinnene gentages i 3.5.1, men beløn kun dyret, når det gennemfører testen korrekt.
  6. Udfør Stigen Rung Test.
    BEMÆRK: Denne test bruges til at vurdere forelimb styrke, stepping, placering, og koordinering31.
    1. Hæld rotten i bunden af stigen (120 cm x 9 cm x 2 cm med 18 trin 1,5 cm tyk, fordelt 4 cm fra hinanden) og rør forsigtigt på rottens hale. Sørg for, at stigen er placeret ved en hældning på 10° og fører til en 13,20 cm x 11 cm åbning på en mørk træ 31,5 cm x 35 cm x 35 cm boks.
    2. Start timeren, når rotten begynder at klatre op ad stigen og stoppe timeren, når rottens snude krydser boksens indgang.
    3. Optag tiden og gentag testen 3x, hver adskilt mindst af et 1 min interval.
  7. Reb klatring
    BEMÆRK: Denne test anvendes til vurdering af gribestyrke, som er afhængig af MN recovery32.
    1. Sæt rotten i bunden af rebet og overtal den til at klatre ved forsigtigt at røre ved halen. Start timeren, når dyret begynder at klatre og stoppe det i det øjeblik rotternes snude krydser platformens indgang.
    2. For hver test skal du registrere den tid, det tager at klatre op på platformen, og antallet af slips af den skadede pote, mens rotten klatrer op i rebet. Overvej testen gyldig, hvis dyret ikke tøver under opgaven eller ikke holder op med at klatre. Giv rotten en snack efter at have udført opgaven korrekt.
    3. Optag tiden og gentag testen 3x, hver adskilt mindst med et 1 minutinterval.
  8. Vandrestier
    BEMÆRK: Denne test anvendes til vurdering af forelimb motor recovery33,34.
    1. Sæt et apparat bestående af en lukket gangbro 16,5 cm i højden x 8,7 cm i bredden x 43 cm i længden. Sørg for, at dette fører til en rektangulær 8,8 cm x 8,2 cm åbning i en af væggene i en sort træ 23 cm x 36 cm x 28 cm boks. Medtag en lodret skydedør for at lukke boksens indgang hurtigt. Medtag en aftagelig top, der skal bruges til at hente rotten33,34.
    2. Læg et stykke grafpapir på gangens gulv. Grib rotten ved halen og lad den holde en malerbørste dyppet i methylenblåt. Placer rotten ved indgangen til korridoren for at få den til at gå ind i boksen. Fjern grafpapiret fra gangens gulv, og gentag testen, indtil der opnås et godt repræsentativt indtryk af begge forpoter.
    3. Fra de opnåede udskrifter skal du vælge en med klare successive forpote udskrifter, fotografere dem i et tiff- eller jpeg-format, og måle følgende parametre ved hjælp af open access-softwaren FIJI35.
      BEMÆRK: Først skal du kalibrere hvert billede ved hjælp af markeringerne i grafpapiret (Analysér | Angiv skala) For det andet skal du konvertere hvert billede til et 8-bit format (Billede | Type | 8-bit). Brug derefter værktøjet til rektangulær markering til at vælge poteudskriften. Beskær denne del af billedet (Billede | Beskæring). I hvert billede skal du fremhæve poteaftrykkene og fjerne baggrunden ved at tærskelbilledet (Billede | Juster | Tærskel).
      1. Mål holdningsfaktoren ved at måle poteaftryksområdet. Brug værktøjet til rektangulær markering til at markere poteudskriften, og tryk på Ctrl + M.
      2. Mål udskriftslængdefaktoren ved at måle den længste længde af poteaftrykket (for trin 3.8.3.2–3.8.3.6 skal du bruge værktøjet til markering af lige linje til at vælge de to fjerneste punkter, og tryk på Ctrl + M).
      3. Mål fingerspredningsfaktoren ved at måle poteaftrykkets bredeste bredde.
      4. Mål den mellemliggende fingerspredningsfaktor ved at måle den bredeste bredde mellem den anden og tredje finger.
      5. Mål skridtlængden ved at måle afstanden mellem homologe punkter af efterfølgende poteindtryk på en given side.
      6. Støttens bund måles ved at måle vinkelafstanden mellem den centrale del af poteaftrykket og bevægelsesretningen29,33,36.
        BEMÆRK: Udfør de sidste to målinger i to par repræsentative på hinanden følgende bilaterale poteindtryk33.

4. Fysiologiske målinger

  1. Infrarød termografi (IRT)37,38,39.
    1. Sørg for, at temperaturen i det rum, hvor målingerne skal udføres, er mellem 18 °C-25 °C ved hjælp af et normalt digitalt hydrotermometer med en termisk opløsning på 0,1 °C. Sørg for, at der ikke er væsentlige varmekilder (f.eks. computere eller køleskabe).
    2. Akklimatisere rotterne ved at bringe dem til vurderingslokalet 2 timer før evalueringen. Før eksperimentet påbegyndes, skal du bedøve rotten som beskrevet ovenfor (trin 1.3-1.6) eller følge institutionens protokol. Kontroller, at der ikke er svar på en tåklemme, før eksperimentet startes.
    3. Tænd for det infrarøde termografiske kamera 15 minutter før anskaffelsen, og sluk ikke det under evalueringerne. Indstil kameraets emissivitetsparameter, så den svarer til skindshudens (ε = 0,98)37,40,41.
    4. Placer rotten på sin dorsum på en ren og stabil overflade med en polyethylen svamp. Sørg for, at der ikke er reflekterende materialer og andre mulige kilder til artefakter. Fix sine forpoter omhyggeligt i supination med dobbelt ansigt lim tape. Sæt et digitalt termometer 2 cm inde i endetarmen for at overvåge rottens centrale temperatur under alle evalueringer.
    5. Hold det termografiske kamera i en vinkel på 90° og 30 cm fra rotten. Fokuser kameraet på hele dyrets krop. Få tre infrarøde termografi billeder fordelt 30 s fra hinanden.
    6. Overfør de erhvervede termogrammer til en computer og analysere dem ved hjælp af analyse software. Definer temperaturen af plantar overfladen af begge forpoter ved hjælp af en fast rektangulær region af interesse (f.eks 9 x 11 pixels) i plantar område af MN, for eksempel i midten af den første metacarpus mund pad (Figur 1). Ved hjælp af den gratis FLIR Tools software, skal du vælge termografi ved at dobbeltklikke på den. På venstre værktøjslinje skal du vælge knappen "Tilføj kassemåleværktøj" og tegne et rektangel på 9*11 pixel over plantarområdet for begge forpoter. Mens du justerer rektanglet, kan dets dimension i pixel bekræftes. Udfør det på begge forpoter. På højre side af billedet finde den maksimale, minimum og gennemsnitlige temperaturer.
    7. Højreklik på det tidligere tegnede investeringsafkast, og vælg eksportér. De gennemsnitlige, maksimale og minimale temperaturer samt en matrix af temperaturer i investeringsafkastet eksporteres derefter til et .csv-dokument. Disse data kan senere udforskes ved hjælp af dataanalyse software.
  2. Elektroneuromyografisk (ENMG) Evaluering
    1. Sæt en elektrisk stimulator op. Tape et par engangs akupunkturnåle (0,25 mm x 25 mm) med en ubetydelig impedans [<1 Ω]) og 25 mm mellem dem for at skabe elektroder til stimulering. Tilslut nu stimulatoren og elektroden til en dataindsamlingsenhed for at tage de indkommende signaler og konvertere dem til digitale signaler, der kan behandles med computersoftwaren.
    2. Udfør evalueringerne i samme rum, og altid under de samme kontrollerede miljøforhold42,43,44. Klem forpoten for at sikre, at rotterne er dybt bestøvet, før du starter dataindsamling.
      BEMÆRK: Dyb anæstesi er af afgørende betydning for at minimere variationen i forbindelse med spontane frivillige og/eller ufrivillige bevægelser foretaget af rotterne43.
    3. Udsæt MN på begge sider under det kirurgiske mikroskop som beskrevet i trin 1.8-1.13. Brug en nummer 15 skalpel klinge til at forlænge brachile indsnit i underarmene med en ventral midterlinjen snit.
    4. Eksponere overfladiske aspekt af flexor digitorum sublimis muskler ved rent ud at adskille den overliggende antebrachial fascia ved hjælp af iris saks. Sæt jordnålen i quadriceps femoris musklen i venstre bagben for at tilslutte signalet jordstikket.
    5. Start med den rigtige forpote og placere optagelsen elektroder i flexor digitorum sublimis muskel mave af forpoten og stimulation elektrode proksimalt til læsionsstedet i MN. Fugt disse elektroder med saltvand.
    6. Sørg for, at softwaren er indstillet på følgende måde: kanalindgangsport 1 (CH1) – stimulator til 0-10 V; og kanalindgangsport 2 (CH2) - EMG til 30-1.000 Hz. Start med at vælge en stimuleringsamplitude på 10 mV, og optag cmom-prøvefrekvensen for sammensatte muskler på 50 kHz i en varighed på 40.000 ms. Øg gradvist stimuleringsamplituden i 10 mV-trin, indtil den når 2.000 mV. Gentag det samme for venstre pote42,43,44.
      BEMÆRK: Signalet forstærkes til 1.000 x og filtreres ved hjælp af et 30-1.000 Hz bånd. Stimuleringsudgangen er indstillet til en enkelt puls med en varighed på 1 ms42,43,44.
    7. Åbn den optagede fil i softwaren til optageapparatet.
      BEMÆRK: Som standard vil skærmen vise blår vinduer på toppen i rødt, stimulatorimpulser, og nedenfor i blåt optageren ENMGs. Hvis du skubber det vandrette rullepanel under tidsskalaen, kan du få den fulde post visualisering. De to vigtigste værktøjer, Zoom værktøj og I-Beam værktøj,er i nederste højre side af panelet. Ved hjælp af zoomværktøjet er det muligt at optimere visualiseringen af CMAPs og udforske grafikken. For at sikre en god tilpasning på visualiseringsskærmen kan det være nødvendigt at justere skærmen efter zoom. Det kan du gøre ved at vælge Vis| Skaler automatisk Bølgeformer. I-beam-værktøjet gør det muligt at vælge bestemte områder af graferne og ydeevnen af de ønskede målinger. Oven på graferne er der tre små vinduer, hvor målingerne vises. P-P viser den gennemsnitlige amplitudeværdi af det valgte område i volt (både i stimulatorposten og i ENMGs), mens Delta-T viser tidsintervallet for dette valg.
    8. Mål parametrene fra det sammensatte muskelhandlingspotentiale (CMPA'er, beskrevet i tabel 1) ved hjælp af de enslydende måleværktøjer fra softwarestikket i "Værktøjskasse til ukontrolleret klassificering af MUAP'er og handlingspotentialer i EMG"45.
    9. For hver rotte bestemmes en minimal værdi af stimuleringsspændingen, hvorefter CMAPs amplitude ikke øges yderligere. Start fra en 0,05 mV stimulus, og give successive stigende stimuli i trinvise spændinger på 0,05 mV.
    10. Påfør en stimulus 20% over denne spænding for at opnå en supramaximal stimulation værdi.
    11. Når sidstnævnte værdi er bestemt, og den tilsvarende stimulus anvendes, skal du registrere de næste CMAP-parametre.
  3. Evaluering af fleksionstyrke
    1. Brug de samme stimulator- og stimuleringselektroder til elektrisk at stimulere MN som i trin 4.2. Indstil indgangskanalen CH1 som stimulator (0-10 V) og udgangsindstillingerne for stimuli varighed på 30 s med impulser af 1 ms varighed og 1 Hz frekvens. Knyt et dynamometer med en opløsning på d = 0,001 N til en computer.
      BEMÆRK: Realtidsvisualisering af data kan opnås ved at opbygge et kraftpunkt pr. gang (N/s) ved hjælp af den software, der tidligere var installeret på computeren, og som er forbundet med et dynamometer46.
    2. Rotten anbringes som beskrevet i trin 4.1.4. Placer en 5/0 silke sutur loop gennem den anden interosseous rum af begge forpoter. Fastgør suturløkken til dynamometerets krog, og forpoten flugter med dynamometeret uden at belaste suturlinjen for meget.
    3. Fastgør den kontralaterale pote med tape for at undgå falske bevægelsesforstyrrelser i dynamometeraflæsningerne.
    4. Indstil dynamometeret til nul ZERO ved at klikke på NUL-knappen.
    5. Stimulatoren justeres til en supramaximal amplitudestimulation på 1,5 V ved at justere spændingsknuden.
    6. På pc'en skal du åbne softwaren AFH-01. Åbn separatoren "Enhed ",og vælg enheden FH5. Opret en ny fil ("Målinger1" er det navn, der er angivet som standard), og omdøb filen.
    7. Placer elektroden på den proksimale del af MN, skal du klikke på spil i bunden af programmet, registrere træk på dynamometeret i 30 s.
    8. Importer de opnåede værdier til en dataanalysesoftware. Beregn de maksimale og gennemsnitlige kraftværdier og området under kurven (AUC) for styrkex-tidsgrafen for hver evaluering.
    9. Gentag for venstre forpote.
  4. Muskelvægt
    1. Afliv rotterne under generel anæstesi ved exsanguination47,48.
    2. Høst flexor carpi radialis musklen fra begge underarme, dissekere musklen fra dens oprindelse, indtil dens distale senen indsættelse, ved hjælp af en række 15 skalpel klinge.
    3. Musklerne vejes med en præcisionsskala9,49.

Representative Results

I alt 34 rotter blev tilfældigt opdelt i følgende grupper: Sham (n = 17), Excision (n = 17) og Nervegraft (n = 10) til operationen. Alle rotter overlevede kirurgi og den postoperative periode begivenhedsløst. En uge efter operationen og i de efterfølgende 100 dage gennemgik alle dyr de funktionstest, der er beskrevet ovenfor, en gang om ugen. De repræsentative resultater af hver af disse test er beskrevet nedenfor.

Gribetest

Procentdelen af rotter med positiv respons i gribetesten var højest for Sham-gruppen. Denne værdi steg gradvist over tid hos rotter fra Crush og Nerve Graft grupper ( Figur3).

Pin Prik Test

Rotter fra Sham gruppen havde de bedste resultater i den kumulative pin prik test i forhold til rotter fra Nerve Graft gruppen. Begge havde bedre score end rotterne i Excision-gruppen (Figur 4).

Stige kører test

Rotternes hastighed i stigen kører test var højest i Sham gruppen end i rotter ne sendt til MN læsion. Blandt sidstnævnte, tid til at køre stigen tendens til at falde over tid, paralleling MN opsving (Figur 5).

Reb test

Som i stigen kører test, den tid rotterne tog at klatre rebet var kortere i Sham gruppen i forhold til de grupper, hvor MN blev såret. Rotternes hastighed i denne test steg, da MN fik lov til at komme sig (Figur 6).

Analyse af vandrespor

Analyse af vandrestier tendens til at vise ændringer i morfologi af pote prints (Figur 7). Disse ændringer var ofte mere udtalt i knusende skader end i segmentale nervelæsioner50.

Infrarød termografi

Termografi var nyttig, når man undersøger temperaturforskelle mellem forpoterne i de første 30 dage efter operationen. Temperaturforskellene var mere mærkbare hos rotter med en mere alvorligt Excision såret MN,Figure 8 f.eks.

Elektroeuromyografi

Tabel 1 opsummerer elektroneuromyografimålingernes biologiske betydning, hvilket giver repræsentative resultater for de forskellige forsøgsgrupper. Forskellige mønstre blev observeret med elektroeuromyografi. En normal CMAP var typisk for en rotte fra Sham-gruppen, mens en polyfasisk CMAP var forbundet med en variabel grad af læsion af MN, som i Crush og i Nerve Graft grupper (Figur 10). I Excision-gruppen blev der ikke observeret nogen CMAPs.

Håndled fleksion styrke

I betragtning af at håndleddet fleksion er hovedsageligt afhængig af MN, denne test blev brugt til at evaluere motoriske opsving i denne nerve område. Håndledsfleksionstyrken var tættest på normal, når restitutionen var maksimal (figur 11).

Muskelvægt og morfologi

Vægten og morfologi af flexor carpis radialis muskel var afhængig af MN opsving, da denne muskel er innervated udelukkende af MN9,10. Således blev normal vægt og morfologi observeret i Sham-gruppen. Et tab af vægt og muskel trophisme blev observeret i Crush, Nerve Graft, og Excision grupper (Figur 12).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af ratens mediannerve.
(1) Mediannervens oprindelse og ophør i rottehjernen (grønt område = primært motorområde; blåt område = primært sensorisk område). (2) Tværgående del af rygmarven på C7-segmentniveau (3) Axillary nerve; (4) Musculokutan nerve; (5) Radial nerve; (6) Median nerve; (7) Ulnar nerve; (8) Medieret kutan gren af armen (9) Medieret kutan gren af underarmen (10) Aksillær arterie; (11) Brachialarterie; (12) Median arterie; (13) Overfladisk radial arterie; (14) Ulnar arterie; (15) Motor gren af mediannerven til pronator teres muskel; (16) Motor gren af mediannerven til flexor carpis radialis muskel; (17) Motor gren af mediannerven til flexor digitorum superficialis muskel; (18) Motorgren af mediannerven til flexor digitorum profundus musklen; (19) Sensorisk gren af mediannerven til thenarregionen; (20) Fælles palmar arterie af den første interosseous rum; (21) Radial palmar digital arterie af det første ciffer; (22) Motor gren af mediannerven til thenar muskler; (23) Palmar arteriel bue; (24) Radial palmar digital nerve af det første ciffer; Ulnarpalmar digital nerve af det første ciffer; (26) Fælles palmar arterie af den tredje interosseous rum; (27) Motorgrene af midternervens midternerves midternerves midternerves spaltenerver til de første tre lumbricale muskler Ulnarpalmar digitale nerver af andet, tredje og fjerde cifre; (29) Ulnar palmar digitale arterier til det fjerde og femte cifre; (30) Radial palmar digitale nerver af det andet, tredje og fjerde cifre; (31) Radial palmar digital arterie af det femte ciffer; (32) Hudområde af mediannerven i forpoten (blåskygget region). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fotografi af den højre forben af rotten, der viser mediannervens kirurgiske anatomi i arm- og aksillærområder.
Cr, kranie; Mig, mediale Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Procentdel af rotter med en positiv gribetest i den forskellige forsøgsgruppe over en periode på 100 dage efter operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Nociception evaluering ved hjælp af kumulative pin prik testresultater i den opererede forpote normaliseret til den kontralaterale pote i de forskellige eksperimentelle grupper.
Lodrette søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. Vandrette linjer i den øverste del af figuren angiver statistisk signifikante forskelle mellem forsøgsgrupper, ***p<0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Gennemsnitshastighed i stigen ser det ud til, at de forskellige forsøgsgrupper kører.
Lodrette søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. Stjerner i den øverste del af figuren indikerer statistisk signifikante forskelle mellem grupperne * p<0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Gennemsnitlig klatrehastighed i rebtesten i Sham- og Excision-grupperne.
Lodrette søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. Stjerner i den øverste del af figuren viser statistisk signifikante forskelle mellem grupperne * p<0,05; **p<0.01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Parametre for gangspor i de forskellige forsøgsgrupper.
Værdier på den opererede lemmer udtrykkes som procentdele af midler normaliseret til den kontralaterale lemmer. (A) Holdning faktor; bB) Udskriftslængde; cC) Fingerspredningsfaktor; dD) Mellemliggende fingerspredningsfaktor (E) Skridtlængde FF) Støttegrundlag. Lodrette søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. Vandrette linjer i den øverste del af figuren angiver statistisk signifikante forskelle mellem forsøgsgrupper. D30, D60, D90 = 30, 60 og 90 dage efter operationen, *p<0.05; **p<0.01; p<0.001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Gennemsnitlig temperaturforskel registreret ved infrarød termografi.
Boksen stipenter repræsenterer temperaturforskellen mellem palmar regionen af mediannerven på den opererede side (højre side) og den kontralaterale side (venstre) i Sham (n = 17) og Excision (n = 17) grupper, * p<0,05; **p<0.01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Typisk infrarødt termografimønster for et dyr fra excisionsgruppen i løbet af de første 45 dage efter operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Typiske mønstre af Compound Muscle Action Potentials (CMAPs) fra et dyr fra Sham og Nerve Graft grupper 90 dage efter operationen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Evaluering af håndledsfleksionstyrke på begge forpoter 90 dage postoperativt i forskellige eksperimentelle grupper.
Håndledsfleksionstyrke blev vurderet ved hjælp af området under kurven (AUC) over en periode på 30 s og ved hjælp af supratetanic stimulation. Lodrette linjer angiver 95 % konfidensintervaller. Vandrette linjer i den øverste del af figuren fremhæver statistisk signifikante forskelle mellem grupper, **p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: Flexor carpi radialis muskelvægt og makroskopisk udseende 100 dage efter operationen.
(A) Kasseparceller, der viser den normaliserede flexor carpi radialis muskelvægt i forskellige forsøgsgrupper, **p<0.01; p<0.001. BB) Fotografier af musklerne i højre og venstre side i sham- og excision-forsøgsgrupperne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Parameter Parameterbetydning Sham-gruppen Excision gruppe NG-gruppe
Neurologisk stimulationstærskel (%) Evaluering af nerve regenerering, da der er et minimalt antal nervefibre, der kræves for at producere enten en CMAP eller en synlig muskelsammentrækning12 281,63 ± 271,65 5359,98 ± 3466,52 2108.12 ± 2115,13
Motorstimuleringstærskel (%) Evaluering af nerve regenerering, da der er et minimalt antal nervefibre, der kræves for at producere enten en CMAP eller en synlig muskelsammentrækning12 462,52 ± 118,91 til 1694,10 ± 503,24 1249,50 ± 503,24
Ventetid (%) Vurdering af nerveledning hastighed i de hurtigste nervefibre, det vil sige den største myelinerede fibre44 113,55 ± 25,04 Nielsen 132,80 ± 69,95
Neuromuskulær transduktionshastighed (%) Vurdering af nerveledning hastighed i de hurtigste nervefibre, det vil sige den største myelinerede fibre44 92,01 ± 20,88 Nielsen 91,30 ± 26,51
CmOM'eramplitude (%) Evaluering af antallet af reinnerverede motorenheder34 til 110,63 ±45,66 Nielsen 41,60 ± 24,84
CMAPs varighed (%) Vurdering af synkroni af muskel innervation, som er afhængig af graden af muskel reinnervation og myelination af de innerverende motorfibre44,45 101,12 ± 23,92 Nielsen 151,06 ± 54,52
NG, nervegraft
CMAPs,sammensatte muskel handling potentiale.
Ikkerelevant
Alle parametre udtrykkes som procenter af de gennemsnitlige kontralaterale værdier.
Numeriske variabler udtrykkes som gennemsnitlig ± standardafvigelse.

Tabel 1: Elektroneuromyografisk vurdering ved forsøgets afslutning.

Discussion

Dette papir præsenterer en protokol til at skabe forskellige typer af MN læsioner og reparation i rotten. Derudover, det illustrerer, hvordan man vurderer den funktionelle genopretning af denne nerve ved hjælp af flere noninvasive adfærdsmæssige tests og fysiologiske målinger.

Især flere af de funktionelle tests, der er beskrevet i dette papir, nemlig Stigen Running Test og Rope Test, er væsentligt afhængige af rottens vilje til at udføre opgaven med forventning om at opnå den mad belønning51,52,53. Det skal bemærkes , at visse rottestammer er mere modtagelige for uddannelse og udfører reproducerbart i denne type test51,52,53. For eksempel, Lewis rotter klarer sig dårligt i disse tests både i uddannelsesfasen og efterfølgende51,52,53.

