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Biochemistry

एक डबल मानवीय BLT-mice मॉडल एक स्थिर मानव की तरह गट Microbiome और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की विशेषता

doi: 10.3791/59773 Published: August 30, 2019

Summary

हम डबल मानवीय BLT-mice कि एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और एक स्थिर engrafted मानव की तरह आंत microbiome सुविधा पैदा करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का पालन रोगाणु मुक्त चूहों या gnotobiotic सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है.

Abstract

मानवीकृत चूहों (हू-मीस) जो एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की सुविधा है, ने मूल रूप से मानव रोगजनकों और रोग के अध्ययन को बदल दिया है। वे मॉडल रोगों है कि अन्यथा मुश्किल या मनुष्यों या अन्य पशु मॉडल में अध्ययन करने के लिए असंभव हैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आंत microbiome मानव स्वास्थ्य और रोग पर गहरा प्रभाव हो सकता है. हालांकि, murine आंत microbiome मनुष्य में पाया एक से बहुत अलग है.  वहाँ एक engrafted मानव आंत microbiome है कि सुधार पूर्व नैदानिक hu-mice मॉडल के लिए एक की जरूरत है. इसलिए, हम डबल hu-mice कि दोनों एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और स्थिर मानव की तरह आंत microbiome सुविधा बनाया. मंजूरी. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WJ/SzJ /SzJ (NSG) चूहों इम्यूनोडेफिशियेंसी के अपने उच्च स्तर के कारण मानवीकरण के लिए सबसे अच्छा जानवरों में से एक है। हालांकि, रोगाणु मुक्त एनएसजी चूहों, और विभिन्न अन्य महत्वपूर्ण रोगाणु मुक्त चूहों मॉडल वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं. इसके अलावा, कई अनुसंधान सेटिंग्स gnotobiotic सुविधाओं के लिए उपयोग नहीं है, और gnotobiotic शर्तों के तहत काम कर रहे अक्सर महंगा हो सकता है और समय लगता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि रोगाणु मुक्त चूहों में कई प्रतिरक्षा कमियां होती हैं जो रोगाणुओं के engraftment के बाद भी मौजूद हैं। इसलिए, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसमें रोगाणु-मुक्त पशुओं या gnotoबायोटिक सुविधाओं की आवश्यकता नहीं होती है। डबल hu-mice उत्पन्न करने के लिए, NSG चूहों हड्डी मज्जा बनाने के लिए सर्जरी से पहले विकिरण के साथ इलाज किया गया, जिगर, थाइमस-मानवीकृत (हू-BLT) चूहों. चूहों तो व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज के लिए पूर्व मौजूदा murine आंत microbiome deplete थे. एंटीबायोटिक उपचार के बाद, चूहों मौखिक gavage के माध्यम से स्वस्थ मानव दाता नमूने के साथ मल प्रत्यारोपण दिया गया. डबल hu-BLT चूहों अद्वितीय था 16S rRNA जीन प्रोफाइल व्यक्तिगत मानव दाता नमूना है कि प्रतिरोपित किया गया था के आधार पर. महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्यारोपण के बाद 14.5 सप्ताह तक अध्ययन की अवधि के लिए डबल हू-बीएलटी चूहों में प्रतिरोपित मानव की तरह माइक्रोबायोम स्थिर था।

Introduction

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मानवीकृत चूहों (हू-मीस) ने हेमेटोपोइसिस, प्रतिरक्षा, कैंसर, ऑटोम्यून्यून रोग, और संक्रामक रोग1,2,3,4 सहित मानव स्वास्थ्य और रोग के कई पहलुओं के अध्ययन को बदल दिया है ,5,6,7,8,9. इन hu-mice अन्य माउस मॉडल पर विशिष्ट लाभ है कि वे एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली है और मानव विशिष्ट रोगजनकों से संक्रमित किया जा सकता है. फिर भी, आंत microbiome के महत्व को मोटापे, चयापचय सिंड्रोम, सूजन रोगों, और कैंसर10,11,12, जैसे कई मानव रोगों में अपनी भूमिका के द्वारा प्रदर्शन किया गया है, 13. म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रणाली और आंत माइक्रोबायोम आंत और प्रणालीगत होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए पारस्परिक रूप से विनियमित होते हैं। प्रतिरक्षा प्रणाली आंत microbiome द्वारा प्रस्तुत प्रतिजनों द्वारा आकार का है और पारस्परिक रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली commensal आंत बैक्टीरिया को बढ़ावा देने और रोगजनकों को नष्ट करने में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाता है14,15, 16.तथापि, हू-मीस के आंत माइक्रोबायोम की अच्छी विशेषता नहीं है और मौरीन आंत माइक्रोबायोम मनुष्यों से संरचना और कार्य में काफी भिन्न है17. यह यूरीन और मानव आंत के साथ-साथ आहार जैसे अन्य महत्वपूर्ण कारकों के बीच विकासवादी, शारीरिक और शारीरिक अंतर के कारण होता है, जो हू-मीस रोग मॉडल18के प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, हू-मीस के म्यूरिन आंत माइक्रोबायोम के वर्गीकरण से परे, एक पशु मॉडल जिसमें मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और मानव आंत माइक्रोबायोम दोनों की विशेषता है, विवो में मानव रोग के जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है।

मानव विषयों में सीधे मानव रोगों का अध्ययन अक्सर अव्यावहारिक या अनैतिक है. कई पशु मॉडल मानव इम्यूनोडेफिशियेंसी वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) जैसे मानव रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। गैर-मानव प्राइमेट मॉडल आनुवंशिक रूप से बाहर निकल रहे हैं, बहुत महंगे हैं, और कई मानव रोगजनकों के लिए अतिसंवेदनशील नहीं हैं। जिन चूहों को रोगाणु मुक्त (जीएफ) के रूप में व्युत्पन्न किया गया है और मानव जैसे आंत माइक्रोबायोम के साथ पुनर्गठित किया गया है, का व्यापक रूप से मानव स्वास्थ्य और रोग का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है19,20. हालांकि, इन जानवरों को एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं है और GF जानवरों के साथ काम करने के लिए विशेष सुविधाओं, प्रक्रियाओं, और विशेषज्ञता की आवश्यकता है. इसलिए, आंत microbiome और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली के जटिल संबंध का अध्ययन करने के लिए सुधार पूर्व नैदानिक मॉडल के लिए एक की जरूरत है. चूहों के कई उपभेदों, इस तरह के एनओडी के रूप में. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WJl/SzJ (NSG), GF के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। GF पशुओं को भी लंबे समय तक चलने वाली प्रतिरक्षा की कमी है कि पूरी तरह से रोगाणुओं21के engraftment द्वारा उलट नहीं कर रहे हैं से पीड़ित हो सकता है. इसलिए, हमने एक डबल हू-मीस बनाया जिसमें एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और विशिष्ट रोगजनक मुक्त (एसपीएफ) शर्तों के तहत स्थिर मानव-जैसे आंत माइक्रोबायोम दोनों की विशेषता है। डबल हू-मोइस उत्पन्न करने के लिए, हड्डी मज्जा, जिगर, थाइमस मानवीय चूहों (हू-BLT) बनाने के लिए एनएसजी चूहों पर सर्जरी की गई थी। हू-BLT चूहों तो व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया और फिर एक स्वस्थ मानव दाता नमूने के साथ मल प्रत्यारोपण दिया. हम 45 डबल हू-BLT चूहों और 4 मानव मल दाता नमूनों से 173 मल नमूनों के जीवाणु आंत microbiome विशेषता. डबल hu-BLT चूहों अद्वितीय 16S rRNA जीन प्रोफाइल व्यक्तिगत मानव दाता नमूना है कि प्रतिरोपित किया जाता है के आधार पर है. महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्यारोपण के बाद 14.5 सप्ताह तक अध्ययन की अवधि के लिए चूहों में प्रतिरोपित मानव की तरह माइक्रोबायोम स्थिर था। इसके अलावा, भविष्यवाणी metagenomes से पता चला है कि डबल hu-BLT चूहों हू-मोस है कि अधिक मानव दाता के नमूने के समान है की तुलना में कार्यात्मक क्षमता की भविष्यवाणी की है.

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Protocol

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यहाँ वर्णित सभी तरीकों नेब्रास्का-Lincoln (UNL) के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और अनुसंधान समिति (IACUC) को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया. यूएनएल में आई ए सी सी सी ने हू-बीएलटी चूहों के उत्पादन और उपयोग से संबंधित दो प्रोटोकॉलों को मंजूरी दे दी है, जिनमें डबल हू-मीस भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, संयुक्त राष्ट्र में वैज्ञानिक अनुसंधान निगरानी समिति (एसआरओसी) ने मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और भ्रूण ऊतकों के उपयोग को भी मंजूरी दे दी है, जो मानवीकृत चूहों के अध्ययन के लिए उन्नत जैव विज्ञान संसाधन से खरीदे जाते हैं (SROC] 2016-1-002).

1. चूहे आवास और रखरखाव

  1. खरीद 6-8 सप्ताह पुराने NSG चूहों (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WJl/
  2. नियंत्रित तापमान, आर्द्रता, और दबाव के साथ एक कमरे में हवा विनिमय, prefilters, और HEPA फिल्टर (0.22 डिग्री मी) के साथ SPF शर्तों के तहत चूहों घर.
    1. घर और prefilters और HEPA फिल्टर (0.22 m) के साथ हवा के आदान-प्रदान के प्रबंधन में सक्षम एक रैक प्रणाली में autoclaved व्यक्तिगत microisolator पिंजरों में चूहों को बनाए रखने.
  3. एक वर्ग द्वितीय प्रकार A2 जैविक सुरक्षा धूआं हुड है कि 70% इथेनॉल के साथ पूर्व इलाज किया गया है में चूहों के सभी प्रक्रियाओं और जोड़तोड़ प्रदर्शन करते हैं। पशु के कमरे में काम करने से पहले, स्नान और स्वच्छ scrubs, tyvek सूट, बूट कवर, बाल टोपी, चेहरा मुखौटा, और दस्ताने में बदल जाते हैं. शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के दौरान tyvek सूट पर एक सर्जरी गाउन पहनें।
    नोट: पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश decontamination भी प्रक्रियाओं से पहले पसंद किया जाता है.
    1. यदि संभव हो तो सभी उपकरणों और अभिकर्मकों को ऑटोक्लेव करें और फिर धूआं हुड को स्थानांतरित करने से पहले कीटाणुरहित करें।
    2. प्रक्रियाओं के दौरान, धुएं के हुड में स्थानांतरित करने से पहले रैक से जानवरों के व्यक्तिगत हवादार पिंजरों को हटा दें और कीटाणुरहित करें।
  4. चूहों को एक विकिरणयुक्त आहार खिलाएं और ऑटोक्लेव्ड पानी प्रदान करें। विकिरणित भोजन ab libitum प्रदान करें और जरूरत के रूप में अतिरिक्त विकिरणित भोजन के साथ पूरक. ऑटोक्लेव्ड पानी साप्ताहिक या आवश्यकतानुसार बदलें।
    नोट: Autoclaved अम्लीकृत पानी भी इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रदान की विकिरणित आहार निर्माण के बाद 6 महीने की एक शेल्फ जीवन था.

2. मानवीय बीएलटी चूहों की पीढ़ी

नोट: हू-BLT चूहों की पीढ़ी पहले वर्णित किया गया है22,23,24.

  1. सर्जरी के दिन, चूहों पूरे शरीर विकिरण की एक खुराक पर दे 12 cGy /
  2. सर्जरी के लिए चूहों को तैयार करें।
    1. प्रत्येक विकिरणित माउस को 12 मिलीग्राम/किलोग्राम की सांद्रता में 100 मिलीग्राम/किलोग्राम और Xylazine की कार्य सांद्रता पर केटामाइन का मिश्रण दें, जो शरीर के वजन के आधार पर 130-170 डिग्री सेल्सियस से लेकर संज्ञाहरण के लिए शरीर के वजन के आधार पर 130-170 डिग्री सेल्सियस से लेकर था। केटामाइन और Xylazine मिश्रण के 3 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 100 मिलीग्राम/एमएल और 0.03 एमएल Xylazine के स्टॉक एकाग्रता पर केटामाइन के 0.27 एमएल को 100 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता में जोड़ें और 2.7 एमएल बाँझ नमकीन के लिए। इंजेक्शन से पहले 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ त्वचा को संक्रमित करें।
    2. प्रत्येक विकिरणित माउस Buprenorphine 1 मिलीग्राम / किलो शरीर के वजन (आधा रहते 72 एच, एसआर-लैब) लंबे समय तक चलने वाले दर्द प्रबंधन के लिए subcutaneous इंजेक्शन द्वारा दे।
    3. प्रीऑपरेटिव एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस के लिए आईपी इंजेक्शन द्वारा सेफाजोलिन के प्रत्येक विकिरणित माउस 100 जेडएल (858 डिग्री ग्राम) दें।
    4. बाद में बाईं गुर्दे का पर्दाफाश करने के लिए इस्तेमाल किया शल्य चिकित्सा साइट पर माउस के बाएं पार्श्व और मध्यस्थ पक्ष के आसपास बिजली के बाल क्लिपर का उपयोग कर चूहों के बाल दाढ़ी.
    5. पेडल पलटा (फर्म टो चुटकी) द्वारा संज्ञाहरण के उचित स्तर की पुष्टि करें।
    6. सर्जरी के दौरान किसी भी बिंदु पर अतिरिक्त संज्ञाहरण की जरूरत है, तो 3-5% पर isoflurane गैस दे।
    7. कॉर्निया शुष्कता को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मलम लागू करें। यदि आवश्यक हो तो कान टैग लागू करें।
  3. बाएं गुर्दे के कैप्सूल में जिगर और थाइमस ऊतकों को प्रत्यारोपित करने के लिए सर्जरी करें।
    1. शल्य चिकित्सा स्थल के केंद्र से शुरू आयोडीन स्क्रब लगाने और एक परिपत्र तरीके से बाहर की ओर बढ़ने से शल्य साइट पर त्वचा को संक्रमित करें। इस प्रक्रिया को 70% आइसोप्रोपेनोल और तीसरी बार आयोडीन के साथ दोहराएं।
    2. संदंश का उपयोग करना, पहले एक trocar में एक मानव भ्रूण जिगर ऊतक टुकड़ा लोड. फिर forceps का उपयोग कर, एक मानव भ्रूण थाइमस ऊतक टुकड़ा trocar में लोड. फिर forceps का उपयोग कर, trocar में एक और मानव भ्रूण जिगर ऊतक टुकड़ा लोड. ऊतकों को ट्रोकार के आंतरिक आयामों को फिट करने के लिए 1-1.6 मिमी3 में काटा जाना चाहिए।
    3. त्वचा को उठाने के लिए बल का उपयोग करें और कैंची का उपयोग करने के लिए एक छोटे से कटौती longitudinally बनाने के लिए. माउस के बाईं ओर 1.5-2 सेमी तक कटौती बढ़ाएँ.
    4. मांसपेशियों की परत उठाने के लिए बल का उपयोग करें और कैंची का उपयोग करने के लिए एक छोटे से कटौती longitudinally बनाने के लिए. गुर्दे को बेनकाब करने के लिए आवश्यक के रूप में कटौती का विस्तार.
    5. गुर्दे के आस-पास के फैटी ऊतक को धीरे से पकड़ कर गुर्दे को उजागर करें। गुर्दे की पैरेन्काइमा को सीधे न छुएं।
    6. एक स्केलपेल का उपयोग कर गुर्दे कैप्सूल के पीछे के अंत में एक 1-2 मिमी चीरा बनाओ.
    7. धीरे धीरे गुर्दे की लंबी धुरी के लिए समानांतर चीरा के माध्यम से preloaded trocar डालने और गुर्दे कैप्सूल और गुर्दे के बीच ऊतकों को रिहा.
    8. ध्यान से गुर्दे और आंत्र उनके सामान्य स्थिति में वापस. त्वचा को बंद करने के लिए मांसपेशियों की परत और सर्जिकल स्टेपल को बंद करने के लिए 13 मिमी 3/8 सर्कल सुई के साथ अवशोषित 5/0 पी-3 (पी-13) टांके का उपयोग करें।
  4. सर्जरी के बाद, वसूली के लिए एक साफ autoclaved microisolator पिंजरे में माउस डाल दिया.
    1. पोस्ट सर्जिकल वसूली के दौरान गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए, एक हीटिंग पैड है कि एक पानी पंप है कि warms और पानी प्रसारित करने के लिए जुड़ा हुआ है पर चूहों युक्त पिंजरे डाल दिया.
    2. चूहों की निगरानी जब तक वे पर्याप्त चेतना हासिल कर लिया है स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए.
  5. सर्जरी पूरा होने के 6 घंटे के भीतर, पूंछ नस के माध्यम से, इंजेक्शन CD34 + hematopoietic स्टेम कोशिकाओं मानव भ्रूण जिगर के ऊतकों से अलग.
    1. चूहों को गर्मी-दीपक से गर्म करें। 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ पूंछ को संक्रमित करें और फिर 1.5 से 5 $ 105 स्टेम सेल/200 $L को पूंछ की नस में इंजेक्ट करें।
    2. इंजेक्शन से किसी भी खून बह रहा बंद करो और माइक्रोइसोलेटर पिंजरे और पिंजरे रैक करने के लिए microisolator पिंजरे के लिए चूहों वापस.
      नोट: पोस्ट सर्जरी चूहों आम तौर पर एक साथ रखे जाते हैं, माइक्रोइसोलेटर पिंजरे में पांच, के दौरान और वसूली के बाद. हालांकि, चूहों केवल एक साथ रखे हैं अगर वे सब एक ही दिन सर्जरी प्राप्त किया.
  6. चूहों दैनिक जाँच करें. ध्यान से शल्य स्टेपल की निगरानी और उन्हें बदलने के रूप में की जरूरत है. संक्रमण या असुविधा के किसी भी संकेत के लिए चूहों की बारीकी से निगरानी करें। सर्जरी के बाद कुछ दिनों के लिए माइक्रोइसोलेटर पिंजरे के फर्श पर ऑटोक्लेव्ड भोजन की आपूर्ति करें।
  7. सर्जरी के 7-10 दिनों के बाद सर्जिकल स्टेपल निकालें। चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए 3-5% पर इसोफ्लुरेन गैस दें। ध्यान से स्टेपल को हटाने और फिर साइट पर एंटीबायोटिक और दर्द से राहत मरहम लागू होते हैं।
  8. मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के पुनर्गठन के लिए 9-12 सप्ताह की अनुमति दें, फिर प्रत्येक मानवीय चूहों से मध्यस्थ saphenous नस से परिधीय रक्त इकट्ठा.
    1. होश चूहों साँस लेने के लिए माउस के सिर के पास एक खोलने और एक पैर को अलग करने के लिए माउस के पीछे के पास एक खोलने के साथ एक उचित आकार प्लास्टिक शंकु संयम का उपयोग कर संयम. पहले संयम शंकु सिर में चूहों रखो और फिर धीरे पैर खोलने के माध्यम से एक पैर खींच.
    2. 70% आइसोप्रोपेनोल के साथ अलग पैर के मध्य पक्ष स्प्रे करें, फिर एक ही साइट पर एंटीबायोटिक और दर्द से राहत मरहम फैलाएं।
      नोट: मरहम बालों को हटाने के लिए आवश्यकता के बिना नस के स्थान को प्रकट करने में मदद करता है और रक्त की बूंद गठन में भी सहायता करता है।
    3. एक 90 डिग्री कोण पर एक 25 गेज सुई का उपयोग करना, नस पंचर और एक EDTA लेपित रक्त संग्रह ट्यूब का उपयोग कर रक्त के 50-100 $L इकट्ठा। बाँझ धुंध के साथ साइट के लिए दबाव लागू करने से खून बह रहा बंद करो. एक बार खून बह रहा बंद कर दिया है, उनके पिंजरे में चूहों को वापस.
      नोट: एकत्र अधिकतम रक्त मात्रा आम तौर पर कर रहे हैं 50 $L प्रति सप्ताह या 100 $L हर दो सप्ताह.
    4. मानव प्रतिरक्षा कोशिका पुनर्गठन के स्तर का परीक्षण करने के लिए एकत्र परिधीय रक्त का उपयोग करें hCD45, MCD45, hCD3, hCD4, hCD19 के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए।

3. एंटीबायोटिक उपचार

  1. एंटीबायोटिक उपचार से पहले, पूर्व उपचार मल के नमूने एकत्र करें। चूहों को एक नए ऑटोक्लेव्ड माइक्रोइसोलेटर पिंजरे में ले जाएं।
  2. दैनिक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं की एक ताजा कॉकटेल तैयार करें।
    1. चूहों के पिंजरे के लिए ताजा तैयार Metronidazole (1 g/L), Neomycin (1 g/L), Vancomycin (0.5 g/L), और एम्पिसिलिन (1 g/L) युक्त पानी की 250 एमएल तैयार करें।
      नोट: एंटीबायोटिक पूरक पीने के पानी के लिए ऑटोक्लेव ्ड या बाँझ पानी का उपयोग करें।
    2. एंटीबायोटिक पूरक पानी के 250 एमएल में 9.2 ग्राम अंगूर चीनी मीठा पेय मिश्रण जोड़ें।
      नोट: अंगूर चीनी मीठा पेय का उपयोग मिश्रण मास्क एंटीबायोटिक दवाओं के कड़वा स्वाद और चूहों में निर्जलीकरण को रोकने में मदद करता है.
    3. एंटीबायोटिक और अंगूर चीनी मीठा पेय मिश्रण पूरक पानी बदलें और चूहों को दैनिक एक नए ऑटोक्लेव पिंजरे में रखें।
      नोट: चूहे कोप्रोफैगिक हैं और पिंजरों को दैनिक बदलने से चूहों को आंत बैक्टीरिया के साथ खुद को फिर से टीका करने से रोकता है।
    4. मानव की तरह आंत microbiome के अधिकतम engraftment के लिए, 14 दिनों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं प्रदान करते हैं. एंटीबायोटिक उपचार के दौरान, वजन घटाने और निर्जलीकरण के लिए चूहों की निगरानी करें। पहले 3-4 दिनों के दौरान वजन घटाने की उम्मीद है और उसके बाद उपचार की अवधि के लिए पठार. यदि निर्जलीकरण होता है, तो आंतरपर्णीय इंजेक्शन के माध्यम से चूहों को नमकीन या रिंगर्स समाधान दें।
      नोट: अन्य आंत microbiome मानवीकरण प्रोटोकॉल एंटीबायोटिक दवाओं के मौखिक gavage के लिए कहते हैं. जबकि murine आंत बैक्टीरिया को कम करने में प्रभावी, हमने पाया कि पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने के कम इनवेसिव विधि हमारे मानवीय चूहों पर कम तनाव डाल दिया और बेहतर परिणाम के लिए नेतृत्व किया.

4. दाता के नमूने और मल प्रत्यारोपण

  1. मानव दाता मल के नमूने तैयार करें।
    1. मानवीकृत चूहों में मल प्रत्यारोपण के लिए मल माइक्रोबायोटा ट्रांसप्लांट (एफएमटी) सामग्री के ठीक से तैयार स्रोतों का उपयोग करें।
    2. Thaw एफएमटी तैयारी और एक अवायवीय कक्ष में अवायवीय परिस्थितियों के तहत उन्हें alicot.
    3. यदि वांछित, इस कदम पर एक निष्पक्ष "मानव" नमूना बनाने के लिए एक साथ मल के नमूनों के बराबर भागों मिश्रण.
    4. एक न्यूनतम करने के लिए एफएमटी सामग्री की ठंड और thawing रखें, अगर alicouating या नमूनों के मिश्रण की जरूरत नहीं है, केवल प्रक्रिया से पहले तुरंत thaw.
  2. मानव मल प्रत्यारोपण
    1. 14 दिनों के एंटीबायोटिक उपचार के पूरा होने के बाद, पीने के पानी को ऑटोक्लेव्ड पानी में बदलें और चूहों को एक नए ऑटोक्लेव्ड पिंजरे में ले जाएं। दैनिक पिंजरे में परिवर्तन बंद करो और एक बार हर 1-2 सप्ताह पिंजरे बदलने अनुसूची लागू.
    2. एंटीबायोटिक दवाओं की समाप्ति के बाद 24 और 48 एच पर दो मल प्रत्यारोपण दें।
    3. एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के बाद 24 ज, एफएमटी सामग्री की आवश्यक मात्रा को कम करें, मौखिक गैवेज के माध्यम से एफएमटी सामग्री के प्रत्येक माउस 200 $L दें। 48 एच पोस्ट एंटीबायोटिक दवाओं पर फिर से प्रक्रिया दोहराएँ।
    4. मानवीय चूहों के फर पर या पिंजरे बिस्तर पर किसी भी शेष या बचे हुए thawed एफएमटी सामग्री बिखर।

5. ताजा मल नमूना संग्रह

  1. धूआं हुड को स्थानांतरित करने से पहले ऑटोक्लेव व्यक्तिगत कागज बैग।
  2. धूआं हुड में, प्रत्येक व्यक्ति कागज बैग में एक माउस डाल दिया और माउस को शौच करने की अनुमति.
  3. बाँझ forceps का उपयोग करना, 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में मल का नमूना इकट्ठा करने और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज। चूहों को माइक्रोइसोलेटर पिंजरों में वापस करें।
    नोट: मल के नमूने इकट्ठा करने की यह विधि किसी भी तनाव को प्रेरित हेरफेर के बिना व्यक्तिगत चूहों से ताजा मल नमूना संग्रह के लिए अनुमति देता है।

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Representative Results

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चित्रा 1 डबल हू-BLT चूहों बनाने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की एक रूपरेखा से पता चलता है और संक्षेप में एनएसजी चूहों के लिए एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और स्थिर मानव की तरह आंत microbiome जोड़ने की प्रक्रिया का वर्णन करता है. चित्र ााा्वित 2 में परिधीय रक्त के प्रवाह कोशिकामिति विश्लेषण का एक उदाहरण दिखाया गया है, जो एक मानवीय बीएलटी-माउस से १० सप्ताह बाद की सर्जरी है। चित्रा 3 डबल hu-mice बनाने के लिए एक आंत microbiome हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल मानव मल दाता नमूने के सापेक्ष बहुतायत से पता चलता है. चित्रा 4 तिल्ली और सीकम के लिए एंटीबायोटिक उपचार द्वारा प्रेरित phenotypic परिवर्तन से पता चलता है, क्या रोगाणु मुक्त जानवरों में मनाया जाता है के समान. चित्रा 5 एक प्रमुख घटक विश्लेषण से पता चलता है (पीसीए) 16S rRNA अनुक्रमण डेटा का खुलासा डबल hu-mice मानव की तरह आंत microbiomes कि मानव दाता नमूने के लिए अद्वितीय हैं की साजिश.

Figure 1
चित्र 1 : डबल मानवीय BLT-mice बनाना. डबल हू-BLT चूहों बनाना एक दो कदम की प्रक्रिया है. पहला कदम एनएसजी चूहों के लिए मानव प्रतिरक्षा प्रणाली engraft है. सर्जरी के दिन, एनएसजी चूहों विकिरण स्टेम कोशिकाओं के लिए एक जगह बनाने के लिए दिया जाता है। चूहों तो मानव भ्रूण जिगर और थाइमस ऊतकों के साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं और मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन. मानव प्रतिरक्षा सेल पुनर्गठन के आसपास की जाँच की है 10 सप्ताह के बाद सर्जरी.  दूसरा कदम मानव आंत microbiome engraft है. चूहे एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज कर रहे हैं पूर्व मौजूदा murine आंत बैक्टीरिया को कम करने के लिए. चूहे तो मानव आंत microbiome प्रदान करने के लिए मल प्रत्यारोपण दिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : डबल मानवीय बीएलटी-मीस में मानव प्रतिरक्षा कोशिका पुनर्गठन का परीक्षण। एक मानवीय बीएलटी-माउस परिधीय रक्त के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का एक उदाहरण 10 सप्ताह के बाद सर्जरी. आंकड़ा लसीकाकोशिका आबादी, mCD45- hCD45 + कोशिकाओं, CD19 + बी कोशिकाओं, CD3 + टी कोशिकाओं, CD4 + टी कोशिकाओं, और CD8 + टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया gating रणनीति से पता चलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : मानव दाता मल नमूना प्रोफाइल. 3 मानव दाता और मिश्रित (सभी दाताओं) नमूने के रिश्तेदार बहुतायत परिवार के स्तर पर दिखाया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एंटीबायोटिक इलाज चूहों रोगाणु मुक्त phenotypes के समान. हू-मीस एंटीबायोटिक उपचार (एंटीबायोटिक्स) या कोई एंटीबायोटिक उपचार (नियंत्रण) के 9 दिनों के बाद बलिदान कर दिया गया। एंटीबायोटिक उपचार के बाद, मानवीकृत चूहों के phenotype रोगाणु मुक्त जानवरों में देखा उन समान करने के लिए शुरू होता है। एंटीबायोटिक उपचार के परिणामस्वरूप तिल्ली (बाएं) के आकार में कमी आई है और सीकम बढ़ा हुआ है (दाएं)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : डबल मानवीय BLT-mice सुविधा मल दाता विशिष्ट आंत microbiomes. 16S rRNA अनुक्रमण डेटा शो के पीसीए साजिश मानव मल प्रत्यारोपण के बाद डबल हू-BLT चूहों सुविधा आंत microbiomes कि व्यक्तिगत मानव मल दाता के लिए अद्वितीय हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

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यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल डबल हू-BLT चूहों के निर्माण के लिए है कि दोनों एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और एक स्थिर मानव की तरह आंत microbiome सुविधा. इस प्रोटोकॉल GF जानवरों और gnotobiotic सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना अन्य मानवीय या गैर मानवीय चूहों मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. जबकि यहाँ वर्णित तरीकों अपेक्षाकृत सरल कर रहे हैं, वहाँ कई महत्वपूर्ण विवरण है कि डबल hu-BLT चूहों के सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं. एनएसजी चूहों अत्यंत प्रतिरक्षा की कमी है और संक्रमण को रोकने चूहों की लंबी अवधि के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है. हमने संक्रमण को रोकने के लिए निम्नलिखित उपाय किए। सबसे पहले, जानवरों को एक समर्पित सूट में एयर एक्सचेंज दर प्रबंधन के साथ एक रैक सिस्टम में HEPA फिल्टर (0.22 डिग्री मी) के साथ व्यक्तिगत microisolator पिंजरों में रखे गए थे। रैक के लिए एयर हैंडलर HEPA फ़िल्टर्ड (0.22 डिग्री मीटर) आपूर्ति और निकास हवा, साथ ही पिंजरे निकास हवा के तापमान और सापेक्ष आर्द्रता की वास्तविक समय पर लाइन निगरानी के साथ पूर्व फिल्टर निहित. दूसरा, जो कोई पशु के कमरे में प्रवेश किया स्नान और साफ scrubs और जूते पहनने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दस्ताने, डिस्पोजेबल tyvek सूट, booties, बाल बोनट, और चेहरा मुखौटा पर डाल दिया था. तीसरा, पिंजरे में परिवर्तन और भोजन और पानी के अलावा सहित सभी प्रक्रियाओं, एक वर्ग द्वितीय प्रकार A2 जैविक सुरक्षा धूआं हुड कि 70% इथेनॉल और यूवी प्रकाश के साथ पूर्व बाँझ था के भीतर प्रदर्शन किया गया. चौथा, aseptic शल्य चिकित्सा तकनीक अस्तित्व सर्जरी के दौरान इस्तेमाल किया गया था, जो सर्जन और सहायकों एक सर्जरी गाउन और दस्ताने सहित सुरक्षा की एक अतिरिक्त परत पहने हुए शामिल थे. सर्जरी के दौरान दस्ताने और उपकरणों की बाँझपन को बनाए रखते हुए, केवल बाँझ उपकरणों, धुंध, और घाव बंद सामग्री का उपयोग करते हुए, कीटाणुरहित धूआं हुड में सर्जरी आयोजित की गई थी। अंत में, संक्रमण को रोकने और engrafted मानव की तरह आंत microbiome की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, सभी भोजन और चूहों को दिया पानी बाँझ था. सभी भोजन विकिरणित किया जाना चाहिए और सभी पानी को स्वत: claved किया जाना चाहिए। दर्द और संकट को कम करने के लिए, हम सर्जरी से पहले चूहों के लिए लंबे समय से अभिनय buprenorphine subcutaneously प्रशासित. माउस सर्जिकल संज्ञाहरण के लिए Ketamine और Xylazine का संयोजन बहुत विश्वसनीय है और के बारे में 30 मिनट के लिए पिछले कर सकते हैं. यदि यह लंबे समय से नहीं है, तो हम चूहों को और अधिक एनेस्थेट करने के लिए isoflurane गैस देते हैं। यह भी सर्जरी के बाद माउस शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। हम पूंछ नस के माध्यम से hematopoietic स्टेम सेल इंजेक्शन तक गर्म वार्मिंग पैड पर पिंजरे डाल दिया. उस समय, चूहों संज्ञाहरण से बरामद कर रहे हैं और रैक करने के लिए लौट आए.

murine आंत microbiome deplete और मानव मल प्रत्यारोपण के लिए तैयार करने के लिए, यह हमेशा ताजा तैयार एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने के लिए और एंटीबायोटिक पूरक पानी और पिंजरों दैनिक बदलने के लिए महत्वपूर्ण है. यह 14 दिन एंटीबायोटिक उपचार भर में कई microisolator पिंजरों का उपयोग करेगा, लेकिन यह सुनिश्चित करता है कि चूहों coprophagia के माध्यम से फिर से टीका नहीं किया जा रहा है. एंटीबायोटिक उपचार के दौरान, यह भी शरीर के वजन और चूहों के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. मल प्रत्यारोपण के बाद, चूहों जल्दी से किसी भी खो वजन हासिल. यह मल प्रत्यारोपण सामग्री के लिए किसी भी फ्रीज-थॉव चक्र को कम करने के लिए और एक अवायवीय कक्ष का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है अगर alicouating नमूने की जरूरत है. डबल हू-BLT चूहों बनाने के दौरान यह चूहों पर प्रेरित हैंडलिंग और तनाव को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह संक्रमण को रोकने में मदद करता है और दीर्घकालिक अस्तित्व में सुधार करता है।

हम शुरू में विरोधी कवक amphotericin बी के साथ चूहों पूर्व इलाज करने की कोशिश की, लेकिन पाया चूहों उपचार बहुत अच्छी तरह से बर्दाश्त नहीं किया और यह अब प्रयोग किया जाता है. हम भी एंटीबायोटिक उपचार के विभिन्न अवधिके के साथ प्रयोग किया. हमने पाया है कि जबकि murine आंत बैक्टीरिया के बहुमत एंटीबायोटिक दवाओं के 7 दिनों के बाद समाप्त होने लगते हैं, दाता engraftment का स्तर उपचार के 14 दिनों के बाद बहुत अधिक है. हम भी दो बार दैनिक मौखिक gavage के माध्यम से एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन की कोशिश की. हालांकि, हमने पाया कि इस विधि हमारे hu-mice के लिए भी आक्रामक था. हम एक दैनिक gavage अनुसूची के लिए बंद कर दिया, लेकिन चूहों अभी भी तनावग्रस्त और अस्वस्थ दिखाई दिया. हमने पाया कि पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं प्रदान सबसे अच्छा तरीका था. यह अभी भी पर्याप्त रूप से murine आंत बैक्टीरिया को कम करने, जबकि चूहों के लिए राशि से निपटने और तनाव कम. हम चूहों एंटीबायोटिक की एक पर्याप्त खुराक प्राप्त करने के लिए और निर्जलीकरण को रोकने के लिए सुनिश्चित करने के लिए पीने के पानी में अंगूर चीनी मीठा पेय मिश्रण प्रदान की. चूहों एंटीबायोटिक उपचार के पहले 3-4 दिनों के दौरान शरीर के वजन में कमी का अनुभव करते हैं, लेकिन इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के माध्यम से अतिरिक्त तरल पदार्थ प्रदान करने से शरीर के वजन में वृद्धि नहीं होती है। मल प्रत्यारोपण के बाद, चूहों जल्दी से खो वजन हासिल.

हालांकि इस विधि reproducibly डबल हू-BLT चूहों उत्पन्न करने में सक्षम है, वहाँ मॉडल के लिए कुछ सीमाएं हैं. पहली बात पर विचार करने के लिए hu-mice है कम संगठित लसीकाभ संरचना है, germinal केंद्र सहित, कम एंटीबॉडी वर्ग स्विचन और सीमित आत्मीयता परिपक्वता के लिए अग्रणी. हालांकि, एनएसजी हू-BLT चूहों प्रणालीगत प्रतिरक्षा पुनर्गठन और अनुवाद टी सेल प्रतिक्रियाओं है और कई मानव रोगों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अन्य मुद्दा अत्यधिक मानव प्रतिरक्षा पुनर्गठन के कई महीनों के बाद कुछ hu-mice में भ्रष्टाचार-versus-होस्ट रोग (GVHD) के संभावित विकास है. हम और दूसरों को इस तरह के blepharitis, खालित्य, वजन घटाने, और malocclusion कि ध्यान से25निगरानी की जानी चाहिए के रूप में जीवीएचडी अभिव्यक्तियों मनाया है.

चूहों में आंत के बैक्टीरिया को कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ कई दस्तावेजी व्यवस्थाएंहैं 26,27,28,29,30,31. हम उनके ज्ञात क्षमता के कारण एंटीबायोटिक दवाओं के हमारे कॉकटेल चुना पेट में बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित करने के लिए और क्योंकि हम साहित्य में सफल जीवाणु कमी के कई उदाहरण पाया. कई प्रकाशित मामलों एंटीबायोटिक दवाओं की एक बहुत कम कठोर पाठ्यक्रम का उपयोग करें, लेकिन हमारे अध्ययन में, हमने पाया कि 14 दिनों के एक मानव की तरह आंत microbiome के इष्टतम engraftment के लिए आवश्यक है. जब तक हम शुरू में Hintze एट अल पर आधारित एक प्रोटोकॉल की कोशिश की, हमने पाया कि मौखिक gavage भी आक्रामक था और है कि विरोधी कवक उपचार चूहों के लिए हानिकारक था26. हमें विश्वास है कि NSG hu-BLT चूहों अद्वितीय हैं और कम इनवेसिव प्रक्रियाओं अन्य अधिक मजबूत चूहों की तुलना में पसंद कर रहे हैं. हम अपने अध्ययन में GF जानवरों का उपयोग नहीं किया. आंत microbiome के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए GF चूहों का उपयोग अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, तथापि, इन जानवरों को एक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं है19,32. इसके अलावा, हम स्वीकार करते हैं कि एक GF NSG hu-BLT चूहों मॉडल के साथ काम करने से अनुसंधान के लिए दिलचस्प अवसर पैदा होंगे. एक के लिए, मानव प्रतिरक्षा कोशिका पुनर्गठन और आंत microbiome की उपस्थिति के बिना एचआईवी-1 जैसे मानव विशिष्ट रोगजनकों के रोगजनन का अध्ययन दिलचस्प परिणाम प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, GF मॉडल मल प्रत्यारोपण के बाद एक मानव की तरह आंत microbiome का एक और अधिक पूरा पुनर्गठन के लिए अनुमति दे सकता है. हालांकि, GF चूहों लंबे समय से स्थायी प्रतिरक्षा की कमी है, यहां तक कि आंत microbiome पुनर्गठन के बाद21. हमारे मॉडल एसपीएफ आवास की स्थिति है, जो व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और GF सुविधाओं की तुलना में कम महंगे का उपयोग करने का लाभ है. हमारे मॉडल भी शल्य चिकित्सा hu-BLT चूहों पैदा करने की सामान्य प्रक्रियाओं परेशान नहीं का लाभ है क्योंकि वहाँ एक पूरी तरह से GF पर्यावरण के लिए कोई ज़रूरत नहीं है.

हम मानते हैं कि इस डबल hu-BLT माउस मॉडल में अद्वितीय है कि यह न केवल मानव प्रतिरक्षा समारोह और मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी रोग रोगजनन और vivo में उपचार पर आंत microbiome के प्रभाव का निर्धारण. इस प्रोटोकॉल के साथ, हम reproducibly मानव दाता विशिष्ट आंत microbiome प्रोफाइल के साथ डबल हू-BLT चूहों बना सकते हैं. इसलिए, हम मानते हैं कि डबल हू-BLT चूहों का उपयोग भविष्य व्यक्तिगत चिकित्सा एचआईवी-1 और कैंसर जैसे विभिन्न मानव रोगों के लिए उपचार पर आंत microbiome के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद होगा. संक्षेप में, हमारे डबल hu-BLT चूहों मॉडल एक महत्वपूर्ण और उपन्यास पूर्व नैदानिक मॉडल है कि दोनों एक कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रणाली और एक स्थिर मानव की तरह आंत microbiome सुविधाओं के लिए मानव स्वास्थ्य और रोग का अध्ययन है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम BLT-humanized चूहों पैदा करने में उनकी सहायता के लिए Yanmin वान, Guobin Kang, और Pallabi Kundu धन्यवाद करना चाहते हैं. हम UNMC जीनोमिक्स कोर सुविधा है जो कार्यात्मक जीनोमिक्स NE-INBRE P20GM103427-14 में नेब्रास्का अनुसंधान नेटवर्क से आंशिक समर्थन प्राप्त स्वीकार करना चाहते हैं, न्यूरोसेंसरी सिस्टम CoBRE P30GM110768, फ्रेड और पामेला Buffett कैंसर केंद्र - P30CA036727, रूट और Rhizobiome अभिनव के लिए केंद्र (CRRI) 36-5150-2085-20, और नेब्रास्का अनुसंधान पहल. हम नेब्रास्का विश्वविद्यालय - लिंकन जीवन विज्ञान अनुलग्नक और उनकी सहायता के लिए अपने कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन के भाग में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है (NIH) अनुदान R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 क्रोनिक एचआईवी संक्रमण और न्यूरोएड्स में उम्र बढ़ने (चैन) केंद्र, 1R01AI111862 क्यू ली के लिए.  funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, पांडुलिपि या प्रकाशन के लिए निर्णय की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

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References

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एक डबल मानवीय BLT-mice मॉडल एक स्थिर मानव की तरह गट Microbiome और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली की विशेषता
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Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).More

Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

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