Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

En dobbelt humaniseret BLT-mus model med en stabil menneskelig-lignende Gut Mikrobiom og humant immun system

doi: 10.3791/59773 Published: August 30, 2019

Summary

Vi beskriver en ny metode til generering af dobbelte humaniserede BLT-mus, der har et funktionelt humant immunsystem og et stabilt menneskelignende tarm mikrobiom. Denne protokol kan følges uden behov for kimfri mus eller gnotobiotiske faciliteter.

Abstract

Humaniserede mus (HU-mus), der har et funktionelt humant immunsystem, har fundamentalt ændret studiet af humane patogener og sygdom. De kan bruges til at modellere sygdomme, der ellers er svære eller umulige at studere i mennesker eller andre dyremodeller. Tarm mikrobiomet kan have en dybtgående indvirkning på menneskers sundhed og sygdom. Men, murine Gut mikrobiome er meget anderledes end den, der findes i mennesker.  Der er behov for forbedrede præ-kliniske Hu-mus modeller, der har en indpodet humant tarm mikrobiom. Derfor har vi skabt dobbelt Hu-mus, der har både et humant immunsystem og stabil menneskelig-lignende Gut mikrobiome. Nikke. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) mus er en af de bedste dyr til menneskeliggørelse på grund af deres høje niveau af immundefekt. Men, kimfri NSG-mus og forskellige andre vigtige bakterie frie mus-modeller er i øjeblikket ikke kommercielt tilgængelige. Yderligere, mange forskning indstillinger ikke har adgang til gnotobiotiske faciliteter, og arbejder under gnotobiotiske betingelser kan ofte være dyrt og tidskrævende. Vigtigere, kimfri mus har flere immundefekter, der eksisterer selv efter engraftment af mikrober. Derfor har vi udviklet en protokol, der ikke kræver kimfri dyr eller gnotobiotiske faciliteter. For at generere dobbelt Hu-mus blev NSG-mus behandlet med stråling før operationen for at skabe knoglemarv, lever, thymus-humaniseret (HU-BLT) mus. Musene blev derefter behandlet med bredspektrede antibiotika for at nedbryder det præ-eksisterende muringut mikrobiom. Efter antibiotisk behandling blev musene givet fækale transplantationer med raske humane donor prøver via oral gavage. Dobbelt Hu-BLT-mus havde unikke 16S rRNA-genprofiler baseret på den enkelte humane donor prøve, der blev transplanteret. Det er vigtigt, at det transplanterede menneskelignende mikrobiom var stabilt i dobbelt Hu-BLT-musene i hele studiets varighed op til 14,5 uger efter transplantationen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Humaniserede mus (HU-mus) har forvandlet studiet af mange aspekter af menneskers sundhed og sygdom, herunder hæmatopoiese, immunitet, kræft, autoimmunsygdom, og smitsomme sygdomme1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Disse Hu-mus har den distinkte fordel i forhold til andre musemodeller i, at de har et funktionelt humant immunsystem og kan være inficeret med menneskelige specifikke patogener. Ikke desto mindre er betydningen af tarm mikrobiomet blevet påvist ved sin rolle i mange menneskelige sygdomme som fedme, metabolisk syndrom, inflammatoriske sygdomme og kræft10,11,12, 13. Slimhinde immunsystemet og tarm mikrobiomet er gensidigt reguleret for at opretholde tarm og systemisk homøostase. Immunsystemet er formet af antigener præsenteret af tarmen mikrobiome og gensidigt immunsystemet spiller en vigtig regulerende rolle i at fremme kommensal tarm bakterier og eliminere patogener14,15, 16. imidlertid har Hu-musens tarm mikrobiom ikke været velkarakteriseret, og murine tarm mikrobiomet adskiller sig væsentligt i sammensætning og funktion fra mennesker17. Dette skyldes evolutionære, fysiologiske, og anatomiske forskelle mellem murine og menneskelige tarm samt andre vigtige faktorer såsom kost, som kan påvirke de eksperimentelle resultater af Hu-mus sygdomsmodeller18. Derfor, ud over klassificeringen af murine Gut mikrobiome af Hu-mus, en dyremodel med både et humant immunsystem og humant tarm mikrobiom er nødvendig for at studere komplekse interaktioner af menneskelig sygdom in vivo.

Studiet af sygdomme hos mennesker direkte i mennesker er ofte upraktisk eller uetisk. Mange dyremodeller kan ikke bruges til at studere humane patogener som humant immundefektvirus type 1 (HIV-1). Ikke-humane primat modeller er genetisk avlede, meget dyre, og er ikke modtagelige for mange humane patogener. Mus, der er afledt som kimfri (GF) og rekonstitueret med human-lignende Gut mikrobiomer har været meget anvendt til at studere menneskers sundhed og sygdom19,20. Men disse dyr har ikke et humant immunsystem og arbejder med GF dyr kræver specialiserede faciliteter, procedurer og ekspertise. Derfor er der behov for forbedrede prækliniske modeller for at studere det komplekse forhold mellem tarm-mikrobiomet og det menneskelige immunsystem. Mange stammer af mus, såsom NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), er ikke kommercielt tilgængelige som GF. GF dyr også kan lide af langvarige immundefekter, der ikke er helt vendt ved engraftment af mikrober21. Derfor har vi skabt en dobbelt Hu-mus med både et funktionelt humant immunsystem og stabil menneskelig-lignende Gut mikrobiom under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser. For at generere dobbelt Hu-mus, kirurgi blev udført på NSG mus til at skabe knoglemarv, leveren, thymus humaniseret mus (HU-BLT). Hu-BLT-musene blev derefter behandlet med bredspektrede antibiotika og fik derefter fækale transplantationer med en sund menneskelig donor prøve. Vi karakteriserede den bakterielle Gut mikrobiome af 173 fækale prøver fra 45 dobbelt Hu-BLT mus og 4 humane fækale donor prøver. Dobbelt Hu-BLT-mus har unikke 16S rRNA-genprofiler baseret på den enkelte humane donor prøve, der er transplanteret. Det er vigtigt, at det transplanterede menneskelignende mikrobiom var stabilt i musene i hele studiets varighed op til 14,5 uger efter transplantationen. Desuden viste de forudsagte metagenomer, at dobbelt Hu-BLT-mus har forskellig forventet funktionel kapacitet end Hu-mus, der ligner de humane donor prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med den institutionelle dyrepleje-og forskningskomité (IACUC)-godkendte protokoller ved University of Nebraska-Lincoln (UNL). IACUC hos UNL har godkendt to protokoller relateret til generering og brug af Hu-BLT-mus, herunder dobbelt Hu-mus. Derudover har Udvalget for videnskabeligt forsknings tilsyn (SROC) på UNL også godkendt brugen af humane embryonale stamceller og føtal væv, som indkøbes fra de avancerede Bioscience-ressourcer til humaniserede mus-studier (SROC # 2016-1-002).

1. mus boliger og vedligeholdelse

  1. Køb 6-8-ugers gamle NSG-mus (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
  2. Hus musene under SPF betingelser med luftudveksling, forfiltre, og HEPA filtre (0,22 μm) i et rum med kontrolleret temperatur, fugtighed, og tryk.
    1. Hus og vedligeholde musene i autoklaveres individuelle mikroisolatorbure i et racksystem, der kan styre luftudveksling med forfiltre og HEPA-filtre (0,22 μm).
  3. Udføre alle procedurer og manipulationer af musene i en klasse II type a2 biologisk sikkerheds røg hætte, der er blevet forbehandlet med 70% ethanol. Før du arbejder i dyre rummet, brusebad og skifte til rene scrubs, Tyvek suit, støvle betræk, hår Cap, ansigtsmaske, og handsker. Bær en operation kjole over Tyvek Suit under kirurgiske indgreb.
    Bemærk: ultraviolet (UV) lys dekontaminering foretrækkes også før procedurer.
    1. Autoklave alle instrumenter og reagenser, hvis det er muligt, og Desinficer derefter før overførsel til røgudemhætten.
    2. Under procedurerne skal du fjerne dyrenes individuelt ventilerede bure fra stativet og desinficere dem, før de overføres til røghætten.
  4. Fodre musene en bestrålet kost og give autoklave vand. Fremstille bestrålede fødevarer AB libitum og supplere med yderligere bestrålede fødevarer efter behov. Skift autoklaveres vand ugentligt eller efter behov.
    Bemærk: Autoclaved syrnet vand kan også anvendes. Den bestrålede diæt havde en holdbarheds levetid på 6 måneder efter fremstillingen.

2. generation af humaniserede BLT-mus

Bemærk: generation af Hu-BLT-mus er blevet beskrevet tidligere22,23,24.

  1. På operationsdagen giver musene hele kroppen bestråling i en dosis på 12 cGy/g legemsvægt.
  2. Forbered musene til kirurgi.
    1. Giv hver bestrålede mus en blanding af ketamin ved arbejds koncentrationen på 100 mg/kg og xylazin i en koncentration på 12 mg/kg, som varierede fra 130-170 μL pr. mus baseret på legemsvægt ved intraperitoneal (IP) injektion til anæstesi. For at forberede 3 ml af ketamin og xylazin blanding tilsættes 0,27 mL ketamin på lager koncentrationen af 100 mg/mL og 0,03 mL xylazin i koncentrationen af 100 mg/mL til 2,7 mL steril saltvand og bland godt. Desinficer huden med 70% isopropanol før injektion.
    2. Giv hver bestrålet mus buprenorphin 1 mg/kg legemsvægt (Half-Live 72 h, SR-LAB) ved subkutan injektion til langtidsholdbar smertebehandling.
    3. Giv hver bestrålet mus 100 μL (858 μg) cefazolin ved IP-injektion til præoperativt antibiotisk profylakse.
    4. Barberer håret af musene ved hjælp af elektriske hårklippere rundt om venstre laterale og mediale side af musen på det senere kirurgiske sted, der anvendes til at udsætte den venstre nyre.
    5. Bekræft korrekt niveau af anæstesi ved pedal refleks (fast tå knivspids).
    6. Giv isofluran gas på 3-5%, hvis yderligere anæstesi er nødvendig på ethvert punkt under operationen.
    7. Påfør øjensalve til begge øjne for at forhindre cornea-udtørring. Anvend øremærke, hvis det er nødvendigt.
  3. Udfør kirurgi for at implantatet leveren og thymus væv i den venstre nyre kapsel.
    1. Desinficer huden på operationsstedet ved at anvende jod scrub begyndende fra midten af operationsstedet og bevæger sig mod ydersiden på en cirkulær måde. Gentag denne proces med 70% isopropanol og en tredje gang med jod.
    2. Ved hjælp af pincet, først indlæse en menneskelig føtal lever væv fragment i en trobil. Derefter ved hjælp af pincet, indlæse en menneskelig føtal thymus væv fragment i trocar. Derefter ved hjælp af pincet, indlæse en anden menneskelig føtal lever væv fragment i trocar. Væv skal skæres til 1-1.6 mm3 for at passe de indvendige dimensioner af trocar.
    3. Brug pincet til at løfte huden og bruge en saks til at lave et lille snit i længderetningen. Forlæng snittet til 1,5-2 cm i venstre side af musen.
    4. Brug pincet til at løfte muskellag og bruge en saks til at lave et lille snit i længderetningen. Forlæng snittet efter behov for at udsætte nyrerne.
    5. Eksponere nyrerne ved forsigtigt at fatte fedtvæv omkring nyrerne. Berør ikke nyre parentchyma direkte.
    6. Lav en 1-2 mm indsnit ved den bageste ende af nyre kapslen ved hjælp af en skalpel.
    7. Langsomt indsætte den forudindlæste trokar gennemsnittet parallelt med den lange akse af nyrerne og frigive væv mellem nyrerne kapsel og nyre.
    8. Returner forsigtigt nyrerne og tarmen til deres normale position. Brug absorberbare 5/0 p-3 (p-13) suturer med 13mm 3/8 Circle Needle for at lukke muskellag og kirurgiske hæfteklammer for at lukke huden.
  4. Efter operationen, sætte musen i en ren autoklaveret microisolator bur til nyttiggørelse.
    1. For at minimere varmetab under post-kirurgisk opsving, sætte buret indeholder musene på en varmepude, der er forbundet til en vandpumpe, der varmer og cirkulerer vandet.
    2. Overvåg musene, indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbency.
  5. Inden for 6 h kirurgi færdiggørelse, via hale-vene, injicere CD34 + hæmatopoietiske stamceller isoleret fra menneskelige føtale lever væv.
    1. Opvarm musene med en varmelampe. Desinficer halen med 70% isopropanol, og Injicer derefter 1,5 til 5 × 105 stamceller/200 μl i hale vene.
    2. Stop enhver blødning fra injektionen og returnere mus til microisolator bur og microisolator bur til buret rack.
      Bemærk: efter operationen er mus typisk anbragt sammen, fem pr. mikroisolatorbur, under og efter helbredelse. Men, mus er kun anbragt sammen, hvis de alle fik kirurgi på samme dag.
  6. Tjek musene dagligt. Overvåg omhyggeligt de kirurgiske hæfteklammer og udskift dem efter behov. Nøje overvåge musene for tegn på infektion eller ubehag. Levering autoklaveret mad på gulvet i microisolator bur for et par dage efter operationen.
  7. Fjern de kirurgiske hæfteklammer 7-10 dage efter operationen. Giv isofluran gas på 3-5% for at bedøve musene. Fjern forsigtigt hæfteklammer og derefter anvende antibiotika og smertelindrende salve på stedet.
  8. Lad 9-12 uger til rekonstitution af humane immunceller, derefter indsamle perifert blod fra den mediale saphena vene fra hver af de humaniserede mus.
    1. Begrænse bevidste mus ved hjælp af en passende størrelse plastik kegle tilbageholdenhed med en åbning nær hovedet af musen til vejrtrækning og en åbning nær bagsiden af musen til at isolere et ben. Sæt musene i fastholdelsesanordningen kegle hoved først og derefter forsigtigt trække et ben gennem benet åbning.
    2. Spray den mediale side af det isolerede ben med 70% isopropanol, derefter sprede antibiotika og smertelindrende salve på samme sted.
      Bemærk: salven hjælper med at afsløre placeringen af venen uden behov for hårfjerning og hjælper også i bloddråbe dannelse.
    3. Ved hjælp af en 25-gauge nål i en 90 ° vinkel, punktere venen og indsamle 50-100 μL blod ved hjælp af en EDTA coated blodindsamlings slange. Stoppe blødningen ved at anvende Tryk på stedet med steril gaze. Når blødningen er stoppet, returnere musene til deres bur.
      Bemærk: det maksimale antal indsamlede blodmængder er typisk 50 μL pr. uge eller 100 μL hvert andet uger.
    4. Brug det indsamlede perifert blod til at teste niveauet af human immuncelle rekonstitution ved hjælp af flow cytometri med antistoffer for hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. behandling af antibiotika

  1. Før behandling med antibiotika, indsamle præ-behandling fækale prøver. Flyt musene til et nyt autoklaveres mikroisolatorbur.
  2. Forbered en frisk cocktail af bredspektrede antibiotika dagligt.
    1. Der tilberedes 250 mL vand med frisk tilberedt metronidazol (1 g/L), neomycin (1 g/L), vancomycin (0,5 g/L) og ampicillin (1 g/L) for hvert mikroisolatorbur af mus.
      Bemærk: Brug autoklave eller sterilt vand til det antibiotikum, som suppleres med drikkevand.
    2. Tilsæt 9,2 g druesukker sødet drikke mix til 250 mL antibiotikum suppleret vand.
      Bemærk: brugen af druesukker sødet drikke blandes masker den bitre smag af antibiotika og hjælper med at forhindre dehydrering i musene.
    3. Ændre antibiotika og druesukker sødet drikke mix suppleret vand og placere musene i en ny autoklaveres bur dagligt.
      Bemærk: mus er coprophagic og ændre bure dagligt forhindrer mus fra re-inokulere sig med tarm bakterier.
    4. For maksimal engraftment af humant-lignende Gut mikrobiome, give antibiotika i 14 dage. Under antibiotisk behandling, overvåge mus til vægttab og dehydrering. Vægttab forventes i løbet af de første 3-4 dage og plateauer efter at for varigheden af behandlingen. Hvis dehydrering opstår, give musene saltvand eller Ringers opløsning via intraperitoneal injektion.
      Bemærk: andre Gut mikrobiome menneskeliggørelse protokoller kræver oral sonde af antibiotika. Mens effektiv til at nedbryder murine Gut bakterier, vi fandt, at den mindre invasive metode til at tilføje antibiotika til drikkevandet lægge mindre stress på vores humaniserede mus og førte til bedre resultater.

4. donor prøver og fækal transplantation

  1. Forbered menneskelige donor fækale prøver.
    1. Brug korrekt forberedte kilder til fækal mikrobiota transplantation (FMT) materiale til fækal transplantation i humaniserede mus.
    2. Tø FMT præparater og alikvot under anaerobe forhold i et anaerob kammer.
    3. Hvis det ønskes, på dette trin blande lige dele af fækale prøver sammen for at skabe en upartisk "menneskelig" prøve.
    4. Holde frysning og optøning af FMT-materiale til et minimum, hvis det ikke er nødvendigt at tilskrive eller blande prøver, skal du kun tø umiddelbart før proceduren.
  2. Menneskelig fækal transplantation
    1. Efter 14 dages behandling med antibiotika skal du ændre drikkevandet til autoklave vand og flytte musene til et nyt autoklaveres-bur. Stop daglige bur ændringer og implementere en gang hver 1-2 uger bur skiftende tidsplan.
    2. Giv to fækale transplantationer ved 24 og 48 h efter ophør af antibiotika.
    3. 24 timer efter behandling med antibiotika, tø den nødvendige mængde FMT-materiale, Giv hver mus 200 μL FMT-materiale via oral gavage. Gentag proceduren igen ved 48 h post antibiotika.
    4. Spred alle resterende eller rester optøede FMT materiale på pels af de humaniserede mus eller på bur strøelse.

5. frisk fækal prøve samling

  1. Autoclave individuelle papirposer før overførsel til røg hætte.
  2. I røg hætten, sætte en mus i hver enkelt papirpose og lad musen til at defecate.
  3. Brug sterile pincet, Saml fækal prøven i 1,5 mL plastrør og fryse ved-80 °C. Returner musene til mikroisolatorbure.
    Bemærk: denne metode til opsamling af fækale prøver giver mulighed for frisk fækal prøve samling fra individuelle mus uden stress inducerende manipulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 viser en skitse af de metoder, der anvendes til at oprette dobbelte Hu-BLT-mus og beskriver kort processen med at tilføje et funktionelt humant immunsystem og stabilt humant-lignende tarm mikrobiom til NSG-musene. Figur 2 viser et eksempel på flow cytometri analyse af perifert blod fra en HUMANISERET BLT-mus 10 uger efter operationen. Figur 3 viser den relative overflod af de humane fækale donor prøver, der anvendes til at overføre et tarm mikrobiom til at skabe dobbelt Hu-mus. Figur 4 viser de fænotypiske forandringer som følge af antibiotikabehandling til milten og cecum, svarende til det, der observeres hos køns frie dyr. Figur 5 viser en hovedkomponent analyse (PCA) plot af 16S rRNA sekvensering data afslører dobbelt Hu-mus har menneskelignende Gut mikrobiomer, der er unikke for den menneskelige donor prøve.

Figure 1
Figur 1 : Oprettelse af dobbelte humaniserede BLT-mus. Oprettelse af dobbelt Hu-BLT-mus er en proces i to trin. Det første skridt er at forankret det menneskelige immunsystem til NSG-musene. På operationsdagen får NSG-mus bestråling til at skabe en niche for stamceller. Musene implanteres derefter med humant føtal lever og thymus væv og injiceres med humane hæmatopoietiske stamceller. Humant immuncelle rekonstitution kontrolleres omkring 10 uger efter operationen.  Det andet skridt er at forankret den menneskelige tarm mikrobiome. Mus behandles med antibiotika for at reducere de allerede eksisterende murine tarm bakterier. Mus får derefter fækale transplantationer for at give den menneskelige tarm mikrobiom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Afprøvning af human immuncelle rekonstitution i dobbelte humaniserede BLT-mus. Et eksempel på flow cytometri analyse af en humaniseret BLT-mus perifert blod 10 uger efter operationen. Figuren viser den gating strategi, der anvendes til at identificere lymfocyt populationen, mCD45-hCD45 + celler, CD19 + B-celler, CD3 + T-celler, CD4 + T-celler og CD8 + T-celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Human donor fækal prøve profiler. Relativ overflod af de 3 humane donorer og blandede (alle donor) prøver vist på familie niveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Antibiotika behandlet mus ligner kimfri fænotyper. Hu-mus blev ofret efter 9 dages antibiotisk behandling (antibiotika) eller ingen antibiotikabehandling (kontrol). Efter behandling med antibiotika begynder Fænotypen af de humaniserede mus at ligne dem, der ses i kimfri dyr. Som et resultat af antibiotisk behandling er der en reduktion i størrelsen af milten (venstre) og cecum er forstørret (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Dobbelt humaniseret BLT-mus har fækale donor specifikke Gut mikrobiomer. PCA plot af 16S rRNA sekvensering data viser efter menneskelig fækal transplantation dobbelt Hu-BLT mus funktion Gut mikrobiomer, der er unikke for den enkelte menneskelige fækale donor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den protokol, der er beskrevet her, er til oprettelse af dobbelte Hu-BLT-mus, som har både et funktionelt humant immunsystem og et stabilt humant-lignende tarm mikrobiom. Denne protokol kan tilpasses andre humaniserede eller ikke-humaniseret mus modeller uden behov for GF dyr og gnotobiotiske faciliteter. Mens de beskrevne metoder er relativt enkle, er der flere vigtige detaljer, der er vigtige for den vellykkede oprettelse af dobbelt Hu-BLT-mus. NSG-mus er ekstremt immundefekt og forebyggelse af infektioner er nøglen til langsigtet overlevelse af musene. Vi traf følgende foranstaltninger for at forhindre infektion. For det første blev dyrene anbragt i individuelle mikroisolatorbure med HEPA-filtre (0,22 μm) i et racksystem med Air Exchange rate Management i en dedikeret Suite. Luft handleren for stativet indeholdt præ-filtre sammen med HEPA filtreret (0,22 μm) forsyning og udstødning luft, samt real-time on-line overvågning af bur udstødningsluft temperatur og relativ fugtighed. For det andet, alle, der trådte ind i dyre rummet var nødt til at brusebad og bære rene scrubs og sko samt sætte på handsker, engangs Tyvek suit, Booties, hårhjelm og ansigtsmaske. For det tredje blev alle procedurer, herunder ændringer i bur og tilsætning af fødevarer og vand, udført inden for en biologisk sikkerheds stinkhed af klasse II a2, der var præsteriliseret med 70% ethanol og UV-lys. Fjerde, aseptisk kirurgisk teknik blev anvendt under overlevelse kirurgi, som omfattede kirurgen og assistenter iført et ekstra lag af beskyttelse, herunder en kirurgi kjole og handsker. Kirurgi blev gennemført i den desinficeres røg hætte, ved hjælp af kun sterile instrumenter, gauzes, og sår lukning materialer, samtidig med at steriliteten af handsker og instrumenter under hele operationen. Endelig, for at forhindre infektion og sikre stabiliteten af den indpodede menneskelignende tarm mikrobiom, al mad og vand givet til musene var steril. Al mad skal bestråles, og alt vand skal autoklave. For at minimere smerter og angst, administrerede vi langtidsvirkende buprenorphin subkutant til mus før operationen. Kombinationen af ketamin og Xylazine til mus kirurgisk anæstesi er meget pålidelig og kan vare omkring for 30 min. Hvis det ikke er længe nok, giver vi isofluran gas til at bedøve musene yderligere. Det er også meget vigtigt at opretholde muse kropstemperaturen efter operationen. Vi sætter buret på den opvarmede opvarmning pad indtil den hæmatopoietiske stamcelle injektion via halen vene. På det tidspunkt, er musene genvundet fra anæstesi og vendte tilbage til rack.

At nedbryder murine tarm mikrobiom og forberede sig til menneskelig fækal transplantation, er det vigtigt altid at bruge frisklavet antibiotika og til at ændre antibiotika suppleret vand og bure dagligt. Dette vil bruge mange microisolator bure i hele 14-dages antibiotikabehandling, men det sikrer, at musene ikke bliver re-inokuleret gennem coprophagia. Under behandling med antibiotika er det også vigtigt at overvåge muternes kropsvægt og helbred. Efter fækal transplantation genvinde musene hurtigt enhver tabt vægt. Det er vigtigt at minimere enhver fryse-tø cyklusser for fækale transplantat materiale og for at sikre at bruge en anaerob kammer, hvis aliciterer prøver er nødvendig. Samtidig med at skabe dobbelt Hu-BLT mus er det vigtigt at minimere håndtering og stress induceret på musene. Dette hjælper med at forebygge infektion og forbedrer langsigtet overlevelse.

Vi oprindeligt forsøgte at pre-Treat mus med anti-svampe amphotericin B, men fandt musene ikke tolerere behandlingen meget godt, og det er ikke længere anvendes. Vi eksperimenterede også med forskellige varigheder af antibiotikabehandling. Vi konstaterede, at mens et flertal af murine Gut bakterier synes at være opbrugt efter 7 dage af antibiotika, niveauet af donor engraftment er meget højere efter 14 dages behandling. Vi har også forsøgt at administrere antibiotika gennem to gange dagligt oral sonde. Men vi fandt, at denne metode var for invasiv for vores Hu-mus. Vi skiftede til en enkelt daglig sonde tidsplan, men musene stadig syntes at være stresset og usunde. Vi fandt, at give antibiotika i drikkevandet var den bedste metode. Det reducerede mængden håndtering og stress til musene, mens det stadig tilstrækkeligt at reducere murine tarm bakterier. Vi leverede druesukker sødet drikke mix i drikkevandet for at sikre, at musene fik en passende dosis af antibiotika og for at forhindre dehydrering. Musene oplever en reduktion i legemsvægten i løbet af de første 3-4 dage af antibiotikabehandling, men at give ekstra væsker via intraperitoneal injektion øger ikke kropsvægten. Efter fækal transplantation genvinde musene hurtigt den tabte vægt.

Mens denne metode er i stand til at reproducerbar generere dobbelt Hu-BLT mus, der er nogle begrænsninger til modellen. Den første ting at overveje er Hu-mus har mindre organiseret lymfoide struktur, herunder avlsmateriale Center, fører til reduceret antistof klasse Skift og begrænset affinitet modning. Men NSG Hu-BLT-mus har systemisk immun rekonstitution og oversætbare T-celle respons og kan bruges til at modellere mange menneskelige sygdomme. Et andet problem er den potentielle udvikling af graft-versus-Host sygdom (GVHD) i nogle Hu-mus efter flere måneders overdreven menneskelig immun rekonstitution. Vi og andre har observeret GVHD manifestationer såsom blepharitis, alopeci, vægttab, og malokklusion, der skal overvåges nøje25.

Der er flere dokumenterede regimer for nedbrydende tarm bakterier i mus med antibiotika26,27,28,29,30,31. Vi valgte vores cocktail af antibiotika på grund af deres kendte evne til at målrette en bred vifte af bakterier i tarmen, og fordi vi fandt flere eksempler på vellykket bakteriel udtømning i litteraturen. Mange offentliggjorte sager bruger en langt mindre stringent kursus af antibiotika, men i vores undersøgelse, vi fandt, at 14 dage er nødvendig for optimal engraftment af en menneskelig-lignende Gut mikrobiome. Mens vi oprindeligt forsøgte en protokol baseret på Hintze et al., fandt vi, at oral sonde var for invasiv, og at anti-svampe behandling var skadelig for mus26. Vi mener, at NSG Hu-BLT-mus er unikke og mindre invasive procedurer foretrækkes sammenlignet med andre mere robuste mus. Vi har ikke bruge GF dyr i vores undersøgelse. Brugen af GF-mus til at studere virkningerne af tarm mikrobiomet har været veldokumenteret, men disse dyr har ikke et humant immunsystem19,32. Yderligere, vi indrømmer, at arbejde med en GF NSG Hu-BLT mus model ville skabe interessante muligheder for forskning. For en, studere Human immuncelle rekonstitution og patogenesen af menneskelige specifikke patogener som HIV-1 uden tilstedeværelsen af tarm mikrobiome kunne give interessante resultater. Desuden kan GF-modeller give mulighed for en mere komplet rekonstitution af et humant-lignende tarm mikrobiom efter fækal transplantation. Men, GF mus har langvarige immundefekter, selv efter Gut mikrobiome rekonstitution21. Vores model har den fordel at bruge SPF boligforhold, som er bredt tilgængelige og billigere i forhold til GF faciliteter. Vores model har også den fordel, at ikke køretøjet står de normale procedurer for kirurgisk generering af Hu-BLT mus, fordi der ikke er behov for en helt GF miljø.

Vi mener, at denne dobbelte Hu-BLT musemodel er unik, fordi det ikke kun kan bruges til at studere menneskelig immun funktion og menneskelige sygdomme, men også bestemme virkningen af tarm mikrobiome på sygdoms patogenese og behandling in vivo. Med denne protokol kan vi reproducerbart skabe dobbelt Hu-BLT mus med human donor specifikke Gut mikrobiome profiler. Derfor mener vi, at bruge dobbelt Hu-BLT mus vil være til gavn for fremtidige personlige medicin applikationer designet til at teste virkningen af tarm mikrobiome på behandlinger for forskellige menneskelige sygdomme som HIV-1 og kræft. Sammenfattende er vores dobbelt Hu-BLT-mus model en vigtig og ny præklinisk model, der har både et funktionelt humant immunsystem og et stabilt humant-lignende tarm mikrobiom til at studere menneskers sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Yanmin WAN, Guobin Kang og Pallabi Kundu for deres hjælp til at generere BLT-humanized mus. Vi vil gerne anerkende UNMC Genomics kerne facilitet, som modtager delvis støtte fra Nebraska Research Network i functional genomics NE-INBRE P20GM103427-14, den molekylære biologi i Neurosenssystemet CoBRE P30GM110768, The fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, Center for root og Rhizobiome innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, og Nebraska Research Initiative. Vi vil gerne takke University of Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex og deres personale for deres hjælp. Denne undersøgelse er delvis støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 kronisk hiv-infektion og aldring i Neuro aids (Chain) Center, 1R01AI111862 til Q Li.  Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og-analyse, udarbejdelse af manuskriptet eller beslutning om offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180, (10), 7009-7018 (2008).
  2. Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6, (9), (2011).
  3. Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193, (2), 587-596 (2014).
  4. Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60, (6), 1726-1733 (2011).
  5. Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
  6. Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348, (6241), (2015).
  7. Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204, (4), 705-714 (2007).
  8. Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (8), 3146-3151 (2014).
  9. Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
  10. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, (7122), 1027-1031 (2006).
  11. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359, (6371), 97-103 (2018).
  12. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359, (6371), (2018).
  13. Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
  14. Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474, (7351), 327-336 (2011).
  15. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336, (6086), 1268-1273 (2012).
  16. Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, (7415), 231-241 (2012).
  17. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33, (10), 1103 (2015).
  18. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8, (1), 1-16 (2015).
  19. Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1, (6), (2009).
  20. Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50, (1), 95-106 (1981).
  21. Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7, (3), (2012).
  22. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108, (2), 487-492 (2006).
  23. Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69, (5), 519-527 (2015).
  24. Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83, (14), 7305-7321 (2009).
  25. Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7, (9), (2012).
  26. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5, (2), 183-191 (2014).
  27. Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
  28. Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
  29. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
  30. Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. (2018).
  31. Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7, (1), 68-74 (2016).
  32. Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3, (3), 234-249 (2012).
En dobbelt humaniseret BLT-mus model med en stabil menneskelig-lignende Gut Mikrobiom og humant immun system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).More

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter