Summary
We beschrijven een nieuwe methode voor het genereren van dubbele gehumaniseerde blt-muizen die een functioneel menselijk immuunsysteem en een stabiel geënt mens-achtige gut microbiome bevatten. Dit protocol kan worden gevolgd zonder de noodzaak van kiemvrije muizen of gnotobiotische faciliteiten.
Abstract
Gehumaniseerde muizen (HU-muizen) die beschikken over een functioneel menselijk immuunsysteem hebben fundamenteel veranderd de studie van menselijke pathogenen en ziekte. Ze kunnen worden gebruikt om ziektes te modelleren die anders moeilijk of onmogelijk te bestuderen zijn bij mensen of andere diermodellen. Het microbioom van de darmen kan een diepgaande invloed hebben op de menselijke gezondheid en ziekte. Echter, de Murine gut microbiome is heel anders dan die gevonden bij de mens. Er is behoefte aan verbeterde pre-klinische hu-mice modellen die een geënt menselijke gut microbiome hebben. Daarom hebben we dubbele hu-muizen gemaakt met zowel een menselijk immuunsysteem als een stabiel mensachtig darmmicrobioom. Knik. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) muizen zijn een van de beste dieren voor humanisatie als gevolg van hun hoge niveau van immunodeficiëntie. Echter, kiemvrije NSG-muizen, en diverse andere belangrijke kiemen-vrije muizen modellen zijn momenteel niet commercieel beschikbaar. Verder, veel onderzoekinstellingen hebben geen toegang tot Gnotobiotic faciliteiten, en werken onder Gnotobiotic voorwaarden kunnen vaak duur en tijdrovend. Belangrijk, kiemvrije muizen hebben verschillende Immuundeficiënties die bestaan, zelfs na de engraftment van microben. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld dat geen kiemvrije dieren of gnotobiotische faciliteiten vereist. Voor het genereren van dubbele hu-muizen, NSG muizen werden behandeld met straling voorafgaand aan de operatie te maken beenmerg, lever, Thymus-gehumaniseerd (HU-BLT) muizen. De muizen werden vervolgens behandeld met breedspectrum antibiotica om de reeds bestaande Murine gut microbiome af te putten. Na behandeling met antibiotica kregen de muizen fecale transplantaties met gezonde menselijke donor monsters via een mond sonde. Dubbele hu-BLT muizen hadden unieke 16S rRNA genprofielen gebaseerd op het individuele menselijke donor monster dat werd getransplanteerd. Belangrijk is dat de getransplanteerde mens-achtige microbiome stabiel was in de dubbele hu-BLT muizen voor de duur van de studie tot 14,5 weken na de transplantatie.
Introduction
Gehumaniseerde muizen (HU-muizen) hebben de studie van vele aspecten van de gezondheid van de mens en ziekte, met inbegrip van hematopoiese, immuniteit, Cancer, auto-immuunziekte en besmettelijke ziekte1,2,3,4 getransformeerd ,5,6,7,8,9. Deze hu-muizen hebben het duidelijke voordeel ten opzichte van andere muismodellen, omdat ze een functioneel menselijk immuunsysteem hebben en kunnen worden geïnfecteerd met menselijke specifieke pathogenen. Niettemin is het belang van het microbioom van de darmen aangetoond door zijn rol bij veel menselijke ziekten zoals obesitas, metabool syndroom, ontstekingsziekten en kanker10,11,12, 13. Het mucosale immuunsysteem en gut microbiome zijn samengereguleerd om gut en systemische homeostase te behouden. Het immuunsysteem wordt gevormd door antigenen die worden gepresenteerd door het microbioom van de darmen en het immuunsysteem speelt een belangrijke regelgevende rol bij het bevorderen van commensale gut bacteriën en het elimineren van pathogenen14,15, 16. echter, de gut microbiome van Hu-muizen is niet goed gekarakteriseerd en de Murine gut microbiome verschilt aanzienlijk in samenstelling en functie van mensen17. Dit is te wijten aan evolutionaire, fysiologische en anatomische verschillen tussen de Murine en de menselijke darm, evenals andere belangrijke factoren zoals dieet, die de experimentele resultaten van Hu-mice ziekte modellen kunnen beïnvloeden18. Daarom, naast de classificatie van Murine gut microbiome van Hu-muizen, een diermodel met zowel een menselijk immuunsysteem en menselijke gut microbiome is nodig om te bestuderen van de complexe interacties van menselijke ziekte in vivo.
De studie van menselijke ziekten direct in menselijke proefpersonen is vaak onpraktisch of onethisch. Veel diermodellen kunnen niet worden gebruikt om menselijke pathogenen zoals humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) te bestuderen. Niet-menselijke primaat modellen zijn genetisch gekweekte, erg duur, en zijn niet vatbaar voor veel menselijke pathogenen. Muizen die zijn afgeleid als kiemvrij (GF) en zijn gereconstitueerd met mensachtige gut microbioom zijn op grote schaal gebruikt om de gezondheid van de mens en de ziekte te bestuderen19,20. Deze dieren hebben echter geen menselijk immuunsysteem en het werken met GF-dieren vereist gespecialiseerde faciliteiten, procedures en expertise. Daarom is er behoefte aan verbeterde pre-klinische modellen om de complexe relatie van het microbioom van de darmen en het menselijke immuunsysteem te bestuderen. Vele stammen van muizen, zoals NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), zijn niet commercieel beschikbaar als GF. GF-dieren kunnen ook last hebben van langdurige Immuundeficiënties die niet volledig worden omgekeerd door de engraftment van microben21. Daarom creëerden we een dubbele hu-muizen met zowel een functioneel menselijk immuunsysteem als een stabiel mens-achtig darmmicrobioom onder specifieke pathogenen vrije (SPF) condities. Voor het genereren van dubbele hu-muizen, chirurgie werd uitgevoerd op NSG muizen te maken beenmerg, lever, Thymus gehumaniseerd muizen (HU-BLT). De hu-BLT muizen werden vervolgens behandeld met breedspectrum antibiotica en kregen vervolgens fecale transplantaties met een gezond humaan donor monster. We kenmerkten de bacteriële gut microbiome van 173 fecale monsters van 45 dubbele hu-BLT muizen en 4 menselijke fecale donor monsters. Dubbele hu-BLT muizen hebben unieke 16S rRNA genprofielen gebaseerd op het individuele menselijke donor monster dat wordt getransplanteerd. Belangrijk is dat de getransplanteerde mens-achtige microbiome was stabiel in de muizen voor de duur van de studie tot 14,5 weken na transplantatie. Bovendien toonden de voorspelde metagenomes aan dat dubbele hu-BLT-muizen een verschillende voorspelde functionele capaciteit hebben dan hu-muizen die meer lijken op de menselijke donor monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele Dierenzorg-en onderzoekscommissie (IACUC)-goedgekeurde protocollen aan de Universiteit van Nebraska-Lincoln (UNL). De IACUC bij UNL heeft twee protocollen goedgekeurd die verband houden met het genereren en gebruiken van Hu-BLT-muizen, waaronder Double hu-muizen. Daarnaast heeft het wetenschappelijk onderzoek Toezichtscomité (SROC) bij UNL ook het gebruik van menselijke embryonale stamcellen en foetale weefsels goedgekeurd, die worden verkregen uit de geavanceerde biowetenschappelijke middelen voor gehumaniseerde muizen studies (SROC # 2016-1-002).
1. muizen huisvesting en onderhoud
- Aankoop 6-8-week oude NSG muizen (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
- Huis de muizen onder SPF-condities met luchtuitwisseling, prefilters en HEPA-filters (0,22 μm) in een ruimte met gecontroleerde temperatuur, vochtigheid en druk.
- Huis en onderhoud de muizen in geautoclaveerd individuele microisolator kooien in een racksysteem dat luchtuitwisseling kan beheren met filters en HEPA-filters (0,22 μm).
- Voer alle procedures en manipulaties van de muizen uit in een klasse II type a2 biologische Safety rook Hood die is voorbehandeld met 70% ethanol. Voor het werken in de dieren kamer, douche en veranderen in schone scrubs, Tyvek pak, boot covers, haar GLB, gezichtsmasker, en handschoenen. Draag een chirurgische jurk over het Tyvek-pak tijdens chirurgische ingrepen.
Opmerking: ultraviolet (UV) licht decontaminatie heeft ook de voorkeur vóór procedures.- Autoclaaf alle instrumenten en reagentia indien mogelijk en desinfecteren alvorens over te brengen naar de damp afzuigkap.
- Verwijder tijdens de procedures de individueel geventileerde kooien van de dieren uit het rek en desinfecteer ze voordat ze naar de damp afzuigkap worden overgebracht.
- Voer de muizen een bestraald dieet en zorg voor geautoclaveerd water. Voorzien van bestraald voedsel AB libitum en aanvullen met extra bestraald voedsel indien nodig. Verander het geautoclaveerd water wekelijks of indien nodig.
Opmerking: aangezuurd water kan ook worden gebruikt. Het bestraalde dieet had een houdbaarheid van 6 maanden na de vervaardiging.
2. generatie van gehumaniseerde BLT muizen
Opmerking: het genereren van Hu-blt-muizen is eerder22,23,24beschreven.
- Op de dag van de operatie, geef de muizen hele lichaam bestraling in een dosis van 12 cGy/g lichaamsgewicht.
- Bereid de muizen voor op een operatie.
- Geef elke bestraalde muis een mengsel van ketamine bij de werkconcentratie van 100 mg/kg en Xylazine bij de concentratie van 12 mg/kg, dat varieerde van 130-170 μL per muis op basis van het lichaamsgewicht door intraperitoneale (IP) injectie voor anesthesie. Om 3 ml van het mengsel van ketamine en Xylazine te bereiden, Voeg 0,27 mL ketamine toe aan de voorraad concentratie van 100 mg/mL en 0,03 mL Xylazine bij de concentratie van 100 mg/mL tot 2,7 mL steriele zoutoplossing en meng goed. Desinfecteer de huid met 70% isopropanol voorafgaand aan de injectie.
- Geef elke bestraalde muis buprenorfine 1 mg/kg lichaamsgewicht (half-Live 72 h, SR-LAB) door subcutane injectie voor langdurig pijnmanagement.
- Geef elke bestraalde muis 100 μL (858 μg) Cefazolin via IP-injectie voor preoperatieve antibiotica profylaxe.
- Scheer het haar van de muizen met behulp van elektrische haar Tondeuses rond de linker laterale en mediale kant van de muis op de latere operatieplaats gebruikt om de linker nier bloot.
- Controleer het juiste niveau van anesthesie door pedaal reflex (stevige teen pinch).
- Geef Isofluraan gas op 3-5% als extra anesthesie nodig is op elk punt tijdens de operatie.
- Breng oogheelkundige zalf aan beide ogen ter voorkoming van corneale uitdroging. Breng de oortag aan indien nodig.
- Voer een operatie uit om de lever en Thymus weefsels in de linker niercapsule te implanteren.
- Desinfecteer de huid op de operatieplaats door het toepassen van jodium scrub vanaf het midden van de operatieplaats en verplaatsen naar buiten op een circulaire manier. Herhaal dit proces met 70% isopropanol en een derde keer met jodium.
- Met behulp van de Tang, eerste laden van een menselijke foetale leverweefsel fragment in een trocar. Vervolgens met behulp van de Tang, laadt een menselijk foetaal Thymus weefsel fragment in de trocar. Vervolgens met behulp van de Tang, laden van een ander menselijk foetale leverweefsel fragment in de trocar. Weefsels moeten worden gesneden tot 1-1,6 mm3 om de inwendige afmetingen van de trocar te passen.
- Gebruik de tang om de huid op te tillen en gebruik een schaar om een kleine snede in de lengterichting te maken. Verleng de snede tot 1,5-2 cm aan de linkerzijde van de muis.
- Gebruik de tang om de spierlaag op te tillen en gebruik een schaar om een kleine snede in de lengterichting te maken. Verleng de snede zo nodig om de nier bloot te leggen.
- Stel de nier bloot door zachtjes het vetweefsel rond de nier te grijpen. Raak de nier parenchym niet direct aan.
- Maak een 1-2 mm incisie aan het achterste uiteinde van de niercapsule met behulp van een scalpel.
- Steek de voorgeladen trocar langzaam door de incisie parallel aan de lange as van de nier en laat de weefsels los tussen de niercapsule en de nieren.
- De nier en darmen voorzichtig terug naar hun normale positie. Gebruik absorbeerbare 5/0 P-3 (P-13) hechtingen met 13mm 3/8 cirkel naald om de spierlaag en chirurgische nieten te sluiten om de huid te sluiten.
- Na de operatie, zet de muis in een schone geautoclaveerd microisolator kooi voor herstel.
- Om warmteverlies te minimaliseren tijdens post-chirurgische herstel, zet de kooi met de muizen op een verwarmingskussen dat is aangesloten op een waterpomp die verwarmt en circuleert het water.
- Monitor de muizen totdat ze voldoende bewustzijn hebben gekregen om borstbeen recumbency te behouden.
- Binnen 6 h van de operatie voltooiing, via de staart-ader, injecteren CD34 + hematopoietische stamcellen geïsoleerd van menselijke foetale leverweefsel.
- Verwarm de muizen met een warmte lamp. Desinfecteer de staart met 70% isopropanol en Injecteer vervolgens 1,5 tot 5 × 105 stamcellen/200 μL in de staart ader.
- Stop eventuele bloedingen van de injectie en retourneer muizen naar de microisolator kooi en de microisolator kooi naar het kooi rack.
Opmerking: na chirurgie worden muizen meestal samen ondergebracht, vijf per microisolator kooi, tijdens en na het herstel. Muizen worden echter alleen bij elkaar ondergebracht als ze allemaal op dezelfde dag een operatie hebben ondergaan.
- Controleer de muizen dagelijks. Controleer de chirurgische nieten zorgvuldig en vervang ze naar behoefte. Houd de muizen nauwlettend in de gaten voor elk teken van infectie of ongemak. Levering van geautoclaveerd voedsel op de vloer van de microisolator kooi voor een paar dagen na de operatie.
- Verwijder de chirurgische nietjes 7-10 dagen na de operatie. Geef Isofluraan gas op 3-5% om de muizen te anesthetiseren. Verwijder voorzichtig de nietjes en breng vervolgens antibiotica en pijnstillende zalf aan op de plaats.
- Laat 9-12 weken toe voor reconstitutie van menselijke immuuncellen en verzamel vervolgens perifeer bloed uit de mediale sapheneuze ader van elk van de gehumaniseerde muizen.
- Trek bewuste muizen met behulp van een passend formaat plastic kegel terughoudendheid met een opening in de buurt van het hoofd van de muis voor ademhaling en een opening in de buurt van de achterkant van de muis om een been te isoleren. Plaats de muizen eerst in de bevestigings kegel en trek vervolgens zachtjes een been door de opening van het been.
- Spray de mediale kant van het geïsoleerde been met 70% isopropanol, verdeel vervolgens antibiotica en pijnstillende zalf op dezelfde plaats.
Opmerking: de zalf helpt om de locatie van de ader te onthullen zonder de noodzaak voor ontharing en helpt ook bij de vorming van bloed druppeltjes. - Gebruik een 25-gauge naald in een hoek van 90 °, prik de ader en Verzamel 50-100 μL bloed met behulp van een met EDTA gecoate bloedopvangbuis. Stop de bloeding door druk op de plaats met steriel gaas toe te passen. Zodra het bloeden is gestopt, de muizen terug naar hun kooi.
NB: het maximale aantal verzamelde bloed volumes is doorgaans 50 μL per week of 100 μL elke twee weken. - Gebruik het verzamelde perifere bloed om het niveau van menselijke immuuncelreconstitutie te testen met behulp van Flowcytometrie met antilichamen voor hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. behandeling met antibiotica
- Voorafgaand aan de behandeling met antibiotica, verzamelen pre-behandeling fecale monsters. Verplaats de muizen naar een nieuwe geautoclaveerd microisolator kooi.
- Bereid dagelijks een frisse cocktail van breedspectrum antibiotica.
- Bereid 250 mL water met vers bereide metronidazol (1 g/L), neomycine (1 g/L), vancomycine (0,5 g/L) en Ampiciline (1 g/L) voor elke microisolator kooi van muizen.
Opmerking: gebruik geautoclaveerd of steriel water voor het met antibiotica aangevuld drinkwater. - Voeg 9,2 g druif suiker gezoete drank mix toe aan 250 mL met antibiotica aangevuld water.
Opmerking: het gebruik van druivensuiker gezoete drank mix maskeert de bittere smaak van de antibiotica en helpt uitdroging in de muizen te voorkomen. - Verander de antibioticum en druif suiker gezoete drank mix aangevuld water en plaats de muizen in een nieuwe geautoclaveerd kooi dagelijks.
Opmerking: muizen zijn coprofagisch en het veranderen van de kooien dagelijks voorkomt dat de muizen zich opnieuw inoculeren met darmbacteriën. - Voor maximale engraftment van de mens-achtige gut microbiome, bieden antibiotica voor 14 dagen. Tijdens de behandeling met antibiotica, bewaken van de muizen voor gewichtsverlies en uitdroging. Gewichtsverlies wordt verwacht tijdens de eerste 3-4 dagen en plateaus daarna voor de duur van de behandeling. Als uitdroging optreedt, geef de muizen zoutoplossing of Ringers Solution via intraperitoneale injectie.
Opmerking: andere gut microbiome humanisatie protocollen vragen om orale maagsonde van antibiotica. Terwijl effectief in het afbreken van de Murine gut bacteriën, we vonden dat de minder invasieve methode van het toevoegen van antibiotica aan het drinkwater minder stress op onze gehumaniseerde muizen en leidde tot betere resultaten.
- Bereid 250 mL water met vers bereide metronidazol (1 g/L), neomycine (1 g/L), vancomycine (0,5 g/L) en Ampiciline (1 g/L) voor elke microisolator kooi van muizen.
4. donor monsters en fecale transplantatie
- Bereid menselijke donor fecale monsters.
- Gebruik goed voorbereide bronnen van fecale microbiota transplantatie (FMT) materiaal voor fecale transplantatie in de gehumaniseerde muizen.
- Ontdooien FMT preparaten en aliquot ze onder anaerobe condities in een anaerobe kamer.
- Indien gewenst, in deze stap meng gelijke delen van de fecale monsters samen om een onbevooroordeelde "menselijke" monster te creëren.
- Het FMT-materiaal tot een minimum te bevriezen en ontdooien, indien het niet nodig is om monsters te mengen of te vermengen, alleen ontdooien onmiddellijk vóór de ingreep.
- Menselijke fecale transplantatie
- Na voltooiing van 14 dagen antibioticabehandeling, verander het drinkwater naar geautoclaveerd water en verplaats de muizen in een nieuwe geautoclaveerd kooi. Stop dagelijkse kooi veranderingen en implementeer een eenmaal per 1-2 weken kooi veranderende schema.
- Geef twee fecale transplantaties op 24 en 48 uur na beëindiging van antibiotica.
- 24 h na antibioticabehandeling, ontdooien de benodigde hoeveelheid FMT-materiaal, geef elke muis 200 μL FMT-materiaal via een orale gavage. Herhaal de procedure opnieuw op 48 h post antibiotica.
- Verdeel alle overgebleven of overgebleven ontdooide FMT-materiaal op de vacht van de gehumaniseerde muizen of op de kooibedden.
5. verse fecale monsterverzameling
- Autoclaaf afzonderlijke papieren zakken voorafgaand aan de overbrenging naar de afzuigkap.
- In de afzuigkap, zet een muis in elke afzonderlijke papieren zak en laat de muis te pogen.
- Gebruik steriele Tang, verzamel het fecale monster in 1,5 mL plastic buizen en Vries bij-80 °C. Keer de muizen terug naar microisolator kooien.
Opmerking: deze methode van het verzamelen van fecale monsters zorgt voor verse fecale monsterverzameling van individuele Muizen zonder enige stress inducerende manipulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een overzicht van de methoden die worden gebruikt om dubbele hu-blt-muizen te maken en beschrijft kort het proces van het toevoegen van een functioneel menselijk immuunsysteem en een stabiele mens-achtige gut-microbiome aan de NSG-muizen. Figuur 2 toont een voorbeeld van een Flowcytometrie analyse van perifeer bloed van een GEHUMANISEERDE blt-muis 10 weken na de operatie. Figuur 3 toont de relatieve overvloed van de menselijke fecale donor monsters die worden gebruikt om een darm-microbiome over te brengen om dubbele hu-muizen te creëren. Figuur 4 toont de fenotypische veranderingen geïnduceerd door antibioticumbehandeling aan de milt en de blindedarm, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij kiemvrije dieren. Figuur 5 toont een hoofdcomponent analyse (PCA) plot van de 16S rRNA sequentie gegevens die dubbele hu-muizen onthullen, hebben humane darmmicrobiomes die uniek zijn voor het menselijke donor monster.
Figuur 1 : Het creëren van dubbele gehumaniseerde BLT-muizen. Het maken van dubbele hu-BLT muizen is een proces in twee stappen. De eerste stap is om het menselijke immuunsysteem naar de NSG-muizen te graveren. Op de dag van de operatie, NSG muizen worden gegeven bestraling om een niche voor stamcellen te creëren. De muizen worden vervolgens geïmplanteerd met menselijke foetale lever en Thymus weefsels en geïnjecteerd met menselijke hematopoietische stamcellen. Menselijke immuuncel reconstitutie wordt gecontroleerd rond 10 weken na de operatie. De tweede stap is het graveren van de menselijke gut microbiome. Muizen worden behandeld met antibiotica om de reeds bestaande Murine gut bacteriën te verminderen. Muizen krijgen vervolgens fecale transplantaties om het menselijk darmmicrobioom te leveren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Testen van menselijke immuuncelreconstitutie in dubbele gehumaniseerde BLT-muizen. Een voorbeeld van Flowcytometrie analyse van een gehumaniseerd BLT-Mouse perifeer bloed 10 weken na de operatie. De afbeelding toont de gating-strategie die wordt gebruikt om de lymfocyten populatie, mCD45-hCD45 + cellen, CD19 + B-cellen, CD3 + T-cellen, CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen te identificeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Menselijke donor fecale monster profielen. Relatieve overvloed van de 3 menselijke donor en gemengde (alle donoren) monsters weergegeven op het niveau van de familie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Met antibiotica behandelde muizen lijken op kiemvrije fenotypes. Hu-muizen werden geofferd na 9 dagen antibioticumbehandeling (antibiotica) of geen antibioticabehandeling (controle). Na behandeling met antibiotica begint het fenotype van de gehumaniseerde muizen te lijken op die gezien in kiemvrije dieren. Als gevolg van de behandeling met antibiotica is er een afname van de grootte van de milt (links) en de blindedarm wordt vergroot (rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Dubbele gehumaniseerde BLT-muizen zijn voorzien van fecale donor specifieke gut microbiomes. PCA plot van 16s rRNA sequencing data show na menselijke fecale transplantatie de dubbele hu-blt muizen zijn voorzien van gut microbioom die uniek zijn voor de individuele menselijke fecale donor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat hier wordt beschreven, is voor de creatie van dubbele hu-BLT-muizen die zowel een functioneel menselijk immuunsysteem als een stabiel mensachtig darmmicrobioom hebben. Dit protocol kan worden aangepast aan andere gehumaniseerde of niet-gehumaniseerde muizen modellen zonder de noodzaak voor GF-dieren en gnotobiotische faciliteiten. Hoewel de hier beschreven methoden relatief eenvoudig zijn, zijn er verschillende kritieke details die belangrijk zijn voor het succesvol maken van dubbele hu-BLT-muizen. NSG-muizen zijn extreem immunodeficiënte en het voorkomen van infecties is de sleutel tot lange termijn Overleving van de muizen. We hebben de volgende maatregelen genomen om infectie te voorkomen. Ten eerste werden dieren ondergebracht in individuele microisolator kooien met HEPA-filters (0,22 μm) in een racksysteem met luchtwisselings beheer in een speciale suite. De luchthandler voor het rek bevatte pre-filters samen met HEPA gefilterd (0,22 μm) toevoer en afvoerlucht, evenals real-time on-line monitoring van de uitlaatlucht temperatuur van de kooi en de relatieve vochtigheid. Ten tweede, iedereen die de dieren kamer binnenkwam moest douchen en dragen schone Scrubs en schoenen, evenals op handschoenen, wegwerp Tyvek pak, laarsjes, haar motorkap en gezichtsmasker. Ten derde werden alle procedures, waaronder veranderingen in de kooi en toevoeging van voedsel en water, uitgevoerd in een klasse II type a2 biologische veiligheids afzuigkap die vooraf werd gesteriliseerd met 70% ethanol en UV-licht. Ten vierde werd aseptische chirurgische techniek gebruikt tijdens een overlevings operatie, waaronder de chirurg en assistenten die een extra beschermingslaag droegen, inclusief een chirurgische jurk en handschoenen. Chirurgie werd uitgevoerd in de gedesinfecteerde rook afzuigkap, met behulp van alleen steriele instrumenten, gauzes en wondsluiting materialen, terwijl de steriliteit van handschoenen en instrumenten gedurende de hele operatie behouden. Tot slot, om infectie te voorkomen en te zorgen voor de stabiliteit van de geënt mens-achtige gut microbiome, alle voedsel en water gegeven aan de muizen was steriel. Alle voedsel moet worden bestraald en alle water moet worden autoclaved. Om pijn en ongemak te minimaliseren, hebben we langwerkende buprenorfine subcutaan toegediend aan muizen vóór de operatie. De combinatie van ketamine en Xylazine voor muis chirurgische anesthesie is zeer betrouwbaar en kan duren voor 30 min. Als dat niet lang genoeg is, geven we Isofluraan gas om de muizen verder te anesthetiseren. Het is ook erg belangrijk om de muis lichaamstemperatuur na de operatie te behouden. We zetten de kooi op het verwarmde verwarmingspad tot de hematopoietische stamcel injectie via de staart ader. Op dat moment, de muizen worden teruggewonnen uit de anesthesie en keerde terug naar rek.
Om de Murine gut microbiome afbrekende en voor te bereiden op menselijke fecale transplantatie, het is belangrijk om altijd gebruik maken van vers bereide antibiotica en om te veranderen antibiotica aangevuld water en kooien dagelijks. Dit zal veel microisolator kooien gedurende de 14-daagse antibioticumbehandeling gebruiken, maar het zorgt ervoor dat de muizen niet opnieuw worden inocculeerd via coprophagia. Tijdens de behandeling met antibiotica is het ook van cruciaal belang om het lichaamsgewicht en de gezondheid van de muizen te bewaken. Na fecale transplantatie herwinnen de muizen snel verloren gewicht. Het is belangrijk om alle Vries ontdooien voor het fecale transplantatiemateriaal te minimaliseren en ervoor te zorgen dat een anaerobe kamer wordt gebruikt als er monsters moeten worden gealiquoteerd. Bij het maken van Double hu-BLT-muizen is het belangrijk om de handling en stress op de muizen te minimaliseren. Dit helpt om infectie te voorkomen en verbetert de overleving op lange termijn.
We probeerden in eerste instantie muizen met anti-schimmel amfotericine B vooraf te behandelen, maar vonden dat de muizen de behandeling niet erg goed verdragen en het wordt niet meer gebruikt. We hebben ook geëxperimenteerd met verschillende duur van de behandeling met antibiotica. We constateerden dat hoewel een meerderheid van de bacteriën van de Murine gut na 7 dagen antibiotica uitgeput lijkt te zijn, het niveau van donor engraftment veel hoger is na 14 dagen behandeling. We probeerden ook antibiotica te toedienen via tweemaal daags oraal gavage. We constateerden echter dat deze methode te invasief was voor onze hu-muizen. We schakelden over op een enkele dagelijkse maagsonde planning, maar de muizen leken nog steeds gestrest en ongezond. We constateerden dat het verstrekken van antibiotica in het drinkwater de beste methode was. Het verminderde de hoeveelheid handling en stress op de muizen terwijl het nog steeds voldoende vermindering van de bacteriën van de Murine gut. We voorzien druivensuiker gezoete drank mix in het drinkwater om ervoor te zorgen dat de muizen een adequate dosering van antibioticum kregen en om uitdroging te voorkomen. De muizen ervaren een afname van het lichaamsgewicht tijdens de eerste 3-4 dagen van de behandeling met antibiotica, maar het verstrekken van extra vloeistoffen via intraperitoneale injectie verhoogt het lichaamsgewicht niet. Na fecale transplantatie herwinnen de muizen snel het verloren gewicht.
Hoewel deze methode reproduceerbaar dubbele hu-BLT-muizen kan genereren, zijn er enkele beperkingen aan het model. Het eerste wat je moet overwegen is hu-muizen hebben minder georganiseerde lymfoïde structuur, waaronder het Germinal Center, wat leidt tot verminderde antilichaam-klasse switching en beperkte affiniteit rijping. Echter, NSG hu-blt muizen hebben systemische immuun reconstitutie en vertaalbare T cel reacties en kan worden gebruikt voor het modelleren van vele menselijke ziekten. Een ander probleem is de mogelijke ontwikkeling van transplantaat-versus-hostziekte (GVHD) in sommige hu-muizen na enkele maanden van overmatige menselijke immuunreconstitutie. Wij en anderen hebben waargenomen GVHD manifestaties zoals blefaritis, alopecia, gewichtsverlies, en malocclusie die zorgvuldig moet worden gecontroleerd25.
Er zijn verschillende gedocumenteerde regimes voor het afbreken van gut bacteriën in muizen met antibiotica26,27,28,29,30,31. We kozen voor onze cocktail van antibiotica als gevolg van hun bekende vermogen om te richten op een breed scala van bacteriën in de darm en omdat we verschillende voorbeelden van succesvolle bacteriële uitputting in de literatuur gevonden. Veel gepubliceerde gevallen gebruiken een veel minder strenge antibioticakuur maar in onze studie, we vonden dat 14 dagen nodig is voor een optimale engraftment van een mens-achtige gut microbiome. Terwijl we in eerste instantie probeerden een protocol op basis van Hintze et al., we vonden dat orale maagsonde was te invasief en dat anti-schimmel behandeling schadelijk voor muizen26was. Wij geloven dat NSG hu-BLT muizen uniek zijn en minder invasieve procedures hebben de voorkeur in vergelijking met andere robuustere muizen. We hebben geen gebruik van GF-dieren in onze studie. Het gebruik van GF-muizen om de effecten van het microbioom van de darmen te bestuderen, is goed gedocumenteerd, maar deze dieren hebben geen menselijk immuunsysteem19,32. Verder geven we toe dat het werken met een GF NSG hu-BLT mice-model interessante mogelijkheden voor onderzoek zou creëren. Voor één, het bestuderen van menselijke immuuncelreconstitutie en de pathogenese van menselijke specifieke pathogenen zoals HIV-1 zonder de aanwezigheid van het microbioom van de darmen kunnen interessante resultaten opleveren. Verder, GF modellen kunnen toestaan voor een vollediger reconstitutie van een mens-achtige gut microbiome na fecale transplantatie. Echter, GF muizen hebben langdurige Immuundeficiënties, zelfs na de darm microbiome reconstitutie21. Ons model heeft het voordeel van het gebruik van SPF woonomstandigheden, die op grote schaal beschikbaar zijn en minder duur in vergelijking met GF-faciliteiten. Ons model heeft ook het voordeel dat de normale procedures van chirurgisch genererende hu-BLT-muizen niet worden verstoord, omdat er geen behoefte is aan een volledig GF-omgeving.
Wij geloven dat dit dubbele hu-BLT muismodel uniek is omdat het niet alleen kan worden gebruikt om menselijke immune functie en menselijke ziekten te bestuderen, maar ook de impact van het microbioom van de darmen op ziekte pathogenese en behandeling in vivo te bepalen. Met dit protocol, kunnen we reproduceerbare dubbele hu-BLT muizen met menselijke donor specifieke gut microbiome profielen te creëren. Daarom geloven we dat het gebruik van dubbele hu-BLT muizen gunstig zal zijn voor toekomstige gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen die zijn ontworpen om de impact van het microbioom van de darmen te testen op behandelingen voor verschillende menselijke ziekten zoals HIV-1 en Cancer. Kortom, ons Double hu-BLT mice-model is een belangrijk en nieuw preklinisch model dat zowel een functioneel menselijk immuunsysteem als een stabiel mensachtig gut-microbiome bevat om de menselijke gezondheid en ziekte te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Yanmin WAN, Guobin Kang en Pallabi Kundu bedanken voor hun hulp bij het genereren van BLT-gehumaniseerde muizen. We willen de kern faciliteit van UNMC Genomics erkennen die gedeeltelijke ondersteuning krijgt van het Nebraska Research Network in Functional genomics NE-INBRE P20GM103427-14, de moleculaire biologie van Neurosensorische systemen CoBRE P30GM110768, de Fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, het centrum voor root en Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, en het Nebraska Research Initiative. We willen de Universiteit van Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex en hun medewerkers bedanken voor hun hulp. Deze studie wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 chronische HIV-infectie en veroudering in neuroaids (keten) Center, 1R01AI111862 aan Q Li. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, voorbereiding van het manuscript of besluit voor publicatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
