Summary
אנו מתארים שיטה הרומן ליצירת הומניזציה כפולה עכברים התכונה המערכת החיסונית האנושית תפקודית יציבה מנופה של בני אדם כמו מיקרובידום. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה ללא צורך בעכברים ללא חיידקים או מתקני גנוטוביוטיקה.
Abstract
עכברים הומניזציה (hu-עכברים) התכונה מערכת חיסונית אנושית תפקודית שינתה באופן מהותי את המחקר של פתוגנים אנושיים ומחלות. הם יכולים לשמש כדי לדגמן מחלות כי הם קשים אחרת או בלתי אפשרי ללמוד בבני אדם או דגמי בעלי חיים אחרים. המעיים יכולים להשפיע עמוקות על בריאות האדם ועל המחלה. עם זאת, מיקרובידום בטן מורלין שונה מאוד מזו שנמצאה אצל בני האדם. יש צורך שיפור מודלים פרה-קליניים הקדם-קליני כי יש חרט מיקרובידום במעיים אנושיים. לכן, יצרנו כפול-עכברים הכוללים גם מערכת חיסונית אנושית ויציבה של מיקרובידום בטן אנושיים. תהנהן. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg) עכברים הם אחד החיות הטובות ביותר עבור הומניזציה בשל הרמה הגבוהה שלהם של הכשל החיסוני. עם זאת, חיידקים NSG ללא נבט, ומודלים שונים חשובים אחרים חיידקים שאינם מסחרית כרגע זמין. יתר על כן, הגדרות מחקר רבות אין גישה למתקני גנוביוטיקה, ועבודה תחת תנאים גנוביוטיים יכול להיות לעתים קרובות יקר זמן רב. וחשוב מכך, עכברים ללא חיידקים יש כמה ליקויים חיסוניים שקיימים גם לאחר החרט של חיידקים. לכן, פיתחנו פרוטוקול שאינו דורש בעלי חיים ללא חיידקים או מתקני גנוביוטיקה. כדי לייצר כפול-עכברים, עכברים NSG טופלו בקרינה לפני ניתוח כדי ליצור מח עצם, כבד, בלוטת התימוס-הומניזציה (hu-בייקון) עכברים. העכברים טופלו לאחר מכן עם אנטיביוטיקה ספקטרום רחב כדי לרוקן את מיקרובידום הבטן מורטין הקיים מראש. לאחר טיפול אנטיביוטי, העכברים ניתנו השתלות צואה עם דגימות של תורם אנושי בריא באמצעות gavage אוראלי. העכבר כפול-הייקון היו פרופילי הגנים הייחודיים של 16S rRNA מבוסס על מדגם התורם האנושי היחיד שהיה מושתל. חשוב מכך, המושתלת האדם כמו microbiome היה יציב בעכברים הכפול hu-בייקון למשך המחקר עד 14.5 שבועות לאחר ההשתלה.
Introduction
עכברים הומניזציה (hu-עכברים) הפכו את המחקר של היבטים רבים של בריאות האדם ומחלות כולל המטפיאה, חסינות, סרטן, מחלות אוטואימוניות, מחלה זיהומית1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. אלה-עכברים הם בעלי יתרון ברור על פני מודלים אחרים של העכבר כי יש להם מערכת פונקציונלית האדם החיסונית יכול להיות נגוע פתוגנים ספציפיים אנושיים. עם זאת, החשיבות של מיקרובידום בטן הפגינו על ידי תפקידה במחלות אנושיות רבות כגון השמנה, תסמונת מטבולית, מחלות דלקתיות, סרטן10,11,12, . שלוש עשרה המערכת החיסונית רירית ואת המעיים מיקרובידום הם הופמוטיות לשמור על בטן והומאוסטזיס מערכתית. המערכת החיסונית מעוצבת על ידי אנטיגנים המוצגים על ידי מיקרובידום המעיים ההופקלי המערכת החיסונית ממלא תפקיד רגולציה חשוב בקידום חיידקים המעיים המנוע וסילוק פתוגנים14,15, 16. עם זאת, מיקרובידום הבטן של הו-עכברים לא היה מאופיין היטב, מיקרובידום בטן murine שונה באופן משמעותי בקומפוזיציה ותפקוד מבני אדם17. זאת בשל הבדלים אבולוציוניים, פיזיולוגיים, ואנטומיים בין המורין לבטן האדם, כמו גם גורמים חשובים אחרים כגון דיאטה, אשר עשויים להשפיע על התוצאות הנסיוניות של מחלת hu-עכברים18. לכן, מעבר לסיווג של מיקרובידום בטן מורלין של hu-עכברים, מודל בעלי חיים הכולל הן מערכת חיסונית אנושית ומיקרובידום הבטן האנושית נחוצה כדי ללמוד את האינטראקציות המורכבות של מחלות אנושיות בvivo.
חקר המחלות האנושיות ישירות במקצועות האדם הוא לעתים קרובות לא מעשי או לא מוסרי. מודלים בעלי חיים רבים לא ניתן להשתמש כדי ללמוד פתוגנים אנושיים כמו וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1). מודלים של פרימטים לא אנושיים הם מחוץ גנטית, יקר מאוד, ואינם חשופים לפתוגנים אנושיים רבים. עכברים שנגזרו כמו נבט חינם (GF) ו מחדש עם האדם כמו בטן microbiomes שימשו רבות כדי ללמוד בריאות האדם מחלה19,20. עם זאת, בעלי חיים אלה אין מערכת חיסונית אנושית ועבודה עם בעלי חיים GF דורש מתקנים מיוחדים, הליכים, ומומחיות. לכן, יש צורך שיפור מודלים טרום קליניים כדי ללמוד את הקשר המורכב של המעיים מיקרובידום ואת המערכת החיסונית האנושית. זנים רבים של עכברים, כגון נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (nsg), אינם זמינים מסחרית כ-GF. בעלי חיים GF עלולים לסבול מליקויים חיסוניים ארוכי טווח שאינם מפוכים לחלוטין על ידי החרט של חיידקים21. לכן, יצרנו כפול העכברים שמציעות הן מערכת החיסון האנושי תפקודית מיקרובידום הבטן האנושי כמו המעיים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן (SPF). כדי ליצור כפול הו-עכברים, הניתוח בוצע על עכברים NSG כדי ליצור מח עצם, הכבד, עכברים הומניזציה של התימוס (hu-בייקון). העכברים של הו-בייקון טופלו לאחר מכן עם אנטיביוטיקה ספקטרום רחב ולאחר מכן נתן השתלות צואה עם דגימת תורם אנושי בריא. אנו מאופיינים את הבטן בקטריאלי מיקרובידום של 173 דגימות צואה מ 45 כפול השני עכברים ו 4 דגימות בצואה אדם התורם. עכברים כפול הייקון יש פרופילי הגנים הייחודיים של 16S rRNA מבוסס על מדגם התורם האנושי היחיד כי הוא מושתל. חשוב מכך, המושתלת האדם כמו microbiome היה יציב בעכברים למשך המחקר עד 14.5 שבועות לאחר ההשתלה. בנוסף, metagenomes החזוי הראו שלעכברים כפולים בעלי יכולת פונקציונלית שונה מאשר עכברים שדומים יותר לדגימות התורמות האנושיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן נערכו בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדת מחקר (IACUC)-פרוטוקולים מאושרים באוניברסיטת נברסקה-לינקולן (UNL). ה-IACUC ב-UNL אישר שני פרוטוקולים הקשורים להפקת ושימוש בעכברי hu-בייקון, כולל עכברים כפולים. בנוסף, מחקר מדעי הוועדה פיקוח (SROC) ב UNL אישרה גם את השימוש בתאי גזע האדם עובריים ורקמות העובר, אשר הושגו מן המשאבים Bioscience מתקדם עבור לימודי עכברים הומניזציה (SROC 2016-1-002).
1. שיכון ואחזקה של עכברים
- רכישת 6-8-שבוע עכברים NSG הישן (נוד. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj).
- בית העכברים תחת תנאי SPF עם החלפת אוויר, מסננים מראש, ו HEPA מסננים (0.22 μm) בחדר עם טמפרטורה מבוקרת, לחות, ולחץ.
- הבית ולשמור על עכברים בכלובים מיקרובודדים בודדים במערכת ארון תקשורת מסוגל ניהול האוויר עם מסננים prefilters ו HEPA מסננים (0.22 μm).
- בצע את כל ההליכים ומניפולציות של העכברים בכיתה II סוג A2 מכסה בטיחות ביולוגית כי כבר טופלו מראש עם 70% אתנול. לפני העבודה בחדר החיות, מקלחת ולשנות לתוך חלוקים נקיים, החליפה tyvek, המגף כיסויים, כובע שיער, מסכת פנים, וכפפות. ללבוש שמלת הניתוח על חליפת tyvek במהלך הליכים כירורגיים.
הערה: אולטרה סגול (UV) טיהור האור מועדף גם לפני הליכים.- האוטוקלב כל המכשירים והריאגנטים אם אפשר ולאחר מכן לחטא לפני המעבר למכסה המנוע.
- במהלך ההליכים, יש להסיר את הכלובים המאווררים באופן אינדיבידואלי מהארונות ולחטא לפני המעבר למנוע העישון.
- להאכיל את העכברים דיאטה לקרינה. ולספק מים אוטוקלבים מספקים ab libitum מזון הקרינה ותוספת עם מזון הוקרן נוסף כנדרש. מחליפים מים אוטוקלבים בשבוע או לפי הצורך.
הערה: acidified ניתן גם להשתמש במים אוטומטיים. הדיאטה שניתן לקרינה סיפקה היה חיי מדף של 6 חודשים לאחר הייצור.
2. הדור של עכבר בייקון הומניזציה
הערה: הדור של עכבר הו-בייקון תואר בעבר22,23,24.
- ביום הניתוח, לתת לעכברים את כל הגוף הקרנה במינון של 12 cGy/g של משקל הגוף.
- . הכן את העכברים לניתוח
- תן כל עכבר לקרינה מוקרן תערובת של קטמין בריכוז העבודה של 100 מ"ג/ק"ג ו Xylazine על הריכוז של 12 מ"ג/ק"ג, אשר נע מ 130-170 μL לכל עכבר מבוסס על משקל הגוף על ידי הזרקת הצפק (IP) הזרקה להרדמה. כדי להכין 3 מ ל של התערובת קטמין ו Xylazine, להוסיף 0.27 mL של קטמין בריכוז המניה של 100 mg/mL ו 0.03 mL של Xylazine על הריכוז של 100 mg/mL כדי 2.7 mL של תמיסת מלח סטרילי מערבבים היטב. חטא את העור עם 70% איזופנול לפני ההזרקה.
- תן כל עכבר מוקרן לקרינה Buprenorphine 1 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף (חצי חי 72 h, SR-LAB) על ידי הזרקה תת עורית לניהול הכאב ארוך טווח.
- תן כל עכבר מוקרן לקרינה 100 μL (858 μg) של Cefazolin על ידי הזרקת IP עבור מניעה אנטיביוטי טרום הניתוח.
- לגלח את השיער של העכברים באמצעות קוצץ שיער חשמלי סביב הצד השמאלי בצד האמצעי של העכבר באתר כירורגי מאוחר יותר השתמשו כדי לחשוף את הכליה השמאלית.
- בדוק את רמת ההרדמה הנכונה על ידי הדוושה רפלקס (צביטה הבוהן המשרד).
- אם יש צורך בהרדמה נוספת במהלך הניתוח, יש להעניק גז איפלוט ב-3-5%.
- החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית. החלת תג האוזן במידת הצורך.
- לבצע ניתוח להשתיל את הכבד רקמות התימוס לתוך קפסולת הכליה השמאלית.
- לחטא את העור באתר כירורגי על ידי החלת לקרצף יוד החל ממרכז האתר כירורגי ונעים לכיוון החוץ באופן מעגלי. חזור על תהליך זה עם 70% איזופנול ובפעם השלישית עם יוד.
- באמצעות מלקחיים, לטעון תחילה 1 רקמת הגוף האדם משבר לתוך trocar. ואז באמצעות מלקחיים, לטעון שבר אחד העובר התימוס האנושי לתוך המכונית. ולאחר מכן שימוש מלקחיים, לטעון שבר אחר של רקמת האדם העוברי לתוך המכונית. רקמות צריך להיות גזור 1-1.6 מ"מ3 כדי להתאים את הממדים הפנימיים של trocar.
- מלקחיים להשתמש כדי להרים את העור ולהשתמש במספריים כדי להפוך חתך קטן longitudinally. הארך את החתך ל-1.5-2 ס מ בצד השמאלי של העכבר.
- מלקחיים להשתמש כדי להרים את שכבת השריר ולהשתמש במספריים כדי להפוך חתך קטן longitudinally. הארך את החתך בהתאם לצורך כדי לחשוף את הכליה.
- לחשוף את הכליה על ידי האוחז בעדינות את רקמת השומן סביב הכליה. אל תגעו במישרין בכליה.
- הפוך את חתך 1-2 מ"מ בקצה האחורי של קפסולת הכליה באמצעות אזמל.
- הכנס לאט את המכונית הטעונה מראש דרך החתך המקביל לציר הארוך של הכליה ושחררו את הרקמות בין קפסולת הכליה לכליה.
- החזר בזהירות את הכליה. והמעיים לעמדתם הרגילה שימוש נספג 5/0 P-3 (P-13) תפרים עם 13mm 3/8 מעגל המחט כדי לסגור את שכבת השריר וסיכות כירורגי כדי לסגור את העור.
- לאחר הניתוח, לשים את העכבר לתוך כלוב נקי מיקרובודדים המיקרו להתאוששות.
- כדי למזער את אובדן החום במהלך ההתאוששות לאחר ניתוח, לשים את הכלוב המכיל את העכברים על משטח חימום כי הוא מחובר למשאבת מים כי מחמם ומסחררת את המים.
- מפקחים על העכברים עד שחזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה.
- בתוך 6 h של השלמת הניתוח, דרך הזנב-וריד, להזריק CD34 + תאי גזע המטפאות מבודדים מרקמת הגוף האנושי העובר.
- לחמם את העכברים עם מנורת חום. לחטא את הזנב עם 70% איזופנול ולאחר מכן להזריק 1.5 כדי 5 × 105 תאי גזע/200 μl לתוך הווריד הזנב.
- הפסיקו את הדימום מהזריקה והעכברים החוזרים לכלוב המיקרו-מבודדים ולכלוב המיקרו-מבודדים למדף הכלוב.
הערה: עכברים שלאחר הניתוח מוחזקים יחד בדרך כלל, חמישה כלוב של מיקרובודדים, במהלך ההחלמה ולאחריה. עם זאת, עכברים מוחזקים יחד רק אם כולם קיבלו ניתוח באותו יום.
- . תבדקו את העכברים מדי יום עקוב בזהירות אחר הסיכות הכירורגית והחלף אותם לפי הצורך. עקוב בקפדנות אחר העכברים לכל סימן של זיהום או אי נוחות. לספק מזון אוטוקלע על הרצפה של הכלוב מיקרובודדים לאחר כמה ימים לאחר הניתוח.
- הסר את הסיכות כירורגי 7-10 ימים לאחר הניתוח. . להחזיר את העכברים לידי ב3-5 הסר בזהירות את הסיכות ולאחר מכן החל משחה אנטיביוטית וכאבים להקלה על האתר.
- אפשר 9-12 שבועות לחוקה של תאי החיסון האנושיים, ולאחר מכן לאסוף דם היקפי מן הווריד saphenous האמצעי מכל העכברים ההומניזציה.
- לרסן עכברים מודע באמצעות איפוק בגודל כראוי חרוט פלסטיק עם פתח ליד הראש של העכבר לנשימה ופתיחה ליד החלק האחורי של העכבר כדי לבודד רגל אחת. לשים את העכברים לתוך ראש חרוט האיפוק הראשון ולאחר מכן בעדינות למשוך רגל אחת דרך פתיחת הרגל.
- רסס את הצד האמצעי של הרגל הבודדת עם 70% איזופנול, ולאחר מכן פזר אנטיביוטיקה ומשחה להקלה על כאבים באותו אתר.
הערה: המשחה מסייעת לחשוף את מיקום הווריד ללא צורך בהסרת שיער ומסייעת גם ביצירת droplet דם. - באמצעות מחט 25-מד בזווית 90 °, נקב את הווריד ולאסוף 50-100 μL של דם באמצעות צינור מצופה דם EDTA מצופים. לעצור את הדימום על ידי הפעלת לחץ על האתר עם גזה סטרילית. , ברגע שהדימום נפסק. החזר את העכברים לכלוב שלהם
הערה: נפח הדם המרבי שנאסף הם בדרך כלל 50 μL לכל שבוע או 100 μL כל שבועיים. - השתמש בדם היקפי שנאסף כדי לבדוק את רמת תא החיסון האנושי מחדש באמצעות הזרמת cy, hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. טיפול אנטיביוטי
- לפני טיפול אנטיביוטי, לאסוף דגימות מראש טיפול בצואה. הזיזו את העכברים לכלוב חדש. של מיקרובודדים
- הכינו קוקטייל טרי של אנטיביוטיקה רחבה מדי יום.
- הכינו 250 mL של מים המכילים מטרוניאזול טריים (1 g/L), Neomycin (1 g/L), ואנקומיצין (0.5 g/L), ו-אמפיצילין (1 g/L) עבור כל כלוב מיקרודלטור של עכברים.
הערה: השתמש באוטוקלבד או במים סטריליים עבור אנטיביוטיקה שנוספו מי שתייה. - הוסף 9.2 גרם של סוכר ענבים ממותק תערובת כדי 250 mL של המים לאנטיביוטיקה בתוספת.
הערה: השימוש בסוכר ענבים ממותק לערבב מסכות את הטעם המר של אנטיביוטיקה ומסייע למנוע התייבשות בעכברים. - שנה את האנטיביוטיקה ואת הסוכר ענבים ממותק לשתות לערבב מים ומניחים את העכברים בכלוב אוטוקלאובי חדש מדי יום.
הערה: עכברים הם שלובים ומחליפים את הכלובים מדי יום, מונעים מהעכברים לחדש את עצמם בעזרת חיידק המעיים. - לקבלת העפילה המקסימלי של מיקרובידום הבטן האנושית, יש לספק אנטיביוטיקה למשך 14 ימים. במהלך טיפול אנטיביוטי, לפקח על העכברים לירידה במשקל והתייבשות. ירידה במשקל צפוי במהלך הראשון 3-4 ימים ומישורים אחרי זה למשך הטיפול. אם התייבשות מתרחשת, לתת את העכברים תמיסת מלח או פתרון Ringers באמצעות הזרקת הצפק.
הערה: בנוסף, מנגנוני הgavage מיקרועיים מתקשרים לטיפול אוראלי של אנטיביוטיקה. בעוד יעיל בשנת מכלה את חיידק הבטן murine, מצאנו כי השיטה פחות פולשנית של הוספת אנטיביוטיקה למים השתייה לשים לחץ פחות על העכברים שלנו הומניזציה והובילו תוצאות טובות יותר.
- הכינו 250 mL של מים המכילים מטרוניאזול טריים (1 g/L), Neomycin (1 g/L), ואנקומיצין (0.5 g/L), ו-אמפיצילין (1 g/L) עבור כל כלוב מיקרודלטור של עכברים.
4. דגימות תורם והשתלת צואה
- הכינו דגימות של. בצואה של תורם אנושי
- השתמש מקורות מוכנים כראוי של השתלת מיקרוביוטה צואה (FMT) חומר עבור השתלת צואה לתוך העכברים ההומניזציה.
- הפשרת fmt ההכנות ו סדרת מחלקים אותם תחת תנאים אנאירובית בחדר אנאירובי.
- אם רצונך בכך, בשלב זה תערבב חלקים שווים של דגימות צואה יחד כדי ליצור דוגמה "אנושית" משוחדת.
- לשמור על הקפאת ולהפשיר את החומר FMT למינימום, אם מצטט או ערבוב של דגימות אינו נחוץ, רק להפשיר מיד לפני ההליך.
- השתלת צואה של אדם
- לאחר השלמת טיפול אנטיביוטי 14 ימים, לשנות את מי השתייה למים אוטוקלבים ולהעביר את העכברים לתוך כלוב אוטוקלאובי חדש. להפסיק שינויים בכלוב היומי וליישם פעם אחת כל 1-2 שבועות כלוב לשנות את לוח הזמנים.
- תן שני השתלות צואה ב 24 ו 48 h הפסקה פוסט של אנטיביוטיקה.
- 24 שעות לאחר טיפול אנטיביוטי, להפשיר את הכמות הדרושה של חומר FMT, לתת לכל עכבר 200 μL של חומר FMT דרך אוראלי gavage. חזור על ההליך שוב ב 48 h הודעה אנטיביוטיקה.
- פזר את החומר שנותר או שאריות FMT המופשרים על פרוות העכברים ההומניזציה או על מצע הכלוב.
5. אוסף טרי מדגם הצואה
- שקיות נייר אוטוקלב בודדות לפני המעבר למכסה המנוע.
- בתוך מכסה המנוע, לשים עכבר אחד לתוך שקית נייר בודדת ולאפשר לעכבר להפריש.
- באמצעות מלקחיים סטרילי, לאסוף את דגימת צואה לתוך צינורות פלסטיק 1.5 mL להקפיא ב-80 ° c. החזר את העכברים. לכלובים מיקרובודדים
הערה: שיטה זו של איסוף דגימות צואה מאפשר איסוף מדגימת צואה טרי מעכברים בודדים ללא כל מאמץ לגרימת לחץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג חלוקה לרמות של השיטות המשמשות ליצירת עכברי hu-בייקון כפולים ומתאר בקצרה את התהליך של הוספת מערכת חיסונית אנושית תפקודית ויציבה מיקרוביבה של האדם לעכברים nsg. איור 2 מראה דוגמה של הזרימה cy, לנסות ניתוח דם היקפי מעכבר בייקון הומניזציה 10 שבועות לאחר הניתוח. איור 3 מראה את השפע היחסי של הדגימות בצואה האנושית המשמש להעברת מיקרובידום בטן כדי ליצור שני עכברים. איור 4 מציג את השינויים פנוהופי הנגרמת על ידי טיפול אנטיביוטי לטחול ו cecum, בדומה למה שנצפה בחיות ללא חיידקים. איור 5 מראה ניתוח המרכיב העיקרי (pca) העלילה של 16 s rrna נתוני רצף הנתונים חשיפת כפול hu-עכברים יש מיקרו-המעיים של בני אדם, כי הם ייחודיים למדגם התורם האנושי.
איור 1 : יצירת הומניזציה כפולה עכברים. יצירת עכברים כפולים של הו-בייקון היא תהליך בן שני שלבים. הצעד הראשון הוא לאחד את המערכת החיסונית האנושית לעכברים NSG. ביום הניתוח, עכברים NSG מקבלים הקרנה כדי ליצור נישה עבור תאי גזע. העכברים מושתלים אז עם הכבד עוברי האדם רקמות בלוטת התימוס והזריקו עם האדם תאים גזע המטפי. המערכת החיסונית של התא האנושי מסומנת בסביבות 10 שבועות לאחר הניתוח. הצעד השני הוא לחתוך. את המעיים האנושיים עכברים מטופלים עם אנטיביוטיקה כדי להפחית את הקיים מראש החיידק murine הבטן. עכברים מקבלים לאחר מכן השתלות צואה כדי לספק את הבטן האנושית microbiome. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : בדיקת תא החיסון האנושי מחדש באמצעות כפול ועכברים הומניזציה. דוגמה של הזרימה cy, לנסות ניתוח של הומניזציה העכבר דם היקפי 10 שבועות לאחר הניתוח. האיור מציג את אסטרטגיית האתר המשמשת לזיהוי אוכלוסיית הלימפוציטים, mCD45-hCD45 + תאים, CD19 + B תאים, CD3 + T תאים, CD4 + T תאים, ו CD8 + T תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הפרופילים האנושיים לדוגמה בצואה. השפע היחסי של שלוש התורמות האנושיות והמעורבות (כל התורמים) המוצגים ברמת המשפחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : עכברים התייחסו לאנטיביוטיקה דומה הפנוטיפים ללא חיידקים. הו-עכברים הוקרבו לאחר 9 ימים של טיפול אנטיביוטי (אנטיביוטיקה) או לא טיפול אנטיביוטי (שליטה). לאחר טיפול אנטיביוטי, הפנוטיפ של העכברים ההומניזציה מתחיל להידמות לאלה הנראים בחיות ללא חיידקים. כתוצאה של טיפול אנטיביוטי יש ירידה בגודל של הטחול (שמאל) ו מעי הוא מוגדל (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : כפול הומניזציה בייקון-עכברים תכונה התורם בצואה הספציפי מיקרובימס. PCA מגרש של 16 s rRNA רצף נתונים להראות לאחר השתלת צואה האדם העכברים הכפול hu-בייקון תכונה מיקרובימס במעיים הייחודיים לתורם האדם היחיד בצואה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא ליצירת עכברים כפול-בייקון התכונה הן המערכת החיסונית האנושית תפקודית ויציבה אנושי כמו בטן microbiome. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למודלים אחרים של עכברים או שאינם הומניזציה ללא צורך בעלי חיים GF ומתקני גנוביוטיקה. בעוד שהשיטות המתוארות כאן הן פשוטות יחסית, קיימות מספר פרטים קריטיים החשובים ליצירה מוצלחת של עכברים כפולים משני הסוגים. עכברים NSG הם מאוד חיסוני ומניעת זיהומים הוא המפתח להישרדות לטווח ארוך של העכברים. לקחנו את הצעדים הבאים כדי למנוע זיהום. ראשית, בעלי חיים שוכנו בכלובים מיקרובודדים בודדים עם מסנני HEPA (0.22 μm) במערכת ארון תקשורת עם ניהול שער החליפין בסוויטה ייעודית. המטפל באוויר עבור ארון התקשורת הכיל טרום מסננים יחד עם HEPA מסוננים (0.22 μm) אספקת אוויר פליטה, כמו גם בזמן אמת ניטור מקוון של טמפרטורת האוויר פליטה בכלוב ולחות יחסית. שנית, כל מי נכנס לחדר החיות היה צריך להתקלח וללבוש מדים נקיים ונעליים, כמו גם לשים על כפפות, חליפת tyvek חד פעמי, נעלי בית, כובע שיער, ומסכת פנים. שלישית, כל ההליכים, כולל שינויי כלוב ותוספת של מזון ומים, בוצעו בתוך Class II סוג A2 בטיחות ביולוגית מתחת למים שהיה מראש מעוקר עם 70% אתנול ואור UV. 4, טכניקה כירורגית אספטי שימש במהלך ניתוח הישרדות, אשר כללה את המנתח ועוזרים לובש שכבה נוספת של הגנה כולל שמלת ניתוח וכפפות. הניתוח נערך במנוע החיטוי, תוך שימוש בכלים סטריליים בלבד, בחומרי הסגר ובפצע, תוך שמירה על עקרות הכפפות והכלים במהלך הניתוח. בסופו של דבר, כדי למנוע זיהום ולהבטיח את יציבותו של מיקרובידום הבטן האנושית הדומה, כל המזון והמים שניתנו לעכברים היה עקר. כל האוכל צריך להיות מוקרן. וכל המים צריכים להיות אוטומטיים כדי למזער את הכאב והמצוקה, הצלחנו למנוע מתת-עורי לעכברים לפני הניתוח. השילוב של קטמין ו Xylazine עבור הרדמה כירורגית העכבר הוא מאוד אמין והוא יכול להימשך 30 דקות. אם זה לא מספיק זמן, אנחנו נותנים גז. כדי להוסיף עוד למטה את העכברים זה גם חשוב מאוד לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר לאחר הניתוח. עד הזרקת תא הגזע המטפי. דרך העורק האחורי באותו זמן, העכברים משוחזרים מהרדמה וחזרו למדף.
כדי לרוקן את הבטן murbiome ולהתכונן השתלת צואה אנושית, חשוב תמיד להשתמש באנטיביוטיקה טרי מוכן לשנות אנטיביוטיקה שנוספו מים וכלובים מדי יום. זה יהיה להשתמש בכלובים מיקרובודדים רבים לאורך 14 יום טיפול אנטיביוטי, אבל זה מבטיח את העכברים אינם מחוסן מחדש דרך coprophagia. במהלך טיפול אנטיביוטי, זה גם קריטי כדי לפקח על משקל הגוף והבריאות של העכברים. לאחר השתלת צואה, העכברים במהירות להחזיר כל משקל אבוד. חשוב למזער כל מחזורי הקפאת ההפשרה לחומר השתלת צואה, כדי לוודא להשתמש בחדר אנאירובי אם יש צורך בדגימות. בעוד יצירת עכברים כפולים כפול הוא חשוב למזער את הטיפול והלחץ המושרה על העכברים. זה עוזר למנוע זיהום ומשפר את ההישרדות לטווח ארוך.
בתחילה ניסינו לטפל מראש עכברים עם אנטי פטרייתי אמפוריטיצין B אבל מצאו את העכברים לא לסבול את הטיפול היטב והוא כבר לא בשימוש. אנו גם ניסויים עם משכים שונים של טיפול אנטיביוטי. מצאנו כי בעוד שרוב החיידקים מורטין נראה לרוקן לאחר 7 ימים של אנטיביוטיקה, רמת התרומה של התורם גבוה הרבה יותר לאחר 14 ימים של טיפול. ניסינו גם מתן אנטיביוטיקה דרך gavage אוראלי פעמיים ביום. עם זאת, גילינו כי שיטה זו הייתה פולשנית מדי עבור העכברים שלנו. החלפנו יום אחד gavage לוח זמנים אבל העכברים עדיין נראה לחוץ ולא בריא. מצאנו שמתן אנטיביוטיקה במים השתייה היה השיטה הטובה ביותר. היא הפחיתה את הטיפול בכמות והלחץ על העכברים תוך כדי הפחתת כראוי את חיידק הבטן murine. סיפקנו סוכר ענבים ממותק משקה לערבב במים השתייה כדי להבטיח את העכברים קיבלו מינון הולם של אנטיביוטיקה כדי למנוע התייבשות. העכברים לעשות הפחתה במשקל הגוף במהלך הראשון 3-4 ימים של טיפול אנטיביוטי, אבל מתן נוזלים נוספים באמצעות הזרקה תוך הצפק לא להגדיל את משקל הגוף. לאחר השתלת צואה, העכברים במהירות להחזיר את המשקל האבוד.
בעוד שיטה זו היא מסוגלת להפיק באופן מידי לייצר עכברים כפולים hu-בייקון, יש כמה מגבלות על המודל. הדבר הראשון שיש לשקול הוא hu-עכברים יש מבנה פחות מאורגן הלימפה, כולל מרכז נבטי, המוביל ברמה מופחתת נוגדן מיתוג והתבגרות אהדה מוגבלת. עם זאת, עכברים NSG-בייקון יש מערכת חיסונית מערכתית לתרגום תגובות התא T ניתן להשתמש כדי לדגמן מחלות אנושיות רבות. בעיה נוספת היא הפיתוח הפוטנציאלי של השתל-מול-מארח מחלה (GVHD) חלק כמה עכברים לאחר מספר חודשים של המערכת החיסונית האנושית מוגזמת. אנחנו ואחרים הבחנו בביטויים GVHD כגון blepharitis, התקרחות, ירידה במשקל, מניעת הסגר כי יש לפקח בזהירות25.
קיימים מספר משטרי מתועד עבור חיידקים מתכלים של המעיים בעכברים עם אנטיביוטיקה26,27,28,29,30,31. בחרנו את קוקטייל האנטיביוטיקה שלנו בשל היכולת הידועה שלהם למקד מגוון רחב של חיידקים בבטן ומכיוון שמצאנו כמה דוגמאות של דלדול חיידקי מוצלח בספרות. הרבה מקרים שפורסמו משתמשים במסלול הרבה פחות קפדני של אנטיביוטיקה אבל במחקר שלנו, מצאנו כי 14 ימים יש צורך לקבלת העפיל האופטימלי של מיקרובידום בטן אדם כמו. בזמן שניסינו בתחילה פרוטוקול המבוסס על הינטסה אל., מצאנו כי gavage אוראלי היה פולשני מדי, כי טיפול אנטי פטרייתי היה מזיק עכברים26. אנו מאמינים כי עכברים NSG-בייקון הם הליכים ייחודיים פחות פולשנית הם העדיפו לעומת עכברים חזקים יותר. אנחנו לא השתמשו בחיות GF במחקר שלנו. השימוש עכברים GF ללמוד את ההשפעות של המעיים מיקרובידום היו מתועדים היטב, עם זאת, בעלי חיים אלה אין מערכת חיסונית אנושית19,32. יתר על כן, אנו מודים כי העבודה עם מודל העכברים GF NSG הוא הזדמנות ליצור הזדמנויות מעניינות למחקר. עבור אחד, לימוד תא החיסון האנושי מחדש את הפתוגנזה של פתוגנים ספציפיים אנושיים כמו HIV-1 ללא נוכחות של מיקרובידום בטן יכול לספק תוצאות מעניינות. יתר על כן, מודלים GF עשוי לאפשר החוקה מלאה יותר של מיקרוביאט של אדם כמו בטן בעקבות השתלת צואה. עם זאת, לעכברים GF יש ליקויים החיסונית לטווח ארוך, גם לאחר המעיים מיקרובידום21מחדש. המודל שלנו יש את היתרון של שימוש בתנאי דיור SPF, אשר זמינים באופן נרחב פחות יקר לעומת מתקני GF. המודל שלנו גם יש את היתרון של לא perturbing את ההליכים הנורמליים של מחולל כירורגי עכברים hu כי אין צורך בסביבה GF לחלוטין.
אנו מאמינים זה מודל העכבר הכפול hu-המבורגר הוא ייחודי בכך שהוא לא רק יכול לשמש כדי ללמוד את תפקוד האדם החיסוני ואת מחלות האדם, אבל גם לקבוע את ההשפעה של מיקרובידום בטן על המחלה פתוגנזה וטיפול vivo. עם הפרוטוקול הזה, אנחנו יכולים ליצור באופן כפול בייקון עכברים עם התורם האנושי מיקרוביזום פרופילים מסוימים. לכן, אנו מאמינים כי השימוש בעכבר כפול הייקון השני יהיה מועיל ליישומים בעתיד תרופות אישיות שנועדו לבחון את ההשפעה של מיקרובידום המעיים על טיפולים עבור מחלות אנושיות שונות כמו HIV-1 וסרטן. לסיכום, הדגם הכפול שלנו מודל עכברים הוא מודל חשוב והרומן טרום קליני התכונות הן מערכת החיסונית האנושית תפקודית מיקרובידום בבטן אנושית יציבה כמו ללמוד בריאות האדם ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו רוצים להודות ליאנמין וואן, לגוקובין קאנג, ולפלאבי קונדו לעזרתם ביצירת עכברים הוממיזציה. היינו רוצים להכיר את UNMC מתקן ליבה גנומיקה אשר מקבל תמיכה חלקית מרשת מחקר נברסקה ב גנומיקה תפקודית NE-INBRE P20GM103427-14, הביולוגיה המולקולרית של מערכות נוירוחושי CoBRE P30GM110768, פרד & פמלה מרכז הסרטן באפט-P30CA036727, המרכז של שורש ו ריזובידום חדשנות (CRRI) 36-5150-2085-20, ואת היוזמה נברסקה מחקר. אנחנו רוצים להודות לאוניברסיטת נברסקה-באגף מדעי החיים לינקולן הצוות שלהם על עזרתם. מחקר זה נתמך בחלק על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 כרונית נגיף ההזדקנות במרכז neuroaids (שרשרת), 1R01AI111862 ל Q לי. לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, הכנת כתב היד או ההחלטה לפרסום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