Rottestald bør give rigelig bevægelsesfrihed i overensstemmelse med deres naturlige sonderende adfærd, ud over at tillade forsøgsdyr at blive fortrolig med nogle af de elementer, der er til stede i de funktionelle test19. Derfor vises forskellige former for boliger, der giver mulighed for større bevægelsesfrihed. De store bure er personlige med berigelseselementer, der senere anvendes i de funktionelle test (f.eks. reb og stiger).

Velsagtens, disse berigende elementer samt bure med indarbejdet løbehjul og de enkelte træningskugler giver en form for postoperativ fysioterapi svarende til den, der tilbydes til menneskelige patienter, der drives på det perifere nervesystem10.

Betydeligt, selv om nogle forfattere går ind dissekere de subkutane væv og muskel fasciae rent eller ved ren skæring med en række 15 skalpel, brugen af thermocautery når dissekere disse strukturer anbefales at minimere risikoen for postoperativ hæmatom.

Det skal bemærkes, at der er udarbejdet talrige test for at teste forskellige aspekter af perifer nervereparation hos rotten, nemlig regenerering af axoner, beskyttelse mod genindstråling og funktionel genopretning, hvoraf nogle ligger uden for denne undersøgelse29,54,55,56. For eksempel er kinematisk analyse29,36,55 og histomorfoometrisk vurdering29,36,57 bredt ansat af flere forfattere. Derudover indebærer flere af disse test variationer for at maksimere effektiviteten og/eller reproducerbarheden54. For eksempel kan mekanisk algisemetri (dvs. evaluering af reaktioner på mekaniske smertefulde stimuli) vurderes kvalitativt ved hjælp af en given von Frey filament, som beskrevet i dette papir, eller semikvantitativt ved hjælp af successivt stærkere von Frey filamenter, eller endda kvantitativt ved hjælp af elektroniske anordninger, der anvender stigende tryk, indtil en tilbagetrækning svar er observeret30,54.

Tilsvarende, selv om flere forfattere bruger walking track analyse til at evaluere forelimb nerve reparation i rotten, andre forfattere hævder, at enkelt MN læsioner ofte undlader at producere reproducerbare ændringer i pawprints10,58,59. Desuden har nogle udtalt, at disse ændringer ikke kan være proportional med muskel opsving10,60. Med dette i tankerne, nogle forskere har slået til lyd for brugen af gangspor analyse i forpoten primært ved vurderingen af inddrivelse efter knusning neve læsioner snarere end efter segmentelle nerve rekonstruktion10,50,61.

Gribetesten anvendes i vid udstrækning til at evaluere motoriske genindvindingaf de muskler , der kontrolleres af MN16,27. For at sikre ensartethed og reproducerbarhed af de data, der er opnået ved denne test, anbefales det at anvende grasping-testen ved hjælp af den veletablerede metode, der er foreslået af Bertelli et al.16. Men den nuværende protokol adskiller sig ved, at det ikke rutinemæssigt immobilisere den kontralaterale pote for at forhindre unødig stress11,27. Det skal også bemærkes, at andre forfattere, efter at have immobiliseret den uskadte pote, kvantitativt vurdere Gribetest ved hjælp af et dynamometer eller en skala27,56. Denne kvantitative evaluering kan dog blive påvirket af den styrke, som forskeren anvender på rottens hale26. Desuden er det vanskeligt at skelne mellem den styrke, der genereres af de digitale flexor muskler (udelukkende innervated af MN i rotten og formålet med Grasping Test9) fra den styrke, der produceres af håndleddet flexors, som omfatter flexor carpi ulnaris, der modtager sin innervation fra ulnar nerve9,10,27. For at forsøge at omgå disse potentielle bias, denne protokol bruger en ordenstal skala svarende til Medical Research Council Scale almindeligt anvendt til lønklasse muskelstyrke hos mennesker10,11,62. Alternativt har andre forfattere beskrevet en detaljeret vurdering af gribearbejde ved hjælp af videoanalyse og et videobaseret pointsystem11,63.

En potentiel ulempe ved at bruge MN i forhold til iskiasnerven er, at en større mængde information er tilgængelig vedrørende sidstnævnte nerve. Dette kan igen gøre det vanskeligere at sammenligne data , der er indhentet med mn, med data fra tidligereforsøgsarbejder46,48,64. Derudover, den mindre størrelse af MN i forhold til iskiasnerven gør kirurgisk manipulation mere udfordrende8,12,,27,56,65.

I modsætning til den metode, der er beskrevet i dette dokument, kan elektroneuromyografievalueringen udføres ved hjælp af transkutane monopolelektroder placeret i armen og thenarregionerne51. Selv om denne metode er mindre invasiv, indebærer den risiko for potentiel forvirring på grund af muligheden for costimulation af ulnarnerven i armregionen9,51.

De fleste forfattere er enige om, at ikke alle tests, der anvendes i rotten giver konkordans resultater, som perifernerve reparation afhænger af en kompleks vifte af faktorer, der omfatter neuron overlevelse, axonal forlængelse og beskæring, synaptogenese, vellykket generobring af denervated sensoriske organer og motoriske enheder, og hjernen plasticitet7,10,50,66,67.

Endelig skal det bemærkes, at en betydelig advarsel af gnavere modeller er, at rotte perifere nerver er meget tættere på deres ende organer og har meget mindre tværsnitsområder end de homologe menneskelige strukturer. Denne størrelsesforskel garanterer imidlertid hurtigere eksperimentelle data hos gnavere, og der kan forventes bedre samlede resultater hos rotter i forhold til mennesker68. Faktisk, flere forfattere advarer om, at pleje skal anvendes, når de forsøger at ekstrapolere eksperimentelle data opnået i perifernerve reparation ved hjælp af gnavere til mennesker7,69. Primatmodeller betragtes som mere sammenlignelige70. Ikke desto mindre er deres anvendelse forbundet med irriterende etiske, logistiske og budgetmæssige begrænsninger71.

Selvom iskiasnerven er den mest almindeligt anvendte nerve i perifer nerve forskning, rotte MN præsenterer flere fordele. For eksempel er MN læsioner forbundet med en mindre forekomst af fælles kontrakturer og automutilation af den berørte pote11,12,16,56. Betydeligt, autotomi efterfølgende til iskiasnerven transection plager 11-70% af rotter. Dette kan gøre aktuelle evalueringer som iskiasindekset umulige14. Dette gør til gengæld skønnet over antallet af dyr, der kræves for at opnå en given statistisk effekt, besværligt15.

Hertil kommer, da MN er kortere end iskiasnerven, nerve opsving er observeret hurtigere58,72,73,74,75,76. Endvidere, MN er ikke omfattet af muskelmasser, hvilket gør dens dissektion teknisk lettere end iskiasnerven16. Derudover har MN en parallel vej til ulnarnerven i armen. Derfor kan ulnar nerven nemt bruges som nervetransplantat til reparation af MN skader. Endelig, hos mennesker, de fleste perifere nervelæsioner forekommer i overekstremiteterne, hvilket yderligere understøtter brugen af denne nerve i rotte77,78.

Velsagtens, gnavere er de eksperimentelle dyr mest almindeligt anvendt i realm af perifere nerve reparation48,79. Som vist, rotte MN er en bekvem model af perifernervelæsion og reparation. Faktisk er der flere standardiserede strategier til rådighed til at vurdere motoriske og sensoriske opsving, der giver en lettere sammenligning af resultaterne36,46,60,80,81,82. Mange af disse metoder er noninvasive, giver mulighed for daglig vurdering.

Desuden er fysioterapi en del af standarden for pleje af patienter, der kommer sig efter perifere nerveskader. Som det fremgår af dette papir, der er flere strategier til at give en postoperativ fysioterapi-lignende miljø til rotter indsendt til MN skader4,5. Denne model er derfor særlig velegnet til at gentage det kliniske scenario og dermed lette ekstrapolering af resultaterne for den menneskelige art12,27,48,56,58,83.

Som det fremgår af dette papir, flere standardiserede strategier er tilgængelige for at vurdere motoriske og sensoriske opsving i MN model af rotten. De fleste af disse er ikke-invasive procedurer, der giver mulighed for hyppig vurdering. Desuden, som de fleste perifere nervelæsioner i den menneskelige art forekommer i den øvre del af eument, de nævnte eksperimentelle fysioterapi indstillinger kan mere rammende efterligne opsving i den kliniske sammenhæng. Velsagtens, dette kan lette ekstrapolering af resultater til den menneskelige art, yderligere validering af brugen af denne nerve i rotten.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Diogo Casal modtog et tilskud fra The Program for Advanced Medical Education, som er sponsoreret af Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Forfatterne er meget taknemmelige for Mr. Filipe Franco for den illustrative tegning i figur 1. Forfatterne vil gerne takke den tekniske hjælp fra Mr. Alberto Severino i at filme og redigere videoen. Endelig vil forfatterne gerne takke Ms Sara Marques for hendes hjælp i alle de logistiske aspekter vedrørende erhvervelse af dyr og vedligeholdelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetaminophen Amazon https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG
Acland clamps Fine Science Tools 00398 V http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf
Acland Single Clamps B-1V (Pair) Fine Science Tools 396 http://www.merciansurgical.com
Biogel Surgical Gloves Medex Supply 30465 https://www.medexsupply.com
BSL Analysis BIOPAC Systems https://www.biopac.com/
Castroviejo needle holders Fine Science Tools 12565-14 http://s-and-t.ne
Clamp applicator Fine Science Tools CAF-4 http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Constante voltage stimulator BIOPAC Systems STM200 https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/
Cutasept skin disinfectant Bode Chemie http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php
Dafilon 10-0 G1118099 http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816
Derf Needle Holders 12 cm TC Fine Science Tools 703DE12 http://www.merciansurgical.com
Dry heat sterilizer Quirumed 2432 http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores
Dynamometer SAUTER FH5 https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/
Electroneuromiography setup BIOPAC Systems MP36 https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/
Ethilon 5-0 W1618 http://www.farlamedical.co.uk/
FLIR Software FLIR
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved Fine Science Tools 11052-10 http://www.finescience.de
Graph paper Ambar
Heat Lamp HL-1 Harvard Apparatus 727562 https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) Universal Drugstore http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml
High-Temperature Cautery Fine Science Tools AA03 http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe Harvard Apparatus 507220F https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Infrared camera FLIR E6 http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/
Instrapac - Adson Toothed Forceps (Extra Fine) Fine Science Tools 7973 http://www.millermedicalsupplies.com
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT Fine Science Tools EA7613-11 http://www.merciansurgical.com
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution Sigma- Aldrich K113 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt&region=PT
Lacri-lube Eye Ointment 5g Express Chemist LAC101F http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT Fine Science Tools EA7652-14 http://www.merciansurgical.com
Meloxicam Recropharma Mobic https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam
Methylene Blue solution Sigma- Aldrich https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 Fine Science Tools JF-5 http://www.merciansurgical.com
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 Fine Science Tools JFA-5b http://www.merciansurgical.com
Micro retractor Fine Science Tools RS-6540 http://www.finescience.de
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight Fine Science Tools 67 http://www.merciansurgical.com
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 Fine Science Tools D-5a.2 http://www.merciansurgical.com
Monosyn 5-0 15423BR http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php
Normal saline for irrigation Hospira, Inc. 0409-6138-22 http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts
Operating microscope Leica Surgical Microsystems http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/
Skin Skribe Surgical Skin Marker Moore Medical 31456 https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1
Snacks Versele-Laga Complete Crock-Berry http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry
Straight mosquito forcep Fine Science Tools 91308-12 http://www.finescience.de
Surgical drapes Barrier 800430 http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml Veet http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lad, S. P., Nathan, J. K., Schubert, R. D., Boakye, M. Trends in median, ulnar, radial, and brachioplexus nerve injuries in the United States. Neurosurgery. 66 (5), 953-960 (2010).
  2. Murovic, J. A. Upper-extremity peripheral nerve injuries: a Louisiana State University Health Sciences Center literature review with comparison of the operative outcomes of 1837 Louisiana State University Health Sciences Center median, radial, and ulnar nerve lesions. Neurosurgery. 65 (4), Suppl 11-17 (2009).
  3. Dy, C. J., Isaacs, J. American Society for Surgery of the Hand surgical anatomy: nerve reconstruction Vol. 1. Dy, C. J., Isaacs, J. , American Society for Surgery of the Hand. (2017).
  4. Trehan, S. K., Model, Z., Lee, S. K. Nerve Repair and Nerve Grafting. Hand Clinics. 32 (2), 119-125 (2016).
  5. Boyd, K. U., Fox, I. K. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. Ch. 4 75-100 (2015).
  6. Geuna, S., et al. Update on nerve repair by biological tubulization. Journal of Brachial Plexius Peripheral Nerve Injury. 9 (1), 3 (2014).
  7. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner Journal. 13 (1), 100-108 (2013).
  8. Angelica-Almeida, M., et al. Brachial plexus morphology and vascular supply in the wistar rat. Acta Medica Portuguesa. 26 (3), 243-250 (2013).
  9. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16 (2), 77-85 (1995).
  10. Casal, D., et al. Reconstruction of a 10-mm-long median nerve gap in an ischemic environment using autologous conduits with different patterns of blood supply: A comparative study in the rat. PLoS One. 13 (4), 0195692 (2018).
  11. Stößel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  12. Manoli, T., et al. Correlation analysis of histomorphometry and motor neurography in the median nerve rat model. Eplasty. 14, 17 (2014).
  13. Ronchi, G., et al. The Median Nerve Injury Model in Pre-clinical Research - A Critical Review on Benefits and Limitations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 288 (2019).
  14. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripheral nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  17. Casal, D., et al. A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
  18. Bertens, A. P. M. G., et al. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zuthphen, L. F., Baumas, V., Beymen, A. C., et al. , Elsevier. 277-311 (2001).
  19. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
  20. Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Israel Journal of Veterinary Medicine. 62 (3), 74 (2007).
  21. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. European Journal of Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  22. Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
  23. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  24. Matsumine, H., et al. Vascularized versus nonvascularized island median nerve grafts in the facial nerve regeneration and functional recovery of rats for facial nerve reconstruction study. Journal of Reconstructive Microsurgery. 30 (2), 127-136 (2014).
  25. Mickley, A. G., Hoxha, Z., Biada, J. M., Kenmuir, C. L., Bacik, S. E. Acetaminophen Self-administered in the Drinking Water Increases the Pain Threshold of Rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 45 (5), 48-54 (2006).
  26. Mandillo, S., et al. Reliability, robustness, and reproducibility in mouse behavioral phenotyping: a cross-laboratory study. Physiological Genomics. 34 (3), 243-255 (2008).
  27. Papalia, I., Tos, P., Stagno d'Alcontres, F., Battiston, B., Geuna, S. On the use of the grasping test in the rat median nerve model: a re-appraisal of its efficacy for quantitative assessment of motor function recovery. Journal of Neuroscience Methods. 127 (1), 43-47 (2003).
  28. Costa, L. M., Simoes, M. J., Mauricio, A. C., Varejao, A. S. Chapter 7: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-kinematic gait analysis to quantify peripheral nerve regeneration in the rat. International Reviews in Neurobiology. 87, 127-139 (2009).
  29. Geuna, S., Varejao, A. S. Evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration. Journal of Neurosurgery. 109 (2), author reply 362 360-362 (2008).
  30. Howard, R. F., Hatch, D. J., Cole, T. J., Fitzgerald, M. Inflammatory pain and hypersensitivity are selectively reversed by epidural bupivacaine and are developmentally regulated. Anesthesiology. 95 (2), 421-427 (2001).
  31. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  32. Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1 (2), 124-131 (1998).
  33. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a Sciatic Function Index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  34. Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Science. 25 (2), 171-179 (1979).
  35. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 155-161 (2012).
  36. Dijkstra, J. R., Meek, M. F., Robinson, P. H., Gramsbergen, A. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods. 96 (2), 89-96 (2000).
  37. Ludwig, N., Formenti, D., Gargano, M., Alberti, G. Skin temperature evaluation by infrared thermography: Comparison of image analysis methods. Infrared Physics & Technology. 62, 1-6 (2014).
  38. Bennett, G. J., Ochoa, J. L. Thermographic observations on rats with experimental neuropathic pain. Pain. 45 (1), 61-67 (1991).
  39. Wakisaka, S., Kajander, K. C., Bennett, G. J. Abnormal skin temperature and abnormal sympathetic vasomotor innervation in an experimental painful peripheral neuropathy. Pain. 46 (3), 299-313 (1991).
  40. Muntean, M. V., et al. Using dynamic infrared thermography to optimize color Doppler ultrasound mapping of cutaneous perforators. Medical Ultrasonography. 17 (4), 503-508 (2015).
  41. Shterenshis, M. Challenges to Global Implementation of Infrared Thermography Technology: Current Perspective. Central Asian Journal of Global Health. 6 (1), 289 (2017).
  42. Wilbourn, A. J. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. 59-74 (2015).
  43. Wu, Y., Martínez, M. ÁM., Balaguer, P. O. Electrodiagnosis in New Frontiers of Clinical Research. Turker, H. , InTech. Ch. 01 (2013).
  44. Werdin, F., et al. An improved electrophysiological method to study peripheral nerve regeneration in rats. Journal of Neuroscience Methods. 182 (1), 71-77 (2009).
  45. Sedghamiz, H., Santonocito, D. Unsupervised Detection and Classification of Motor Unit Action Potentials in Intramuscular Electromyography Signals. 2015 E-health and Bioengineering Conference IEEE. , 1-6 (2015).
  46. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  47. Carstens, E., Moberg, G. P. Recognizing pain and distress in laboratory animals. Ilar Journal. 41 (2), 62-71 (2000).
  48. Tos, P., et al. Chapter 4: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part I-experimental models. International Reviews in Neurobiology. 87, 47-79 (2009).
  49. Galtrey, C. M., Fawcett, J. W. Characterization of tests of functional recovery after median and ulnar nerve injury and repair in the rat forelimb. Journal of the Peripheral Nervous System. 12 (1), 11-27 (2007).
  50. Giusti, G., et al. Return of motor function after segmental nerve loss in a rat model: comparison of autogenous nerve graft, collagen conduit, and processed allograft (AxoGen). Journal of Bone and Joint Surgery American. 94 (5), 410-417 (2012).
  51. Stossel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  52. Nikkhah, G., Rosenthal, C., Hedrich, H. J., Samii, M. Differences in acquisition and full performance in skilled forelimb use as measured by the 'staircase test' in five rat strains. Behavioral Brain Research. 92 (1), 85-95 (1998).
  53. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behavioral Brain Research. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  54. Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
  55. Costa, L. M., Simões, M. J., Maurício, A. C., Varejão, A. S. P. International Review of Neurobiology. 87, Academic Press. 127-139 (2009).
  56. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  57. Raimondo, S., et al. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Reviews in Neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  58. Bontioti, E. K. M., Dahlin, L. B. Regeneration and functional recovery in the upper extermity of rats after various types of nerve injuries. Journal of the Peripheral Nervous System. 8, 159-168 (2003).
  59. Schönfeld, L. M., Dooley, D., Jahanshahi, A., Temel, Y., Hendrix, S. Evaluating rodent motor functions: Which tests to choose. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 83, 298-312 (2017).
  60. Urbancheck, M. S. Rat walking tracks do not reflect maximal muscle force capacity. Journal of Reconstructive Microsurgery. 15 (2), 143-149 (1999).
  61. Cudlip, S. A., Howe, F. A., Griffiths, J. R., Bell, B. A. Magnetic resonance neurography of peripheral nerve following experimental crush injury, and correlation with functional deficit. Journal of Neurosurgery. 96 (4), 755-759 (2002).
  62. Wang, Y., Sunitha, M., Chung, K. C. How to measure outcomes of peripheral nerve surgery. Hand Clinics. 29 (3), 349-361 (2013).
  63. Wang, H., Spinner, R. J., Sorenson, E. J., Windebank, A. J. Measurement of forelimb function by digital video motion analysis in rat nerve transection models. Journal of the Peripheral Nervous System. 13 (1), 92-102 (2008).
  64. Yanase, Y. Experimental and Clinical Reconstructive Microsurgery. Tamai, S., Usui, M., Yoshizu, T. , Springer-Verlag. Ch. 2 44-51 (2004).
  65. Barton, M. J., et al. Morphological and morphometric analysis of the distal branches of the rat brachial plexus. Italian Journal of Anatomy and Embryology. 121 (3), 240-252 (2016).
  66. Vincent, R. Adult and obstetrical brachial plexus injuries. Peripheral Nerve Surgery: Practical applications in the upper extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Churchill Livingstone. 299-317 (2006).
  67. Dahlin, L. B. Peripheral Nerve Surgery: Practical Applications in the Upper Extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Elsevier. Ch. 1 1-22 (2006).
  68. Vargel, I., et al. A comparison of various vascularization-perfusion venous nerve grafts with conventional nerve grafts in rats. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (7), 425-437 (2009).
  69. Grinsell, D., Keating, C. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  70. Wang, D., et al. A simple model of radial nerve injury in the rhesus monkey to evaluate peripheral nerve repair. Neural Regeneration Research. 9 (10), 1041-1046 (2014).
  71. Casal, D., et al. Unconventional Perfusion Flaps in the Experimental Setting: A Systematic Review and Meta-Analysis. Plastic Reconstructive Surgery. 143 (5), 1003-1016 (2019).
  72. Bontioti, E. End-to-side nerve repair. A study in the forelimb of the rat. , PhD thesis, Lund (2005).
  73. Bodine-Fowler, S. C., Meyer, R. S., Moskovitz, A., Abrams, R., Botte, M. J. Inaccurate projection of rat soleus motoneurons: a comparison of nerve repair techniques. Muscle Nerve. 20 (1), 29-37 (1997).
  74. Valero-Cabre, A., Navarro, X. H reflex restitution and facilitation after different types of peripheral nerve injury and repair. Brain Research. 919 (2), 302-312 (2001).
  75. Wall, P. D., et al. Autotomy following peripheral nerve lesions: experimental anaesthesia dolorosa. Pain. 7 (2), 103-111 (1979).
  76. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16, 77-85 (1995).
  77. Wood, M. J., Johnson, P. J., Myckatyn, T. M. Nerve Surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E., Yee, A. , Thieme. Ch. 1 1-40 (2015).
  78. Rosberg, H. E. Epidemiology of hand injuries in a middle-sized city in southern Sweden - a retrospective study with an 8-year interval. Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery and Hand Surgery. 38, 347-355 (2004).
  79. Gordon, T., Borschel, G. H. The use of the rat as a model for studying peripheral nerve regeneration and sprouting after complete and partial nerve injuries. Experimental Neurology. 287, Pt 3 331-347 (2017).
  80. Bertelli, J. A., Ghizoni, M. F. Concepts of nerve regeneration and repair applied to brachial plexus reconstruction. Microsurgery. 26 (4), 230-244 (2006).
  81. Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioural evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 46, 203-208 (1993).
  82. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripherla nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  83. Ronchi, G., et al. Standardized crush injury of the mouse median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 188 (1), 71-75 (2010).

Tags

Medicin median nerve nerve regenerering perifert nervesystem reparation rotte eksperimentel model kirurgi funktionelle tests
Funktionelle og fysiologiske metoder til evaluering af median nerveregenerering i rotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., … More

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., Pais, D., Farinho, A., Alves, S., Pen, C., Mascarenhas-Lemos, L., Ferreira-Silva, J., Ferraz-Oliveira, M., Vassilenko, V., Videira, P. A., Goyri-O'Neill, J. Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat. J. Vis. Exp. (158), e59767, doi:10.3791/59767 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter