Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Funktionella och fysiologiska metoder för att utvärdera mediannervregenerering hos råtta

Published: April 18, 2020 doi: 10.3791/59767
Automatic Translation
*1,2, *3, 4,5, 1, 6, 7, 7, 7, 7, 7, 3, 4,5, 1
1Anatomy Department, NOVA Medical School, 2Plastic and Reconstructive Surgery Department and Burn Unit, Centro Hospitalar de Lisboa Central, 3Physics Department, Faculty of Sciences and Technology, LIBPhys, 4Glycoimmunology, CEDOC, NOVA Medical School, 5UCIBIO, Life Sciences Department, Faculty of Sciences and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 6Tissue Repair Unit, CEDOC, NOVA Medical School, 7Pathology Department, Centro Hospitalar de Lisboa Central
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras är ett protokoll för att producera olika typer av median nerv (MN) skador och reparation i råtta. Dessutom visar protokollet hur man utvärderar den funktionella återhämtningen av nerven med hjälp av flera noninvasive beteendetester och fysiologiska mätningar.

Abstract

Huvudsyftet med denna undersökning är att visa hur man skapar och reparerar olika typer av mediannervskador (MN) hos råttan. Dessutom presenteras olika metoder för att simulera postoperativ fysioterapi. Flera standardiserade strategier används för att bedöma motor och sensorisk återhämtning med hjälp av en MN-modell av perifera nerv lesion och reparation, vilket möjliggör enkel jämförelse av resultaten. Flera alternativ ingår för att ge en postoperativ sjukgymnastik-liknande miljö till råttor som har genomgått MN skador. Slutligen ger papperet en metod för att utvärdera återhämtningen av MN med hjälp av flera noninvasive tester (dvs. gripa test, pin prick test, stege rung gångtest, rep klättring test, och gångspår analys), och fysiologiska mätningar (infraröd termografi, elektroneuromyography, flexion styrka utvärdering, och flexor carpi radialis muskelvikt bestämning). Därför verkar denna modell särskilt lämpligt att replikera ett kliniskt scenario, underlätta extrapolering av resultaten till den mänskliga arten.

Även om ischiasnerven är den mest studerade nerven i perifer nerv forskning, analys av råtta MN presenterar olika fördelar. Till exempel finns det en minskad incidens av gemensamma kontrakturer och automutilation av den drabbade extremiteten i MN lesion studier. Dessutom är MN inte omfattas av muskelmassor, vilket gör dess dissekering lättare än ischiasnerven. Dessutom observeras MN återhämtning tidigare, eftersom MN är kortare än ischiasnerven. Dessutom har MN en parallell väg till ulnanerven i armen. Därför kan ulna nerv lätt användas som nervtransplantat för att reparera MN skador. Slutligen är MN hos råttor ligger i frambenet, besläktad med den mänskliga övre delen; hos människor är den övre delen platsen för de flesta perifera nervskador.

Introduction

Perifera nervskador uppträder regelbundet som ett resultat av trauma, infektion, vaskulit, autoimmunitet, malignitet och/eller strålbehandling1,2. Tyvärr fortsätter perifer nerv reparation att presentera kliniskt oförutsägbara och ofta nedslående resultat3,4. Det råder bred enighet om att det fortfarande behövs betydande grundforskning och translationell forskning för att förbättra utsikterna för de drabbade4,,5,,6,,7.

Råttan MN visar stora likheter medmänniskors 8,,9 (figur 1). Med ursprung från brachiala plexus i axillary regionen, denna nerv sjunker ner i den mediala aspekten av armen, når armbågen, och förgrening av till majoriteten av musklerna i ventrala facket i underarmen. MN når handen, där den innerverar thenarmusklerna och de två första lumbriska musklerna samt till en del av råttanshandhud 9 (figur 1).

Med hjälp av råtta MN är det möjligt att på ett tillfredsställande sätt replikera perifera nervskador hos människa10,,11,12. Denna nerv har flera potentiella forskningsfördelar i förhållande till den vanligtvis använda ischiasnerven. Eftersom MN ligger i frambenet av råttor (besläktad med de mänskliga övre extremiteterna), kan det skadas experimentellt med en mycket mindre inverkan på råttans välbefinnande, jämfört med ischiasnerven, som innerverar en betydande del av bäckenbenet13. Dessutom förekommer de flesta kliniska lesioner hos människor i övre extremiteten, vilket motsvarar råttans framben10,11,12,14,15,16.

Detta dokument visar hur man producerar olika typer av MN organskador i råtta. Dessutom presenteras olika sätt att simulera postoperativ sjukgymnastik. Slutligen beskrivs tester för att utvärdera funktionell återställning av MN. Det finns flera standardiserade strategier tillgängliga för att bedöma motor och sensorisk återhämtning med hjälp av en MN-modell av perifera nerv lesion och reparation, vilket möjliggör en enkel jämförelse av resultat. MN-modellen är särskilt lämplig för att replikera det kliniska scenariot, vilket underlättar extrapolering av resultaten till den mänskliga arten.

Protocol

Alla försök som rör djurförsök godkändes av kommittén för institutionsvård och användning och etiska kommittén vid Nova University Medical School, Lissabon, Portugal (08/2012/CEFCM).

1. Median nervkirurgi

OBS: Följ aseptisk teknik under operationen. Använd personliga skyddsinstrument (PPE) och använd en steril kirurgisk klänning17. Autoklav alla nödvändiga kirurgiska instrument före operationen (se tabell över material).

  1. Använd 12 veckor gamla Wistar råttor. Förse dem med ad libitum mat och vatten med 12 h ljus-mörka cykler 7 dagar före operationen. Före anestesi, väg råttan för att bestämma mängden bedövningsmedel som krävs.
  2. Bedöva råttan med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin (40–80 mg/kg kroppsvikt) och xyazin (5–10 mg/kg kroppsvikt). Kontrollera om anestesidjupet är på grund av bristen på svar på en tå nypa och genom att observera andningshastigheten under hela förfarandet18,19. Ge ytterligare analgesi om en andningsfrekvens över 110 cykler/min eller motoriskt svar på tå nypa observeras18,,20.
  3. Injicera 1 mg/kg meloxikam subkutant för att ge förebyggande analgesi20,,21.
  4. För att undvika hornhinnans nötning under operationen, applicera oftalmisk gel på båda ögonen.
  5. Använd en hårborttagningskräm för att ta bort håret över den mediala aspekten till höger. När du är klar, tvätta med varm koksaltlösning för att ta bort krämen17.
  6. Lägg råttan i ryggläge på en värmedyna. Applicera en jod eller klorhexidin-baserade kirurgiska scrub över operativa platsen. Låt den vara i minst 15 s och torka sedan med etanol. Upprepa ansökan 3x. Se till att skrubben kommer i kontakt med huden i minst 2 minuter innan du fortsätter med operationen.
    OBS: Kontakta infektionskontrollmyndigheten på din forskningsenhet för alternativa protokoll för att förhindra infektion på operationsområdet19.
  7. Drapera det kirurgiska området17.
    OBS: Utför alla procedurer under strikta aseptiska villkor19.
  8. Incise huden i den mediala aspekten av höger arm och bröst regionen till den djupa fascial planet, med hjälp av ett nummer 15 skalpell blad. Försiktigt cauterize någon blödningskärl med hjälp av en elektrisk cautery.
  9. Dela försiktigt brachialin fascia, som presenterar som en vitaktig slida som täcker musklerna, med hjälp av en thermocautery eller ett par trubbiga saxar, var noga med att inte skada kärl- och nervstrukturer i den mediala aspekten av armen.
  10. Öppna en sax rakt på sak under terminalen införandet av pectoralis stora muskeln, för att retas denna muskel bort från den underliggande axillary artär och ven, liksom från terminal grenar av brachialen plexus.
  11. Dela införandet av pectoralis stora muskeln med en elektrisk cautery. Exponera och avsnitt pectoralis mindre muskel.
  12. Dissekera rakt på sak MN från brachialen och från ulnarnerven från axillaryregionen upp till armbågen. Detta möjliggör exponering av de olika terminalgrenarna i brachiakalplexus, nämligen medianen, ulna, radiella, axillary och muskulogena nerver (figur 2).
  13. Separera olika experimentella grupper enligt beskrivningen nedan.
    1. Skapa gruppen Sham genom att bara dissekera MN.Create the Sham group by only disseking the MN.
    2. Skapa crush-gruppen genom att komprimera MN i mitten delen av armen i 15 s med hjälp av ett nummer 5 microsurgery pincett, eller ett liknande instrument22,23.
    3. Skapa Excision-gruppen med hjälp av ett par mikrokirurgisaxar för att punktlägga ett 10 mm långt segment från den centrala delen av MN i armen. Ligate den proximala stubben av nerven med en 8/0 Nylon sutur för att förhindra axonal tillväxt.
    4. Skapa graftgruppen med hjälp av det 10 mm långa segmentet av MN som beskrivs i det senare steget och rotera den 180°. Sutur proximala och distala stubbar av den sektionerade MN till nervtransplantatet med avbrutna 10/0 Nylon stygn.
  14. Stäng hudsåret med avbrutna 5/0 Nylonstyror10,24.
  15. Förse postoperativ analgesi med 7 ml körsbärssmaksmakade paracetamol blandat med 43 ml kranvatten25 för att få en koncentration på 4,48 mg/ml i 50 ml plastvattenflaskor som gjorts tillgängliga för råttorna ad libitum i 3 dagar25.

2. Bostäder och sjukgymnastik

  1. Låt råttor ha kontakt med fysioterapiapparaterna 2–4 veckor före operationen, för att säkerställa en enklare och snabbare anpassning till träningsinställningarna. Utför övningarna genom att följa de procedurer som beskrivs nedan.
  2. En gång om dagen, placera varje råtta inuti en individuell fysioterapisfär och placera därefter sfären i ett rum med några hinder. Låt råttan ambulate och utforska rummet fritt i en halvtimme.
  3. Hus råttorna individuellt i ensamma burar med inkorporerade löphjul för att hjälpa dem att utöva.
  4. Bilda grupper om 4–5 djur och hus dessa grupper i personliga burar. Anpassa burarna genom att inkludera stegar, rep, löphjul och andra miljöberikande element.
  5. Returnera enskilda råttor till personliga burar dagen efter operationen.
  6. Återuppta fysioterapi övningar 3 dagar efter operationen.

3. Funktionella tester

  1. En vecka innan du börjar utföra funktionella tester, bekanta råttorna med maten behandlar att användas som positiv förstärkning. Ge denna förstärkning efter det framgångsrika slutförandet av varje test, före och efter operationen. Efter den inledande träningsperioden på 3 veckor, återuppta alla tester 1 vecka efter operationen.
  2. Utför testerna på kvällen, när råttorna är naturligt mer aktiva. Återuppta tester 1 vecka efter operationen.
  3. Utför Griptestet genom att placera råttan på ett rutnät och lyft den i svansen, så att den kan ta tag i gallret med sina framträckor11,26. Tilldela en "positiv" poäng om råttan kan ta tag i nätet med båda forepaws. Tilldela en "negativ" poäng om råttan inte kan ta tag i nätet med den skadade tassen.
    OBS: Ett positivt gripprov indikerar att MN:s motorkomponent fungerar16,27.
  4. Utför en Pin Prick Test28,29.
    1. Gör en plastplattform med ett kvadratiskt rutmönster på 4 mm x 4 mm. Ge stöd till detta galler med en 21 cm lång metallram.
    2. Placera råttan på plattformen och täck gallret med en 15,5 cm x 15,5 cm x 11 cm genomskinlig plastlåda. Vänta några minuter tills normala aktiviteter (t.ex. undersökande och större grooming) avtar.
    3. Starta testet när råttan står stilla och står på sina fyra tassar.
    4. Med hjälp av en spegel, sätt in en estesiometer (t.ex. nummer 4 Von Frey hår med en böjkraft på 25 g) genom nätet och peta palmar aspekten av framskådning i huden territorium MN (figur 1). Upprepa bedömningen 5x på varje gnag alternativt, väntar några sekunder efter varje utvärdering.
    5. Kontrollera att von Frey-glödtråden30 är böjd för korrekt utvärdering. Betyg tillbakadragande svaren på följande sätt: "0" för inget tillbakadragande svar, "1" om råttan långsamt tar bort tassen från glödtråden, "2" om råttan snabbt svarar på stimulans och tar bort tassen eller slickar tassen.
      OBS: Om ambulation och bitning av glödtråden observeras upprepa stimulans, eftersom dessa anses tvetydiga svar.
  5. Utbildningstillfällen
    OBS: Träna råttorna dagligen i 3 veckor innan du utför operationen på kvällen i en svagt ljus. Träningspassen rekommenderas speciellt för repklättring, stege stege och vandringsleder tester. Dessa kan göras i den ordning som presenteras innan, börjar med repklättringstestet, stege stege stege, och slutligen vandringsleder test. Låt samma djur vila några minuter före ett nytt test.
    1. Under den första veckan placerar du råttan på den sista tredjedelen av stegen/repet/korridoren, nära lådans ingång. Villkora djuret att röra sig mot lådan öppningen genom att försiktigt röra och / eller dra spetsen på svansen. Ge råtta en mat behandla när den kommer in i rutan, så att det några sekunder av vila innan du upprepar testet. Upprepa det 5x varje dag i 5 dagar.
    2. Under den andra veckan placerar du djuret på den andra tredjedelen av stegen/repet/korridoren Upprepa stegen i 3.5.1.
    3. Under den tredje veckan placerar du råttan på botten av stegen/repet/korridoren, på motsatt sida av lådans entré. Upprepa stegen i 3.5.1, men belöna endast djuret när det är klart testet korrekt.
  6. Utför stegstegskörningstestet.
    OBS: Detta test används för att bedöma frambenets styrka, stegning, placering och samordning31.
    1. Placera råttan längst ner på stegen (120 cm x 9 cm x 2 cm med 18 steg 1,5 cm tjock, fördelade 4 cm från varandra) och försiktigt röra vid råttans svans. Se till att stegen är placerad vid en lutning på 10° och leder till en 13,20 cm x 11 cm öppning på en mörk trä 31,5 cm x 35 cm x 35 cm låda.
    2. Starta timern när råttan börjar klättra på stegen och stoppa timern när råttans tryne korsar lådans ingång.
    3. Registrera tiden och upprepa testet 3x, var och en separerad minst med ett 1 minintervall.
  7. Rep Klättring
    OBS: Detta test används för att bedöma greppstyrka, som är beroende av MN återhämtning32.
    1. Sätt råttan längst ner på repet och övertala den att klättra genom att försiktigt röra svansen. Starta timern när djuret börjar klättra och stoppa det så fort råttornas tryne korsar plattformens ingång.
    2. För varje test, registrera den tid det tar att klättra till plattformen och antalet snedsteg av den skadade tassen medan råttan klättrar upp i repet. Tänk på testet giltigt om djuret inte tvekar under uppgiften eller inte slutar klättra. Ge råttan ett mellanmål efter att ha utfört uppgiften på rätt sätt.
    3. Registrera tiden och upprepa testet 3x, var och en separerad minst med 1 minuts intervall.
  8. Vandringsleder
    OBS: Detta test används för utvärdering av framben motoråtervinning33,,34.
    1. Ställ in en apparat som består av en begränsad gångväg som är 16,5 cm hög x 8,7 cm lång. Se till att detta leder till en rektangulär 8,8 cm x 8,2 cm öppning i en av väggarna i en svart trä 23 cm x 36 cm x 28 cm låda. Inkludera en vertikal skjutdörr för att stänga lådans ingång snabbt. Inkludera en flyttbar topp som ska användas för att hämta råttan33,,34.
    2. Placera ett diagrampapper på korridorens golv. Ta tag i råttan i svansen och låt den hålla en målning borste indränkt i metylenblått. Placera råttan vid ingången till korridoren för att få den att gå inuti lådan. Ta bort grafpapperet från korridorens golv och upprepa testet tills ett gott representativt intryck av båda framtjännarna erhålls.
    3. Från de erhållna utskrifterna väljer du en med tydliga på varandra följande forepaw-utskrifter, fotograferar dem i tiff- eller jpeg-format och mäter följande parametrar med hjälp av open access-programvaran FIJI35.
      OBS: Först kalibrera varje bild med hjälp av markeringarna i grafpapperet (Analysera | Ange skala) För det andra konverterar du varje bild till ett 8-bitarsformat (Bild | Typ | 8-bitars). Använd därefter det rektangulära markeringsverktyget för att markera tassutskriften. Beskär den här delen av bilden (Bild | Beskär). Markera tassavtrycken i varje bild och ta bort bakgrunden genom att trösklar bilden (Bild | Justera | Tröskelvärdet).
      1. Mät hållningsfaktorn genom att mäta tassvisningsområdet. Använd det rektangulära markeringsverktyget för att markera tassutskriften och tryck på Kontroll + M.
      2. Mät utskriftslängdsfaktorn genom att mäta den längsta längden på tassavtrycket (för steg 3.8.3.2–3.8.3.6 använder du verktyget för markering av rak linje för att välja de två mest avlägsna punkterna och tryck på Kontroll + M).
      3. Mät fingerspridningsfaktorn genom att mäta den bredaste bredden på tassavtrycket.
      4. Mät mellanfingerspridningsfaktorn genom att mäta den bredaste bredden mellan andra och tredje fingrarna.
      5. Mät steglängden genom att mäta avståndet mellan homologa punkter av på varandra följande tass intryck på en viss sida.
      6. Mät stödets bas genom att mäta det vinkelräta avståndet mellan tassintryckets centrala del och rörelseriktningen29,,33,36.
        OBS: Utför de två sista mätningarna i två par representativa på varandra följande bilaterala tass intryck33.

4. Fysiologiska mätningar

  1. Infraröd termografi (IRT)37,38,39.
    1. Se till att temperaturen i det rum där mätningarna kommer att utföras är mellan 18 °C–25 °C med en normal digital hydrotermerometer med en värmeupplösning på 0,1 °C. Se till att det inte finns några betydande värmekällor (t.ex. datorer eller kylskåp).
    2. Acklimatisera råttorna genom att föra dem till utvärderingsrummet 2 h före utvärderingen. Innan du påbörjar experimentet bedövas råttan enligt beskrivningen ovan (steg 1.3–1.6) eller följer institutionens protokoll. Kontrollera om svaret på en tå nypa innan du startar experimentet.
    3. Slå på den infraröda termografiska kameran 15 min före förvärvet och stäng inte av den under utvärderingarna. Ställ in emissivitetsparametern för kameran så att den matchar råttans hud (ε = 0,98)37,40,41.
    4. Placera råttan på dess rygg på en ren och stabil yta med en polyetensvamp. Se till att det inte finns några reflekterande material och andra möjliga källor till artefakter. Fixa dess fräsar försiktigt i supination med dubbel ansikte lim tejp. Sätt i en digital termometer 2 cm inuti ändtarmen för att övervaka råttans centrala temperatur under alla utvärderingar.
    5. Håll termografiska kameran i 90° vinkel och 30 cm avstånd från råttan. Fokusera kameran på hela djurets kropp. Få tre infraröda termografibilder placerade 30 s från varandra.
    6. Överför de förvärvade termogrammen till en dator och analysera dem med hjälp av analysprogramvara. Definiera temperaturen på den plantar ytan av båda forepaws med hjälp av en fast rektangulär region av intresse (t.ex. 9 x 11 pixlar) i plantar territorium MN, till exempel i mitten av den första metakarpal fot pad (figur 1). Med hjälp av den kostnadsfria FLIR Tools-programvaran väljer du termografin genom att dubbelklicka på den. På den vänstra verktygsraden väljer du knappen"Lägg till lådmätningsverktyg" och rita en rektangel på 9*11 pixlar över plantarområdet för båda framtjuvarna. När du justerar rektangeln kan dess dimension i pixlar bekräftas. Utför det på båda forepaws. På höger sida av bilden hitta den maximala, lägsta och genomsnittliga temperaturer.
    7. Över den tidigare ritade avkastningen högerklickar du och väljer exportera. Medelvärdet, högsta och minimala temperaturer, samt en matris med temperaturer i ROI exporteras sedan till ett CSV-dokument. Dessa data kan senare utforskas med hjälp av dataanalysprogramvara.
  2. Utvärdering av elektroneuromografiska (ENMG)
    1. Sätt upp en elektrisk stimulator. Tejpa fast ett par engångsakupunkturnålar (0,25 mm x 25 mm) med en försumbar impedans [<1 Ω]) och 25 mm mellan dem för att skapa elektroder för stimulering. Nu ansluter stimulatorn och elektroden till en datainsamlingsenhet för att ta de inkommande signalerna och omvandla dem till digitala signaler som kan bearbetas med datorprogramvaran.
    2. Utför utvärderingarna i samma rum, och alltid under samma kontrollerade miljöförhållanden42,,43,44. Nyp på framtjänta för att säkerställa att råttorna är djupt sövda innan datainsamling påbörjas.
      OBS: Djupbedövning är av största vikt för att minimera variationer i samband med spontana frivilliga och/eller ofrivilliga rörelser av råttorna43.
    3. Exponera MN på båda sidor under det kirurgiska mikroskopet enligt beskrivningen i steg 1.8–1.13. Använd ett nummer 15 skalpellblad för att förlänga brachiala snitten i underarmarna med ett ventralt mittlinjesnitt.
    4. Exponera den ytliga aspekten av flexor digitorum sublimis muskler genom att rakt på sak separera överliggande antebrachial fascia med iris sax. Sätt in jordnålen i quadriceps femoris muskeln i vänster bakben för att ansluta signalen jordkontakten.
    5. Börja med rätt framtjäckning och placera inspelningselektroderna i flexor digitorum sublimis muskelmage av frambenad och stimuleringselpoximal till lesionstället i MN. Fukta dessa elektroder med saltlösning.
    6. Se till att programvaran är inställd på följande sätt: kanalingångsport 1 (CH1) – stimulator till 0–10 V; och kanalingångsport 2 (CH2) - EMG till 30–1 000 Hz. Börja med att välja en stimuleringsamplitud på 10 mV och registrera de sammansatta muskelverkningspotentialerna CMAPs-provhastighet på 50 kHz under en varaktighet av 40 000 ms. Öka gradvis stimuleringsamplituden i 10 mV-steg tills den når 2 000 mV. Upprepa samma för den vänstra tassen42,43,44.
      OBS: Signalen förstärks till 1000x och filtreras med ett 30–1 000 Hz-band. Stimuleringsutgången är inställd på en enda puls med en varaktighet på 1 ms42,43,44.
    7. Öppna den inspelade filen i inspelningsutrustningen.
      Som standard visar skärmen släpfönster ovanpå i rött, stimulatorpulserna och under i blått inspelaren ENMGs. Om du skjuter den horisontella rullningslisten under tidsskalan kan visualiseringen av hela posten visualiseras. De två huvudverktygen, zoomverktyget och I-Beam-verktyget, finns längst ned till höger på panelen. Med hjälp av zoomverktyget är det möjligt att optimera visualiseringen av CMAPs och utforska grafiken. För att garantera en bra montering på visualiseringsskärmen kan det vara nödvändigt att justera skärmen efter zoomning. Om du vill göra det väljer du Visa| Vågformer för automatisk skalning. I-balkverktyget gör det möjligt att välja specifika områden i diagrammen och prestanda för de önskade mätningarna. Ovanpå diagrammen finns det tre små fönster där mätningarna visas. P-P visar det genomsnittliga amplitudvärdet för det valda området i volt (både i stimulatorposten och i ENMGs), medan Delta-T visar tidsintervallet för det valet.
    8. Mät parametrarna från den sammansatta muskelverkningspotentialen (CMPA: er, som beskrivs i tabell 1)med hjälp av de homonyma mätverktygen från programvarukontakten "Toolbox for unsupervised classification of MUAPs and action potentials in EMG"45.
    9. För varje råtta, bestämma ett minimalt värde av stimuleringsspänning varefter CMAPs amplituden inte ökar ytterligare. Börja från en 0,05 mV stimulans, och ge successiva ökande stimuli i inkrementella spänningar på 0,05 mV.
    10. Applicera en stimulans 20% över denna spänning för att få en supramaximal stimulering värde.
    11. När det senare värdet har fastställts och motsvarande stimulans tillämpas registrerar du nästa CMAPs-parametrar.
  3. Utvärdering av flexionsstyrka
    1. Använd samma stimulator och stimuleringselektroder för att elektriskt stimulera MN som i steg 4.2. Ställ in ingångskanalen CH1 som stimulator (0–10 V) och utdatainställningarna för stimulivaraktighet på 30 s med pulser på 1 ms varaktighet och 1 Hz frekvens. Länka en dynamometer med upplösningen d = 0,001 N till en dator.
      OBS: Realtidsvisualisering av data kan erhållas genom att bygga en kraftområde per gång (N/s) med hjälp av programvaran som tidigare installerats på datorn och länkad till en dynamometer46.
    2. Placera råttan enligt beskrivningen i steg 4.1.4. Placera en 5/0 siden sutur slinga genom den andra interosseous utrymme av båda forepaws. Fäst suturslingan på dynamometerns krok och framtjan i linje med dynamometern utan att utsätta suturlinjen för hårt.
    3. Fixa kontralateral tass med tejp för att undvika falska rörelsestörningar i dynamometeravläsningarna.
    4. Ställ dynamometern på noll genom att klicka på NOLL-knappen.
    5. Justera stimulatorn till en supramaximal amplitudstimulering på 1,5 V genom att justera spänningshnuten.
    6. Öppna programvaran AFH-01 på datorn. Öppna avgränsaren "Enhet" och välj enheten FH5. Skapa en ny fil ("Mått1" är namnet som anges som standard) och byt namn på filen.
    7. Placera elektroden på den proximala delen av MN, klicka på spela längst ner i programmet, spela in dra på dynamometern för 30 s.
    8. Importera de värden som erhållits till ett dataanalysprogram. Beräkna de maximala och genomsnittliga kraftvärdena och området under kurvan (AUC) för styrkediagrammet x för varje utvärdering.
    9. Upprepa för den vänstra yten.
  4. Muskel vikt
    1. Avliva råttorna under narkos genom exsanguination47,48.
    2. Skörda flexor carpi radialis muskeln från båda underarmarna, dissekera muskeln från dess ursprung tills dess distala sena insättning, med hjälp av ett nummer 15 skalpell blad.
    3. Väg musklerna med en precisionsskala9,49.

Representative Results

Totalt 34 råttor delades slumpmässigt in i följande grupper: Sham (n = 17), Excision (n = 17) och Nerve Graft (n = 10) för operationen. Alla råttor överlevde kirurgi och den postoperativa perioden uneventfully. En vecka efter operationen och under de följande 100 dagarna genomgick alla djur de funktionella tester som beskrivs ovan en gång i veckan. De representativa resultaten av vart och ett av dessa tester beskrivs nedan.

Greppa test

Andelen råttor med ett positivt svar i förståtttestet Sham var högst för Sham-gruppen. Detta värde ökade gradvis med tiden hos råttor från grupperna Crush and Nerve Graft (figur 3).

Pin Prick Test

Råttor från Sham-gruppen hade de bästa poängen i det kumulativa pin prick-testet i förhållande till råttor från Nerve Graft-gruppen. Båda hade bättre poäng än råttorna i Excision-gruppen (figur 4).

Stege kör test

Råttornas hastighet i stege kör testet var högst i Sham gruppen än i råttor fram till MN lesion. Bland de senare tenderade tiden att köra stegen att minska med tiden, vilket parallellerade MN-återhämtningen (figur 5).

Rep Test

Som i stegen kör test, den tid råttorna tog att klättra repet var kortare i Sham gruppen jämfört med de grupper där MN skadades. Råttornas hastighet i detta test ökade när MN tilläts återhämta sig (figur 6).

Analys av gångspår

Analys av vandringsleder tenderade att visa förändringar i morfologi av tass utskrifter (Figur 7). Dessa förändringar var ofta mer uttalad i krossning skador än i segmental nerv organskador50.

Infraröd termografi

Termografi var användbart när man undersöker temperaturskillnader mellan 20:00 under de första 30 dagarna efter operationen. Temperaturskillnaderna var mer märkbara hos råttor med ett allvarligare skadat MN, till exempel hos dem från Excision-gruppen (figur 8 och figur 9).

Elektroneuromyografi

I tabell 1 sammanfattas elektroneuromografimätningarnas biologiska betydelse och de ger representativa resultat för de olika experimentella grupperna. Olika mönster observerades med electroneuromyography. En normal CMAP var typisk för en råtta från Sham gruppen, medan en polyfasisk CMAP var associerad med en varierande grad av lesion av MN, som i Crush och i Nerve Graft grupper (Figur 10). I Excision-gruppen observerades inga CMAPs.

Handleden Flexion Styrka

Med tanke på att handleden flexion är främst beroende av MN, detta test användes för att utvärdera motor återhämtning i denna nerv territorium. Handleden flexion styrka var närmast det normala när återhämtningen var maximal (figur 11).

Muskelvikt och morfologi

Vikten och morfologi flexor carpis radialis muskeln var beroende av MN återhämtning, eftersom denna muskel är innervated uteslutande av MN9,10. Således observerades normal vikt och morfologi i Sham-gruppen. En viktminskning och muskeltrofi observerades i crush, nervtransplantatoch Excision grupper (Figur 12).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av råttans mediannervs anatomi.
(1)Ursprung och upphörande av mediannerven i råtthjärna (grönområde = primärt motorområde; blått område = primärt sensoriskt område). 2.Tvärgående del av ryggmärgen på C7-segmentnivå. (3) Axillary nerv; 4)Muskulocutanous nerv; (5) Radiell nerv; (6) Mediannerven; (7) Ulnar nerv; 8.Medial kutana gren av armen; 9.Medial kutana gren av underarmen; (10) Axillary artär; (11) Brachialens artär; (12)Medianartär; (13) Ytlig radiell artär; (14) Ulnar artär; (15) Motorgren av mediannerven till pronator teres muskeln; (16) Motorgren av mediannerven till flexor carpis radialis muskel; (17) Motor gren av mediannerven till flexor digitorum superficialis muskel; (18) Motor gren av mediannerven till flexor digitorum profundus muskel; (19)Sensorisk gren av mediannerven till thenarregionen; (20) Gemensam palmarartär i det första interosseous utrymmet; (21) Radial palmar digital artär av den första siffran; (22) Motor gren av mediannerven till thenar musklerna; (23) Palmar kranskärl båge; (24) Radial palmar digital nerv av den första siffran; Ulnarpalmar digital nerv av den första siffran; (26) Gemensam palmarartär i det tredje interosseous utrymmet; (27)Motorgrenar av mediannervens terminalavdelningar till de tre första lumbriska musklerna. Ulnarpalmar digitala nerver av andra, tredje och fjärde siffrorna; Ulnarpalmar digitala artärer till den fjärde och femte siffran; (30) Radial palmar digitala nerver av den andra, tredje och fjärde siffror; (31) Radial palmar digital artär av den femte siffran; (32) Hudterritorium för mediannerven i tydningen (blåskuggad region). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Foto av råttans högra framben som visar mediannervens kirurgiska anatomi i arm- och armhåleregionerna.
Cr, hjärnskålen; Jag, mediala Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Procentandel råttor med ett positivt grepptest i den olika experimentella gruppen under en period av 100 dagar efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Bedömning av nociception med kumulativa pin prick-testresultat i den opererade överpåden normaliserad till den kontralaterala tassen i de olika experimentella grupperna.
Vertikala staplar representerar 95 % konfidensintervall. Horisontella linjer i den övre delen av figuren indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan försöksgrupper, ***p<0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Genomsnittlig hastighet i stegelöpprovet i de olika försöksgrupperna.
Vertikala staplar representerar 95 % konfidensintervall. Asterisker i den övre delen av figuren indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna, *p<0.001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Genomsnittlig klätterhastighet i reptestet i grupperna Sham och Excision.
Vertikala staplar representerar 95 % konfidensintervall. Asterisker i den övre delen av figuren visar statistiskt signifikanta skillnader mellan grupper, * p<0,05; ** p<0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Vandringsledsparametrar i de olika experimentella grupperna.
Värden på den opererade extremiteten uttrycks i procent av medel som normaliseras till den kontralaterala extremiteten. AA) Hållningsfaktor. B)Utskriftslängd; CCFingerspridningsfaktor; D)Spridningsfaktor för mellanfinger. E)Steglängd. (F)Bas för stöd. Vertikala staplar representerar 95 % konfidensintervall. Horisontella linjer i den övre delen av figuren indikerar statistiskt signifikanta skillnader mellan försöksgrupper. D30, D60, D90 = 30, 60 och 90 dagar efter operationen, *p<0,05; ** p<0,01; p<0.001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Genomsnittlig temperaturskillnad registrerad av infraröd termografi.
Boxens områden representerar temperaturskillnaden mellan palmarregionen i mediannerven på den opererade sidan (höger sida) och den kontralaterala sidan (vänster) i grupperna Sham (n = 17) och Excision (n = 17), *p<0,05; ** p<0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Typisk infraröd termografi mönster av ett djur från excision gruppen under de första 45 dagarna efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Typiska mönster av Compound Muscle Action Potentials (CMAPs) från ett djur från Sham och Nerv graft grupper 90 dagar efter operationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Utvärdering av handleden flexion styrka på båda forepaws 90 dagar postoperatively i olika experimentella grupper.
Handleden flexion styrka bedömdes med hjälp av området under kurvan (AUC) under en tidsperiod på 30 s och med hjälp av supratetanic stimulering. Vertikala linjer anger 95 % konfidensintervall. Horisontella linjer i den övre delen av figuren belyser statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna, **p<0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: Flexor carpi radialis muskelvikt och makroskopisk utseende 100 dagar efter operationen.
(A)Lådområden som visar den normaliserade flexor carpi radialis muskelvikt i olika experimentella grupper, ** p<0.01; p<0.001. (B)Fotografier av musklerna på höger och vänster sida i Sham och Excision experimentella grupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Parametern Parameter betydelse Sham-gruppen Excision-grupp NG-gruppen
Neurologisk stimuleringströskel (%) Utvärdering av nervregenerering, eftersom det finns ett minimalt antal nervfibrer som krävs för att producera antingen en CMAP eller en synlig muskelkontraktion12 281,63 ± 271,65 5359,98 ± 3466,52 2108,12 ± 2115,13
Tröskelvärde för motorstimulering (%) Utvärdering av nervregenerering, eftersom det finns ett minimalt antal nervfibrer som krävs för att producera antingen en CMAP eller en synlig muskelkontraktion12 462,52 ± 118,91 1694,10 ± 503,24 1249,50 ± 503,24
Svarstid (%) Bedömning av nervledningshastighet i de snabbaste nervfibrerna, det vill säga de största myelineradefibrerna 44 113,55 ± 25,04 Ej mycket 132,80 ± 69,95
Neuromuskulär transduktionshastighet (%) Bedömning av nervledningshastighet i de snabbaste nervfibrerna, det vill säga de största myelineradefibrerna 44 92,01 ± 20,88 Ej mycket 91,30 ± 26,51
CMAPs amplitud (%) Utvärdering av antalet återinvaterade motorenheter34 110,63 ±45,66 Ej mycket 41,60 ± 24,84
CMAPs varaktighet (%) Bedömning av synkron av muskel innervation, som är beroende av graden av muskel reinnervation och myelination av innervating motorfibrer44,45 101,12 ± 23,92 Ej mycket 151,06 ± 54,52
NG, nervtransplantat
CMAPs, sammansatt muskelverkan potential.
Ej tillämpligt, ej tillämpligt
Alla parametrar uttrycks i procent av de genomsnittliga kontralaterala värdena.
Numeriska variabler uttrycks som genomsnittlig ± standardavvikelse.

Tabell 1: Elektroneuromografisk bedömning i slutet av experimentet.

Discussion

Detta dokument presenterar ett protokoll för att skapa olika typer av MN skador och reparation i råtta. Dessutom illustrerar det hur man utvärderar den funktionella återhämtningen av denna nerv med hjälp av flera noninvasive beteendemässiga tester och fysiologiska mätningar.

Noterbart är flera av de funktionella tester som beskrivs i detta dokument, nämligen Ladder Running Test och Rope Test, betydligt beroende av råttans vilja att utföra uppgiften med förväntan att få mat belöning51,52,53. Det bör noteras att vissa råttastammar är mer mottagliga för utbildning och utför reproducerbart i denna typ av tester51,,52,53. Till exempel, Lewis råttor prestera dåligt i dessa tester både i träningsfasen och därefter51,52,53.

Råtta bostäder bör tillåta gott om fri rörlighet i samförstånd med deras naturliga undersökande beteende, förutom att tillåta försöksdjur att bekanta sig med några av de delar som finns i funktionella tester19. Därför visas olika former av bostäder som möjliggör högre rörelsefrihet. De stora burarna är personliga med anrikningselement som senare används i funktionstesterna (t.ex. rep och stegar).

Förmodligen dessa berikande element samt burar med inbyggda löphjul och de enskilda utbildningsfärerna ger en form av postoperativ sjukgymnastik liknande den som erbjuds till mänskliga patienter som drivs på det perifera nervsystemet10.

Betydligt, även om vissa författare förespråkar dissekera subkutan vävnader och muskel fasciae rakt på sak eller genom ren skärning med ett antal 15 skalpell, användning av thermocautery vid dissekering av dessa strukturer rekommenderas för att minimera risken för postoperativa hematom.

Det bör noteras att många tester har utarbetats för att testa olika aspekter av perifer nerv reparation hos råtta, nämligen axonal regenerering, mål reinnervation, och funktionell återhämtning, av vilka några ligger utanför ramen för denna studie29,54,55,56. Till exempel kinematiska analys29,36,55 och histomorphometric bedömning29,36,57 är allmänt anställda av flera författare. Dessutom innebär flera av dessa tester variationer för att maximera effektiviteten och/eller reproducerbarheten54. Till exempel kan mekanisk algisemetri (dvs. utvärdering av svar på mekaniska smärtsamma stimuli) bedömas kvalitativt med hjälp av en viss von Frey-glödtråd, som beskrivs i detta dokument, eller semikvantitativt med hjälp av successivt starkare von Frey-glödtrådar, eller till och med kvantitativt använda elektroniska apparater som använder ökande tryck tills ett tillbakadragande svar observeras30,54.

På samma sätt, även om flera författare använder vandringsled analys för att utvärdera framben nerv reparation i råtta, andra författare hävdar att enda MN organskador ofta misslyckas med att producera reproducerbara förändringar i pawprints10,58,59. Dessutom har vissa uppgett att dessa förändringar kanske inte står i proportion till muskelåterhämtning10,,60. Med detta i åtanke, vissa forskare har förespråkat användning av gångspår analys i förutsåg främst vid bedömning av återhämtning efter krossning neve organskador snarare än efter segmental nerv återuppbyggnad10,50,61.

Griptestet används ofta för att utvärdera motorisk återhämtning av de muskler som kontrolleras av MN16,27. För att garantera enhetlighet och reproducerbarhet av de uppgifter som erhållits med detta test rekommenderas tillämpning av förståtttestet med hjälp av den väletablerade metod som föreslagits av Bertelli et al.16. Det nuvarande protokollet skiljer sig dock genom att det inte rutinmässigt immobiliserar den kontralaterala tassen för att förhindra onödig stress11,27. Det bör också noteras att andra författare, efter immobilisering av den oskadade tassen, kvantitativt bedöma gripa testet med hjälp av en dynamometer eller en skala27,56. Denna kvantitativa utvärdering kan dock påverkas av den styrka som forskaren tillämpar på råttans svans26. Dessutom är det svårt att skilja mellan den styrka som genereras av de digitala flexormusklerna (enbart innerveras av MN i råtten och föremålet för Griptest9) från den styrka som produceras av handleden flexor, som inkluderar flexor carpi ulnaris som får sin innervation från ulnanerven9,10,27. För att försöka kringgå dessa potentiella fördomar, detta protokoll använder en ordningsskala som liknar Medical Research Council Scale vanligen används för att gradera muskelstyrka hos människor10,11,62. Alternativt har andra författare beskrivit detaljerad bedömning av att förstå med hjälp av videoanalys och ett videobaserat poängsystem11,63.

En potentiell nackdel med att använda MN jämfört med ischiasnerven är att en större mängd information finns tillgänglig om den senare nerven. Detta kan i sin tur göra det svårare att jämföra data som erhållits med MN och tidigare experimentella arbeten46,48,64. Dessutom, den mindre storleken på MN jämfört med ischiasnerven gör kirurgisk manipulation mer utmanande8,12,27,56,65.

I motsats till den metod som beskrivs i detta dokument kan elektroneuromografiutvärderingen utföras med transkutan monopolelektroder placerade i armen och thenarregionerna51. Trots att mindre invasiv, denna metod medför risk för potentiell förvirring på grund av risken för costimulation av ulna nerv i armregionen9,51.

De flesta författare instämmer i att inte alla tester som används i råttan ger samstämmiga resultat, som perifera nerv reparation beror på ett komplext utbud av faktorer, bestående av neuron överlevnad, axonal töjning och beskärning, synaptogenesis, framgångsrik återerövring av denervated sinnesorgan och motorenheter, och hjärnan plasticitet7,10,50,66,67.

Slutligen bör det noteras att en betydande varning av gnagare modeller är att råtta perifera nerver är mycket närmare sina slutorgan och har mycket mindre tvärsnittsområden än homologa mänskliga strukturer. Denna storleksskillnad garanterar dock snabbare experimentella data hos gnagare, och bättre övergripande resultat hos råttor i jämförelse med människor är att vänta68. Faktum är att flera författare varnar för att försiktighet måste användas när man försöker extrapolera experimentella data som erhållits i perifer nerv reparation med gnagare till människor7,69. Primatmodeller anses vara mer jämförbara70. Ändå är deras användning förknippas med irriterande etiska, logistiska och budgetbegränsningar71.

Även om ischiasnerven är den vanligaste nerven i perifer nerv forskning, råtta MN presenterar flera fördelar. Till exempel är MN-lesioner associerade med en mindre incidens av ledkontrakturer och automutilation av den drabbade tassen11,12,16,56. Signifikant, autotomy efter ischiasnerven transection drabbar 11-70% av råttor. Detta kan göra nuvarande utvärderingar som ischiasindex omöjligt14. Detta gör i sin tur uppskattningen av antalet djur som krävs för att få en viss statistisk effekt besvärlig15.

Dessutom, eftersom MN är kortare än ischiasnerven, nervåterhämtning observeras tidigare58,72,73,74,75,76. Dessutom är MN inte omfattas av muskelmassor, vilket gör dess dissekering tekniskt lättare än ischiasnerven16. Dessutom har MN en parallell väg till ulnanerven i armen. Därför kan ulna nerv lätt användas som nervtransplantat för att reparera MN skador. Slutligen, hos människor, de flesta perifera nervskador förekommer i den övre delen, som ytterligare stöder användningen av denna nerv i råttan77,78.

Förmodligen är gnagare de försöksdjur som oftast används i sfären av perifer nervreparation48,79. Som visas är råttan MN en bekväm modell av perifer nervskada och reparation. I själva verket finns det flera standardiserade strategier för att bedöma motor och sensorisk återhämtning, vilket möjliggör en enklare jämförelse av resultaten36,46,60,,80,81,82. Många av dessa metoder är noninvasive, vilket möjliggör daglig bedömning.

Dessutom är fysioterapi en del av standarden på vården av patienter som återhämtar sig från perifera nervskador. Som framgår av detta dokument, det finns flera strategier för att ge en postoperativ sjukgymnastik-liknande miljö till råttor in till MN skador4,5. Därför är denna modell särskilt lämplig för att replikera det kliniska scenariot, underlätta extrapolering av resultaten till den mänskliga arten12,27,48,56,58,83.

Som visas i detta dokument, flera standardiserade strategier finns tillgängliga för att bedöma motor och sensorisk återhämtning i MN-modellen av råtta. De flesta av dessa är icke-invasiva förfaranden, vilket möjliggör frekvent bedömning. Dessutom, eftersom de flesta perifera nervskador i den mänskliga arten förekommer i den övre delen, kan de nämnda experimentella fysioterapiinställningarna mer träffande efterlikna återhämtning i det kliniska sammanhanget. Förmodligen kan detta underlätta extrapolering av resultat till den mänskliga arten, vilket ytterligare validerar användningen av denna nerv hos råttan.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Diogo Casal fick ett bidrag från Programmet för avancerad medicinsk utbildning, som sponsras av Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Författarna är mycket tacksamma mot Filipe Franco för den belysande ritningen i figur 1. Författarna vill tacka den tekniska hjälpen av Mr Alberto Severino i filmning och redigering av videon. Slutligen vill författarna tacka Ms Sara Marques för hennes hjälp i alla logistiska aspekter som rör djurförvärv och underhåll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetaminophen Amazon https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG
Acland clamps Fine Science Tools 00398 V http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf
Acland Single Clamps B-1V (Pair) Fine Science Tools 396 http://www.merciansurgical.com
Biogel Surgical Gloves Medex Supply 30465 https://www.medexsupply.com
BSL Analysis BIOPAC Systems https://www.biopac.com/
Castroviejo needle holders Fine Science Tools 12565-14 http://s-and-t.ne
Clamp applicator Fine Science Tools CAF-4 http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf
Constante voltage stimulator BIOPAC Systems STM200 https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/
Cutasept skin disinfectant Bode Chemie http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php
Dafilon 10-0 G1118099 http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816
Derf Needle Holders 12 cm TC Fine Science Tools 703DE12 http://www.merciansurgical.com
Dry heat sterilizer Quirumed 2432 http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores
Dynamometer SAUTER FH5 https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/
Electroneuromiography setup BIOPAC Systems MP36 https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/
Ethilon 5-0 W1618 http://www.farlamedical.co.uk/
FLIR Software FLIR
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved Fine Science Tools 11052-10 http://www.finescience.de
Graph paper Ambar
Heat Lamp HL-1 Harvard Apparatus 727562 https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) Universal Drugstore http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml
High-Temperature Cautery Fine Science Tools AA03 http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe Harvard Apparatus 507220F https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613
Infrared camera FLIR E6 http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/
Instrapac - Adson Toothed Forceps (Extra Fine) Fine Science Tools 7973 http://www.millermedicalsupplies.com
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT Fine Science Tools EA7613-11 http://www.merciansurgical.com
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution Sigma- Aldrich K113 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt&region=PT
Lacri-lube Eye Ointment 5g Express Chemist LAC101F http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT Fine Science Tools EA7652-14 http://www.merciansurgical.com
Meloxicam Recropharma Mobic https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam
Methylene Blue solution Sigma- Aldrich https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 Fine Science Tools JF-5 http://www.merciansurgical.com
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 Fine Science Tools JFA-5b http://www.merciansurgical.com
Micro retractor Fine Science Tools RS-6540 http://www.finescience.de
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight Fine Science Tools 67 http://www.merciansurgical.com
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 Fine Science Tools D-5a.2 http://www.merciansurgical.com
Monosyn 5-0 15423BR http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php
Normal saline for irrigation Hospira, Inc. 0409-6138-22 http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts
Operating microscope Leica Surgical Microsystems http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/
Skin Skribe Surgical Skin Marker Moore Medical 31456 https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1
Snacks Versele-Laga Complete Crock-Berry http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry
Straight mosquito forcep Fine Science Tools 91308-12 http://www.finescience.de
Surgical drapes Barrier 800430 http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml Veet http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lad, S. P., Nathan, J. K., Schubert, R. D., Boakye, M. Trends in median, ulnar, radial, and brachioplexus nerve injuries in the United States. Neurosurgery. 66 (5), 953-960 (2010).
  2. Murovic, J. A. Upper-extremity peripheral nerve injuries: a Louisiana State University Health Sciences Center literature review with comparison of the operative outcomes of 1837 Louisiana State University Health Sciences Center median, radial, and ulnar nerve lesions. Neurosurgery. 65 (4), Suppl 11-17 (2009).
  3. Dy, C. J., Isaacs, J. American Society for Surgery of the Hand surgical anatomy: nerve reconstruction Vol. 1. Dy, C. J., Isaacs, J. , American Society for Surgery of the Hand. (2017).
  4. Trehan, S. K., Model, Z., Lee, S. K. Nerve Repair and Nerve Grafting. Hand Clinics. 32 (2), 119-125 (2016).
  5. Boyd, K. U., Fox, I. K. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. Ch. 4 75-100 (2015).
  6. Geuna, S., et al. Update on nerve repair by biological tubulization. Journal of Brachial Plexius Peripheral Nerve Injury. 9 (1), 3 (2014).
  7. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner Journal. 13 (1), 100-108 (2013).
  8. Angelica-Almeida, M., et al. Brachial plexus morphology and vascular supply in the wistar rat. Acta Medica Portuguesa. 26 (3), 243-250 (2013).
  9. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16 (2), 77-85 (1995).
  10. Casal, D., et al. Reconstruction of a 10-mm-long median nerve gap in an ischemic environment using autologous conduits with different patterns of blood supply: A comparative study in the rat. PLoS One. 13 (4), 0195692 (2018).
  11. Stößel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  12. Manoli, T., et al. Correlation analysis of histomorphometry and motor neurography in the median nerve rat model. Eplasty. 14, 17 (2014).
  13. Ronchi, G., et al. The Median Nerve Injury Model in Pre-clinical Research - A Critical Review on Benefits and Limitations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 288 (2019).
  14. Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripheral nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  17. Casal, D., et al. A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
  18. Bertens, A. P. M. G., et al. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zuthphen, L. F., Baumas, V., Beymen, A. C., et al. , Elsevier. 277-311 (2001).
  19. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. Journal of Visualized Experiments. (47), e2586 (2011).
  20. Lee-Parritz, D. Analgesia for rodent experimental surgery. Israel Journal of Veterinary Medicine. 62 (3), 74 (2007).
  21. Roughan, J. V., Flecknell, P. A. Evaluation of a short duration behaviour-based post-operative pain scoring system in rats. European Journal of Pain. 7 (5), 397-406 (2003).
  22. Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
  23. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  24. Matsumine, H., et al. Vascularized versus nonvascularized island median nerve grafts in the facial nerve regeneration and functional recovery of rats for facial nerve reconstruction study. Journal of Reconstructive Microsurgery. 30 (2), 127-136 (2014).
  25. Mickley, A. G., Hoxha, Z., Biada, J. M., Kenmuir, C. L., Bacik, S. E. Acetaminophen Self-administered in the Drinking Water Increases the Pain Threshold of Rats (Rattus norvegicus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 45 (5), 48-54 (2006).
  26. Mandillo, S., et al. Reliability, robustness, and reproducibility in mouse behavioral phenotyping: a cross-laboratory study. Physiological Genomics. 34 (3), 243-255 (2008).
  27. Papalia, I., Tos, P., Stagno d'Alcontres, F., Battiston, B., Geuna, S. On the use of the grasping test in the rat median nerve model: a re-appraisal of its efficacy for quantitative assessment of motor function recovery. Journal of Neuroscience Methods. 127 (1), 43-47 (2003).
  28. Costa, L. M., Simoes, M. J., Mauricio, A. C., Varejao, A. S. Chapter 7: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part IV-kinematic gait analysis to quantify peripheral nerve regeneration in the rat. International Reviews in Neurobiology. 87, 127-139 (2009).
  29. Geuna, S., Varejao, A. S. Evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration. Journal of Neurosurgery. 109 (2), author reply 362 360-362 (2008).
  30. Howard, R. F., Hatch, D. J., Cole, T. J., Fitzgerald, M. Inflammatory pain and hypersensitivity are selectively reversed by epidural bupivacaine and are developmentally regulated. Anesthesiology. 95 (2), 421-427 (2001).
  31. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  32. Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1 (2), 124-131 (1998).
  33. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a Sciatic Function Index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  34. Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Science. 25 (2), 171-179 (1979).
  35. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 155-161 (2012).
  36. Dijkstra, J. R., Meek, M. F., Robinson, P. H., Gramsbergen, A. Methods to evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods. 96 (2), 89-96 (2000).
  37. Ludwig, N., Formenti, D., Gargano, M., Alberti, G. Skin temperature evaluation by infrared thermography: Comparison of image analysis methods. Infrared Physics & Technology. 62, 1-6 (2014).
  38. Bennett, G. J., Ochoa, J. L. Thermographic observations on rats with experimental neuropathic pain. Pain. 45 (1), 61-67 (1991).
  39. Wakisaka, S., Kajander, K. C., Bennett, G. J. Abnormal skin temperature and abnormal sympathetic vasomotor innervation in an experimental painful peripheral neuropathy. Pain. 46 (3), 299-313 (1991).
  40. Muntean, M. V., et al. Using dynamic infrared thermography to optimize color Doppler ultrasound mapping of cutaneous perforators. Medical Ultrasonography. 17 (4), 503-508 (2015).
  41. Shterenshis, M. Challenges to Global Implementation of Infrared Thermography Technology: Current Perspective. Central Asian Journal of Global Health. 6 (1), 289 (2017).
  42. Wilbourn, A. J. Nerve surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E. , Thieme. 59-74 (2015).
  43. Wu, Y., Martínez, M. ÁM., Balaguer, P. O. Electrodiagnosis in New Frontiers of Clinical Research. Turker, H. , InTech. Ch. 01 (2013).
  44. Werdin, F., et al. An improved electrophysiological method to study peripheral nerve regeneration in rats. Journal of Neuroscience Methods. 182 (1), 71-77 (2009).
  45. Sedghamiz, H., Santonocito, D. Unsupervised Detection and Classification of Motor Unit Action Potentials in Intramuscular Electromyography Signals. 2015 E-health and Bioengineering Conference IEEE. , 1-6 (2015).
  46. Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
  47. Carstens, E., Moberg, G. P. Recognizing pain and distress in laboratory animals. Ilar Journal. 41 (2), 62-71 (2000).
  48. Tos, P., et al. Chapter 4: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part I-experimental models. International Reviews in Neurobiology. 87, 47-79 (2009).
  49. Galtrey, C. M., Fawcett, J. W. Characterization of tests of functional recovery after median and ulnar nerve injury and repair in the rat forelimb. Journal of the Peripheral Nervous System. 12 (1), 11-27 (2007).
  50. Giusti, G., et al. Return of motor function after segmental nerve loss in a rat model: comparison of autogenous nerve graft, collagen conduit, and processed allograft (AxoGen). Journal of Bone and Joint Surgery American. 94 (5), 410-417 (2012).
  51. Stossel, M., Rehra, L., Haastert-Talini, K. Reflex-based grasping, skilled forelimb reaching, and electrodiagnostic evaluation for comprehensive analysis of functional recovery-The 7-mm rat median nerve gap repair model revisited. Brain and Behavior. 7 (10), 00813 (2017).
  52. Nikkhah, G., Rosenthal, C., Hedrich, H. J., Samii, M. Differences in acquisition and full performance in skilled forelimb use as measured by the 'staircase test' in five rat strains. Behavioral Brain Research. 92 (1), 85-95 (1998).
  53. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behavioral Brain Research. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  54. Navarro, X. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview. European Journal of Neuroscience. 43 (3), 271-286 (2016).
  55. Costa, L. M., Simões, M. J., Maurício, A. C., Varejão, A. S. P. International Review of Neurobiology. 87, Academic Press. 127-139 (2009).
  56. Ronchi, G., et al. Functional and morphological assessment of a standardized crush injury of the rat median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 179 (1), 51-57 (2009).
  57. Raimondo, S., et al. Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques. International Reviews in Neurobiology. 87, 81-103 (2009).
  58. Bontioti, E. K. M., Dahlin, L. B. Regeneration and functional recovery in the upper extermity of rats after various types of nerve injuries. Journal of the Peripheral Nervous System. 8, 159-168 (2003).
  59. Schönfeld, L. M., Dooley, D., Jahanshahi, A., Temel, Y., Hendrix, S. Evaluating rodent motor functions: Which tests to choose. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 83, 298-312 (2017).
  60. Urbancheck, M. S. Rat walking tracks do not reflect maximal muscle force capacity. Journal of Reconstructive Microsurgery. 15 (2), 143-149 (1999).
  61. Cudlip, S. A., Howe, F. A., Griffiths, J. R., Bell, B. A. Magnetic resonance neurography of peripheral nerve following experimental crush injury, and correlation with functional deficit. Journal of Neurosurgery. 96 (4), 755-759 (2002).
  62. Wang, Y., Sunitha, M., Chung, K. C. How to measure outcomes of peripheral nerve surgery. Hand Clinics. 29 (3), 349-361 (2013).
  63. Wang, H., Spinner, R. J., Sorenson, E. J., Windebank, A. J. Measurement of forelimb function by digital video motion analysis in rat nerve transection models. Journal of the Peripheral Nervous System. 13 (1), 92-102 (2008).
  64. Yanase, Y. Experimental and Clinical Reconstructive Microsurgery. Tamai, S., Usui, M., Yoshizu, T. , Springer-Verlag. Ch. 2 44-51 (2004).
  65. Barton, M. J., et al. Morphological and morphometric analysis of the distal branches of the rat brachial plexus. Italian Journal of Anatomy and Embryology. 121 (3), 240-252 (2016).
  66. Vincent, R. Adult and obstetrical brachial plexus injuries. Peripheral Nerve Surgery: Practical applications in the upper extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Churchill Livingstone. 299-317 (2006).
  67. Dahlin, L. B. Peripheral Nerve Surgery: Practical Applications in the Upper Extremity. Slutsky, D. J., Hentz, V. R. , Elsevier. Ch. 1 1-22 (2006).
  68. Vargel, I., et al. A comparison of various vascularization-perfusion venous nerve grafts with conventional nerve grafts in rats. Journal of Reconstructive Microsurgery. 25 (7), 425-437 (2009).
  69. Grinsell, D., Keating, C. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
  70. Wang, D., et al. A simple model of radial nerve injury in the rhesus monkey to evaluate peripheral nerve repair. Neural Regeneration Research. 9 (10), 1041-1046 (2014).
  71. Casal, D., et al. Unconventional Perfusion Flaps in the Experimental Setting: A Systematic Review and Meta-Analysis. Plastic Reconstructive Surgery. 143 (5), 1003-1016 (2019).
  72. Bontioti, E. End-to-side nerve repair. A study in the forelimb of the rat. , PhD thesis, Lund (2005).
  73. Bodine-Fowler, S. C., Meyer, R. S., Moskovitz, A., Abrams, R., Botte, M. J. Inaccurate projection of rat soleus motoneurons: a comparison of nerve repair techniques. Muscle Nerve. 20 (1), 29-37 (1997).
  74. Valero-Cabre, A., Navarro, X. H reflex restitution and facilitation after different types of peripheral nerve injury and repair. Brain Research. 919 (2), 302-312 (2001).
  75. Wall, P. D., et al. Autotomy following peripheral nerve lesions: experimental anaesthesia dolorosa. Pain. 7 (2), 103-111 (1979).
  76. Bertelli, J. A., Taleb, M., Saadi, A., Mira, J. C., Pecot-Dechavassine, M. The rat brachial plexus and its terminal branches: an experimental model for the study of peripheral nerve regeneration. Microsurgery. 16, 77-85 (1995).
  77. Wood, M. J., Johnson, P. J., Myckatyn, T. M. Nerve Surgery Vol. 1. Mackinnon, S. E., Yee, A. , Thieme. Ch. 1 1-40 (2015).
  78. Rosberg, H. E. Epidemiology of hand injuries in a middle-sized city in southern Sweden - a retrospective study with an 8-year interval. Scandinavian Journal of Plastic and Reconstructive Surgery and Hand Surgery. 38, 347-355 (2004).
  79. Gordon, T., Borschel, G. H. The use of the rat as a model for studying peripheral nerve regeneration and sprouting after complete and partial nerve injuries. Experimental Neurology. 287, Pt 3 331-347 (2017).
  80. Bertelli, J. A., Ghizoni, M. F. Concepts of nerve regeneration and repair applied to brachial plexus reconstruction. Microsurgery. 26 (4), 230-244 (2006).
  81. Bertelli, J. A., Mira, J. C. Behavioural evaluating methods in the objective clinical assessment of motor function after experimental brachial plexus reconstruction in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 46, 203-208 (1993).
  82. Bertelli, J. A., Mira, J. C. The grasping test: a simple behavioral method for objective quantitative assessment of peripherla nerve regeneration in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 58 (1-2), 151-155 (1995).
  83. Ronchi, G., et al. Standardized crush injury of the mouse median nerve. Journal of Neuroscience Methods. 188 (1), 71-75 (2010).

Tags

Medicin mediannerven nervregenerering perifert nervsystem reparation råtta experimentell modell kirurgi funktionella tester
Funktionella och fysiologiska metoder för att utvärdera mediannervregenerering hos råtta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., … More

Casal, D., Mota-Silva, E., Iria, I., Pais, D., Farinho, A., Alves, S., Pen, C., Mascarenhas-Lemos, L., Ferreira-Silva, J., Ferraz-Oliveira, M., Vassilenko, V., Videira, P. A., Goyri-O'Neill, J. Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat. J. Vis. Exp. (158), e59767, doi:10.3791/59767 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter